具有與γ磷酸結合的電活性標記的核苷三磷酸的制作方法

專利名稱：具有與γ磷酸結合的電活性標記的核苷三磷酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種適用于監測與磷酸化相關的事件的新的電活性核苷三磷酸 (nucleotide tiphosphate)。
背景技術：
在細胞通信網絡中，許多酶和受體在“開(或上去，ση”)和“關(或下來， off” )之間轉換，或換句話說，是“磷酸化的”和“去磷酸化的”。在磷酸化期間，來 自ATP的磷酰基轉移至蛋白質特定的絲氨酸，蘇氨酸或酪氨酸殘基。由于這些修飾，蛋 白質的功能或定位可以變化，這在一些情況下可以導致腫瘤蛋白的形成、異常蛋白質磷酸化是許多疾病，包括癌癥、糖尿病和慢性炎性疾病的原因。量 化蛋白質激酶活性的分析方法對于理解其在這些疾病的診斷和療法中的作用是很關鍵 的。目前對于檢測蛋白質磷酸化的方法依賴于放射標記的ATP3、基于熒光的方法4、和 熒光共振能傳遞(FRET)5。近來，結合生物素的ATP分子被開發用于檢測磷酸化反應6。 然而，需要用電活性或光學標記對肽進行其它修飾，這增加了成本并導致了處理過程冗 長和耗時。因此，需要開發一種監測或檢測與磷酸化相關的事件的可替換方法，其能夠克 服當前檢測方法的至少一種缺點。

發明內容
現在已經開發了一種新的電活性核苷三磷酸，其適用于監測和/或檢測與磷酸 化相關的事件，包括磷酸化本身的可替換方法中。因此，本發明一方面，提供了含有電活性標記的Y磷酸基團的核苷三磷酸結合 物(conjugate)。本發明另一方面，提供了一種檢測激酶底物磷酸化的方法，包括(a)在電極表面固定底物；(b)在允許檢測磷酸化活性的條件下，用激酶和含電活性標記的Y磷酸的核苷 三磷酸結合物孵育固定的底物；(c)檢測底物的磷酸化。一方面，磷酸化通過電化學方法檢測。另一方面通過光譜法，包括質譜法檢測
磷酸化。本發明另一方面，提供了一種檢測樣品中感興趣的激酶的方法，包括(a)在電極表面上固定對感興趣的激酶特異的底物；(b)在允許檢測磷酸化活性的條件下，用樣品和含有電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸結合物孵育固定的底物；和(c)檢測底物的磷酸化，其中底物的磷酸化指示樣品中激酶的存在。本發明另一方面，提供了識別候選激酶底物的方法，包括(a)在電極表面上固定候選激酶底物；(b)在允許檢測磷酸化活性的條件下，用含激酶的電解液和含有電活性標記的 Y磷酸的核苷三磷酸結合物孵育固定的底物；和(c)檢測底物的磷酸化，其中候選底物的磷酸化指示所述候選物質是激酶的底 物。本發明另一方面，提供了一種篩選調節激酶活性的候選化合物的方法，包括(a)在電極表面上固定激酶底物；(b)在允許檢測磷酸化活性的條件下，用激酶、候選化合物和含有電活性標記的 Y磷酸的核苷三磷酸結合物孵育固定的底物；和(c)檢測底物的磷酸化水平，其中，在缺乏所述化合物時，磷酸化水平從一個磷 酸化水平實現變化指示所述化合物調節所述激酶的活性。本發明另一方面，提供了一種高通量篩選樣品中存在蛋白激酶的方法，包括(a)提供一種包含多個電極的微電極陣列；(b)將激酶底物固定于陣列中的每一電極上；(c)用感興趣的樣品和含有電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸孵育攜帶所述用 感興趣的樣品固定的底物的所述微電極陣列；和(d)檢測每一電極中底物的磷酸化水平，其中在多個電極中的一種或多種底物的 磷酸化指示在樣品中存在對一種或多種磷酸化底物特異的激酶。本發明另一方面，提供了一種診斷對象中與蛋白激酶的水平異常或缺乏相關的 疾病的方法，包括(a)將與疾病相關的激酶的底物固定于一個或多個電極上；(b)用來自對象的樣品和含電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸孵育攜帶固定底 物的一個或多個電極；(C)檢測每一陣列的電極中底物的磷酸化水平，其中相對于正常對照，在對象樣 品中的異常磷酸化水平或缺乏磷酸化指示所述對象患有或易于患上所述疾病。另一方面，提供了一種包含至少一種固定于電極表面的激酶底物的激酶生物傳 感器，其中所述電極表面浸沒于包含具有電活性標記Y磷酸的電活性核苷三磷酸的電解 液中。又一方面，提供了一種篩選激酶磷酸化的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含至少一種激酶底物、電極、含電活性標記的Y磷酸基團的核苷三磷酸結合物和一種激酶。這些方面的至少一些的一個或多個優點包括(i)適用于監測和/或檢測與磷酸 化相關的事件，包括磷酸化本身的新的電活性核苷三磷酸結合物，Gi)與其它監測和/或 檢測磷酸化的方法相比，新的電活性核苷三磷酸結合物可以以非常低的成本生產，(iii) 檢測或監測與磷酸化相關的事件，包括磷酸化本身的事件的方法并不需要用電活性或光 標記來修飾肽，和(iii)新的電活性核苷三磷酸結合物有助于、簡化和加速包括監測和檢測磷酸化事件包括磷酸化本身的步驟。具體而言，本發明的新的電活性核苷三磷酸結合物能夠用于發現新藥，分子診斷劑和分子靶向。本發明的這些和其它方面通過以下的詳細描述和接著的附圖會更加清楚，其 中


圖1是示出了電活性二茂鐵-ATP結合物合成的示意圖；圖2是示出了電化學檢測底物磷酸化的方法中金屬茂-ATP結合物用途的示意 圖；圖3示出了在圖2的方法中采用各種二茂鐵-ATP濃度(a d)獲得的循環伏安 圖；圖4示出了在圖2的方法中存在(a)和不存在(b)PKC下獲得的循環伏安圖；圖5示出了在圖2的方法中存在(a)和不存在(b)的PKC下獲得的方波伏安圖；圖6圖形示出了電流密度依賴于圖2的方法的反應時間的響應；圖7示出了微電極陣列；和圖8 (A-D)示出了微電極陣列的用法。圖9 (A)示出了在含有(a)過表達(over-expressed) CK2 α，(b)內源性 CK2 水
