來自玉米的次生壁形成基因及其用途的制作方法

專利名稱：：來自玉米的次生壁形成基因及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明--般地涉及分子生物學領域。
背景技術：
：在過去的100年中在玉米中，收獲指數(谷物與地上總生物量的比例)己經保持恒定在大約50%(Sinclair,(1998)"Historicalchangesinharvestindexandcropnitrogenaccumulation";CropScience38:638-643);(TollenaarandWu.(1999)"Yieldimprovementintemperatemaizeisattributabletogreaterstresstolerance";CropScience39:1597-1604)。因此，在過去50-60年中谷物產量的四倍化是由于每單位土地面積總生物量生產的增加，其由增加的種植密度來完成(DuvickandCassman，(1999)"Post-greenrevolutiontrendsinyieldpotentialoftemperatemaizeinthenorth-centralUnitedStates";CropScience39:1622-1630)。在漸增的種植密度下選擇更高谷物產量導致了植物結構的顯著構造變化(architecturalchange),即相對直立和窄的葉子以最小化遮蔽。更密集的種植的不期望的結果是增加了莖倒伏的頻率。種植密度和生物量生產之間關系顯著地偏離線性關系，因為對于每單位土地面積的最大生物量產量獲得最佳密度。這反映在個體植物生物量的成比例的更高下降中，其顯示為更弱的莖并因此增加的倒伏的形式。單位長度的玉米莖中的纖維素已被發現是機械強度的最佳指示物(Appenzeller，etal.，(2004)"Cellulosesynthesisinmaize-isolationandexpressionanalysisofthecellulosesynthase(CesA)genefamily";Cellulose11:287-299;Ching，etal.，(2006)"Brittlestalk2encodes鄰utativeglycosylphosphatidylinositol-anchoredproteinthataffectsmechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycellwalls，，；Planta224:1174-1184)。纖維素構成了成熟的莖千物質的大約50%(Dhugga，未出版)。盡管在種質中玉米莖壁中纖維素濃度可發生相當大的改變，而對于木質素其基本上是不變的(Dhugga，未出版)。這暗示了纖維素濃度的改變是以其它細胞壁成分例如半纖維素和可溶成分為代價的。在干物質中增加的纖維素濃度應該允許改善收獲指數，而不會不利地影響莖機械強度。因此最優選的改善莖強度的手段是通過增加的纖維素濃度和次生壁成分。本發明涉及涉及細胞壁形成，特別是次生壁形成(SCW)的一組玉米基因。纖維素可占例如玉米的植物的次生細胞壁的最多6()%。作為本發明主題的基因被揭示是與次生壁形成有關的，這是基于它們的表達模式與先前己經顯示涉及次生細胞壁形成的ZmCesA10，ZmCesAll，ZmCesA12，ZmCesA13，禾RBk2基因(Appenzeller，etal.，(2004)"Cellulosesynthesisinmaize-isolationandexpressionanalysisofthecellulosesynthase(CesA)genefamily";Cel丄ulose11:287—299;Ching，etal.，(2006)"Brittlestalk2encodesaputetiveglycosylphosphatidylinositol-anchoredproteinthataffectsmechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycellwalls，，？Planta224:1丄74—1丄84^Dhugga，5未出版)的表達模式的強相關性。本發明中的許多這些基因除了這些專有分析之外沒有已知與細胞壁形成相關。這些基因可被用于在幾個領域增強作物植物性能和價值l)植物站立性(standability)，收獲指數，和產量潛力；2)作為用于乙醇或用于其它可再生生物產品的原料的植物干物質；和3)青貯飼料。除了它作為組織強度(一種在構造中令人非常興趣的性狀)的主要決定因子的作用之外，纖維素構成了地球上最過剩的可再生能量資源。每年僅僅在美國從玉米中就生產大約2.75億公噸的秸稈。大約三分之二的秸稈可潛在地被用于乙醇，丁醇和來自一些玉米生長區域的其它燃料或生物產品(Graham,etal.，(2007)"CurrentandpotentialU.S.cornstoversupplies";AgronomyJournal99:1-11)。世界范圍內來自谷物秸稈和稻草的木質纖維素廢料的生產預期是每年30億噸(KuhadandSingh(1993)"Lignocellulosebiotechnology:Currentandfutur印rospects，，；Critic.Rev.Biotechnol.13:151-172)。次生壁占了地球植物的植物生物量的大部分，并且因此是用于處理以改善用于能量生產的生物量的數量和質量的適當的靶標。為了改善的青貯飼料質量而改變次生壁可通過改變木質素濃度而完成。木質素的類型和數量都長久已知會影響青貯飼料可消化性。木質素也是用于乙醇生產的細胞壁多糖消化中的障礙。我們的列表中的幾種基因擴大了我們可以用于改變用于改善的青貯飼料質量的細胞壁組成的候選物數量。本發明提供了至少三個領域的農業問題的解決途徑1)植物站立性，收獲指數，和產量潛能；2)作為用于乙醇或用于其它可再生生物產品的原料的植物干物質；和3)青貯飼料可消化性。發明簡述本發明提供了控制植物生長和次生細胞壁形成以增加產量的組成和方法。該組成包括來自玉米的SCW序列。本發明組成包括選自SEQIDN0:1-456及其變體和片段的氨基酸序列和核苷酸序列。在相關植物中表達的DNA構建體中提供編碼SCW序列的多核苷酸。進一步提供了包含本發明序列的表達盒、植物、植物細胞、植物部分和種子。在具體的實施方案中，該多核苷酸與組成性啟動子可操作地相連。本文提供了在植物或植物部分中調節SCW序列水平的方法。該方法包括向植物或植物部分導入包含本發明SCW序列的異源多核苷酸。SCW多肽的水平可被增加或降低。這類方法可用于增加植物的產量，在一個實施方案中，該方法被用于增加谷類的谷粒產量。附圖簡述圖1:玉米莖外皮和內部組織對不同莖特征和機械強度的相對貢獻。圖2:在玉米雜種的干物質中的纖維素濃度。從來源于三塊田地復本的每塊的兩株植物收集數據。纖維素在獲自成熟的穗下的第三節間的粉末化千物質上通過Updegraff方法(Updegraff(1969)"Semimicrodeterminationofcelluloseinbiologicalmaterials";Ana:[.Biochem.32:120-124)確定。圖3:對于4種參考次生細胞壁基因和38種已發現基因的橫跨十二種玉米組織的轉錄物分布。四種參考次生細胞壁基因(Bk2，CesA10，CesAll，CesA12)和具有相關表達模式的38種己發現基因的信使RNA分布。組織表達水平代表了代表參考和己發現組的基因的MPSS17-mer標簽組的平均(和SE)值。總體基因表達模式在這些組之間非常類似，顯示了在莖中的峰表達，在根和葉中的更微弱的表達，和在其它組織中的很少的表達，特別是頂端分生組織，其缺少次生細胞壁。平均表達強度沒有組織表達模式的對應重要，因為基因之間轉錄物和標簽水平將天然地和由于技術原因而改變。發明詳述在下文中參考附圖更全面描述本發明，其中顯示了本發明的一些而不是全部實施方案。的確，這些發明可以許多不同形式實施并不應限制于本文列出的實施方案；而本文提供這些實施方案以使本公開滿足適用的法律要求。全文中同樣的數字表示同樣的要素。本文列出的本發明許多變體和其他實施方案(利用之前的說明書和相關附圖中的教導)對于本發明所屬領域的技術人員而言是熟知的。因此應當理解的是本發明不限于公開的具體實施方案并且所述修改和其他實施方案均包含于附加權利要求的范圍。雖然本文應用了具體的術語，但是它們僅用于通用和描述性意義并不具有限制性。除非另外說明，本發明的實施將應用植物學、微生物學、組織培養、分子生物學、化學、生物化學和重組DNA技術的傳統技術，其均屬于本
技術領域：
。該類技術在文獻中有詳細說明。見例如Langenheim和Thimann,植物學植物生物學及其與人類事務的關系(BOTANY:PLANTBIOLOGYANDITSRELATIONTOHUMANAFFAIRS),JohnWiley(1982);植物細胞培養和體細胞遺傳學(CELLCULTUREANDSOMATICCELLGENETICSOFPLANTS),第1巻，Vasil編輯.(1984);Stanier等，微生物世界(THEMICROBIALWORLD)，第5版，Prentice-Hall(1986);Dhringra和Sinclair,基礎植物病理學方法(BASICPLANTPATHOLOGYMETHODS),CRCPress(1985);Maniatis等，分子克隆實驗室手冊(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)(1982);DNA克隆(DNACLONING)，第I和II巻，Glover編輯，(1985);寡聚核苷酸合成(OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS)，Gait編輯，(1984);核酸雜交(NUCLEICACIDHYBRIDIZATION)，Hames和Higgins編輯，(1984);及酶學方法(METHODSINENZYM()L()GY)系列，Co固ck禾口Kaplan編輯，AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA。[酬單位、字首和符號表示為SI接受形式。除非另外指明，分別地,核酸由左向右以5'至3'方向書寫；氨基酸序列由左向右從氨基至羧基的方向書寫。數字范圍包括限定該范圍的數值。本文中提及的氨基酸可為它們普遍使用的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議使用的單字母符號。同樣，核苷酸以它們被普遍接受的單字母編碼表示。通過整體引用詳細說明更加全面定義下文中定義的術語。在描述本發明中可應用下列術語，其定義如F所示。術語"微生物"指任何微生物(包括真核和原核微生物)，例如真菌、酵母、細菌、放線菌、藻類和原生動物以及其他單細胞結構。術語"擴增"指使用至少該核酸序列之-作為模板構建核酸序列的多個拷貝或與該核酸序列互補的多個拷貝。擴增體系包括聚合酶鏈式反應(PCR)系統、連接酶鏈反應(LCR)系統、核酸序列為基礎的擴增(NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)、QP復制酶7系統、轉錄為基礎的擴增系統(TAS)和鏈置換擴增(SM)。例如見診斷分子生物學原理和應用(DIAGNOSTICMOLECULARMICROBIOLOGY-PRINCIPLESANDAPPLICATIONS)，Persing等編輯，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC(1993)。擴增產物被稱作擴增子。術語"保守修飾變異體"應用于氨基酸和核酸序列。就具體核酸序列而言，保守修飾變異體指編碼該氨基酸序列相同或保守修飾變異體的核酸。由于遺傳密碼的簡并性，許多功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此在任何用密碼子規定丙氨酸的位置，該密碼子可被改變成任何所述相應密碼子而不會改變被編碼的多肽。這種核酸變異為"沉默變異"并代表了一類保守修飾變異。本文的每一個編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸每個可能的沉默變異。本領域普通技術人員可認識到，核酸中每一個密碼子(除了AUG,其為甲硫氨酸的唯一密碼子;一個例外是紅色微球菌(Micrococcusrubens),它的甲硫氨酸密碼子為GTG(]:shizuka等.，(1993)J.Gen.Microbiol.139:425-32))均可以被修飾以產生功能相同的分子。因此，編碼本文多肽的核酸的每一個沉默變異都內含在每個所述多肽序列并以引用形式并于本文。對于氨基酸序列而言，技術人員應認識到當該變化引起用化學相似的氨基酸置換氨基酸時，改變、添加或缺失被編碼序列中的單個氨基酸或一小部分氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的單個置換、缺失或添加為"保守修飾變異體"。因此，可改變選自1至15的整數的任何數量的氨基酸殘基。因此，例如，可進行1、2、3、4、5、7或10個改變。保守修飾變異體通常與它們所來源自的未修飾多肽序列具有相似的生物活性。例如,對天然底物的底物特異性、酶活力、或配體/受體結合通常至少為天然蛋白的30%、40%、50%，、60%、70%、80%或90%，優選60-90%。保守取代表提供了本領域熟知的功能相似氨基酸。下列六組均包含可相互保守替換的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)，賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M),纈氨酸(V);及6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。還參見Creighton，PROTEINS,W.H.FreemanandCo.(1984)。如本文所使用，"基本上由…組成"意指在目標多核苷酸中包含附加序列，其中在嚴格雜交條件下該附加序列不會與相同于該多核苷酸的cDNA選擇性雜交并且其中該雜交條件包括在65。C().IXSSC和O.1%十二烷基硫酸鈉中的洗滌步驟。"編碼"或"被編碼"，對于特定核酸而言，意指包含翻譯成特定蛋白質的信息。編碼蛋白質的核酸可能在該核酸的翻譯區內含有非翻譯序列(例如，內含子)，或者可能缺少這些插入的非翻譯序列(例如，在cDNA中)。編碼蛋白質的信息由密碼子的使用來確定。通常，核酸編碼氨基酸序列采用"通用"遺傳密碼。但是,例如在一些植物、動物、真菌線粒體、細菌山羊支原體細菌(Mycoplasmacapricolum)(Yamao等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:2306-2309)或纖毛蟲Macro皿cleus中，當使用這些生物體表達核酸時可使用通用密碼的變異體。當以合成方式制備或改變核酸時,可利用表達該核酸的預期宿主的已知密碼子偏好。例如，雖然本發明的核酸序列可在單子葉和雙子葉植物種二者中表達，但是由于這些偏好已顯示出不同所以可修飾序列以滿足單子葉植物或雙子葉植物的具體密碼子偏好和GC含量偏好(Murray等，(1989)NucleicAcidsRes.17:477-98,此處通過引用并入)。因此，對特定氨基酸的玉米偏好密碼子可來源自已知玉米基因序列。來自玉米植物中28個基因的玉米密碼子使用列于上文中Murray等的表4。如本文所使用，提及核酸的"異源"指源自外來物種的核酸,或者如果來自同一物種則通過刻意的人為干預使相對于其天然形式在組成和/或基因組基因座上發生實質性改變。例如，與異源結構基因上可操作地連接的啟動子是來自與該結構基因所來源自的物種不同的物種，或者，如果來自相同物種，則其中之一或二者均從其天然形式發生實質性改變。異源蛋白質可來自外來物種，或者，如果來自同一物種，則被刻意的人為干預相對于其天然形式發生實質性改變。"宿主細胞"意指含有載體并支持該表達載體復制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞例如大腸桿菌，或真核細胞例如酵母、昆蟲、植物、兩棲動物或哺乳動物細胞。宿主細胞優選地為單子葉或雙子葉植物細胞,包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、稻、棉花、油菜、大麥、黍和番茄。尤其優選的單子葉植物宿主細胞為玉米宿主細胞。術語"雜交復合物"包括由兩條單鏈核酸序列選擇性相互雜交形成的雙鏈核酸結構。在向細胞插入核酸的上下文中，術語"導入"意指"轉染"或"轉化"或"轉導"并包括將核酸整合入真核或原核細胞，其中該核酸可被整合入細胞基因組(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)，轉化成自主復制子或者被瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。術語"己分離"指實質上或基本上沒有在自然存在環境中通常與其伴隨或相互作用的組分中的物質(例如核酸或蛋白質)。已分離物質任選包含在其天然環境中未發現伴隨該物質的物質。如本文定義，"已分離"核酸也指"異源"核酸。除非另外說明，術語"SCW核酸"意指包含編碼SCW多肽的多核苷酸("SCW多核苷酸")的核酸。