專利名稱：生產成熟的重組螨i類變應原的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產成熟的重組螨I類變應原的方法。
背景技術：
WO 01/29078，實施例2描述了在巴斯德畢赤氏酵母(Pichia Pastoris)中生產 Der fl，包括在YPD培養基中pH 6下培養以生產pro-Der fl。回收培養介質的上清液并 用pH 4. 5緩沖液稀釋，并在用pH 4. 5緩沖液平衡的SP-S印harose柱中運行。用20-25柱 體積的具有線性NaCl梯度的pH 4. 5緩沖液洗脫蛋白質。這種方法生產Der Π的兩種成 熟形式，其中一種與另一種相比具有在氨基末端的兩個額外氨基酸。一般認為，巴斯德畢 赤氏酵母(P.pastoris)能生產前體并將其裂解從而生產成熟形式。在WO 01/29078的實 施例12中，其推測pro-Der fl經歷自處理并被制備成在活性部位具有突變的惰性突變體 (inactive mutant)。制備得到Der pi的相應突變體。在實施例12中沒有指出表達所述 突變體的方法。
Yasuhara 等人(Clinical and Experimental Allergy, 2001, Volume 31, pages 116-124)描述了一種生產rDer fl的方法，其中野生型Der fl的前體的表達是在如下步驟 中獲得的使巴斯德畢赤氏酵母在BMMY培養基中pH 6.0下生長48-72小時，然后通過離心 收獲上清液。通過在4°C下對IOOmM乙酸酯緩沖液(pH 4.0)透析48小時，自催化地實現體 外活化。Jacquet 等人(Clin Exp Allergy 2002，32_1048_1053)公開了 Der pi 的生產，包 括在緩沖的最小葡萄糖(BMG)培養基中培育巴斯德畢赤氏酵母，所述巴斯德畢赤氏酵母含 有具有編碼proDer pi的cDNA的質粒。通過每天加入甲醇0. 5%來誘導表達。通過離心 收集上清液。所收集的proDer pi在柱上并通過超濾進行純化。通過Der pi的自催化處 理使純化的proDer pi經受熟化，所述自催化處理是通過對IOOmM醋酸鈉緩沖液pH 4的透 析。De Halleux 等人(J Allergy Clin Immunol, 2006)公開了野生型 rproDer pi 的 生產和rproDer pi的N52Q非糖基化突變體。使用pPICZ α C作為表達載體在巴斯德畢赤 氏酵母Χ-33中進行表達。所述培養物在30°C下在指定的發酵培養基中培養。然后在30下 用甲醇誘導所述培養物3天。在培養和誘導期間將所述培養基的pH調節至6.0。對所述由 發酵產生的培養混合物進行離心并將上清液對25mmol/L醋酸鈉緩沖液pH 4. 5進行透析， 并且在4. 5C下保持約3-4天用于pro-Der pi和pro-Der plN52Q成為成熟的變應原的自 熟化。然后通過在SP-S^harose上的陽離子交換以及附加的步驟進行純化。本發明的目的是提供一種生產重組成熟螨I類變應原的改進方法。發明概述本發明實現了此目的，即涉及一種生產成熟的重組螨I類變應原的方法，所述方 法包括以下步驟a)提供宿主細胞形式的變應原表達系統，所述宿主細胞選自包含載體的酵母，所述載體含有編碼前變應原的cDNA， b)在5. 5-7. 5的培養PH下培養所述變應原表達系統一定的培養期以表達前變應