平，(C)過表達激酶-死CK2ci，(d)正常表達的CK2ci的細胞溶解產物中實施的CK2-催 化磷酸化反應的方波伏安圖。圖9 (B)是檢測Hela細胞溶解產物中CK2 α過表達狀態的圖表。圖10(A)是在不同CK2 α ‘濃度的(a)-(e)存在下和在酶不存在(f)下，底物肽 的CK2 α ‘-催化的磷酸化的循環伏安圖；圖10(B)說明(a)在分析緩沖液中，(b)在HeLa細胞溶解產物存在下和(c)在 對照實驗中采用底物肽修飾的電極時CK2 α ‘濃度對電流響應的影響。圖Il(A)說明在抑制劑，(1)在不同濃度(a) (e)的TBB(4，5，6，7-四 溴-2-氮雜苯并咪唑)存在下和在CK2ci不存在的對照(f)實驗中，底物肽CK2ci-催化 的磷酸化的抑制作用的循環伏安圖。圖11 (B)說明檢測CK2 α ‘-催化的磷酸化的動力學的雙倒數作圖 (Lineweaver-Burk plot)。圖11 (C)示出了圖11 (A)的對照實驗。圖12(A)示出了在 AbIl-T315I(a)_(d)存在下和 AbIl_T315I 不存在(e)下，用 信號轉導蛋白(STP)肽對酪氨酸激酶-催化的磷酸化的抑制作用的CV。圖12 (B)示出了固定STP肽的AW1-T315I-催化磷酸化的動力學測定的雙倒數作圖。圖12 (C)示出了在具有STP肽(a)、(b)的HeLa細胞溶解產物存在下和對照實 驗(C)，陽極電流依賴于AW1-T315I激酶的量的響應的圖。圖12 (D)示出了電流依賴于一般蛋白激酶抑制劑(b)和(C)和對照實驗(a)濃度 的響應的圖。圖13 (A)示出了在不同濃度(a)、(b)和(C)的HER2/ErbB2存在下，采用FLT3肽的酪氨酸激酶催化磷酸化的抑制作用的循環伏安圖。圖13 (B)示出了測定HER2/ErbB2_催化的磷酸化的動力學的雙倒數作圖。圖13(C)示出了底物肽在(a)存在下及(b)和(C)不存在下，陽極電流依賴于HER2/ErbB2激酶的量的響應的圖。圖13(D)示出了 J依賴于N-苯甲酰基星形孢菌素濃度的響應的圖。圖14示出了底物肽的激酶催化磷酸化的質譜(MS)圖。
具體實施例方式本發明提供了一種新的電活性核苷三磷酸結合物。該核苷三磷酸包含適用于檢 測激酶磷酸化活性的方法的電活性-標記Y磷酸。在一個實施方式中，所述方法包括將 激酶的至少一種底物固定于電極表面上，在允許檢測磷酸化活性和檢測底物磷酸化的條 件下，用電活性核苷三磷酸結合物在激酶存在下孵育固定的底物。一方面，磷酸化活性 通過電化學檢測。另一方面，磷酸化活性通過質譜法進行檢測。本文中所使用的術語“電活性”是指可轉運的Y磷酸(phosphate)含有在施加電 場時可檢測的標記。電活性標記的實例包括有機標記和有機金屬標記。一方面，電活性 標記包括金屬茂(metallocene)，包括取代的金屬茂或其能與含水環境相容的衍生物。例 如，金屬茂可以是二茂鐵，二茂鈷或其衍生物。也可以使用取代的金屬茂如鹵素-取代 的金屬茂，含有酰胺基取代環戊二烯的金屬茂或其它衍生物如柄型-金屬茂化合物，金 屬茂陽離子如二茂鐵離子[Fe (C5H5) 2]+，三層絡合物(具有三個Cp陰離子和兩個交替存 在的金屬陽離子)。另一方面，電活性標記包括喹啉、硝基雜環、NAD+、NADP+,含 氮芳香烴和雜環。術語“核苷三磷酸(nucleotide tiphosphate)”意思是指腺苷_5'-三磷酸(ATP)
及其核苷酸衍生物，例如，包括在6氨基位置的取代腺苷衍生物。例如，取代基可以包 括甲氧基、乙氧基，戊基，己基，芐基和取代的芐基，以及含有氨基氮的5-和6-元環結 構。在一個實施方式中，電活性核苷三磷酸可以是含有通過將金屬茂或其衍生物結 合于ATP而形成的金屬茂標記的Y磷酸的金屬茂-ATP結合物。金屬茂-ATP結合物可 以采用合成的方法形成，其中羧化金屬茂化合物經過處理而產生與反應形式的ATP結合 而生成所需結合物的Boc-保護或N-保護的結合物。金屬茂-ATP結合物的識別可以采 用已知的技術如NMR光譜或質譜確認以識別Y位置的磷酰胺鍵。電活性核苷三磷酸，如金屬茂-ATP結合物，可以用于檢測激酶催化的磷酸化 的方法中。在本發明的一個方面，該方法包括電化學分析，然而，其它方法，包括質譜 法都是可能的。結合物適用于檢測任何激酶的磷酸化活性，所述激酶包括絲氨酸/蘇氨 酸蛋白激酶如 PKC、KITR、PDFGR、CK2、CDK、CDK2、MKKU RAF> CHKU mTOR、ROCK、MLK 和 P38/SAPK2a，以及包括受體激酶如 EGRF、TRKA、TRKC> PDGFR- α 禾 Π PDGFR-β、VEGFRU VEGFR2、VEGFR3、ERBB2、ERBB3、ERBB4、 MET、RON、EPHB2和B4、RYK、DDRl、DDR2和ALK的酪氨酸激酶和非受體酪氨 酸激酶如 SRC、SYK、ABLU BRK、YESl 和 JAK1-3。基于靶激酶，合適的底物被選擇用于固定于工作電極表面。合適的工作電極表面包括金屬如金和鉬，半導體表面如摻雜硅或GaAs，和透明傳導表面，如石墨、玻璃碳和銦錫氧化物。電極表面，或工作電極可以采取在末梢改性的微米級金屬導線形式，或 每一工作電極是單個可尋址的芯片基電極陣列。電極表面用激酶肽底物涂層。在這方面，肽底物可以在其末端改性而包含將會 結合到電極表面的部分。改性的性質可以隨著電極表面的性質而變化。例如，底物可以 經過改性而包括末端半胱氨酸殘基而允許底物通過Au-S鍵接或Pt-S鍵接分別連接至金屬 電極表面，如金或Pt。對于ITO電極表面，包括羧化殘基的底物改性是合適的。對于含 硅的電極表面，可以利用氨烷基三乙氧基硅烷化學和肽偶聯方法。偶聯到碳表面(玻璃 碳和石墨)包括苯甲酸衍生物的重氮偶聯，接著激酶底物肽偶聯至表面的肽偶聯。激酶底物的實例包括但不限于AKTide-SA、AKTide_2T、Src底物II、CDKl底 物 II、Cdk5 底物、Crebtide、Crosstide> AbIl 信號轉導蛋白、HER2/ErbB2 FLT3 底物、 合成肽(Syntide) 2、Autocamtide-2、Autocamtide-3和CK2底物。