如本文所使用，"核酸"包括單鏈形式或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另外限定，涵蓋已知的具有天然核苷酸基本特性即能與單鏈核酸以類似天然核苷酸的方式雜交的類似物(例如，肽核酸)。"核酸文庫"意指分離的DNA或RNA分子的集合，其包含并實質上代表了特定生物基因組的全部轉錄部分。在標準分子生物學參考文獻中教導了構建示例核酸文庫(例如基因組和c廳文庫)的方法，例如Berger和Kimrael，分子克隆技術指南(GUIDETOM0LECULARCL0NINGTECHNIQUES)，來自酶學方法叢書(theseriesMETHODSINENZYM0L0GY)，第152巻，AcademicPress,Inc.，SanDiego，CA(1987);Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)，第2版，卜3巻，(1989);以及分子生物學通用規程(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY),Ausubel等編輯，通用規禾呈(CurrentProtocols)，GreenePublishing-Associates,Inc.禾卩JohnWiley&Sons,Inc合資企業(1994增刊)。如本文所使用，"可操作地連接"包括第一個序列(例如啟動子)和第二個序列之9間的功能性連接，其中該啟動子序列起始并介導對應于第二個序列的DNA序列的轉錄。一般而言，可操作地連接意指被連接的核酸序列是鄰近的，在需要連接兩個蛋白質編碼區時是鄰近的并且在同一閱讀框內。如本文使用的，術語"植物"包括完整植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子和植物細胞及其后代。如本文使用的，植物細胞包括但不限于種子懸浮培養物、胚、分生組織區域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉以及小孢子。本發明方法中可用的植物種類通常寬泛至適用轉化技術的高等植物種類，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括以下屬的物種南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、核桃屬(Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Li誦)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(D塞us)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Si卿is)、顛茄屬(At.ropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersi固)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Sola誦)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、Ciahorium、向曰葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Broraus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Neraesis、天竺葵屬(Pelargonium)、Panieum、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、Salpiglossis、黃瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(0ryza)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeuni)、黑麥屬(Secale)、蔥屬(A:1.1i，)、及小麥屬(Triti固)。尤其優選的植物為玉米(Zeamays)。如本文使用的，"產量"包括指收獲時每英畝谷類作物的蒲式耳(bushel)，對于谷物水分校正(通常為15%)。收獲時測定谷物水分。測定校正后的谷物測試重量作為每蒲式耳重量(以磅計算)，對于收獲時的谷物水分水平校正。如本文使用的，"多核苷酸"包括脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其類似物，所述類似物具有天然核糖核苷酸的基本性質，即可在嚴格雜交條件下和與天然存在核苷酸實質相同的核苷酸序列雜交和/或者允許翻譯成與天然存在核苷酸相同的氨基酸。多核苷酸可為天然或異源結構基因或調節基因的全長序列或子序列。除非另外指明，該術語包括特定序列及其互補序列。因此，為穩定性或其它原因而主鏈被修飾的DNA或RNA為該術語在本文中所指的"多核苷酸"。此外，含有罕見堿基(例如肌苷)或修飾堿基(例如三苯甲基化堿基)(僅舉兩例)的DNA或RNA為該術語在本文所指的多核苷酸。應該理解已經對可達到本領域技術人員已知的許多有用目的的DNA和:RM進行了許多修飾。本文使用的術語多核苷酸涵蓋多核苷酸的化學、酶或代謝修飾形式，以及病毒和細胞(尤其包括單細胞和復雜細胞)特有DNA和RNA的化學形式。術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術語用于其中一個或更多個氨基酸殘基為對應天然氨基酸的人工化學類似物的氨基酸聚合物以及天然氨基酸聚合物。如本文所使用，"啟動子"包括從轉錄起點的上游DNA區域并涉及識別和結合RNA聚合酶和其它起始轉錄的蛋白質。"植物啟動子"為可在植物細胞中起始轉錄的啟動子。示例植物啟動子包括但不限于從植物、植物病毒以及包含在植物細胞表達的基因的細菌(例如農桿菌(Agrobact.erium)或根瘤菌(Rhizobium))中獲得的啟動子。啟動子實例優選起始特定組織的轉錄，例如葉、根、種子、纖維、木質部管、管胞或厚壁組織。這些啟動子被稱為"組織優選的"。"細胞類型"特異啟動子主要驅動一個或更多個器官中特定細胞類型的表達，例如,根或葉的維管細胞。"誘導型"或"調節型"啟動子為受環境調控的啟動子。可通過誘導型啟動子影響轉錄的環境條件的實例包括缺氧條件或光照存在。另一類啟動子是發育調控型啟動子，例如,驅動花粉發育過程中表達的啟動子。組織優選、細胞類型特異性、發育調節型以及誘導型啟動子構成了"非組成型"類啟動子。"組成型"啟動子為在大多數環境條件下處于活性形式的啟動子。術語"SCW多肽"指一個或更多個氨基酸序列。該術語也包括其片段、變異體、同系物、等位基因或前體(例如，前蛋白原或蛋白原)。"scw蛋白"含有scw多肽。除非另外說明，術語"scw核酸"意指包含編碼scw多肽的多核苷酸("scw多核苷酸")的核酸。如本文所使用，"重組體"包括通過導入外源核酸而修飾的細胞或載體，或該細胞來源自這樣修飾獲得的細胞。因此，例如，作為刻意人為介入的結果，重組細胞可表達未發現在天然(非重組體)形式的細胞內以相同形式存在的基因，或者表達或被異常表達、低表達(underexpressed)或根本不表達的天然基因。本文所用術語"重組體"不包含通過天然事件對細胞或載體的改變(例如，自發性突變、自然轉化Z轉導/轉座)，例如在沒有刻意人為介入下發生的事件。如本文所使用，"重組表達盒"為具有一系列特定核酸元件由重組或合成產生的核酸構建體，其可在靶細胞中轉錄特定核酸。重組表達盒可整合入質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段。通常，表達載體的重組表達盒部分包括將要轉錄的核酸以及啟動子等等。術語"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"在本文中可互換使用，指整合入蛋白質、多肽或肽(統稱為"蛋白質")的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸，除非另外限制，也可涵蓋已知的與天然氨基酸以相似形式發揮功能的天然氨基酸類似物。術語"選擇性雜交"包括核酸序列與特定核酸目標序列在嚴格雜交條件下以比其與非目標核酸序列的雜交具有更高的可檢測程度(例如，至少為背景的兩倍)并實質上排除了非目標核酸的雜交。選擇性雜交序列相互間通常具有約至少4()%的序列同一性,優選60_90%的序列同一性，且最優選100%序列同-一性(即互補)。術語"嚴格條件"或"嚴格雜交條件"包括探針以比與其它序列更高可檢測程度(例如,至少為背景的兩倍)與其目標序列雜交的條件。嚴格條件依賴于序列并隨環境不同而不同。通過調控雜交和/或洗滌條件的嚴格程度，可鑒定與探針最高l()O%互補的目標序列(同源探測)。或者，可調節嚴格度使序列中得以存在-些錯配以檢測較低相似度(異源探測)。探針的最佳長度為約500個核苷酸，但其長度也可從少于500個核苷酸到等于目標序列全長的范圍內隨意變化。嚴格條件通常為鹽濃度小于約1.5M鈉離子的條件，通常約0.01到1.()M鈉離子濃度(或其它鹽)，pH為7.0至8.3,用于短探針(例如，10到50個核苷酸)的溫度至少為約3(TC，用于長探針(例如，大于50個核苷酸)的溫度至少為約6(TC。也可通過加入去穩定劑例如甲酰胺或Denhardt's以達到嚴格條件。示例性低嚴格度條件包括在37°C、含30至35%甲酰胺、1MNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液中雜交，在50至55。C用IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)洗滌。示例性中等嚴格度條件包括在37°C、40至45%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中雜交，在55至6(TC用0.5X至1XSSC洗滌。示例性高嚴格度條件包括在37°C、50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS雜交，在60至65。C用0.1XSSC洗滌。特異性通常為雜交后洗滌的函數,關鍵因素為終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，可通過Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.138:267-84的方程估計Tm:Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%甲酰胺)-500/L;其中，M為一價陽離子的摩爾濃度，^GC為DNA中鳥嘌呤核苷和胞嘧啶核苷酸百分比，％甲酰胺為雜交溶液中甲酰胺百分比，L為雜交體的堿基對長度。Tm為在給定離子強度和pH下50%互補目標序列與完全匹配探針雜交時的溫度。每1%的錯配會使Tra下降約1°C;因此，可調節T,u、雜交條件和/或洗滌條件使其與具有期望同一性的序列雜交。例如，如果要找尋同一性》9()%的序列，可將Tni降低l(rC。通常，所選嚴格條件比給定離子強度和pH:下特異序列和其互補序列的熱熔點(Tm)約低5t:。但是，非常嚴格條件可使用低于熱熔點(TJ1、2、3或(C的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可使用低于熱熔點(T,》6、7、8、9或l(TC的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可使用低于熱熔點(Tm)11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。通過使用方程、雜交和洗滌組合以及期望Tm，一般專業人員即可理解雜交嚴格度和/或洗滌溶液的變化已闡述在內。如果錯配結果的期望程度為低于45t:(水溶液)或32t:(甲酰胺溶液)的Tra，那么優選提高SSC濃度以使用更高的溫度。核酸雜交的廣泛指導參見Tiis線生物化學和分子生物學實驗室技術一核酸探針雜交(LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDM()LECULA:RBIOLOGY—HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACII)P腿ES)，第]:部分，第2章，雜交原理及核酸探針分析策略綜述("Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyof皿cleicacidprobeassays,，，)Elsevier,NewYork(1993);以及分子生物學通用規程(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)，第2章，Ausubel等編輯，GreenePublishing禾口Wi:[ey—:[nterscience，NewYork(1995)。除非另夕卜說明，本申i青中高嚴格度定義為在65。C、4XSSC、5XDenhardt.'s(500ml水中含5gFicoll、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.lmg/ml煮沸過的鮭精DNA以及25mM磷酸鈉中雜交，以及在65t:、0.1XSSC、0.1%SDS中洗滌。如本文所使用，"轉基因植物"包括基因組中包含異源多核苷酸的植物。通常，異源多核苷酸可穩定地整合在基因組中，這樣該多核苷酸傳遞至連續世代。異源多核苷酸可單獨或者作為重組表達盒的一部分整合入基因組。本文中使用的"轉基因"包括因異源核酸的存在而使基因型被改變的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括起始被如此改變的轉基因以及由起始轉基因的有性雜交或無性繁殖產生者。本文所用術語"轉基因"不包括因常規植物育種方法或自然發生事件例如隨機異體受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發突變引起的基因組(染色體或染色體外)的改變。如本文所使用，"載體"包括用于宿主細胞轉染并可在其中插入多核苷酸的核酸。載體通常為復制子。表達載體允許插入其中的核酸轉錄。以下術語用于描述兩個或更多個核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關系(a)"參比序列"，(b)"對比窗口"，(c)"序列同一性"，(d)"序列同一性百分比"，以及(e)"實質同一性"。12如本文所使用，"參比序列"為用作序列對比基準的已定義序列。參比序列可以是特定序列的子序列或全部；例如，為全長cDNA或基因序列、或完整cDNA或基因序列的片段。如本文所使用,"對比窗口"指包括多核苷酸序列的連續和特定片段,其中該多核苷酸序列可與參比序列對比并且其中對比窗口中的多核苷酸序列部分可含有相對于參比序列(不含添加或缺失)用于優化兩個序列比對的添加或缺失(即缺口)。通常，對比窗口長度至少為20個連續核苷酸，任選30、40、50、100或更長。本領域技術人員應理解通常引入缺口罰分并將其從匹配數值中減去以避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而引起的與參比序列的高度相似。用于對比核苷酸和氨基酸序列的比對方法為本領域人員熟知。Smith和Waterman，(1981)Adv.A卯l.Math2:482中的局部同源性算法(BESTFIT)可優化比較序列的比對；也可通過Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443-53中的同源比對算法(GAP);還可通過Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA85:2444的相似性檢索方法(Tfasta和Fast.a);通過這些算法的計算機實施，包括但不限于PC/Geneprogram中的CLUSTAL，(Intelligenet.ics，MountainView，California)禾口WisconsinGeneticsSoftwarePackage第8片反(可購自GeneticsComputerGroup(GCGprograms(Accelrys，Inc.，SanDiego，CA))中的GAP、BESTF]:T、BLAST、FASTA和TFASTA。下列文獻詳細地闡述了CLUSTAL程序Higgins禾卩Sharp,(1988)Gene73:237-44;Higgins禾PSharp,(1989)CABIOS5:15卜3;Corpet等，(1988)NucleicAcidsRes.16:1088卜90;Huang等，(1992)ComputerApplicationsintheBiosciences8:155-65;以及Pearson等，(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-31。用于優化多序列總體比對的優選程序為Pi:l.eUp(Feng和I)oolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25:35卜60，且其與Higgins和Sharp，(1989)CABI0S5:151-53描述的方法相似，以引用形式并于本文)。