原，從而獲得包含前變應原的培養混合物， C)將培養混合物的PH調節至3. 5-5. 0的熟化pH，d)將所述培養混合物在熟化pH下維持一定的熟化期以將所述前變應原轉變成成 熟的變應原，從而獲得產物混合物，和e)使所述產物混合物經歷純化方法，以從產物混合物中分離成熟的變應原。本發明是基于可能在培養混合物中進行前變應原的熟化以獲得成熟的變應原的 實驗發現，其中表達是在沒有任何從培養混合物中的在先分離或純化產物的情況下進行 的。這種方法與現有技術方法相比具有許多優點。第一，本發明的方法簡單，因為其允許在 同一反應器中進行表達和熟化，由此省去了對單獨熟化步驟的需要。第二，在完成表達之后 可立即進行熟化而無需任何居間的純化步驟，這使得可能更有效地控制熟化方法，特別是 避免在純化步驟下發生不受控制的熟化。本發明方法的第三個優點是縮短成熟期，這對將前變應原和成熟變應原的降解減 到最小很重要，由此提高產率。第四個優點是在熟化期期間中允許繼續表達和分泌，這提高了產率和/或允許縮 短表達期。第五個優點是純化步驟簡單化，因為僅僅分離變應原的成熟形式，而在現有技術 的方法中表達步驟通常會產生包含前變應原和成熟變應原的混合物的發酵產品，這使得需 要額外的純化步驟。
圖1顯示出在熟化期期間內在0、3和18小時時獲得的培養混合物樣品的 SDS-PAGE。發明詳述螨I類變應原通過本發明的方法生產的螨I類變應原可以是任何已知的無氣門目 (orderAstigmata)的螨I類變應原，特別是選自粉螨總科(Acaroidea)、嗜甜螨總科 (Glycyphagoidea)和羽螨總科(Analgoidea)的變應原，更特別是選自粉螨科(Acaridae)、 嗜甜螨科(Glycyphagidae)、棘鼠螨科(Echimyopodidae)和蚍螨科(Pyroglyphidae)的變 應原，更特別是選自粉螨屬(Acarus)、無爪螨屬(Blomia)、塵螨屬(Dermatophagoides)、嗜 霉螨屬(Euroglyphus)、食甜螨屬(Glycyphagus)、嗜鱗螨屬(L印idoglyphus)和食酪螨屬 (Tyrophagus)的變應原。在本發明具體的實施方案中，所述螨I類變應原選自Aca sUBlo tl、Der fl、Der pl、Eur mUGly dULep dl 和 Tyr pi。特別是所述螨 I 類變應原選自 Blo tl、Der fl、Der pi和Eur ml。更具體而言，所述螨I類變應原是Der pi。 此外，通過本發明方法生產的螨I類變應原可以是上述變應原的天然存在的同等 型，以及上述變應原的突變的變體，例如通過重組技術制備的突變的變體。例如，可以進行 突變以獲得野生型變應原的低變應原變體，以使變應原更穩定和/或更易于表達和純化以 及以改變變應原的糖基化類型，例如通過取代帶有聚糖側鏈的氨基酸。
變應原表汰系統所述宿主細胞可以是任何適于本目的的酵母，特別是酵母目 (Saccharomycetales)的酵母，更特別是選自畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬 (Saccharomyces)和假絲酵母屬(Candida)的酵母。在本發明具體的實施方案中，所述宿主細胞是糖酵母科(saccharomycetaceae)的，更特別是選自畢赤氏酵母屬(Pichia)和糖酵 母屬(Saccharomyces)，以及最特別是選自巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastohs)和釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)。所述載體(vector)可以為用作編碼前變應原的DNA的轉運體(carrier)的任何 傳統載體，并且其可以被引入到寄主細胞中并在其中表達。所述載體特別可以是質粒或噬 菌體。合適的載體的示例是大腸桿菌(E. coli)/巴斯德畢赤氏酵母穿梭載體pGAPZaA、 pPICZ α A、pPICZ α B、pPICZ α C、pPIC9K 和 pHIL-Sl。在本發明一個具體的實施方案中，所述載體包括組成型啟動子，例如編碼甘油 醛-3-磷酸脫氫酶的GAP基因的啟動子。在本發明另一個具體的實施方案中，所述載體包 括甲醇-可誘導的啟動子，例如AOX啟動子。