激酶底物可以含有單 個或多個磷酸化位點。多個磷酸化位點可以是酪氨酸，絲氨酸或蘇氨酸的任何之一。在允許檢測磷酸化活性的條件下，底物涂覆的電極表面用電活性核苷三磷酸如 金屬茂-ATP結合物和底物激酶進行孵育，這種磷酸化活性的檢測方法如，例如，通過將 電極表面浸沒于電介質中并在反電極如鉬導線，和參比電極如Ag/AgCl或其它參比電極 體系如甘汞電極，NHE(普通氫電極)和SHE(標準氫電極)存在下進行電化學法測定。在圖2(A)中圖示了在孵育時發生的反應10的示意圖提供并圖示了激酶20將金 屬茂-核苷三磷酸結合物40的電活性γ磷酸50遞送至底物30。在孵育之后，帶有核苷 三磷酸40的電活性Y磷酸50的底物30的磷酸化采用合適的電化學技術如循環伏安法， 方波伏安法和電化學阻抗光譜測定伏安變化或采用其它合適的技術如質譜(參見圖14)進 行檢測60。本發明的方法提供了一種識別溶液如細胞溶解產物中存在激酶的方法，以及顯 示激酶活性的方法。磷酸化反應是化學計量的，因為伏安變化直接與通過電活性標記如 金屬茂轉移測定的磷酸化程度成比例。因此，磷酸化之后所得的電極表面電荷直接與金 屬茂基團的總表面濃度相關，由此提供了一種以快速和精確的模式測定和檢測磷酸化速 率的定量方法，并允許實時監測激酶的磷酸化反應曲線。反應也有利地是可逆的，由此 允許底物_修飾的電極的多次使用。另外，本發明的方法可以在候選激酶調節化合物，包括抑制劑化合物或激動劑 化合物存在下實施，提供了篩選這種有潛力作為與所給激酶相關的疾病有關的治療藥劑 的候選化合物的方法。這種篩選方法，如圖2(B)所示，包括以下步驟將所選激酶20 的底物30固定于電極表面70上，用電活性核苷三磷酸40如金屬茂-ATP結合物在激酶 20和候選化合物80(如，抑制劑)存在下孵育固定的底物30，和通過任何合適的檢測方 法60如電化學的或通過質譜法檢測底物30的磷酸化的水平。從在缺乏候選化合物時的 磷酸化水平產生的磷酸化水平變化指示候選化合物80調節了激酶的活性。另外，本發明的方法可以實施而識別新的蛋白激酶底物。這種方法包括以下步 驟將候選底物固定于電極表面上，用電活性核苷三磷酸如金屬茂-ATP結合物在激酶存 在下孵育固定的候選底物，和通過任何合適的檢測方法如電化學法檢測底物的磷酸化水 平。候選底物的磷酸化指示候選底物是激酶的底物。
在本發明的一個實施方式中，提供了一種微電極陣列。該陣列包括一系列電極，連接至不同肽底物，每一底物特異于不同蛋白激酶。陣列的制備，除了其包括隨底 物變化的多個電極之外，類似于單個肽底物電極，并可以含有每一底物的復制物而產生 統計意義上的結果。每一肽底物在C-或N-端之一進行修飾而包括適用于按先前的描述 將其連接至電極表面的連接劑。對于本技術領域內技術人員而言應該理解到通過這種電 極陣列靶向的激酶并沒有特殊限制，而因此電極陣列可以包含任何所選的肽底物。如所述的微電極陣列適用于激酶分析(kinase profiling)，包括一種或多種激酶的 磷酸化特性的檢測。在這方面，尤其適用于分析包括組分混合物的細胞溶解產物，而由 此適用于用作診斷工具通過對照標準例如由健康個體獲得的正常分布來識別細胞溶解產 物中的異常活性。陣列也適用于篩選激酶調節劑而測定其在單個篩選中對多種激酶/底 物相互作用的影響。異常蛋白磷酸化是較多疾病的原因，包括癌癥，糖尿病和慢性炎性疾病。例 如，蛋白激酶CK2、AbIl和HER2就經常在腫瘤或白血病細胞中過表達，而在鼠中呈現 出致瘤活性。量化蛋白激酶活性的分析方法對于理解其在診斷和治療這些疾病中的作用 是很關鍵的。因此，本發明的另一方面是診斷對象中與蛋白激酶水平異常或缺乏相關的 疾病的方法。這種方法包括以下步驟將與疾病相關的激酶底物固定于一個或多個電 極；用來自對象的樣品和含電活性標記Y磷酸的核苷三磷酸孵育攜帶固定底物的一個或 多個電極；和通過任何合適的檢測方法如電化學方法檢測一個或多個電極中底物的磷酸 化水平，其中相對于標準對照，對象樣品中磷酸化的水平異常或缺乏指示對象患有或易 患這種疾病。對象包括任何在其系統中含有蛋白激酶的生物，包括動物和植物。本發明的實施方式參照以下具體實施例進行描述，而不能理解為限制性的。實施例I-Fc-ATP的合成Boc-NH (CH2)6N(H) COFc (化合物 1)的制備將二茂鐵羧酸(230mg，lmmol) 溶解于20mL無水DCM中。然后，按順序加入1.2當量TEA (0.17mL)和1.2當量 HBTU(455mg)。30min后，將Boc_NH (CH2) 6NH2加入溶液中并繼續攪拌過夜。反應完 成后，真空下除去溶劑，而殘余物通過快速柱色譜法在硅膠上(DCM-MeOH，95 5 ； Rf = 0.25)純化而得到黃色固體狀所需化合物，產率78% (334mg)。1H-NMlU δ， DMSO) 7.74 (t，1H, J = 5.2Hz, NH-COFc)，6.78 (t，1H, J = 5.4Hz, NH-Boc)， 4.78 (s，2H, Cp)，4.32 (s，2H, Cp), 4.14 (s，5H, Cp), 3.15 (q，2H, J = 6.4Hz, CH2)，2.90 (q, 2H, J = 6.4Hz, CH2) , 1.23-1.52 (m，17H) .13C (1H)-NMR ( δ , DMSO) 168.57, 155.57, 77.27, 76.94, 69.73, 69.23, 68.06, 39.76, 38.54, 29.50，29.47，28.26，26.17，26.08。IR: Vmax = 3363 (NH)，3310 (NH)，2976 (Fe)， 2934 (Fe), 2861 (Fe)，1687 (CO-OtBu), 1623(酰胺-1)，1535(酰胺-2)。MS (EI+) m/ ζ C22H32FeN2O3 計算值:428.2 ；實驗值(M+) 428.1。