用于數據庫相似性檢索的BLAST家族程序包括在核苷酸數據庫序列中進行核苷酸查詢序列的BLASTN;在蛋白質數據庫序列中進行核苷酸查詢序列的BLASTX;在蛋白質數據庫序列中進行蛋白質查詢序列的BLASTP;在核苷酸數據庫序列中進行蛋白質查詢序列的TBLASTN和在核苷酸數據庫序列中進行核苷酸查詢序列的TBLASTX。參見分子生物學通用規程(CURRENTPROTOCOLSI雨OLECULARBIOLOGY)，第19章，Ausubel等編車茸,GreenePublishing禾卩Wiley-Interscience，NewYork(1995)。GAP使用了Needleman和Wunsch，上文的算法以尋找既能最大化匹配數量又能最小化缺口數量的兩個完整序列的比對。GAP考慮所有可能的比對及缺口位置，并創建最多匹配堿基數目和最少缺口的比對。這使得能夠在匹配堿基單元中提供缺口生成罰分和缺口延伸罰分。GAP必須為其插入的每一個缺口利用匹配的缺口生成罰分數量。如果選擇缺口延伸罰分大于()，GAP必須額外為每個被插入的缺口利用缺口長度與缺口延伸罰分的乘積。WisconsinGeneticsSoftwarePackage第10版本中的默認缺口生成罰分值和缺口延伸罰分值分別為8和2。缺口生成和缺口延伸罰分可表示為選自0至100的整數。因此，例如，缺口生成和缺口延伸罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多。GAP代表了是最佳比對家族的一員。雖然這一家族中有很多成員，但是其它成員均沒有更好的質量。GAP顯示四個比對品質因數(figureofmerit):質量、比率、同一性和相似性。質量是為了比對序列而最大化的度量。比率是將質量除以較短片段的堿基數目。同一性百分比是實際匹配符號的百分比。相似性百分比是相似符號的百分比。忽略從缺口13跨越的符號。當一對符號的評分矩陣數值大于或等于O.50(相似性閾值)時會給出相似性評分。WisconsinGeneticsSoftwarePackage第10版本中用的評分矩陣為BL0SUM62(參見，Henikoff和Ifenikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)。除非另外說明，本文提及的序列同一性/相似性數值指使用默認參數的BLAST2.0程序組件獲得的數值(Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-402)。正如本領域普通技術人員所理解，BLAST檢索假設可將蛋白質建模為隨機序列。但是,很多真實的蛋白質包含非隨機序列區域(如同聚物段(tract)、短周期重復)或富含一個或更多個氨基酸的區域。盡管蛋白質的其它區域完全不類似,這些低復雜度區域仍可在非相關蛋白質之間比對。可使用很多低復雜度過濾程序減少這樣的低復雜度比對。例如，可單獨或聯合使用SEG(Woot.en和Federhen，(1993)Comput.Chem.17:149-63)和XNU(Claverie和States,(1993)Comput.Chem.17:19卜201)低復雜度過濾器。如本文所使用，兩個核酸或多肽序列的"序列同一性"或"同一性"包括指在特定對比窗口下比對最大相應性時相同的兩個序列中的殘基。當序列同--'性百分比用于指蛋白質時，人們認識到不相同的殘基位置通常由于保守氨基酸替換而不同，其中氨基酸殘基被其它具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基替換并因此不改變該分子的功能性質。在序列區別在于保守替換時，可上調序列同一性百分比以校正該替換的保守性質。由于這些保守替換而不同的序列被稱為具有"序列相似性"或"相似性"。進行這一調整的方法為本領域技術人員所熟知。通常其中涉及將保守置換作為部分錯配而非全部錯配進行評分,藉此提高序列同一性百分比。因此,例如，當相同氨基酸評分為1且非保守替換評分為()時，保守替換評分介于0和1之間。例如，根據Meyers和Miller,(1988)ComputerApplic.Biol.Sci.4:1卜17的算法計算保守替換的評分，例如，如程序PC/GENE所實施(Intelligenetics，MountainView，California,USA)。如本文所使用，"序列同一性百分比"指通過在對比窗口下比較兩個優化比對序列得到的數值,其中對比窗口中的多核苷酸序列部分可包含與參比序列(其不包含增加或缺失)相比用于兩個序列最佳比對的添加或缺失(即，缺口)。百分比如下計算通過測定兩序列中出現的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數量以得到匹配位置的數量，將匹配位置的數量除以對比窗口中總位置數量并將該結果乘以100即得到序列同一性百分比。術語多核苷酸序列的"實質同一性"指用所述采用標準參數的比對程序之一與參比序列對比時，含有介于50_100%序列同一性的序列的多核苷酸，優選至少50%序列同-性，優選至少60%序列同一性，優選至少70%，更優選至少80%，更優選至少90%，最優選至少95%。本領域技術人員應理解可通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等適當調整這些數值來測定由兩條核苷酸序列編碼的蛋白質的對應同一性。用于這些目的的氨基酸序列實質同一性通常指介于55-100%的序列同一性，優選至少55%，優選至少60%，更優選至少70%、80%、90%，且最優選至少95%的序列同一性。核苷酸序列實質同一的另一個指征為兩個分子是否在嚴格條件下相互雜交。遺傳密碼的簡并性允許很多可引起編碼相同氨基酸的核苷酸序列變化的氨基酸替換，因此可能編碼相同多肽的DNA序列在嚴格條件下并不會相互雜交。例如當使用遺傳密碼許可的最大密碼子簡并性產生核酸拷貝時就可能發生這種情況。兩個核酸序列實質同一的一個指征為由第一個核酸編碼的多肽與第二個核酸編碼的多肽有免疫交叉反應性。肽的上下文中的術語"實質同--'性"表明肽包含在特定對比窗口中與參比序列的序列同一性介于55-100%的序列，優選至少55%序列同一性，優選60%，優選70%，更優選80%，最優選至少90%或95%的序列同一性。優選采用Needleman和Wunsch,上文的同源性比對算法進行最佳比對。兩個肽序列實質同一的一個指征是第一個肽與抗第二多肽的抗體有免疫反應性。因此,例如當兩個肽僅是由于保守替換而不同時第一個肽與第二個肽實質同一。此外，當兩個肽因非保守改變而不同時，如果抗體識別的表位實質同一，那么第一個多肽與第二個多肽是實質同一的。"實質類似"的肽共有如上所述的序列，除了不相同的殘基位置可由于保守氨基酸變化而不同。本發明公開SCW多核苷酸和多肽。本發明的新穎核苷酸和蛋白質的表達形式表明它們改變細胞壁形成并因此在植物發育中發揮重要作用。該多核苷酸可在多種植物組織中表達。因此該多核苷酸和多肽可為操縱植物發育以改變種子和營養組織發育、時間安排(timing)或組成提供機會。可利用這一點產生不育植株、無種子植物或改變胚乳組成的植物。核酸本發明提供，特別是含有SCW多核苷酸的RNA、DNA的已分離核酸及其類似物和./或嵌合體。本發明也包括在不同組織中被優化表達的多核苷酸。例如，對于在玉米植物中多核苷酸的表達，可改變序列以符合特異密碼子偏好并可依據Murray等....匕文所述改變GC含量。玉米植物中28個基因的玉米密碼子的使用列于如Murray等上文所述表4。本發明的SCW核酸包含已分離的SCW多核苷酸，其包括(a)編碼SCW多肽及其保守修飾的和多態變異體的多核苷酸；(b)與(a)或(b)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；(c)(a)或(b)的多核苷酸的互補序列。下表(表1)列出了本文公開的玉米序列的的特定同一性。另外的表，表2，列出了本文公開的稻(0ryzasat.iva(0s))，擬南芥菜(Arabidopsisthaliana(At))，Populustrichocarpa(Pt)，Medicagotrimcatula(Mt)，禾口兩色蜀黍(Sorghumbicolor(Sb))中的SCW序列直向同源物的特定同一性。表1SCW組玉米序列身份SEQIDNO:SCW01多核苷酸0RF多肽多核苷酸轉錄物啟動子SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:77SEQIDNO:42515<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>一些實施方案中，本發明的多核苷酸被克隆、擴增或另外地構建自真菌或細菌。該核酸可方便地包含除本發明多核苷酸之外的序列。例如，可將包含一個或更多個核酸內切酶限制位點的多克隆位點插入該核酸以輔助該多核苷酸的分離。也可插入可翻譯序列輔助分離本發明已翻譯的多核苷酸。例如，六-組氨酸標記序列提供了純化本發明蛋白質的便利方法。本發明核酸-不包括多核苷酸序列-任選為載體、接合體(adapter)或接頭以克隆和/或表達本發明多核苷酸。可向該克隆和/或表達序列加入其它序列優化它們在克隆和./或表達中的功能、輔助分離該多核苷酸或促進將該多核苷酸導入細胞。通常，本發明核酸的長度小于本發明其多核苷酸的長度，小于2()K堿基對，通常小于15Kb,經常小于10Kb。克隆載體、表達載體、接合體和接頭的使用為本領域已知。示例性核酸包括該類載體，例如M13、入ZAPExpress、入ZAPII、入gt10、入gtll、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescriptII、ADASHII、AEMBL3、AEMBL4、pWE15、S叩erCos1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pS:PUTK、p3，SS、pGEM、pSK十/-、pGEX、pSP()RTI和11、pOPRSVICAT、p0PI3CA、pXTl、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pOG44、pOG45、pFRTPGAL、pNEOPGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、入MOSSlox和AMOSElox。本發明的任選載體包括但不限于入ZAPII和pGEX。各種核酸的描述參見，例如，StratageneCloningSystems，Catalogs1995，1996，1997(LaJolla，CA)禾卩AmershamLifeSciences，Inc，Catalog'97(ArlingtonHeights,IL)。構建核酸的合成方法可通過直接化學合成得到本發明己分離的核酸，通過如下方法如Narang等，(1979)Meth.Enzymo:[.68:90-9的磷酸三酯法;:Brown等，(1979)Meth.Enzymo:[.68:109-51的磷酸二酯法；Beaucage等，(1981)Tetra.Letts.22(20):1859-62的二乙基亞磷酰胺法；Beaucage等上文中描述的固相亞磷酰胺三酯法，例如使用自動合成儀(例如Needham-VanDevanter，等.,(1984)NucleicAcidsRes.12:6159-68所述)和美國專利第4，458，066號的固體載體方法。化學合成通常產生單鏈寡聚核苷酸。這可通過與互補序列雜交或使用單鏈作為模板通過DNA聚合酶的聚合作用轉化成雙鏈DNA。技術人員可認識到雖然化學合成DNA限制于約100個堿基的序列，但是可通過連接較短序列得到更長的序列。UTRs和密碼子偏好—般而言，已發現翻譯效率受RNA5'非編碼或非翻譯區(5'UTR)特異序列元件的調控。陽性序列基序包括翻譯起始共有序列(Kozak，(1987)NucleicAcidsRes.15:8125)和5〈G〉7甲基GpppGRNA帽結構(Dru咖ond等.，(1985)NucleicAcidsRes.13:7375)。陰性元件包括穩定的分子內5，UTR莖-環結構(Muesing等，(1987)Cell48:691)和AUG序列或在5，UTR中位于適當AUG之后的短開放閱讀框(Kozak,上文，Rao等，(1988)Mol.andCell.Biol.8:284)。因此本發明提供用于調節異源編碼序列翻譯的5'和Z或3'UTR區。[O訓]此外，可修飾本發明多核苷酸的多肽編碼區段以改變密碼子使用。被改變的密碼子使用可用于改變翻譯效率和/或優化在期望宿主中表達的編碼序列或優化在玉米中表達的異源序列的密碼子使用。可使用商業購買的軟件包例如購自UniversityofWisconsinGenet.icsComputerGroup的"密碼子偏好"分析本發明多核苷酸編碼區的密碼子使用。參見Devereaux等，(1984)NucleicAcidsRes.12:387_395;或MacVector4.1(EastmanKodakCo.,NewHaven,Conn.)。因此，本發明提供了至少一種本發明多核苷酸編碼區特有的密碼子使用頻率。可用于測定密碼子使用頻率的多核苷酸數量(每個氨基酸3個核苷酸)可為從3至本文提供的本發明多核苷酸數量之間的任何整數。任選地，該多核苷酸為全長序列。用于統計分析的示例性序列數量可為至少1、5、10、20、50或100個。序列改組本發明提供了使用本發明多核苷酸進行序列改組的方法和藉此得到的組成。序列改組闡述于PCT出版物第96/19256號。也可參見Zhang等.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-9;和Zhao等.，(1998)NatureBiotech16:258-61。一般而言，序列改組可提供產生具有期望特性的多核苷酸文庫，其可供選擇或用于篩選。重組多核苷酸文庫產生自相關序列多核苷酸群，其包含序列區，其具有實質序列同-"性并可體外或體內同源重組。序列重組多核苷酸群包含具有期望或有利特性并可通過適當選擇或篩選方法選擇的多核苷酸亞群。該特性可為可用于在篩選系統中選擇或檢測的任何性質或特性,可包括下列的性質被編碼蛋白、轉錄元件、基因或轉基因的序列控制轉錄、:RM加工、RNA穩定性、染色質構象、翻譯或其它表達性質、復制元件、蛋白質-結合元件等，例如任何可賦予可選擇或可檢測性質的特性。在一些實施方案中，該所選擇特性為與本文提供的野生型蛋白質相比改變的K。,和/或K^t。在其它實施方案中，產生自序列改組的蛋白質或多核苷酸比非改組野生型多核苷酸的配體結合親和性更強。在又一實施方案中，產生自序列改組的蛋白質或多核苷酸與非改組野生型多核苷酸相比其最優PH改變。該類性質的增加可至少為野生型數值的110%、120%、130%、140%或大于150%。重組表達盒本發明進一步提供包含本發明核酸的重組表達盒。可使用編碼本發明期望多核苷酸的核酸(例如編碼足夠長的多肽以編碼本發明活性蛋白質的基因組序列的cDNA)構建可導入期望宿主細胞的重組表達盒。重組表達盒通常包含與翻譯起始調節序列可操作地連接的本發明多核苷酸，所述翻譯起始調節序列可引導該多核苷酸在預期宿主細胞中(例如被轉化植物的組織)的轉錄。例如，植物表達載體可包括(1)5，和3'調節序列轉錄控制下的克隆植物基因和(2)顯性選擇標記。需要時該類植物表達載體也可包含啟動子調節區(例如，賦予誘導型或組成型、環境或發育調節型或細胞或組織特異性/選擇性表達)、轉錄起始位點、核糖體結合位點、:RM加工信號、轉錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。可使用可在再生植物的所有組織中引導本發明多核苷酸表達的植物啟動子片段。該類啟動子在本文中被稱作"組成型"啟動子，其在大多數環境條件下和發育或細胞分化狀態下是活性的。組成型啟動子的實例包括來自根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-I)NA的1'或2'啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利第5，683，439號)、Nos啟動子、rubisco啟動子、GRP卜8啟動子、來自花椰菜花斑病毒(CaMV)的35S啟動子(如0dell等，(1985)Nature313:810-2所述)；稻肌動蛋白(McElroy等，(1990)PlantCell163-171);泛素(Christensen等,(1992)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等，(1992)PlantMo:1.Biol.18:675-89);pEMU(Last等，(1991)Theor.Appl.Genet.81:58卜8);MAS(Velten，等，(1984)EMB0J.3:2723-30);玉米H3組蛋白(L印et.it等，(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-85;和At.anassvoa等，(1992)PlantJournal2(3):291-300);ALS啟動子如PCT申請第W096/30530號所述；G0S2(美國專利第6，504，083號)32和其它本領域技術人員已知的來自各種植物基因的轉錄起始區。