在本發明一個具體的實施方案中，所述載體包 括用于分泌的信號序列，例如釀酒酵母α因子和ΡΗ01。在本發明一個具體的實施方案中，所述酵母是巴斯德畢赤氏酵母且所述載體是 pGAPZa A。在本發明具體的實施方案中，修飾所述變應原的氨基酸序列以使得在分子的 C-末端包含許多組氨酸殘基。這種組氨酸殘基的序列，通常被認為是HIS-標簽(HIS-tag)， 形成供親和色譜法使用的金屬結合位點，用于簡化從發酵液體混合物中純化重組分子。前變應原的表達在5. 5-7. 5的培養pH下培養所述變應原表達系統一定的培養期以表達前變應原， 從而獲得包含前變應原的培養混合物。具體而言，所述培養PH為5. 8-7. 2之間，更優選 6. 0-7. 0，更優選 6. 2-6. 8。在本發明一個具體的實施方案中，所述培養期為12小時-144小時，優選24小 時-120小時，更優選48小時-96小時。proDer pi 向成熟 Der pi 的熟化將培養混合物的pH調節至3. 5-5. O的熟化pH。在本發明一個具體的實施方案中， 所述熟化PH是3. 7-4. 8，更特別是3. 9-4. 6，并最特別是4. 0-4. 5。在本發明另一個具體的實施方案中，所述熟化期是8小時-30小時，特別是12小 時-26小時，更特別是14小時-24小時，更特別是16小時-22小時并且最特別是17小 時-21小時。純化方法用于從發酵液體混合物中分離蛋白質產物的任何常規方法都可以用在本發明的 方法中作為純化方法，以從熟化所得到的產物混合物中分離成熟的變應原。合適的純化方法的實例是離心法、過濾法、超濾法、透濾法、透析法、膠濾法、沉淀 法、親和色譜法以及這些方法的組合。定義關于本發明，使用以下定義
術語“前變應原”是指變應原分子的前體，即包含成熟部分和分子的前肽的變應原分子。
實施例實施例1 重組Der pi的牛產本實施例提供一種在巴斯德畢赤氏酵母中表達pro-Der pi型之后生產成熟的重 組Der pi的方法。前體的熟化是在發酵容器中進行的，通過在確定的時段內調節pH至4. 0 以使所有的pro-Der pi都被加工成隨后被純化的成熟的Der pi分子。rproDer pi 變體的構建通過PCR構建局部遺傳密碼最優化的rproderpl野生型(wt)(從現在起寫為 rproderpl)cDNA，所述cDNA包含用于rproDer plwt (從現在起寫為rproDer pi)的完整編 碼區域并具有額外的IOaa C-末端His標簽。所述編碼的rproDerpl蛋白質相當于具有額 外V204A的UniProt登記號P08176的proDer pi區域(aa 19-320)(貫穿本實施例的aa編 號是從proDer pi的第一個aa開始)，其是天然存在的變體。分別使用正向引物和反向引 物以產生在5'和3'末端附近具有引入的Xhol和Xbal限制性位點的964bp片段。將該 rproderpl基因克隆到pCR4_TOP0中，轉化到TOPlO(Invitrogen)中并驗證序列。隨后使 用限制酶Xhol和Xbal通過定向克隆將rproder pi基因再克隆到大腸桿菌/巴斯德畢赤 氏酵母穿梭載體PGAPZaA中。這產生具有釀酒酵母α因子下游的rproDer pi編碼區域的 質粒rproderpl，所述釀酒酵母α因子在兩個蛋白質之間具有促進重組蛋白質分泌的Kex2 裂解位點。所述質體最初被轉化入E. coli T0P10細胞中。通過重疊延伸法(overlap extension method)完成位點特異突變體W32D的構 建。簡言之，在一個PCR反應中，正向引物1與反向引物7—起使用，在另一個PCR反應中 反向引物3與正向引物6 —起使用，以及在第三個PCR反應中反向引物2與正向引物8 一 起使用，所有都以proderpl作為模板。