NH2 (CH2) 6N (H) COFc (化合物 2)的制備將 TFA (5 當量)加入 IOmL DCM 的 Boc-保護的二茂鐵基胺(334mg，lmmol)的混合物中。將混合物攪拌Ih之后，真空下 除去溶劑。加入三部分DCM并蒸發除去過量的TFA。將殘余物溶解于IOmLDCM中并 加入0.25mLTEA將TFA鹽完全轉化成游離胺。除去溶劑后，混合物(含有TEAH+鹽)無需進一步純化直接用于下一步驟。為了表征，將混合物溶解于20mL的DCM(含5% TEA)并用鹽水和水萃取。除去溶劑后，殘余物在高真空下干燥而獲得黃色固體。產 率 90% (295mg)。1H-NMR( δ , DMSO"d6) 7.74 (t, 1H, J = 5.3Hz, NH-COFc)， 4.78 (s，2H, Cp)，4.32 (s，2H, Cp), 4.14 (s，5H, Cp), 3.15 (q，2H, J = 6.4Hz, CH2)，2.52 (s，2H, CH2) , 1.49 (t，1H, J = 6.6Hz, CH2) , 1.27-1.39 (m，6H, CH2) .13C (1H)-NMR ( δ , DMSO) 168.56，76.95，69.70，69.21，68.05，41.53，38.58， 33.23，29.51，26.41，26.24.IR vmax = 3293.68 (NH2)，2962.94 (Fe)，2928.63 (Fe)， 2854.23 (Fe)，1624.45 (酰胺-1)，1541.51 (酰胺-2)。MS (EI) m/z C17H24FeN2O 計算 值328.1 ；實驗值(M+) 328.1。Y-磷酸Fc_ATP(化合物3)的制備將腺苷5'-三磷酸二鈉鹽(lOOmg， 0.18mmol)溶解于IOmL 0.1M TEAB緩沖液(pH = 7.5)中并上載到陽離子交換樹脂(AG 50W-X8)填充的柱子上，該柱子用0.1M TEAB緩沖液預平衡。收集所需餾分(用UV光 監測)并在真空下蒸發。將殘余物用IOmL干甲醇共蒸餾3次并在氬氣下溶解于1.8mL的 干DMF中。加入DCC (123mg)并在Ar氣中在室溫下攪拌混合物3h而形成腺苷-5'-三 偏磷酸酯(ATMP)。將ATMP溶液在Ar下被加入到在IOmL MeOH和0.25mL TEA中 的化合物2(295mg，5當量)的混合物中。將混合物攪拌30min，并傾倒于20mLH20 中。將溶液上載到DEAE-纖維素柱上并用蒸餾H2O沖洗而除去過量的二茂鐵-胺。隨 后，實施線性梯度的TEAB緩沖液(0.1-1M)(洗脫)而得到所需餾分(黃帶)，將其凍 干成淡黃色粉末。Fc-ATP(TEAH+鹽)產率50%，而進一步將TEAH交換成Na形式 以供 NMR 光譜分析。31P (1H)-NMR ( δ , D2O) -0.07 ( y )d, J = 21.IHz ； -10.76(a) d, J = 19.9Hz ； -22.14(β )t, J= 19.9Hz.1H"NMR( δ , D2O) 8.52 (s, 1Η, Η_8)， 8.19 (s，1Η, Η-2), 6.10 (d，1Η, J= 5.5Hz, H-I' )，4.73 (s，2Η, Cp), 4.74 (s，1H, H-2' )，4.53 (s，1H, H_3' )，4.46 (s，2H, Cp), 4.37 (s，1H, H_4' )，4.23 (m， 2H, H-5 ' )，4.20 (s，5H, Cp), 3.16 (t，2H, J = 6.5Hz, CH2), 2.79 (q，2H, J = 7.8Hz, CH2), 1.31-1.45 (m, 4H, CH2), 1.11-1.25 (m, 4H, CH2)。 [H4 ‘ Μ] (ESI+) m/ ζ C27H39FeN7O13P3 計算值818.1 ；實驗值818.2。在圖1中提供了 Fc-ATP結合物合成的示意圖。試劑所有合成反應除非另外指出都在Ar氣下實施。二乙基氨基乙基 (DEAE)-纖維素，腺苷-5' _三磷酸(ATP) 二鈉鹽獲自Sigma并按照所收到的那樣進行 使用。Dowex AG 50 W-X8 獲自 Bio-RadLaboratories (Ontario，Canada)。N，N' -二 環己基碳二亞胺(DCC)，0-(1Η-苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N' _四甲基脲六氟 磷酸鹽(HBTU)獲自AdvancedChemTech(KY，USA)。二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲 烷(DCM)在使用之前用CaH2蒸餾。甲醇在碘存在下調節的鎂中蒸餾。二茂鐵羧酸7和 6-氨基己基氨基甲酸叔丁基酯8根據文獻方法進行制備。實施例2-蛋白激酶C磷酸化的電化學檢測循環伏安法(CV)采用CHInstruments 660系統(Austin，TX)進行實施。具有絲 網印刷的金電極(SPEs)的 DEP-芯片由 BioDeviceTechnology Ltd. (Ishikawa，Japan)友好 捐贈并按照 文獻Li et al.Anal.Chem.2005，77，5766-5769的描述進行制備。SPE的總長 為11mm，而工作電極的幾何面積為2.64mm2。參比電極為Ag/AgCl漿料電極(Ag/AgClpast electrode),而反電極是碳電極。1H, 13C, 31P NMR實驗在BrukerAvance 500MHz光譜儀上進行實施，而化學位移對照殘余DMSO (對于1H為2.50ppm而對于13C為39.52ppm)和H2O (4.79ppm)。質譜 采用Perkin Elmer-Sciex API365儀器進行實施。除非另外指出，試劑都購自Merek。所有的溶液采用MilKporeMilli Q系統的超 純水(18.3ΜΩ-αη)制備和稀釋。1.