就本發明而言泛素為單子葉植物表達的優選啟動子。或者，該植物啟動子可引導本發明多核苷酸在特異性組織中或在更精確的環境或發育控制條件下表達。該類啟動子被稱作"誘導型"啟動子(Rab17，RAD29)。可通過誘導型啟動子影響轉錄的環境條件包括病原體攻擊、厭氧環境或存在光照。誘導型啟動子的實例為Adhl啟動子，其可被缺氧或冷應激誘導，Hsp70啟動子，其可被熱應激誘導，PPDK啟動子，其可被光誘導。發育控制下的啟動子實例包括僅在或優選在某些組織例如葉、根、果實、種子或花中起始轉錄的啟動子。啟動子的操作也可根據其在基因組中的位置而變化。因此，誘導型啟動可在某些位點成為完全或部分組成型的。如果需要多肽表達，通常期望在多核苷酸編碼區的3'-端包含多腺苷酸化區。該多腺苷酸化區可來自各種植物基因或來自T-DNA。被加入的3'端序列可來源自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因或來自另--植物基因或較少優選地來自任何其它真核基因。該類調節元件的實例包括但不限于3'終止和/或多腺苷酸化區例如來自根癌農桿菌胭脂堿合酶(nos)基因者(Bevan等,(1983)NucleicAcidsRes.12:369-85);馬鈴薯蛋白水解酶抑制劑II:(P皿]:)基因(Keil等，(1986)NucleicAcidsRes.14:5641-50;禾卩An等，(1989)PlantCell1:115-22);以及CaMV19S基因(Mogen等，(1990)PlantCell2:126卜72)的那些。可在部分編碼序列的5'非翻譯區或編碼序列加入內含子序列以增加在胞質溶膠中積累的成熟信號的量。在植物和動物表達構建體二者的轉錄單元中包含可剪接內含子已顯示可在mRNA和蛋白質二者水平上增加基因表達至1000-倍(Buchman和Berg，(1988)Mol.CellBiol.8:4395-4405;Callis等，(1987)GenesDev.1:1183-200)。當置于轉錄單位的5'端附近時該基因表達的內含子增強作用通常最強。使用玉米內含子Adh卜S內含子1、2和6，Bronze-1內含子為本領域已知。一般地，可參見THEMAIZEHANDBOOK(玉米手冊)，第116章，Freeling和Wal.bo(編輯)，Springer,NewYork(1994)。本發明可用植物信號序列包括但不限于將蛋白質靶向于植物細胞胞外基質的編碼信號肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等，(1989)J.Biol.Chem.264:4896-900)，例如白花丹葉煙草(Nicotianaplumbaginifolia)擴展基因(DeLoose等，(1991)Gene99:95-100);將蛋白質耙向于液泡的信號肽，例如甘薯儲藏蛋白(sporaniin)基因(Matsuka等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:834)和大麥凝集素基因(Wilkins等，(1990)PlantCell，2:30H3);可引起蛋白質分泌的信號肽，例如PRIb(Lind等，(1992)PlantMol.Biol.18:47-53)或大麥a淀粉酶(BAA)信號肽(Rahmatullah等.，(1989)PlantMol.Biol.12:119，以引用形式并于本文)或將蛋白質靶向于質體的信號肽，例如油菜籽烯酰基ACP還原酶信號肽(Verwaert等，(1994)PlantMol.Biol.26:189-202)。與SCW多核苷酸融合的大麥a淀粉酶信號序列為本發明用于在玉米中表達的優選構建體。包含來自本發明多核苷酸序列的載體通常包含標記基因，其賦予植物細胞的選擇性表型。通常該選擇性標記基因編碼抗生素抗性，適當的基因包括編碼抗生素大觀霉素抗性的基因(例如，aada基因)、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉移酶(SPT)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(HPT)基因、編碼可抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草劑(尤其是磺酰脲類除草33劑)抗性的基因(例如含有引起該抗性的突變的乙酰乳酸合成酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突變)、編碼可抑制谷氨酰胺合成酶作用的除草劑抗性的基因，例如膦絲菌素或basta(例如bar基因)或其它本領域己知基因。該bar基因編碼對除草劑basta的抗性，ALS基因編碼對除草劑氯磺隆的抗性。可用于高等植物中基因表達的常用載體為本領域已知并包括來源自如Rogers等，(1987)Meth.Enzymol.153:253-77所描述的根癌農桿菌的腫瘤-誘導(Ti)質粒。這些載體為植物整合型載體，因為在轉化時該載體將載體DM的一部分整合入宿主植物的基因組中。可用于本文的示例性根癌農桿菌載體為Schardl等，(1987)Gene61:1-ll和Berger等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86:8402-6描述的質粒pKYLX6和pKYLX7。本文另一可用載體為購自CLONTECHLaboratories，Inc.(PaloAlto，CA)的質粒pBI101.2。宿主細胞中的蛋白質表達使用本發明的核酸可在重組工程細胞例如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物或優選植物細胞中表達本發明蛋白質。該細胞在非-天然條件(例如，數量、組成、位置和/或時間)下生產該蛋白質，因為它們已通過人為介入發生遺傳學改變以做到這一點。預期本領域技術人員熟知可用于表達編碼本發明蛋白質的核酸的很多表達系統。本文不詳細描述在原核細胞或真核細胞中表達蛋白質的各種方法。簡略而言，可通過例如將DNA或cDNA與啟動子(可為組成型或誘導型)可操作地連接然后將其并入表達載體以完成編碼本發明蛋白質的已分離核酸的表達。該載體適用于原核細胞或真核細胞中的復制和整合。典型的表達載體包含可用于調節編碼本發明蛋白質的DNA表達的轉錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子。為了得到已克隆基因的高水平表達，需要構建至少包含引導轉錄的強啟動子(例如泛素)、用于翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄/翻譯終止子的表達載體。將組成型啟動子分類為提供一定范圍的表達。因此，有些為弱組成型啟動子，其它為強組成型啟動子。通常,"弱啟動子"意指驅動編碼序列低水平表達的啟動子。"低水平"意指約1/10000轉錄物至約1/100000轉錄物至約1/500，000轉錄物的水平。相反，"強啟動子"可驅動編碼序列"高水平"表達，或約1Z10轉錄物至約1/100轉錄物至約1/1000轉錄物。技術人員將認識到可修飾本發明蛋白質而不降低其生物學活性。一些修飾可促進分子的克隆、表達或靶向并入融合蛋白。該類修飾為本領域技術人員熟知并包括，例如，在氨基端加入甲硫氨酸以提供起始位點，或在兩端之一放置附加氨基酸(例如聚組氨酸)以產生方便定位的限制酶切位點或終止密碼子或純化序列。原核細胞中的表達原核細胞可用作表達宿主。原核細胞最普遍的代表為各種大腸桿菌株(E.coli);但是也可使用其它微生物株。通常使用的原核控制序列(本文定義為包括轉錄起始啟動子，任選含有操作子，還有核糖體結合位點序列)包括這些通常使用的啟動子例如P-內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統(Chang等，(1977)Nature198:1056)、色氨酸(trp)啟動子系統(Goedde:l.,等，(1980)NucleicAcidsRes.8:4057)和來源自A的PL啟動子和N-基因核糖體結合位點(Shimat.ake等，(1981)Nature292:128)。也可在在轉染大腸桿菌的DNA載體中包含選擇標記。該類標記的實例包括指定對氨芐青霉素、四環素或氯霉素抗性的基因。所選擇載體允許將相關基因導入適當的宿主細胞中。細菌載體通常為質粒或噬菌體來源。用噬菌體載體顆粒感染或用裸露的噬菌體載體DNA轉染適當的細菌細胞。如果使用質粒載體，用該質粒載體DNA轉染細菌細胞。可使用芽孢桿菌屬物種(Bacillussp.)和沙門氏茵屬(Salmonella)獲得用于表達本發明蛋白的表達系統(Palva等，(1983)Gene22:229-35;Mosbach等，(1983)Nature302:543-5)。Pharmacia的pGEX_4T_l質粒載體為本發明優選的大腸桿菌表達載體。真核細胞中的表達許多真核表達系統例如酵母、昆蟲細胞系、植物和哺乳動物細胞為本領域技術人員已知。如下簡述,本發明可在這些真核系統中表達。在一些實施方案中，將如下文所討論的轉化/轉染植物細胞作為生產本發明蛋白質的表達系統。在酵母中合成異源蛋白質已廣為人知。Sherman等，(1982)METH0DSINYEASTGENETICS,ColdSpringHarborLaboratory為廣為認可的描述可用于在酵母中生產蛋白質的各種方法的專著。用于生產真核蛋白質的兩種廣泛使用的酵母為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。用于在酵母屬和畢赤酵母屬中表達的載體、菌株和方案為本領域已知并可從供應商購買(例如，Invitrogen)。期望時，適當的載體通常具有表達控制序列，例如啟動子，包括3…磷酸甘油酸酯激酶或醇氧化酶，和復制起點、終止序列等。本發明蛋白質一旦表達即可通過裂解細胞并將標準蛋白質分離技術應用于該裂解產物或沉淀從酵母中分離。可通過使用Western印跡技術或其它標準免疫測定技術的放射免疫測定法監控純化過程。也可將編碼本發明蛋白質的序列與各種表達載體連接用于轉染例如哺乳動物、昆蟲或植物來源的細胞培養物。哺乳動物細胞系統常為單層細胞形式雖然也可使用哺乳動物細胞懸液。本領域已開發了許多可表達完整蛋白質的適當宿主細胞系，包括HEK293、BHK21和CH()細胞系。這些細胞的表達載體可包括表達控制序列，例如復制起點、啟動子(例如，CMV啟動子、HSVtk啟動子或pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子)、增強子(Queen等，(1986)Immunol.Rev.89:49)和必要的加工信息位點，例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點(例如，SV40大TAgpolyA附加位點)和轉錄終止子序列。用于生產本發明蛋白質的其它動物細胞可來自例如美國典型培養物保藏中心細胞系和雜交瘤目錄(第7版，1992)。用于在昆蟲細胞中表達本發明蛋白質的適當載體通常來源自SF9桿狀病毒。適當的昆蟲細胞系包括蚊幼蟲、蠶、粘蟲、蛾和果蠅(Drosophia)細胞系，例如Schneider細胞系(參見，例如，Schneider,(1987)J.Erabryol.Exp.Morphol.27:353-65)。對于酵母而言，當使用更高級的動物或植物宿主細胞時通常將多腺苷酸化或轉錄終止子序列并入載體中。終止子序列的一個實例為來自牛生長激素基因的多腺苷酸化序列。也可包括用于準確剪接轉錄物的序列。剪接序列的一個實例為來自SV40的VP1內含子(Sprague等，(1983)J.Virol.45:773-81)。此外，可將在宿主細胞中控制復制的基因序列并于載體中例如存在于牛乳頭狀瘤病毒類型_載體中者(S辜ia-C卿o，"BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVect.or，，，DNACLONING:APRACTICALAPPROACH,第二巻，Glover(編輯),IRL出版社，Arlington,VA,第213—38頁(1985))。此外，可使用置于適當植物表達載體中的SCW基因轉化植物細胞。然后可從植物愈傷組織中分離該多肽或用轉化細胞再生轉基因植物。可收獲該轉基因植物，并可對適當的組織(例如，種子或葉)運用大規模蛋白質提取和純化技術。植物轉化方法已知很多向植物中導入外源基因的方法并可用于向植物宿主中插入SCW多核苷酸，包括生物學和物理學植物轉化方案。參見，例如，Miki，等，"ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants,"METHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECIINOLOGY,GlickandThompson(編輯)，CRCPress,Inc.,Boca:Raton，第67-88頁(1993)。所選方法隨宿主植物而變化，包括化學轉染方法例如磷酸鈣、微生物介導的基因轉移例如農桿菌屬(Horsch，等，(1985)Science227:1229-31)、電穿孔、顯微注射和生物射彈轟擊。植物細胞或組織轉化和植物再生的表達盒和載體以及體外培養方法為已知并可獲得。參見，例如，Gruber,等.，"Vectorsfor:P:l.antTransformation."METHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY,上文，第89-119頁。可通過一種或更多種通常使用的直接導入細胞的技術將已分離多核苷酸或多肽導入植物。該類方案可根據靶向用于基因修飾的生物體、細胞、植物或植物細胞的類型(即單子葉或雙子葉)而變化。用于轉化植物細胞的適當方法包括顯微注射(Crossway等，(1986)Biot.echniques4:320-334;美國專利第6300543號)、電穿孔(Riggs等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606)、直接基因轉移(Paszkowski等，(1984)EMB0J.3:2717-2722)和生物射彈顆粒加速(參見，例如，Sanford等，美國專利第4945050號；W091/10725;和McCabe等，(1988)Biotechnology6:923-926)。也可參見Tomes,等，通過微粒轟擊直接向完整植物細胞轉移DNA(DirectDNATransferintolntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment).第197-213頁，PlantCell,TissueandOrganCulture,FundamentalMethods.0丄Gamborg&G.C.Phillips(編輯)，Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork，1995;美國專利第5736369號(分生組織);Weissinger等，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477;Sanford,等，(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37(洋蔥)；Christ.ou等，(1988)PlantPhysiol.87:671-674(大豆)；Datt.a等.，(1990)Biotechnology8:736-740(稻);Klein等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米);Klein等，(1988)Biotechnology6:559-563(玉米);W()91/10725(玉米)；Klein等，(1988)Plant.Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm等，(1990)Biotechnology8:833-839;和Gordon-Kamm等，(1990)PlantCell2:603-618(玉米)；Hooydaas-VanSlogteren&Hooykaas(1984)Nature(London)311:763-764;Bytebier等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349(百合科(Li:1.iaceae));DeWet等，(1985)TheExperimentalManipulationofOvuleTissues,G.P.Chapman等(編車lj;)，第197-209頁；Longman，NY(花粉)；Ka印pler等，(1990)PlantCellR印orts9:415-418;以及Ka印pler等，(1992)Theor.A卯l.Genet.84:560-566(頸須—介導轉化);美國專利第5693512號(超聲);1)，Hal:l.uin等，(1992)PlantCell4:1495-1505(電穿孔)；Li等，(1993)PlantCellR印ortsl2:250-255;Christou禾口Ford(1995)A麗lsofBotany75:407-413(稻);0sjoda等，(1996)NatureBiotech.14:745-750;農桿菌介導的玉米轉化(美國專利第5981840號);碳化硅頸須方法(Frame等，(1994)PlantJ.6:941-948);激光方法(Guo等，(1995)PhysiologiaPlanta進93:19-24);超聲方法(Bao等，(1997)UltrasoundinMedicine&Biology23:953-959;FinerandFiner(2000)LettApplMicrobiol.30:406-10;Amoah等，(2001)JExpBot52:1135-42);聚乙二醇方法(Krens等，(1982)Nature296:72-77);可使用電穿孔(Froram等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5824-5828)和顯微注射(Crossway等，(1986)Mol.Gen.Genet.202:179-185)轉化單子葉和雙子葉細胞的原生質體；均以引用形式并于本文。