通過在最后的PCR反應中一起使用所述三個生成 的PCR產物以及引物1和2產生含有突變得完全片段，繼之以將957bp Xhol-Xbal片段定 向克隆到pGAPZaA中，如為proderpl所描述的，產生質體rproderpl_N132D (從現在起寫為 rproderpl-N)。rproDer pi變體的表達和純化根據制造商的操作流程將pGAPZ α A-rproderp 1_Ν轉化到巴斯德畢赤氏酵母 X33wt菌株(Invitrogen)中。將克隆重復劃線在YPDZ-瓊脂平板上并檢查表達。如制造 商(Invitrogen)提供的操作流程所描述，培養表達rproDer pl_N132E的巴斯德畢赤氏酵 母X33: :rproder pl_N克隆(從現在起寫為rproDer pl_N)，簡言之，用來自單個菌落的 細胞接種5ml YPDZ培養基(YPD+100 μ g/ml Zeocin)并使其在震蕩器中于220rpm 30°C下 生長過夜。2ml的該培養物用于接種400ml的新鮮YPD (酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖)培 養基，在使用所述YPD培養基用于接種待用于發酵的3. 61的YPD培養基之前，先將所述YPD 培養基培養過夜。在 5L 最大容量的容器中，在 B. Braun-Biotech Internationalsystem(BI0STAT B-DCU型)中以以下基本發酵條件進行發酵
-溫度30°C_800rpm的攪拌速度-0. 8體積每分鐘的氣流供給_pH最初控制在pH 6. 5，通過自動加入30% NH4OH或5% H2S04。發酵是在稱為YPD的復合物培養基中進行的，所述YPD的成份為酵母提取物、 2%大豆蛋白胨和2%葡萄糖。通過在600nm處的光密度測量來控制生長培養物的細胞密 度。控制利用PO2電極測量的溶解氧以便于進行細胞分裂(低的PO2水平表明由于高細胞 活動的高耗氧量，而增加的PO2水平表明由于例如碳源耗盡的低細胞活動或細胞分裂)。如 果加入碳源是必需的，將包含5%葡萄糖、13. 4%酵母氮堿(YNB)和0. 02%生物素的溶液加 入到進行中的培養物。pH調節以及proDer pi向成熟Der pi的熟化以6. 5的受控pH發酵48h之后，所表達的重組產物是r-pro-Der pl，其可以通過 SDS-PAGE進行驗證。為了開始熟化過程，將pH減小至pH 4. 0并維持在該水平上，同時使 其它發酵條件保護不變。在酸性PH下18小時后，觀察到僅有成熟的r-Der pl作為重組產 物，參見圖1。在進行分離成熟的r-Der pl時，為了避免更多的蛋白酶活性，將pH升至pH 8.0，并收集培養物。純化方法通過離心和隨后的過濾從酵母細胞中澄清(clarify)并分離包含所分泌的重組產物的培養液。分兩步進行(NH4) 2S04(硫酸銨)沉淀法，第一步達到1. 8M的(NH4)2SO4濃度， 繼之分離沉淀的和可溶的產物，和在第二步中，使第一步后獲得的上清液達到3. 2M的鹽濃 度。這樣高的鹽濃度誘導重組產物從來自第一步的上清液(其包含許多蛋白質污染物)中 選擇性沉淀，由此使得所述重組產物的純化。所有這些步驟都是在4°C下進行。離心后，使 成團塊的沉淀物從在高鹽濃度下可溶的組分中分離，并將所述團塊貯藏在-20°C下。通過親和色譜法，根據透析樣品的BD-TALON金屬親合力(BD Biosciences)實現 重組產物(成熟的r-Der pl)的進一步純化。通過組氨酸標簽將所述重組產物精特異性地 與柱結合，并通過加入咪唑的色譜緩沖液(50mM磷酸鈉，300mMNaCl，pH 8.0)至300mM的終 濃度進行洗脫。在4°C下，在AKTAexplorer平臺上進行色譜步驟。將洗脫峰對緩沖液鹽水 進行透析并且樣品保持冷藏。結論從上可知，本實施例表明可以在同一反應器中進行培養以表達所述前變應原及其 熟化，即在熟化之前沒有任何從培養混合物的殘余組分中分離前變應原的步驟。同時，該實 施例表明可在比較短的時段(18小時)內進行熟化。