采用Fc-ATP的蛋白激酶C-催化的磷酸化反應在整個制備步驟中SPE在室溫下在陪替氏培養皿中孵育以避免溶液在表面上快 速蒸發。除了另外聲明之外，電化學測定對于每一條件實施3次(η = 3)。2.在SPE上蛋白激酶C底物肽的固定使得200 μ M底物蛋白激酶C ζ肽溶液(5 μ L)的等分試樣涂覆到SPE的金工作 電極并在4°C下孵育過夜。蛋白激酶C ζ肽(SIYRRGSRRWRKL)購自Calbiochem(EMD Biosciences, USA)并在N_端用半胱氨酸殘基修飾。修飾的蛋白激酶C ζ偽底物序列含 有 Serl 19，代替了 Alal 199。在孵育步驟之后，電極用空白TBS沖洗。將肽膜通過浸沒于SPE的0.ImM己 硫醇的乙醇溶液中5min而稀釋，并用空白TBS沖洗表面。3.SPE表面的PKC-催化磷酸化激酶分析緩沖液包含20mM Tris、0.5mM EDTA> 10mMMgCl2> 500yg/mL 磷脂 酰基絲氨酸(pH 7.5)。Fc-ATP和激酶、PKC的濃度根據最佳實驗條件變化。來自鼠腦的 蛋白激酶 C(E.C.2.7.1.37)購自 Sigma，在包含 20mMTris、0.5mM EDTA、0.5mMEGTA、 5mM DTT> IOOmM NaCL 0.02 % 吐溫(Tween) 20 和 1 μ g/mL 亮抑酶肽的 50%甘油中。 一個單位(U)的PKC每分鐘在30°C下將從ATP中轉移Ihmol磷酸至組蛋白Hl中1(1’ “。 等分試樣(200 μ L)的最佳分析緩沖液包含100U/mL PKC和100 μ M Fc-ΑΤΡ,加入到 1.5mL藥水瓶中。將固定底物肽的SPE置于藥水瓶中，該藥水瓶在30°C下的加熱塊(VWR Scientific, USA)中孵育lh。在Ih的孵育后，將SPE用空白TBS沖洗并除去過量的 Fc-ATP和其它試劑，并隨后置于電化學工作站中。4.SPCE表面上的電化學測定通過在室溫下將20 μ L 0.1Μ的NaClO4(pH 6.5)涂到SPE的表面上而實施電化 學檢測。以lOOmV/s的掃描速率實施循環伏安法(CV)。方波伏安法(SWV)涉及通過 15Hz頻率下25mV的振幅掃過O IV的電壓而氧化Fc殘基。在圖2(A)中示出了采用Fc-ATP作為共-底物檢測激酶催化的磷酸化的電化學 原理的示意圖。底物肽30經由硫鍵固定于SPE70的表面上。蛋白激酶20C(PKC)_催 化的反應將Y -磷酸-Fc基團50轉移至肽30的絲氨酸35殘基上。連接于肽30的Fc基 團50采用CV進行電化學觀察。Fc的伏安檢測包括0 IV的范圍內的電壓以lOOmV/s 的速率掃描。由于采用這種電化學方法，Fc-ATP的可逆氧化還原性質就得以監測。圖 3 示出了由 Fc-ATP 在溶液中以(a) 100 μ M (b) 50 μ M (c) 25 μ M 禾口(d) 10 μ M Fc-ATP 的溶 液存在下，從CV獲得的伏安響應。氧化峰在 0.26V進行檢測而還原峰在 0.22ν檢測(相對于SPE的以Ag漿料為基礎的參比電極)。氧化還原峰電壓的分離表明在該過程中涉及到了一個電子。這種 電化學行為可從Fc明確的電化學性質預期到。為了實驗條件的優化，一系列測定在改變Fc-ATP濃度和100U/mL PKC存在下
采用相同的分析條件進行實施。隨著Fc-ATP濃度的增加，肽的磷酸化導致在表面上產生 高電流響應。電流響應對于超過100 μ M的濃度保持恒定。因此將100 μ M Fc-ATP應 用于進一步的激酶分析。當分析緩沖液中不使用ATP-F時，沒有獲得顯著的電流響應， 這指示通過按照所述嚴格沖洗SPE在電極表面上非特異性吸收Fc-ATP的抑制作用。當 采用低濃度Fc-ATP時，沒有觀察到電流響應。采用表面固定的肽，記錄在如圖4所示的分析溶液中存在和不存在PKC時的電 流密度響應。在圖4-a中所示的CV響應顯示了如溶液中所觀察到的Fc-ATP相似的氧化 還原行為，然而，峰電壓微微漂移至更高值，指示表面上肽膜的存在，這妨礙了氧化還 原過程在低電壓下發生。在圖4-b中任何氧化還原電流信號的缺乏指示Fc-ATP連接至肽 依賴于激酶的存在。而且，在缺乏PKC時沒有氧化還原活性表明電極表面上Fc-ATP非 特異性吸收的成功抑制作用。將SWV也應用于檢測如圖5中所示的PKC低濃度下的Fc氧化電流信號。底物 肽和Fc-ATP濃度分別在200 μ M和100 μ M下保持恒定。圖5_a顯示在0.1U/mL PKC 存在下獲得的電流響應，而同時圖5-b顯示在0.01U/mL PKC存在下獲得電流響應。記 錄了電流密度響應隨著PKC濃度增加而增加的趨勢(圖5)。為了優化Fc-ATP響應而監測孵育時間的依賴性。底物肽、PKC和Fc-ATP的 濃度分別在200 μ Μ, 100U/mL和100 μ M下保持恒定，如圖6所示記錄了電流依賴于在 30°C下的孵育時間的響應。當將分析溶液孵育Ih后，峰電流高度達到飽和水平。當使 得激酶反應僅僅進行20min時，觀察到小電流響應，表明表面_固定的底物肽在100 μ M Fc-ATP存在下并未發生有效的磷酸化(圖6)。實施例3-酪蛋白激酶2 (CK2)和酪氨酸激酶AbIl和HER2/ErbB2磷酸化的檢測先前已經證實，采用含有電活性標記的、磷酸基團的核苷三磷酸結合物適用于 采用電化學生物傳感系統檢測蛋白激酶C活性。在該實施例中，核苷三磷酸結合物的效 用是用于檢測另一充分描述的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪蛋白激酶_2(CK2)和兩個臨 床重要的酪氨酸激酶、AbIl和HER2/ErbB2，而用以評價這種用于測定蛋白激酶抑制劑 效能的方法。首先對于絲氨酸/蘇氨酸激酶的激酶特異性肽RRRDDDSDDD12的酶修飾，采用 Fc-ATP作為共底物的質譜分析對CK2進行評價。圖14 示出 了對于(A) CK2，(B)AbIl_T315I 和(C)HER2/ErbB2 采用應用生物系 統 4700 蛋白酶分析儀(Applied Biosystems 4700Proteomics Analyzer)用 DHB (2，5- 二氫 苯甲酸)基質(lOmg/niL)和1 1具有樣品的混合物檢測底物肽激酶催化磷酸化的MS 圖。含有磷酸化的肽的樣品采用標準磷酸化肽分離試劑盒(ThermoScientific Pierce)的方