農桿菌介導的轉化將表達載體導入植物最普遍使用的方法是基于農桿菌的天然轉化系統。根癌農桿菌(A.tumefaciens)和發根農桿菌(A.rhizogenes)為植物致病性土壤細菌，其可遺傳轉化植物細胞。根癌農桿菌和發根農桿菌的Ti和Ri質粒分別攜帶用于遺傳轉化植物的基因。參見，例如，Kado,(1991)Crit.Rev.PlantSci.10:1。農桿菌屬載體系統和農桿菌屬介導的基因轉移方法闡述于Gruber等，上文；Miki等，上文；和Moloney等，(1989)PlantCe:l.1R印ort.s8:238。相似的，該基因可插入分別來自根癌農桿菌或發根農桿菌的Ti和Ri質粒的T-DNA區。因此,可使用這些質粒如上所述構建表達盒。己知許多控制序列，當其與異源編碼序列偶聯并轉化入宿主有機體時就原始編碼序列的組織/器官特異性而言呈現出保真基因表達。參見，例如，Benfey和Chua，(1989)Science244:174-81。尤其適用于這些質粒的控制序列為該基因在各種靶植物中組成型葉-特異性表達的啟動子。其它可用的控制序列包括來自胭脂堿合酶(N0S)基因的啟動子和終止子。N0S啟動子和終止子存在于質粒pARC2，可購自美國典型培養物保藏中心，編號為ATCC67238。如果使用該體系則來自Ti或Ri質粒之--的毒性(vir)基因也必須存在，或與T-DNA部分一起或通過二元系統(其中vir基因存在于另一獨立的載體中)。該類系統，其中使用的載體以及轉化植物細胞的方法闡述于美國專利第4658082號，美國專利申請第913914號，申請日期1986年10月1日，如美國專利第5262306號中引用，授權于1993年11月16日;禾口Simpson等，(1986)PlantMol.Biol.6:403-15(也被'306專利引用)；其完整內容均以引用形式并于本文。構建之后可將這些質粒置于發根農桿菌或根癌農桿菌并將這些載體用于轉化植物種細胞，其對鐮孢茵屬(Fusarium)或鏈格孢屬(Alternaria)的感染敏感。本發明也涵蓋幾種其它轉基因植物包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、稻、三葉草、巻心菜、香蕉、咖啡、芹菜、煙草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。選擇發根農桿菌還是根癌農桿菌取決于藉此轉化的植物。通常根癌農桿菌為轉化優選的生物體。大多數雙子葉植物、一些裸子植物和少數單子葉植物(例如，Liliales和Arales的某些成員)對根癌農桿菌感染敏感。發根農桿菌的宿主范圍也較寬，包括大多數雙子葉植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成員。單子葉植物的轉化現在取得一些成功。歐洲專利申請第604662A1號公開了用農桿菌轉化單子葉植物的方法。歐洲專利第672752A1公開了用未成熟胚的盾片以農桿菌轉化單子葉植物的方法。Ishida等討論了通過將根癌農桿菌與未成熟胚接觸轉化玉米的方法(NatureBiotechnology14:745-50(1996))。-一經轉化，這些細胞可用于再生轉基因植物。例如，可用這些載體通過損傷植物并將載體引入傷口位點從而感染整個植物。可損傷植物的任何部分，包括葉、莖和根。或者可用這些載體接種外植體形式的植物組織,例如子葉組織或葉盤并在促進植物再生的條件下培養。用發根農桿菌和根癌農桿菌(包含編碼煙曲霉毒素降解酶的基因)接種植物組織轉化的根或枝條可作為植物組織來源，或通過體細胞胚胎發生或器官發生再生煙曲霉毒素抗性轉基因植物。該類再生植物組織的方法的實例公開于Shahin,Theor.Appl.Genet.69:235-40(1985);美國專利第4658082號;Sirapson，等，上文；美國專利申請第913913號和913914號，均申請于1986年10月1日，如美國專利申請第5262306號(授權于1993年11月16日)所引用，完整公開內容以引用形式并于本文。直接基因轉移雖然農桿菌介導轉化的宿主范圍很廣，一些主要的谷類作物種和裸子植物通常對該基因轉移模式具有抗性，盡管最近已在稻中取得一些成功(Hiei，等，(1994)ThePlantJournal6:271-82)。已研發了數種植物轉化的方法(總稱為直接基因轉化)作為農桿菌介導轉化的另一選擇。一種廣泛適用的植物轉化方法為微粒介導轉化，其中將DNA載于約1-4ura微粒的表面。用可將微粒加速至300至600m,Zs速度足以穿透植物細胞壁和膜的生物射彈設備將該表達載體導入植物組織(Sanford等，(1987)Part.Sci.Technol.5:27;Sanford，(1988)TrendsBiotech6:299;Sanford，(1990)Physiol.Plant79:206;和Klein等，(1992)Biotechnology10:268)。另一種向植物物理傳遞DNA的方法為如Zang，等，(1991)BioTechnology9:996中闡述的靶細胞超聲。或者，使用脂質體或原生質球融合體向植物中導入表達載體。參見，Deshayes等，(1985)EMB0J.4:2731;和Christou等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3962。也有報導使用CaCl2沉淀,聚乙烯醇或聚L-鳥氨酸可直接攝取DM至原生質體。參見，例如，Hain，等，(1985)Mol.Gen.Genet.199:161;andDraper,etal.，(1982)PlantCellPhysiol.23:451。已闡述了原生質體、完整細胞和組織的電穿孔。參見，例如，Donn等，(1990)，AbstractsoftheV]:]:th]:nt'1.CongressonPlantCellandTissueCultureI:A:PTC，A2-38，第53頁；D，Halluin，等，(1992)PlantCel14:1495-505;和Spence等，(1994)PlantMol.Biol.24:5卜61。增加SCW多肽的活性和/或水平提供了增加本發明SCW多肽活性和/或水平的方法。可通過向植物提供SCW多肽增加本發明scw多肽的水平和/或活性。可通過向植物中導入編碼scw多肽的氨基酸序列、向植物中導入編碼scw多肽的核苷酸序列或通過選擇編碼本發明scw多肽的基因組基因座不同基因組變體提供SCW多肽。如本文其它部分所述,本領域已知許多向植物提供多肽的方法，包括但不限于向植物中直接導入多肽，向植物中導入(瞬時或穩定)編碼具有次生細胞壁發育活性的多肽的多核苷酸構建體。也應該認識到本發明方法可應用不可在已轉化植物中引導蛋白質或RNA表達的多核苷酸。因此，可通過改變編碼SCW多肽或其啟動子的基因增加SCW多肽的水平和/或活性。參見，例如，Kniiec，美國專利第5565350號；Zarling等，PCT/US93/03868。因此提供了攜帶SCW基因突變的誘變植物，其中該突變可增加SCW基因的表達或增加被編碼SCW多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性。降低SCW多肽的活性和/或水平38提供了通過用表達抑制SCW多肽表達的多核苷酸的表達盒轉化植物細胞降低或消除本發明SCW多肽活性的方法。該多核苷酸可通過防止SCW信使RNA的翻譯直接地或通過編碼抑制編碼SCW多肽的SCW基因的轉錄或翻譯的多肽間接地抑制SCW多肽的表達。抑制或消除植物細胞基因表達的方法為本領域已知，本發明中可使用任何這種方法抑制SCW多肽的表達。根據本發明，如果SCW多肽的蛋白水平低于未經基因修飾或誘變以抑制該SCW多肽表達的植物中相同SCW多肽蛋白水平的70%，則SCW多肽的表達被抑制。在本發明的具體實施方案中，根據本發明被修飾的植物中SCW多肽的蛋白水平低于不是突變體或未經基因修飾以抑制該SCW多肽表達的植物中相同SCW多肽蛋白水平的60%、低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于10%、低于5%或低于2%。可通過例如檢測植物細胞或植物中SCW多肽的表達水平直接地或例如通過測定植物細胞或植物中SCW多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性或通過測定植物的生物量間接地測定scw多肽的表達水平。進行該類檢測的方法闡述于本文其它部分。在本發明的其它實施方案中，通過用包含編碼抑制SCW多肽活性的多肽的多核苷酸的表達盒轉化植物細胞降低或消除SCW多肽活性。根據本發明如果SCW多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性小于未經修飾以抑制該SCW多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性的植物中相同SCW多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性的70%，則該SCW多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性被抑制。在本發明的具體實施方案中，根據本發明被修飾的植物中該scw多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性小于未經修飾以抑制該SCW多肽表達的植物中該相同SCW多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性的60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%或小于5%。當通過本文別處描述的檢測方法不可檢測時則根據本發明SCW多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性被"消除"。測定SCW多肽植物生長和/或次生細胞壁發育活性的方法闡述本文其它部分。在其它實施方案中，可通過破壞SCW多肽的編碼基因降低或消除SCW多肽的活性。本發明涵蓋具有SCW基因突變的誘變植物，其中該突變降低SCW基因的表達或抑制被編碼的scw多肽的植物生長和/或次生細胞壁發育活性。因此，很多方法可用于降低或消除SCW多肽的活性。此外，不止一種方法可用于降低單個scw多肽的活性。降低或消除scw多肽表達的非限制性實例見以下內容。1.基于多核苷酸的方法在本發明的一些實施方案中，用可表達抑制本發明SCW多肽表達的多核苷酸的表達盒轉化植物。本文使用的術語"表達"指基因產物的生物合成，包括所述基因產物的轉錄和/或翻譯。例如，為達到本發明目的，可表達抑制至少一種scw多肽表達的多核苷酸的表達盒為可產生抑制至少一種本發明SCW多肽轉錄和/或翻譯的RNA分子的表達盒。從DNA分子"表達"或"生產"蛋白質或多肽指轉錄或翻譯該編碼序列以產生該蛋白或多肽，而從RNA分子"表達"或"生產"蛋白質或多肽指翻譯RNA編碼序列以產生該蛋白質或多肽。抑制SCW多肽表達的多核苷酸實例如下所示i.有義抑制/共抑制在本發明的一些實施方案中，可通過有義抑制或共抑制抑制SCW多肽的表達。對于共抑制而言，設計一個表達盒表達相應于全部或部分以"有義"方向編碼scw多肽的信使RNA的RNA分子。該RNA分子的過度表達可導致天然基因表達降低。因此，篩選經共抑制表達盒轉化的多種植物系以鑒定呈現SCW多肽表達最大抑制者。用于共抑制的多核苷酸可對應于全部或部分編碼SCW多肽的序列，全部或部分SCW多肽轉錄物的5'和/或3'非翻譯區，或全部或部分編碼SCW多肽轉錄物的編碼序列和非翻譯區兩者。在一些實施方案中多核苷酸包含部分或全部SCW多肽的編碼區，將該表達盒設計成消除該多核苷酸的起始密碼子這樣就不會翻譯任何蛋白質產品。共抑制可用于抑制植物基因表達以產生具有不可檢測蛋白水平的由這些基因編碼的蛋白質的植物。例如，參見，Broin等.，(20()2)PlantCel:[14:1417-1432。共抑制也可用于抑制相同植物中的多種蛋白質的表達。例如，參見，美國專利第5942657號。使用共抑制抑制植物內源基因表達的方法闡述于Flavell等.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3490-3496;Jorgensen等，(1996)PlantMol.Biol.31:957-973;Johansen和Carrington(2001)PlantPhysiol.126:930-938;Broin等，(2002)PlantCell.14:1417-1432;Stout.jesdijk等，(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Yu等，(2003)Phytochemistry63:753-763;和美國專利第5034323號、5283184號和5942657號，均以引用形式并于本文。可通過在表達盒于有義序列的3'位置和多腺苷酸化信號的5'位置導入多聚-dT區增加共抑制效率。參見，美國專利申請公開第20020048814號，以引用形式并于本文。通常這種核苷酸序列與內源基因的轉錄物序列具有實質同--'性，優選大于約65%序列同一性，更優選大于約85%序列同一性，最優選大于約95%序列同一性。參見，美國專利第5283184號和5034323號，以引用形式并于本文。ii.反義抑制在一些實施方案中，可通過反義抑制獲得對SCW多肽表達的抑制。對于反義抑制而言，將該表達盒設計為表達與編碼SCW多肽的信使RNA的全部或部分互補的RNA分子。該反義RNA分子的過度表達可導致原始基因的表達降低。因此,篩選用該反義抑制表達盒轉化的多種植物系以識別呈現SCW多肽表達最大抑制者。用于反義抑制的多核苷酸可對應于編碼SCW多肽的序列的互補體的全部或部分，SCW轉錄物5'和/或3'非翻譯區的全部或部分，或編碼SCW多肽的轉錄物的編碼序列和非翻譯區二者的互補體的全部或部分。此外，該反義多核苷酸可與目標序列完全互補(即與目標序列的互補物同一性為1()()%)或部分互補(即與目標序列的互補物同一性小于100%)。反義抑制可用于抑制相同植物中多種蛋白質的表達。例如，參見美國專利第5942657號。而且，反義核苷酸的部分可用于破壞目標基因的表達。一般而言，可使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸，300、400、450、500、550或更多的核苷酸的序列。使用反義抑制來抑制植物中內源基因表達的方法闡述于，例如Liu等，(2()()2)PlantPhysiol.129:1732-1743和美國專利第5759829號和第5942657號，均以引用形式并于本文。通過在表達盒于反義序列的3'位置和多腺苷酸化信號的5'位置包含多聚-dT區可增加反義抑制的效率。參見美國專利申請公開第20020048814號，以引用形式并于本文。iii.雙鏈RNA干擾在本發明的一些實施方案中，可通過雙鏈RNA(dsRNA)干擾獲得對SCW多肽表達的抑制。對于dsRNA千擾而言，將如....匕所述用于共抑制的有義RNA分子和與有義RNA分子完全或部分互補的反義RNA分子表達在相同的細胞中，從而抑制了對應內源信使RNA的表達。通過設計包含有義序列和反義序列兩者的表達盒完成該有義和反義分子的表達。或者，對有義和反義序列可使用單獨的表達盒。然后篩選用單個dsRNA千擾表達盒或復數個表達盒轉化的多種植物系以鑒別呈現SCW多肽表達最大抑制的植物系。使用dsRNA干擾抑制內源植物基因表達的方法闡述于Waterhouse等.，(1998):Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13959-13964，Liu等，(2002)PlantPhysiol.129:1732-1743，以及WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631和WO00/49035，均以引用形式并于本文。iv.發夾RNA干擾和含內含子發夾RNA干擾在本發明的一些實施方案中，可通過發夾RNA(hpRNA)干擾或含內含子發夾RNA(ihpRNA)干擾抑制SCW多肽的表達。這些方法可高效抑制內源基因的表達。參見Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38，及其中引用的文獻。