權利要求
一種生產成熟的重組螨I類變應原的方法，包含以下步驟a)提供宿主細胞形式的變應原表達系統，所述宿主細胞選自包含載體的酵母，所述載體含有編碼前變應原的cDNA，b)在5.5-7.5的培養pH下培養所述變應原表達系統一定的培養期以表達前變應原，從而獲得包含前變應原的培養混合物，c)將培養混合物的pH調節至3.5-5.0的熟化pH，d)將所述培養混合物在熟化pH下維持一定的熟化期以將所述前變應原轉變成成熟的變應原，從而獲得產物混合物，和e)使所述產物混合物經歷純化方法，以從產物混合物中分離成熟的變應原。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述酵母選自由畢赤氏酵母屬、糖酵母屬和假絲酵 母屬組成的組。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述酵母是巴斯德畢赤氏酵母。
4.如權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中所述載體選自質粒和噬菌體。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述載體是質粒。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述載體選自pGAPZα A、pPICZ α A、pPICZ α B、 pPICZα C、pPIC9K 和 pHIL-Sl。
7 如權利要求6所述的方法，其中所述載體是pGAPZα A。
8.如權利要求1-7中任意一項所述的方法，其中所述培養期為12小時-144小時，優選 24小時-120小時，更優選48小時-96小時。
9.如權利要求1-8中任意一項所述的方法，其中所述熟化期是8小時-30小時，優選 12小時-26小時，更優選14小時-24小時，更優選16小時-22小時和最優選17小時-21 小時。
10.如權利要求1-9中任意一項所述的方法，其中所述培養pH為5.8-7. 2，更優選 6. 0-7. 0，更優選 6. 2-6. 8。
11.如權利要求1-10中任意一項所述的方法，其中所述熟化pH是3.7-4. 8，更優選 3. 9-4. 6，并最優選 4. 0-4. 5。
12.如權利要求1-11中任意一項所述的方法，其中所述螨I類變應原選自Acasl、 Blotl、Derfl、Derpl、Eurml、Gydl、I^pdl 禾口 Tyrpl0
13.如權利要求12所述的方法，其中所述螨I類變應原選自Blotl、DerfUDerpl和 Eurml。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述螨I類變應原是Derpl。
全文摘要
本發明涉及一種生產成熟的重組螨I類變應原的方法，所述方法包括以下步驟a)提供宿主細胞形式的變應原表達系統，所述宿主細胞選自包含載體的酵母，所述載體含有編碼前變應原的cDNA，b)在5.5-7.5的培養pH下培養所述變應原表達系統一定的培養期以表達前變應原，從而獲得包含前變應原的培養混合物，c)將培養混合物的pH調節至3.5-5.0的熟化pH，d)將所述培養混合物在熟化pH下維持一定的熟化期以將所述前變應原轉變成成熟的變應原，從而獲得產物混合物，和e)使所述產物混合物經歷純化方法，以從產物混合物中分離成熟的變應原。
文檔編號C07K14/435GK101821286SQ200880110787
公開日2010年9月1日 申請日期2008年10月7日 優先權日2007年10月8日
發明者D·B·埃爾南德斯, R·I·孟薩爾維克萊門蒂 申請人:阿爾克-阿貝洛有限公司