案進行富集和純化。我們的結果(圖14A)清楚地表明，CK2將所需的氧化還原基團轉移至靶肽 (m/zCK2靶肽之前1264.4359，Fc轉移之后1654.1647)。其它反應采用底物肽對于 Abll-T315I和HER2/ErbB2進行實施，清楚地表明我們的方法對于酪氨酸激酶也有效(圖14B&C)。1.物料和方法i.在SPE上的底物肽的固定將底物肽在金微電極表面上采用硫辛酸的琥珀酰亞胺_酯進行共價固定，包括 以下步驟用5mM NHS-硫辛酸酯在乙醇中孵育裸金微電極15h ； (b)用底物肽在2mM N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺(EDC)在0.1M 2-(N_嗎啉基)乙磺酸 (MES, pH 6)中的溶液存在下孵育N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)-硫辛酸-改性的表面2h， (c)用巰基聚乙二醇5' 000單甲基醚(PEG-硫醇5' 000)在乙醇中的溶液(1 IOOv/ ν)中孵育肽修飾電極lOmin。ii.CK2-催化的磷酸化CK2 α 和 CK2 α ’ 激酶分析緩沖液包含 50mM Tris HCl (pH 7.5)、IOmM MgCl2> 150mM NaCL ATP-Fc 濃度為 100 μ M ATP-Fc,總反應體積為 25 μ L。CK2 的 CK2 α 和 CK2 α ‘形式和肽底物(RRRDDDSDDD)在 D.W.Litchfield' s 實驗室(University of WesternOntario, London, Canada)中制備。將底物肽修飾電極在37°C下孵育2h。在孵育 時間之后，電極采用2M NaClO4多次沖洗。在沖洗過程之后，將電極浸沒于2M NaClO4 中采用Ag/AgCl參比電極進行電化學測定，這經由鹽橋用電解質連接，并用Pt導線作為 反電極。iii.Abll-T315I-催化的磷酸化Abll-T315I-激酶分析緩沖液包括 60mM HEPES (pH 7.5)、5mMMgCl2、5mM MnCl2> 3 μ MNa3V04、400 μ M ATP>肽底物(STP)和激酶，總反應體積為25 μ L。純化 的重組人體Abll-T315I-突變激酶和其底物肽信號轉導蛋白(STP，EGIYDVP)購自Cell SignallingTechnology(MA, USA)。將底物肽修飾電極在37°C下孵育2h。在按照CK2 相同的沖洗過程之后，CV測定采用如上述相同的參數進行記錄。iv.HER/ErbB2催化的磷酸化 HER2/ErbB2激酶的活性采用以下條件進行測定5mM MOPS (pH 7.2)、2.5mM β -甘油磷酸酯、5mM MnCl2> 100 μ M Fc-ATP在FLT3肽底物和IOng/ μ L激酶存在下， 總反應體積為25 μ L。純化的重組人體HER2/ErbB2激酶和FLT3 (DNEYFYV)底物肽購 自CellSignalling Technology (MA，USA)。將底物肽改性的電極在37°C下孵育2h。在按 照以上描述的對于CK2相同的沖洗程序后，采用相同的參數記錄CV測定結果。v.細胞溶解產物的預處理對于含有細胞溶解產物的反應，20X106HeLa細胞獲自D.W.Litchfield' s實驗 室(University of Western Ontario, London, Canada),通過方 轉 IOmin 而溶角軍于 ImL 含 有 ImM 苯基甲磺酰氟(PMSF，Pierce, USA)的溶胞緩沖液(50mM Tris (pH 8)，150mM NaCl, 10%甘油，0.5% Triton X-100 )中。在磷酸化反應期間，Halt 磷酸酶抑制劑混 合液(Pierce，USA)按照與細胞溶解產物1 1比率(ν/ν)應用于抑制絲氨酸、蘇氨酸和 酪氨酸磷酸酶活性。細胞碎片在12,OOOrmp下收集并在4°C下儲存上清液直至在隨后的反 應中使用。對于含有HeLa細胞溶解產物的反應，細胞溶解產物溶液與激酶反應緩沖液按 照1 10 (V/V)的比率混合，而如上描述應用于磷酸化反應或去磷酸化反應。vi.采用電化學數據計算酶活性
CV測定的電化學數據作為每次測試的電荷密度⑴獲得。激酶活性測定的 Fc-ATP 濃度，對于 CK2 為 100 μ Μ,而對于 Abll_T315I 和 HER2_ErbB2 為 200 μ Μ。本 文中，計算步驟的詳細描述，將給出對于CK2-催化的磷酸化。反應體積為25 μ L，每次 測試產生2.5nmolFc_ATP。然后，Fc-ATP的特異性電-活性(SE) (J/nmole Fc-ΑΤΡ)按
照如下進行計算。
權利要求
1.一種核苷三磷酸結合物，含有電活性標記的Y磷酸基團。
2.根據權利要求1所述的核苷酸，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團選自包 括有機標記的Y磷酸基團和有機金屬標記的Y磷酸基團的組。
3.根據權利要求1所述的核苷酸，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團是金屬 茂，包括取代的金屬茂。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述金屬茂選自由二茂鐵、二茂鈷及其任 意衍生物組成的組。
5.根據權利要求1所述的核苷酸，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團選自由 醌和硝基雜環組成的組。