對于hpRNA干擾,將表達盒設計為表達可與其自身雜交以形成包含單鏈環區和堿基配對莖的發夾結構的:rm分子。該堿基配對莖區包含對應于全部或部分編碼表達被抑制的基因的內源信使RNA的有義序列，和與該有義序列完全或部分互補的反義序列。因此，該分子的堿基配對莖區通常決定了該RNA千擾的特異性。hpRNA分子可高效抑制內源基因的表達，它們所誘導的RNA干擾可遺傳至植物后代中。參見，例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38。用于hpRNA干擾抑制或沉默基因表達的方法闡述于例如，Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk等,(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38;Pandolfini等，:BMCBiotechnology3:7，美國專利申請公開第20030175965號；均以引用形式并于本文。hpRNA構建體沉默體內基因表達的有效性的瞬時分析闡述于Panstruga，et.al.，(2003)Mol.Biol.R印.30:135-140，通過引用并于本文。對于ihp:RM而言，該干擾分子具有與hp:RM相同的通用結構，但是該RNA分子還包含可在表達該ihpRNA的細胞內被剪接的內含子。使用內含子可在剪接后最小化發夾RNA分子環的大小并且增加千擾效率。參見，例如，Smith等，(2000)Nature407:319-320。事實上Smith等人證實了使用ihpRNA介導干擾100%抑制內源基因的表達。使用ihpRNA干擾抑制內源植物基因表達的方法闡述于，例如，Smith等，(2000)Nature407:319-320;Wesley等，(2001)PlantJ.27:58卜590;Wang和Wat.erhouse(2001)Curr.Opin.PlantBiol.5:146-150;Waterhouse和Helliwell(2003)Nat..Rev.Genet.4:29-38;Helliwell和Waterhouse(2003)Methods30:289-295,以及美國專利申請公開第20030180945號，均以引用形式并于本文。用于hpRNA干擾的表達盒還可設計為該有義序列和反義序列不對應于內源RNA的形式。在這一實施方案中，該有義序列和反義序列在環序列側翼，其包含對應于目標基因的全部或部分內源信使RNA的核苷酸序列。因此,是該環區決定了RNA干擾的特異性。參見，例如，WO02/00904，以引用形式并于本文。v.擴增子介導的干擾擴增子表達盒包含植物病毒來源序列，其包含全部或部分目標基因但一般不是該天然病毒的全部基因。存在于該表達盒轉錄產物中的該病毒序列允許轉錄產物引導自身的復制。由擴增子產生的轉錄物相對于目標序列(即該SCW多肽的信使RNA)可為有義或反義。使用擴增子抑制內源植物基因表達的方法闡述于，例如，Angell和Baulcombe(1997)EMBOJ.16:3675-3684，Angell和Baulcombe(1999)PlantJ.20:357-362，及美國專利第6646805號，均以引用形式并于本文。vi.核酶在一些實施方案中，由本發明表達盒表達的多核苷酸為催化性RNA或具有對SCW多肽的信使RNA特異的核酶活性。因此，該多核苷酸引起該內源信使RNA的降解,導致SCW多肽表達降低。這一方法闡述于，例如，美國專利第4987071號，以引用形式并于本文。vii.小干擾RNA或微小RNA在本發明的一些實施方案中，可通過表達編碼微小RNA(miRNA)的基因進行RNA千擾從而抑制SCW多肽的表達。miRNA為由約22個核糖核苷酸組成的調節劑。miRNA高效抑制內源基因的表達。參見，例如，Javier等，(2003)Nature425:257-263，以引用形式并于本文。對于miRNA千擾而言，將該表達盒設計為表達建模于內源miRNA基因上的RNA分子。該miRNA基因編碼形成含有與另一內源基因(目標基因)互補的22-核苷酸序列的發夾結構的RNA。對于SCW表達抑制而言，該22-核苷酸序列選自SCW轉錄物序列并含有所述SCW序列有義方向的22個核苷酸和與該有義序列互補的對應反義序列的21個核苷酸。miRNA分子可高效抑制內源基因的表達并且它們誘導的RNA千擾可遺傳至植物后代。2.基于多肽的基因表達抑制在一個實施方案中，多核苷酸編碼與編碼SCW多肽基因結合的鋅指蛋白，導致該基因表達降低。在具體的實施方案中，該鋅指蛋白與scw的調控區結合。在其它實施方案中，該鋅指蛋白與編碼SCW多肽的信使RNA結合并防止其翻譯。篩選鋅指蛋白靶向位點的方法闡述于,例如，美國專利第6453242號，使用鋅指蛋白抑制植物基因表達的方法闡述于，例如，美國專利申請公開第20030037355號，均以引用形式并于本文。3.基于多肽的蛋白活性抑制在本發明的一些實施方案中，所述多核苷酸編碼與至少一種SCW多肽結合的抗體并減少scw多肽的次生細胞壁形成活性。在另一個實施方案中，抗體的結合通過細胞數量控制機制導致抗體-SCW復合物周轉增加。在植物細胞中表達抗體和通過抗體的表達和與植物細胞蛋白結合來抑制分子途徑為本
技術領域：
已知。參見，例如，Conrad和Sonnewald(2003)NatureBiotech.21:35-36，以引用形式并于本文。4.基因破壞(disruption)在本發明的一些實施方案中，通過破壞編碼SCW多肽的基因降低或消除SCW多肽的活性。可通過本
技術領域：
已知的任何方法破壞編碼scw多肽的基因。例如，在一個實施方案中，通過轉座子標記技術阻斷該基因。在另一個實施方案中，通過使用隨機或靶向誘變誘變植物并篩選次生細胞壁發育活性降低的植物以破壞該基因。i.轉座子標記技術在本發明的一個實施方案中，使用轉座子標記技術降低或消除一個或更多個SCW多肽的SCW活性。轉座子標記技術包括將轉座子插入內源SCW基因以降低或消除SCW多肽的表達。"SCW基因"意指編碼依據本發明的SCW多肽的基因。42在該實施方案中，通過將轉座子插入編碼SCW多肽基因的調控區或編碼區降低或消除一個或更多個SCW多肽的表達。可使用位于SCW基因的外顯子、內含子、5'或3'非翻譯序列、啟動子或任何其它調控序列內的轉座子降低或消除被編碼的SCW多肽的表達和/或活性。用于轉座子標記植物中特異基因的方法為本
技術領域：
熟知。參見，例如，Maes等.，(1999)TrendsPlantSci.4:90-96;Dharmapuri和Sonti(1999)FEMSMicrobiol.Lett.179:53-59;Meissner等，(2000)PlantJ.22:265-274;Phoga等，(2000)J.Biosci.25:57-63;Walbot(2000)Curr.()pin.PlantBiol.2:103-107;Gai等，(2000)NucleicAcidsRes.28:94-96;Fitzmaurice等，(1999)Genetics153:1919-1928)。此夕卜，用于在已選擇基因中篩選Mu插入的TUSC步驟已闡述于Bensen等，(1995)PlantCell7:75-84;Mena等，(1996)Science274:1537-1540;和美國專利第5962764號；均以引用形式并于本文。ii.活性降低的突變植物降低或去除植物內源基因表達的其它方法也為本領域已知并可相似的應用于本發明。這些方法包括其它形式的誘變作用，例如反求遺傳學意義(用PCR)上使用的用于鑒別內源基因缺失植物系的甲磺酸乙酯誘導的誘變作用、缺失誘變和快中子缺失誘變。這些方法的實例見0hshima等.，(1998)Virology243:472-481;0kubara等，(1994)Genetics137:867-874;以及Quesada等，(2000)Genetics154:42卜436;均以引用形式并于本文。此外,篩選化學誘導突變的快速和自動方法-TILLING(靶向基因組中誘導的局部損害(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes))，(使用變性:HPLC或選擇性核酸內切酶消化已選擇的PCR產物)也可用于本發明。見McCallum等，(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457，以引用形式并于本文。可影響被編碼蛋白的基因表達或干擾其功能(次生細胞壁形成活性)的突變為本領域已知。基因外顯子中的插入突變通常形成無效突變體。保守殘基的突變在抑制被編碼蛋白的次生細胞壁形成活性中是特別有效的。已闡述了適于以消除次生細胞壁發育活性為目標的誘變作用的植物scw多肽的保守殘基。可根據本領域熟知的步驟分離該類突變體，并可通過遺傳雜交堆疊(stack)不同SCW基因座中的突變。參見，例如，Gruis等，(2002)PlantCe:l114:2863-2882。在本發明的另一實施方案中，由于基因倒置和重復基因座重組顯性突變體可用于引起RNA沉默。參見，例如，Kusaba等，(2003)PlantCell15:1455-1467。本發明涵蓋降低或去除一個或更多個SCW多肽活性的其它方法。改變或突變植物基因組核苷酸序列其它方法的實例為本領域已知并包括但不限于使用RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復載體、雜雙鏈寡核苷酸、自身互補RNA:DNA寡聚核苷酸和重組劑(re固bino卿ic)寡核苷堿基。所使用的該類載體和方法為本領域已知。參見，例如，美國專利第5565350號；5731181號；5756325號;5760012號；5795972號和5871984號，均以引用形式并于本文。也可參見W()98/49350、WO99/07865、WO99/25821,以及Beetham等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8774-8778;均以引用形式并于本文。iii.調節植物生長和/或次生細胞壁發育活性在具體方法中，通過增加植物中SCW多肽的水平或活性增加植物中次生細胞壁發43育基因的水平和/活性。增加植物中SCW多肽的水平和/或活性的方法闡述于本文其它部分。簡略而言，該類方法包括向植物提供本發明SCW多肽并藉此增加SCW多肽的水平和/或活性。在其它實施方案中，可通過將包含本發明SCW核苷酸序列的多核苷酸導入植物中從而提供編碼SCW多肽的SCW核苷酸序列、表達該SCW序列、增加該SCW多肽的活性并藉此增加植物或植物部分的次生細胞壁形成。在其它實施方案中，導入植物中的該sew核苷酸構建體被穩定整合入該植物的基因組中。在其它方法中，可通過增加植物中SCW多肽的水平和./或活性增加植物組織的細胞數量和生物量。該類方法詳細闡述于本文其它部分。在一個該類方法中，將scw核苷酸序列導入植物中，該SCW核苷酸序列的表達降低SCW多肽的活性并藉此增加植物生長和/或植物或植物部分的次生細胞壁發育。在其它實施方案中，該導入植物的scw核苷酸構建體被穩定整合入該植物的基因組中。如上文所述，本領域技術人員可識別用于調節植物生長和/或植物中次生細胞壁發育多核苷酸和多肽的水平/活性的適當啟動子。本實施方案的示例性啟動子闡述于本文其它部分。因此，本發明進一步提供了相對于對照植物組織的植物生長和/或次生細胞壁發育具有被修飾的植物生長和/或次生細胞壁發育的植物。在一個實施方案中，本發明植物中本發明sew多肽的水平/活性增加并因此植物生長和/或該植物組織中的次生細胞壁發育增加。在其它實施方案中，本發明植物中本發明scw多肽水平被降低或消除并因此植物生長和/或該植物組織中次生細胞壁發育降低。在其它實施方案中，該類植物具有被穩定整合入它們基因組的核酸分子，該分子包含與驅動該植物細胞中表達的啟動子可操作地連接的本發明的SCW核苷酸序列。iv.調節根發育本文提供了調節根發育的方法。通過"調節根發育"預期達到與對照植物相比植物根發育的任何改變。這些根發育的改變包括但不限于初生根的生長速率、新生根重量、側根和不定根形成的范圍、維管系統、分生組織發育或徑向膨脹的改變。特別地,最期望的結果是具有更強維管系統的根，所述更強的維管系統改善了植物的站立性并因此降低根倒伏以及對害蟲的敏感性更低。本文提供了調節根發育的方法。該方法包含調節植物中SCW多肽的水平和/或活性。在一個方法中，向植物提供本發明的scw序列。在另--個方法中，通過向植物中導入包含本發明SCW核苷酸序列的多核苷酸從而提供SCW核苷酸序列、表達該SCW序列并藉此修飾根發育。在又另一個方法中，導入該植物的SCW核苷酸構建體被穩定整合入該植物的基因組中。在其它方法中，通過改變植物中SCW多肽的水平或活性調節根發育。SCW活性的增加可導致根發育的至少一種或更多種以下改變，包括但不限于相對于對照植物根分生組織更大、根生長增加、徑向膨脹增強、維管系統增強、根分枝增加、不定根更多和/或新生根重量增加。如本文所使用，術語"根生長"涵蓋單子葉和雙子葉植物中組成其發育不同階段根體系的不同部分生長的所有方面。也應該理解的是根生長增強可由其一個或更多個部分包括初生根、側根、不定根等的生長增強引起。測量根體系中該發育改變的方法為本領域已知。參見，例如，美國專利申請第2003/0074698號和Werner等，(2001)PNAS18:10487-10492，二者均以引用形式并于本文。如上所述,本領域技術人員可識別用于調節植物中根發育的適當啟動子。這一實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子和根優選啟動子。示例性根優選啟動子闡述于本文其它部分。通過增加SCW多肽的活性和/或水平刺激根生長并增加根質量也可用于提高植物的站立穩定性。術語"倒伏抗性"或"站立穩定性"指植物將其自身固定于土壤中的能力。對于具有直立或半直立生長習慣的植物而言，該術語也指在不利(環境的)條件下保持立式位置的能力。這一'性狀與根系統的大小、深度和形態學有關。此外,通過增加SCW多肽的水平和/或活性刺激根生長并增加根質量也可用于促進外植體的體外繁殖。而且，由SCW活性的水平和./或活性增加引起的更高根生物量的產生對產量具有直接作用并對由根細胞或轉基因根細胞或所述轉基因根細胞的細胞培養物生產的化合物的生產具有間接作用。由根培養物生產的一種相關化合物的實例為紫草素，通過該方法可有利增強其產量。因此本發明進一步提供與對照植物的根發育相比根發育被調節的植物。在一些實施方案中，本發明植物的本發明sew多肽的水平/活性增強并且根生長和/或根生物量增加。在其它實施方案中，該類植物將包含與驅動該植物細胞中表達的啟動子可操作地連接的本發明SCW核苷酸序列的核酸分子穩定整合入它們的基因組。v.調節枝條和葉發育本發明也提供調節植物中枝條和葉發育的方法。"調節枝條和/或葉發育"意指植物枝條和/或葉發育中的任何改變。這些枝條和/或葉發育的改變包括但不限于根分生組織發育、葉數量、葉大小、葉和莖維管、節間長度和葉衰老的改變。如本文所使用，"葉發育"和"枝條發育"涵蓋單子葉和雙子葉植物中在其發育不同階段分別組成葉體系和枝條體系的不同部分的生長的所有方面。測量枝條和葉體系中這些發育改變的方法為本領域已知。參見，例如Werner等，(2001)PNAS98:10487-10492和美國專利申請第2003/0074698號，均以引用形式并于本文。調節植物中枝條和/或葉發育的方法包括調節本發明SCW多肽的活性和/或水平。在一個實施方案中提供了本發明的scw序列。在其它實施方案中，可通過向植物中導入包含本發明scw核苷酸序列的多核苷酸以提供本發明scw核苷酸序列、表達該scw序列并藉此修飾根和/或葉發育。在其它實施方案中，導入植物的該SCW核苷酸構建體被穩定整合入該植物的基因組中。在具體的實施方案中，通過降低植物中SCW多肽的水平和/或活性調節枝條和/或葉發育。sew活性的降低可引起與對照植物相比至少一種或更多種以下枝條和Z或葉發育的改變，包括但不限于葉數量減少、葉表面減少、維管減少、節間變短和生長矮小以及葉衰老推遲。如上文所述，本領域技術人員可識別用于調節植物枝條和葉發育的適當啟動子。該實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子、枝條-優選啟動子、枝條分生組織-優選啟動子和葉-優選啟動子。示例性啟動子已闡述于本文其它部分。降低植物中SCW活性和/或水平可引起節間變短和生長矮小。因此，本發明方法可45用于生產矮生植物。此外,如上文所述，調節植物中SCW活性可調節根和枝條二者的生長。因此本發明進一步提供了改變根/枝條比例的方法。可通過降低植物中SCW多肽的水平和Z或活性進一步調節枝條或葉的發育。因此，本發明進一步提供與對照植物相比根和/或葉發育被調節的植物。在一些實施方案中，本發明植物中本發明sew多肽水平/活性增強，枝條和Z或葉發育被改變。這些改變包括但不限于與對照植物相比葉數量增加、葉表面增加、維管形成增加、節間變長和植物增高以及葉衰老的改變。在其它實施方案中，本發明植物具有水平/活性降低的本發明sew多肽。vi.調節生殖組織發育本文提供了調節生殖組織的方法。在一個實施方案中提供了調節植物中花發育的方法。"調節花發育"意指與其中sew活性或水平未被調節的對照植物相比植物生殖組織結構的任何改變。"調節花發育"進一步包括與其中scw活性或水平未被調節的對照植物相比植物生殖組織發育時間安排的任何改變(即花發育時間的推遲或加速)。肉眼可見的改變包括生殖組織大小、形狀、數量或位置，這些結構形成的發育時間段或在環境壓力下維持或進行開花過程的能力的變化。