6.根據權利要求1至5所述的核苷酸，其特征在于所述核苷三磷酸包括腺苷-5'-三 磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物。
7.根據權利要求6所述的核苷酸，其特征在于所述核苷酸衍生物包括取代的腺苷衍生物。
8.針對權利要求1至7所述的核苷酸的抗體。
9.根據權利要求8所述的抗體，其特征在于所述抗體被標記。
10.一種檢測底物磷酸化的方法，其特征在于所述方法包括(a)在電極表面固定所述底物；(b)用含激酶的電解液和含電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸結合物孵育固定的所 述底物；(c)檢測所述底物的磷酸化。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述底物包含單個或多個磷酸化位點。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于在所述底物中的所述磷酸化位點包括酪 氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基。
13.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述激酶包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 和酪氨酸激酶。
14.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述底物是候選激酶底物，其中所述候 選底物的磷酸化指示所述候選物是所述激酶的底物。
15.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團選自包 括有機和有機金屬標記的Y磷酸基團的組。
16.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團是金屬 茂，包括取代的金屬茂。
17.根據權利要求16所述的方法，其特征在于所述金屬茂選自由二茂鐵、二茂鈷及其 任意衍生物組成的組。
18.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團選自由 醌和硝基雜環組成的組。
19.根據權利要求10至18所述的方法，其特征在于所述核苷三磷酸包括腺 苷-5' _三磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物。
20.根據權利要求19所述的方法，其特征在于所述核苷酸衍生物包括取代的腺苷衍生物。
21.根據權利要求10至20所述的方法，其特征在于所述電極選自由絲網印刷金電 極、金微電極、金微電極陣列芯片、碳電極和ITO電極組成的組。
22.根據權利要求10至21所述的方法，其特征在于所述磷酸化通過電化學進行檢測。
23.根據權利要求10至21所述的方法，其特征在于所述磷酸化通過質譜檢測。
24.一種檢測樣品中感興趣的激酶的方法，其特征在于所述方法包括(a)在電極表面上固定所述感興趣的激酶的特異性底物；(b)用所述樣品和含有電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸結合物孵育固定的所述底 物；以及(c)檢測所述底物的磷酸化，其中所述底物的磷酸化指示所述樣品中存在所述激酶。
25.根據權利要求24所述的方法，其特征在于所述底物包括單個或多個磷酸化位點。
26.根據權利要求25所述的方法，其特征在于在所述底物中的所述磷酸化位點包括酪 氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基。
27.根據權利要求24所述的方法，其特征在于所述感興趣的激酶包括絲氨酸/蘇氨酸 蛋白激酶或酪氨酸激酶。
28.根據權利要求24至27所述的方法，其特征在于所述樣品是選自由細胞培養物、 細胞溶解產物、提取物、體液和純化的蛋白質溶液組成的組中的一種流體。
29.根據權利要求24至28所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團選 自包括有機和有機金屬標記的Y磷酸基團的組。
30.根據權利要求24至28所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團是 金屬茂，包括取代的金屬茂。
31.根據權利要求30所述的方法，其特征在于所述金屬茂選自由二茂鐵、二茂鈷及其 任意衍生物組成的組。
32.根據權利要求24至28所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團是 有機標記的Y磷酸基團，其中所述有機標記的基團選自由醌和硝基雜環組成的組。
33.根據權利要求24至32所述的方法，其特征在于所述核苷三磷酸包括腺 苷-5' _三磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物。
34.根據權利要求33所述的方法，其特征在于所述核苷酸衍生物包括取代的腺苷衍生物。
35.根據權利要求24至34所述的方法，其特征在于所述電極選自由絲網印刷金電 極、金微電極、金微電極陣列芯片、碳電極和ITO電極組成的組。
36.根據權利要求24所述的方法，其特征在于所述方法包括檢測所述樣品中所述激酶 的濃度。
37.根據權利要求24至36所述的方法，其特征在于所述磷酸化進行電化學檢測。
38.根據權利要求24至36所述的方法，其特征在于所述磷酸化通過質譜法進行檢測。
39.一種篩選調節激酶活性的候選化合物的方法，其特征在于所述方法包括 (a)將激酶的底物固定在電極表面上；(b)用含激酶的電解液、所述候選化合物和含電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸孵 育固定的所述底物；和(c)檢測所述底物的磷酸化水平，其中在缺乏所述化合物時磷酸化水平從一個磷酸化 水平產生的變化指示所述化合物調節所述激酶的活性。
40.根據權利要求39所述的方法，其特征在于所述候選化合物包括激酶活性的抑制劑。
41.根據權利要求39所述的方法，其特征在于所述候選化合物包括激酶活性的激動劑。
42.根據權利要求39所述的方法，其特征在于所述底物包括單個或多個磷酸化位點。
43.根據權利要求42所述的方法，其特征在于在所述底物中的所述磷酸化位點包括酪 氨酸，絲氨酸或蘇氨酸殘基。
44.根據權利要求39所述的方法，其特征在于所述激酶包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 或酪氨酸激酶。
45.根據權利要求39至44所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團選 自包括有機和有機金屬標記的Y磷酸基團的組。
46.根據權利要求39至44所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團是 金屬茂，包括取代的金屬茂。
47.根據權利要求46所述的方法，其特征在于所述金屬茂選自由二茂鐵、二茂鈷及其 任意衍生物組成的組。
48.根據權利要求39至44所述的方法，其特征在于所述電活性標記的Y磷酸基團是 有機標記的Y磷酸基團，其中所述有機標記的基團選自由醌和硝基雜環組成的組。
49.根據權利要求39至48所述的方法，其特征在于所述核苷三磷酸包括腺 苷-5' _三磷酸(ATP)及其核苷酸衍生物。
50.根據權利要求49所述的方法，其特征在于所述核苷酸衍生物包括取代的腺苷衍生物。
51.根據權利要求39至50所述的方法，其特征在于所述電極選自由絲網印刷金電 極，金微電極，金微電極陣列芯片，碳電極和ITO電極組成的組。
52.根據權利要求39至51所述的方法，其特征在于所述磷酸化通過電化學進行檢測。
53.根據權利要求39至51所述的方法，其特征在于所述磷酸化通過質譜法進行檢測。
54.一種高通量篩選樣品中存在蛋白激酶的方法，其特征在于所述方法包括(a)提供一種包含多個電極的微電極陣列；(b)將激酶底物固定于所述陣列中的每個電極上；(c)用感興趣的所述樣品和含有電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸孵育攜帶固定的 所述底物的所述微電極陣列；和(d)檢測每個電極中所述底物的磷酸化水平，其中在所述多個電極中的一種或多種底 物的磷酸化指示在所述樣品中存在特異于所述一種或多種磷酸化底物的所述激酶。
55.根據權利要求54所述的方法，其特征在于所述激酶的底物是一種特異性蛋白激酶的所述底物。
56.根據權利要求54所述的方法，其特征在于所述激酶的底物包括不同蛋白激酶的底 物，其中特定底物磷酸化的缺乏指示針對所述特定底物的所述蛋白激酶的缺乏。
57.根據權利要求54所述的方法，其特征在于所述樣品是選自由細胞培養基、細胞溶 解產物、提取物、體液、和純化的蛋白溶液組成的組中的一種流體。
58.根據權利要求54所述的方法，其特征在于所述方法包括測定所述樣品中所述蛋白 激酶的所述濃度。
59.一種診斷對象中與蛋白激酶水平異常或缺乏相關的疾病的方法，其特征在于所述 方法包括(a)將與所述疾病相關的所述激酶的底物固定在一個或多個電極上；(b)用來自所述對象的樣品和含電活性標記的Y磷酸的核苷三磷酸孵育攜帶固定的 所述底物的所述一個或多個電極；(c)檢測每個陣列的所述電極中所述底物的磷酸化水平，其中在對象樣品中相對于正 常對照的磷酸化水平異常或缺乏指示所述對象患有或易患所述疾病。
60.根據權利要求59所述的方法，其特征在于所述對象包括植物或動物。
61.根據權利要求59所述的方法，其特征在于所述對象是哺乳動物。
62.根據權利要求54和59所述的方法，其特征在于所述磷酸化通過電化學進行檢測。
63.根據權利要求54和59所述的方法，其特征在于所述磷酸化通過質譜法進行檢測。
64.一種激酶生物傳感器，其特征在于所述生物傳感器包括至少一種固定于電極表面 的激酶底物，其中所述電極表面浸沒在包含具有電活性標記的Y磷酸的電活性核苷三磷 酸的電解液中。
65.一種用于篩選激酶磷酸化的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含至少一種激酶底 物、電極、含有權利要求1至7中任一項所述的電活性標記的γ磷酸基團的所述核苷三 磷酸結合物和一種激酶。
66.根據權利要求65所述的試劑盒，其特征在于所述激酶底物固定于所述電極上。
67.根據權利要求65所述的試劑盒，進一步包括一種或多種用于重構、稀釋或溶解所 述底物、所述激酶和/或所述電活性核苷三磷酸的緩沖液。
68.根據權利要求65所述的試劑盒，進一步包括一種能夠終止所述激酶與所述底物的 反應的試劑。
全文摘要
核苷三磷酸(NTP)參與磷酸化反應，其中磷酸基團通過激酶從NTP轉移到底物上。在激酶反應中提供的NTP的γ磷酸結合于電活性標記，導致該γ磷酸-電活性標記結合物從NTP轉移到底物。電活性標記是一種有機部分，如醌或硝基雜環，或者是一種金屬茂，如二茂鐵或二茂鈷。一旦γ磷酸-電活性標記結合物通過激酶轉移到電極結合的底物，磷酸化的發生就通過循環伏安法進行電化學檢測。磷酸化也能夠通過對攜帶了結合電活性標記的γ磷酸的底物進行質譜分析來檢測。含有γ磷酸-電活性標記結合物的NTP適用于檢測樣品中激酶存在的方法，篩選調節激酶活性的候選化合物的方法，以及適用于診斷與激酶相關的疾病的方法。
文檔編號C07H19/20GK102016064SQ200880109467
公開日2011年4月13日 申請日期2008年9月26日 優先權日2007年9月27日
發明者卡甘·克爾曼, 宋海峰, 海因茨-伯恩哈德·克拉茨 申請人:卡甘·克爾曼, 宋海峰, 海因茨-伯恩哈德·克拉茨