微觀改變可包括組成該生殖組織的細胞類型或形狀的改變。調節植物花發育的方法包括調節植物中的SCW活性。在一種方法中提供了本發明的scw序列。可通過向植物中導入包含本發明scw核苷酸序列的多核苷酸以提供scw核苷酸序列、表達該scw序列并藉此調節花發育。在其它實施方案中，該導入植物的scw核苷酸構建體被穩定整合入該植物的基因組中。在具體方法中，通過降低植物中SCW多肽的水平或活性調節花發育。SCW活性的降低可引起與對照植物相比至少--種或更多種以下花發育的改變，包括但不限于開花推遲、花數量減少、部分雄株不育和結實率(seedset)降低。誘導開花推遲或抑制開花可用于提高飼料作物例如苜蓿的產量。測量這些花發育的發育改變的方法為本領域已知。參見，例如，Mouradov等，(2()02)ThePlantCell—SI11-S130,以引用形式并于本文。如上所述,本領域技術人員可識別用于調節植物花發育的啟動子。用于該實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子、誘導型啟動子、枝條-優選啟動子和花序-優選啟動子。在其它方法中，通過增強本發明SCW序列的水平和/或活性調節花發育。該類方法可包括將SCW核苷酸序列導入植物并增強該SCW多肽的活性。在其它方法中，導入植物的scw核苷酸構建體被穩定整合入植物的基因組中。增強本發明scw序列的表達可調節應激期間的花發育。該類方法闡述于本文其它部分。因此，本發明進一步提供了與對照植物的花發育相比花發育被調節的植物。組成包括本發明scw多肽水平或活性被增強并且花發育被改變的植物。組成也包括本發明SCW多肽水平/活性被增強的植物，其中該植物可在應激期間維持或進行開花過程。也提供可使用本發明SCW序列增加種子大小和/或重量的方法。該方法包括增強植物或植物部分例如種子中scw序列的活性。種子大小和/或重量的增加包括該種子大小或重量的增加和/或一個或更多個種子部分包括例如胚、胚乳、種皮、糊粉層或子葉的大小或重量的增加。如上所述，本領域技術人員可識別用于增加種子大小和/或種子重量的啟動子。用于該實施方案的示例性啟動子包括組成型啟動子、誘導型啟動子、種子-優選啟動子、胚_優選啟動子和胚乳_優選啟動子。用于降低植物中種子大小和/或種子重量的方法包括降低植物中的SCW活性。在一個實施方案中，可通過向植物中導入包含本發明SCW核苷酸序列的多核苷酸以提供SCW核苷酸序列、表達該SCW序列并藉此提高種子重量和/或大小。在其它實施方案中，導入植物的SCW核苷酸構建體被穩定整合入該植物的基因組中。應進一步認識到也可通過增加幼苗的生長速度或增強早期活力來增加種子大小和/或重量。如本文所使用，術語"早期活力"指植物在早期發育階段快速生長的能力并與發芽后成功建立良好發育的根體系和良好發育的光合器官相關。此外，與對照相比，種子大小和/或重量的增加也可引起植物產量的增加。因此,本發明進一步提供與對照植物相比種子重量和./或種子大小增加的植物。在其它實施方案中還提供了活力和植物產量增加的植物。在一些實施方案中，本發明植物中本發明scw多肽的水平/活性增強并且種子重量和/或種子大小增加。在其它實施方案中該類植物具有被穩定整合入它們的基因組中的包含與驅動該植物細胞中表達的啟動子可操作地連接的scw核苷酸序列的核酸分子。Vii.用于SCW啟動子多核苷酸的使用方法包含本發明公開的SCW啟動子及其變異體和片段的多核苷酸當與DNA構建體裝配在一起(這樣該啟動子序列可與包含相關多核苷酸的核苷酸序列可操作地連接)時可用于任何宿主細胞的基因操作，優選植物細胞。以這一方式，在表達盒中與在相關宿主細胞中表達的相關多核苷酸序列一起提供本發明scw啟動子多核苷酸。本發明scw啟動子序列可在包含具有次生壁的細胞的多種組織中表達，因此該啟動子序列可用于特別是在包含次生壁細胞中調節相關多核苷酸的時間和/或空間表達。合成雜合啟動子區為本領域已知。該區包含與其它多核苷酸啟動子元件可操作地連接的多核苷酸的上游啟動子元件。在本發明的一個實施方案中，通過包含本發明scw啟動子序列的合成雜合啟動子或其變異體或片段(與異源啟動子的上游啟動子元件可操作地連接)控制異源序列的表達。已鑒定出參與植物防御系統的--匕游啟動子元件，其可用于產生合成啟動子。參見，例如，Rushton等，(1998)Curr.0pin.PlantBiol.1:311-315。或者，合成SCW啟動子序列可包含存在于SCW啟動子序列中的上游啟動子元件的副本。應認識到本發明啟動子序列可與其天然SCW編碼序列-一起使用。包含與其天然SCW基因可操作地連接的SCW啟動子的DNA構建體可用于轉化任何相關植物以得到期望的表型改變,例如調節細胞數量、調節根、枝條、葉、花和胚的發育、應激耐受力和本文其他部分闡述的任何其他表型的改變。本文公開的啟動子核苷酸序列和方法可用于調節宿主植物中任何異源核苷酸序列的表達以改變該植物的表型。人們感興趣的各種表型改變包括改變植物的脂肪酸組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御機制等。可通過提供植物中異源產物的表達或增加內源產物的表達得到這些結果。或者，可通過提供一種或更多種內源產物(尤其是植物中的酶或輔因子)表達的降低得到這些結果。這些變化可引起被轉化植物表型的改變。相關基因反映商業市場和參與農作物研發者的興趣。相關農作物和市場發生變化，發展中國家開放世界市場,新的農作物和技術就會出現。此外，隨著我們對于農作物性狀和特性例如產量和雜交優勢認識的增加，用于轉化的基因選擇隨之變化。相關基因的大致分類包括，例如，參與信息的基因，例如鋅指，參與通信的基因，例如激酶以及參與管家的基因，例如熱休克蛋白。更具體的轉基因分類，例如，包括編碼農作物重要性狀、昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑抗性、不育性、谷粒特性和商業產品的基因。相關基因一般包括涉及油、淀粉、糖或營養物代謝以及影響核仁大小、蔗糖載量等的基因。在某些實施方案中，本發明核苷酸序列可與其他相關多核苷酸序列組合(堆疊)以產生具有期望表型的植物。該產生的組合可包括任何一種或更多種相關多核苷酸的多拷貝。本發明多核苷酸可與任何基因或基因組合堆疊以生產具有多種期望性狀組合的植物，包括但不限于動物飼料需要的性狀例如高油基因(例如，美國專利第6232529號)；平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美國專利第5990389號、5885801號、5885802號和5703409號);大麥高賴氨酸(Williamson等，(1987)Eur.J.Biochera.165:99-106;和WO98/20122);高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等，(1986)J.Biol.Chem.261:6279;Kirihara等，(1988)Gene71:359;Musumura等，(1989)PlantMol.Biol.12:123));消化性增強(例如，被修飾的貯存蛋白(美國專利申請序列號10/053410,2001年11月7日申請)；硫氧還蛋白(美國專利申請序列號10/005429，2001年12月3日申請))，其公開內容均以引用方式并于本文。本發明的多核苷酸也可與下列性狀堆疊有利于昆蟲、疾病或除草劑抗性的性狀(例如，蘇云金芽孢桿菌(Bacillust.huringiensis)毒性蛋白(美國專利第5366892號;5747450號;5737514號;5723756號;5593881號;Geiser等.，(1986)Gene48:109);凝集素(VanI)arame等.，(1994)PlantMol.Biol.24:825);煙曲霉毒素解毒基因(美國專利第5792931號);無毒和疾病抗性基因(Jones等，(1994)Science266:789-Martin等，(1993)Science262:1432;Mindrinos等，(1994)Cell78:1089);可產生除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體，例如S4和/或I--Ira突變；谷氨酰胺合酶抑制劑,例如膦絲菌素或basta(例如，bar基因)；草甘磷(glyphosate)抗性(EPSPS基因))；以及有利于加工處理或加工產品的性狀，例如高油(例如，美國專利第6，232，529號)；被改良的油類(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國專利第5952544號；W094/11516));被改良的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分枝酶(SBE)和淀粉脫枝酶(SDBE));聚合物或bi鄰:l.astics(例如美國專利第5602321號；P-酮硫解酶，聚羥基丁酸合酶和乙酰乙酰CoA還原酶(Schubert等，(1988)J.Bacterid.170:5837-5847)促進聚羥基鏈烷酸酯的表達(PHAs))，其公開以引用形式并于本文。也可將本發明的多核苷酸與影響農業性狀(例如雄株不育(例如參見美國專利第5583210號)、莖強度、開花時間)或轉化技術性狀例如細胞周期調節或基因打靶(例如，WO99/61619;W()00/17364;WO99/25821)的多核苷酸組合，其公開以引用形式并于本文。在一個實施方案中，相關序列促進植物生長和/或農作物產量。例如，相關序列包括可改良初生根或側根系統的農業重要基因。這些基因包括但不限于養分/水運輸物和生長誘導物。該類基因的實例包括但不限于玉米細胞膜HtATP酶(M:HA2)(Frias等，(1996)PlantCell8:1533-44);AKTl,擬南芥(Arabidopsis)中的鉀攝取器官的組分(Spalding等，(1999)JGenPhysiol113:909-18);可在根頂端細胞中活化細胞分裂周期的RML基因(Cheng等.，(1995)PlantPhysiol108:881);玉米谷氨酰胺合成酶基因48(Sukanya等，(1994)PlantMolBiol26:1935-46)和血紅蛋白(Duff等，(1997)J.Biol.Chem27:16749-16752，Arredondo-Peter等，(1997)PlantPhysiol.115:1259-1266;Arredondo-Peter等，(1997)PlantPhysiol114:493-500及其中引用的參考文獻)。相關序列也可用于表達負性影響于根發育的基因的反義核苷酸序列。此外，除了使用傳統的育種方法也可遺傳學改變農業上重要的性狀例如油、淀粉和蛋白含量。改良包括增加油酸、飽和和不飽和油的含量、增加賴氨酸和硫的水平，提供必須氨基酸及對淀粉的改良。IIordothionin蛋白的改良闡述于美國專利第5703049號、5885801號、58858()2號核5990389號，以引用形式并于本文。另一個實例為由大豆2S白蛋白編碼的富含賴氨酸和/或硫的種子蛋白(闡述于美國專利第5850016號)以及來自大麥的糜蛋白酶抑制劑(闡述于Williamson等，(1987)Eur.J.Biochem.165:99-106)，其公開內容均以引用形式并于本文。可通過定點誘變得到編碼序列的衍生物以增加被編碼多肽中預選定氨基酸的水平。舉例而言，編碼大麥高賴氨酸多肽(BHL)的基因來源自大麥糜蛋白酶抑制劑，美國專利申請序列號08/740682，1996年11月1日申請和W098/20133，其公開內容均以引用形式并于本文。其它蛋白質包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，例如來自向日葵種子(Lilley等，(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedst.uffs,Applewhite編車骨(AmericanOilChemistsSociety,Champaign,Illinois)，497-502頁；以引用考形式并于本文)、玉米(Pedersen等，(1986)J.Biol.Chem.261:6279;Kirihara等，(1988)Gene71:359;二者均以引用形式并于本文);和稻(Musumura，等，(1989)PlantMol.Biol.12:123,以引用形式并于本文)。其它農業上重要的基因編碼乳膠、Floury2、生長因子、種子貯藏因子和轉錄因子。昆蟲抗性基因可編碼對嚴重影響產量的害蟲的抗性，例如食根蟲(rootw翻)、切根蟲(cutworm)、歐洲玉米螟(EuropeanCornBorer)等。該類基因包括，例如，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因(美國專利第5366892號、574745()號、5736514號、57237S6號、55938S1號以及Geiser等，(1986)Gene48:109);等等。編碼疾病抗性性狀的基因包括脫毒基因，例如對抗fumonosin(美國專利第5792931號);無毒力(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等，(1994)Science266:789;Martin等，(1993)Science262:1432;andMindrinos等(1994)Ce:ll78:1089);等等。除草劑抗性性狀可包括編碼用于抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草劑抗性的基因，尤其是磺酰脲類除草劑(例如，包含引起該抗性的突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和Z或Hra突變)、編碼用于抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑抗性的基因，例如膦絲菌素或basta(例如，bar基因)或其它本領域已知基因。bar基因編碼除草劑basta抗性，nptll基因編碼對抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性，ALS-基因突變體編碼對除草劑氯磺隆的抗性。也可在表達盒中編碼不育基因并提供物理去雄的另一選擇。用于該方法的基因的實例包括雄株組織-優選基因和具有雄柱不育表型的基因如QM，闡述于美國專利第5583210號。其它基因包括激酶和編碼對雄株或雌株配子體發育具有毒性的化合物的基因。谷粒的質量反映在性狀中，例如飽和和不飽和油的水平和類型、必需氨基酸的質量和數量以及纖維素的水平。在玉米中，改良hordothionin蛋白闡述于美國專利第5703049號、5885801號、5885802號禾口5990389號。商業性狀也可在一個或復數個可增加例如乙醇產生用淀粉或提供蛋白表達的基因上編碼。轉化植物的另一個重要的商業用途為生產聚合物和bioplastics,例如美國專利第5602321號中所述。基因例如13-酮硫解酶、PHB酶(多羥基丁酸合酶)和乙酰乙酰CoA還原酶(參見，Schubert等，(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847)可促進聚羥基鏈烷酸酯(PHAs)的表達。外源產物包括植物酶和產物以及來自于包括原核細胞和其它真核細胞在內的其它來源的酶和產物。這些產物包括酶、輔因子、激素等。可增加蛋白質的水平尤其是具有改良的氨基酸分布以提高植物營養價值的改良蛋白質。這可通過表達該類氨基酸含量提高的蛋白完成。可通過參考以下非限制性實施例更好的理解本發明。本領域技術人員應理解可在不偏離如本文所公開和要求的本發明精神和范圍的前提下實施本發明的其它實施方案。實施例實施例l.分離SCW序列在為涉及玉米中植物細胞壁形成而由此鑒定的基因中，纖維素合酶(CesA)基因，CesAlO，CesAll和CesA12以及另一基因，脆莖_2(Bk2)，是特別令人感興趣的，因為它們涉及次生細胞壁形成(Appenzeller，etal.，(2004)"Cellulosesynthesisinmaize:isolationandexpressionanalysisofthecellulosesynthase(CesA)genefamily";Cellulose11:287-299;Ching，etal.，(2006)"Brittlestalk2encodesaputativeglycosylphosphat.idylinositol-anchoredproteinthatfectsmechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycellwalls";Planta224:1174-1184)。因此，我們使用這四種基因作為參考組，以鑒定表達模式與這些參考基因的表達模式強相關的其它基因。用這種方法鑒定的基因被認為在次生細胞壁形成中起重要作用。圖3顯示了這四種參考基因橫跨12種關鍵玉米組織類型的表達模式的概要。注意在莖組織中的特征性表達，其是玉米中次生細胞壁形成的關鍵位置。實施例2.具有與參考某因強相關表達:的某因的鑒定這些基因的管理(curation)依賴于它們的表達模式與橫跨MPSS數據集中大量文庫的參考組的表達模式的相似性。Pioneer-DuPont具有覆蓋寬范圍的植物結構和生物學的227種玉米組織/處理MPSSTM樣品的廣泛的專有集合。MPSS樣品的數據排列在一張大表中，針對其可進行相關性分析。皮爾遜相關系數橫跨227種樣品而計算，所述227種樣品用于以使得每對由來自參考的一個成員和來自剩余標簽的第二成員組成的方式的配對。這樣產生了每個受試標簽命中(hit.)的四個R和R2值的列表，四種參考基因中的每種一個(特別是對于用于那些基因的標簽)。這四個值然后被平均，并以降序排列。那些在列表頂端的將具有橫跨玉米MPSS樣品組的最類似于該四種參考基因的表達模式。為了本研究的目的，建立了大約().7的最小截斷平均R值。存在具有低于它的相關性的另外的標簽，但是超過該閾值的那些被選擇用于繼續分析。實施例3.關于相關基因的信息的管理(curation)利用專有和公共基因組和轉錄物序列資源將高得分MPSS標簽作圖到它們的相應基因或起源。一些MPSS標簽證明是參考基因的替代標簽,并且因此被排除。當存在模糊的標簽與基因的匹配時，通過參考其它表達數據發現感興趣的基因，所述其它表達數據例如來自ESTs的,其中莖組織的表達特別被認為是正確基因的證據。由此獲得該基因和它的基因產物，鑒定啟動子，轉錄物區域,()RFs，和概念上的翻譯的最佳描述。這通常需要手動管理(curation)。然后，該基因的圖譜位置也被確定，主要利用專有的PHDvl.2m鄰。該基因的概念--匕的翻譯被重新分析以識別它們相應的可能的功能。為本目的可使用Swiss-Prot數據庫和各種計算機工具和其它資源。實施例4.利用反求遺傳學確證棊岡發現候詵物次生壁形成基因(SCW)數據表還顯示了通過選擇的敲除(knock-out)誘變產生的用于驗證的當前的優先化(prioritization)(反求遺傳學)。反求遺傳學資源保證了已測序的基因候選物的功能分析。Pioneer的TUSC系統是利用玉米可轉座元件家族，增變基因(Mutator),M:eeleyandBriggs(1995)<<;Reversegeneticsformaize"MaizeGenet.Coop.Newsl.69:67-82，產生的插入突變體的文庫。這是一種利用來鑒定用于選擇的基因序列的轉座子插入突變體的已有專利的方法(BriggsandMeeley，US專利號5，962，764)。為了表征候選基因，通過利用從公共和專有序列數據庫可獲得的玉米基因組數據，將用于每種優先化scw候選物的工作基因模型翻譯為最佳的可獲得的基因組序列模型。然后對于要進行TUSC篩選過程的每種候選序列設計基因特異性PCR引物。這些引物成對地對非突變基因組DNA進行驗證，并且在針對來自TUSC群體的DNA的重復(iterative)插入篩選中，每種引物然后與通用的增變基因特異的引物配對。在來自選擇的TUSC系的F2子代之間確認在本程序中鑒定的各個插入等位基因的遺傳率，并且為了田間繁殖回收來自每種陽性系的種子。田間材料限定了分離的玉米家族，其中對于SCW基因的插入(無效)等位基因是遺傳分離的。增變基因插入位置然后通過PCR和DNA測序而確定。遺傳上，每種突變等位基因進行幾輪的回交以清除背景突變，并且接下來自交來產生在規定的遺傳背景中的分離的突變體家族和純合SCW基因突變體儲庫。也可進行等位基因間雜交，只要有可能幫助增加選擇的突變基因座的表型分析的速度。SCW成分的表型分析通過將無效突變體與它們的適當對照比較來進行，并且頂端的候選物對于每種候選基因對SCW形成/沉積的貢獻的更詳細的研究是先進的。可利用幾種測試,例如節間機械強度,莖壁中的纖維素濃度，和或許掃描電子顯微鏡術,來確定次生壁的完整性是否已經受影響(Appenze:l.ler，etal.，(2004)"Cellulosesynthesisinmaize:isolat.ionandexpressionanalysisofthecellulosesynthase(CesA)genefamily，，；Cellulose11:287-299;Ching，et.al.，(2006)"Brittlestalk2encodesaputativeglycosylphosphatidylinositol-anchoredproteinthataffectsraechanicalstrengthofmaizetissuesbyalteringthecompositionandstructureofsecondarycellwalls";Plante224:1174-1184)。實施例5.轉基因植物的轉化和再生用含有與干旱誘導啟動子MB17啟動子(Vilardell等，(1990)PlantMolBiol14:42廠432)可操作地連接的ZmSCW序列和選擇標記基因PAT(可賦予對除草劑雙丙氨磷(Bialaphos)的抗性)的質粒轟擊來自溫室供體植物的未成熟玉米胚。或者可在分離的質粒中提供該選擇標記基因。根據如下步驟進行轉化。培養基配方如下所示。靶組織的制備:將穗去殼并用30%Clorox漂白劑加0.5%Micro去污劑表面滅菌20分鐘，并用無菌水沖洗兩遍。將未成熟的胚切開并將胚軸面朝下放置(盾片面朝上)，每個平板放置25個胚,于560Y培養基中放置4小時然后排列在2.5-cm耙區域內用于轟擊。DNA的制備制備包含與泛素啟動子可操作地連接的SCW序列的質粒載體。使用如下所示的氯化鈣沉淀方法將該質粒DNA和含有PAT選擇標記的質粒DNA—起沉淀至1.1um(平均直徑)鎢顆粒上100u1在水中的制備的鎢顆粒TrisEDTA緩沖液中含有10u1(1iig)DNA(1ug總DNA)100u12.5MCaCl210y10.1M亞精胺按順序將各試劑加入鎢顆粒混懸液并同時置于多管漩渦混懸儀上。將最終混合物簡略超聲處理并在持續漩渦混懸下溫育10分鐘。在沉淀階段后，將試管簡單離心、移除液體，用500ml100%乙醇洗滌并離心30秒。再次移除液體，向終鎢顆粒沉淀加入105u1100%乙醇。對于粒子槍轟擊而言，將鴇/DM顆粒簡略超聲處理并將101點樣于各大載體(raacrocarrier)中央并在轟擊之前干燥約2分鐘。粒子m處理在粒子槍#HE34_1或#HE34_2中以#4水平轟擊樣品板。所有樣品均接受650PSI的單次轟擊，總計從各已制備的顆粒/DM試管中取10個等分試樣。后續處理轟擊后將胚置于560Y培養基中2天，然后轉移至含有3mg/L雙丙氨磷的560R篩選培養基中，然后每2周傳代培養。約篩選10周后，將篩選-抗性愈傷組織克隆轉移至288J培養基中開始植物再生。體細胞胚成熟后(2-4周)將發育好的體細胞轉移至發芽培養基并轉移至光照培養室。約7-1()天后，將正在發育的小植株轉移至272V無激素的培養基試管中培養7-10天直至小植株良好建立。然后將植株轉移至含有罐栽土的平面中插口(insertsinflats)(相當于2.5"罐)中并在生長室里生長1周，接著在溫室中繼續生長卜2周，然后轉移至傳統的600罐(1.6加侖)并生長至成熟。監測植物并對于植物干旱抗性的增強計分。檢測干旱抗性增強的測定法為本
技術領域：
常規的并包括，例如，與相同環境條件下的對照玉米植物相比在干旱條件下核-抽穗容量產量(kernel-earringcapacityyields)的增加。或者，可監測被轉化植物分生組織發育的調節(即穗--匕小穗的形成減少)。參見，例如，Bruce等，(2002)JournalofExperimentalBotany53:1-13。轟擊和培養基轟擊培養基(560Y)包含4.0g/lN6基礎鹽(basalsalt)(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2,4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH調至pH5.8后用D-1H20定容);2.Og/lGelrite(用H:2()定容后加入)以及8.5mg/l硝酸銀(將培養基滅菌并冷卻至室溫后加入)。選擇培養基(560R)包含4.0g/lN6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.Oml,ZlEriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺素、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l2，4-D(用KOH調至pH5.8后用D-1H20定容)；3.Og/lGelrite(用D-1H20定容后加入)以及520.85mg,Zl硝酸銀和3.0mg,Zl雙丙氨磷(兩者均在將培養基滅菌并冷卻至室溫后加入)。植物再生培養基(288J)包含4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074)、5.Oml/1MS維生素貯備液(0.100g煙酸、0.02g/l鹽酸硫胺素、0.10g/l鹽酸吡哆醇、0.40g/l甘氨酸(用精制的(polished)D-1H2()定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15:473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/1蔗糖和1.Oml,Zl0.ImM脫落酸(調至pH5.6之后用精制的D-IH20定容)；3.Og/1Gelrit.e(用D_IH20定容后加入)以及1.Omg/1吲哚乙酸和3.Omg/1雙丙氨磷(將培養基滅菌并冷卻至6(TC后加入)。無激素培養基(272V)包含4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074)、5.Onil/lMS維生素儲備液(0.l()0g/l煙酸、0.02g/:[鹽酸硫胺素、0.10g,Zl鹽酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-IH20定容)、0.lg,Zl肌醇、40.Og/1蔗糖(調至pH5.6之后用精制的D-IH20定容)和6g/l細菌培養用瓊脂(用精制的D-1H20定容后加入)，滅菌并冷卻至60°C。實施例6.農桿茼介導的轉化對于用本發明ZmSCW序列的反義序列的農桿菌介導轉化玉米而言，優選使用Zhao描述的方法(美國專利第5981840號和PCT專利公開W098/32326;其內容以引用形式并于本文)。簡略而言,從玉米中分離未成熟的胚并使其與農桿菌的混懸液接觸，其中該細菌可將SCW序列轉化至至少一個未成熟胚的至少一個細胞中(步驟l:感染步驟)。在該步驟中優選將未成熟胚浸漬于農桿菌的混懸液中以起始接種。將胚與農桿菌共培養--段時間(步驟2:共培養步驟)。在感染步驟之后優選將未成熟胚培養在固體培養基上。在共培養階段之后可考慮任選進行"靜息"步驟。在該靜息步驟中，在至少存在一種已知可抑制農桿菌生長的抗生素并且不加入植物轉化體篩選試劑的條件下溫育胚(步驟3:靜息步驟)。優選在含有抗生素(但不含篩選試劑)的固體培養基中培養未成熟胚以消除農桿菌并提供被感染細胞的靜息階段。接下來在含有篩選試劑的培養基中培養接種胚并回收生長中的已轉化愈傷組織(步驟4:篩選步驟)。優選在含有篩選試劑的固體培養基中培養未成熟胚以得到轉化細胞的選擇性生長。然后將愈傷組織再生至植物中(步驟5:再生步驟)，優選將生長于篩選培養基中的愈傷組織培養于固體培養基中以再生植物。監控植物并對分生組織發育的調節評分。例如枝條和花分生組織的大小和外觀的變化和/或葉、花和/或果實的產量增加。實施例7.表達模式下面的表3顯示了橫跨227種玉米MPSS文庫的根據它們與表達模式參考基因的平均皮爾遜相關系數的降序的次生細胞壁形成基因的列表。另外，對于每種基因的可能的功能和它在次生細胞壁形成中的作用有概述。許多這些基因涉及碳水化合物或木質素代謝,次生細胞壁的兩種主要亞成分。然而,該列表也包含了新的基因以及與碳水化合物或木質素合成或修飾目前沒有直接關系的基因。表3次生細胞壁形成基因表達相關性和功能53表3.次生壁形成基因-表達相關性，描迷和可能的功能<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>圖3顯示了參考次生細胞壁形成基因以及在本研究中發現的新的次生細胞壁基因的橫跨12種關鍵玉米組織的表達模式。注意與莖表達的顯著相關，次生細胞壁形成的關鍵位置,而且更小程度地與根和葉表達相關,那里也形成次生細胞壁。令人感興趣的是,在基本上只有初生細胞壁的頂部分生組織處，幾乎沒有這些基因的表達。實施例8.纖維素在機械強度卜.的作用纖維素是植物生物量的最大單個化學組分(圖2)。它平均占據了玉米秸稈干質量的5()%。作為最大的組分，對它沉積的任何限制都可能限制生長進而限制生物量累積。玉米中的谷物產量是總生物量的函數，因為收獲指數(谷物與地上總生物量的比例)在上世紀已經保持在50%左右。生物量的任何提高將導致提高的谷物產量。特異地影響纖維素形成的基因將幫助提高生物量的碳水化合物成分，使得其更適于青貯飼料以及乙醇生產。另外，具有提高的纖維素濃度的莖將具有提高的機械強度，其將使其更不可能倒伏并因此間接有助于谷物產量的提高。木質素形成和細胞壁交聯基因也可能幫助提高莖強度。木質素,其為疏水性的，通過從纖維素周圍排除水提高纖維素的強度。千纖維素已知比潮濕的纖維素更強。具有提高的纖維素濃度的葉，由于它們是機械上更強的，因此將能夠保持更直立的表型，其將通過降低遮蔽(shading)提高每單位土地面積光合成能力。輔你l9.舊料柳鏡,肝TO雜'性細細,鍵貢M圖l所示數據獲自2001年以三種密度(27,43和59K每英畝)生長的七種雜種，每種一式三份。從每個復本采樣兩個莖。穗下的節間3和4利用:l:nstron進行3點彎曲試驗。在測量引起節間斷裂的負重之后，將第3節間分離為外皮和內部組織。利用外皮和內部組織作為自變量(分別為Xi和X2)并且總莖作為因變量(Y)進行Path系數分析。多重回歸方程可看作Y=a+bA+b^^e，其中a是截距,b是回歸系數，以及e是誤差。Path系數計算如下:pYXn=bn*sXn/sY，其中n是1或2，p是path系數，以及s是標準偏差。每個自變量對總莖(Y)的貢獻計算如下SY^rYxn，其中sYXn為Y和Xn的協方差，并且r是這兩個變量之間的皮爾遜相關系數。直徑的未解釋的變異可歸因于玉米莖不是理想地圓的和由此與精確地確定橫截面積相關的困難。一些其它變量,例如維管束的大小和數量以及它們的密度，可解釋強度上其余的變化。通過除去其編碼用于催化的酶的特定步驟的限制,選擇期望的等位基因或過表達其基因，可導致特定多糖(組成改變)或總細胞壁(組成未變)的百分比的提高。在后一情況中，另外的干物質可容納于擴大的維管束中，所述擴大的維管束接著導致了提高的直徑。實施例10大豆胚轉化如下用含有與泛素啟動子可操作地連接的SCW序列的質粒轟擊大豆胚。為了誘導體細胞胚，將從表面滅菌的大豆栽培品種A2872的未成熟種子切割的長度為3-5mm的子葉在適當的瓊脂培養基上于26。C光照或黑暗條件下培養六至十周。然后將產生次生胚的體細胞胚切斷并置于適當的液體培養基中。在重復篩選繁殖為早期球形期胚的體細胞胚集簇之后，按照如下所述保存該混懸液。可在旋轉振蕩器(150rpm)上在35ml液體培養基中于26°C(熒光燈(florescentlight)，16:8小時日/夜時間表)保持大豆胚發生混懸培養物。通過約35mg組織接種入35ml液體培養基中每兩周傳代培養該培養物。然后通過粒子槍轟擊方法轉化大豆胚發生的混懸培養物(Klein等，(1987)Nature(London)327:70-73，美國專利第4945050號)。這些轉化中可使用DuPont.BiolisticPDS1000/HE儀器(heliumretrofit)。57可用于促進大豆轉化的選擇標記基因是由來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子(0dell等，(1985)Nature313:810-812)、來自質粒pJR225的潮霉素磷酸轉移酶基因(來自大腸桿菌;Gritz等，(1983)Gene25:179-188)以及來自根癌農桿菌Ti質粒T-DNA的胭脂堿合酶的3'區域組成的轉基因。含有與泛素啟動子可操作地連接的SCW有義序列的表達盒可作為限制性片段被分離。可將該片段插入攜帶該標記基因的載體的泛素限制酶切位點中。向50y160mg/ml1um金顆粒混懸液中加入(按順序):5ii1DNA(1yg/y1)、20u1亞精胺(()1M)和50111CaCl2(2.5M)。然后將該顆粒制劑攪拌三分鐘，在微型離心機上旋轉IO秒中并去除上清。然后用飾l70X乙醇將DNA-包裹的顆粒洗滌一次并重懸于40ul的無水乙醇中。將DNA/顆粒混懸液超聲處理三次，每次1秒鐘。之后將5微升的DNA-包裹金顆粒載樣于各大載體盤上。將約3(K)-4()(Mg生長了兩周的混懸培養物置于空的60xl5mra培養皿中并用移液管將殘余液體從組織中除去。對于每一個轉化試驗，常規轟擊約5-10板組織。將膜破裂壓力設置為1100psi并將室抽真空至28英寸汞柱。將組織置于距阻滯篩(retainingscreen)約3.5英寸遠的地方并轟擊三次。轟擊后可將組織平均分成兩份，放回至液體中并按照如上所述培養。轟擊后五至七天，用新鮮培養基替換液體培養基，轟擊后十-至十二天用含有50mg/ml潮霉素的新鮮培養基替換。該篩選培養基可每周更新。轟擊后七至八周可觀察到綠色的轉化組織從未轉化的壞死胚發生的集簇中生長出來。移除已分離的綠色組織并接種入單獨的燒瓶中以生成新的、克隆繁殖的、轉化的胚發生混懸培養物。每一新系可認為是獨立的轉化事件。然后將這些混懸液傳代培養并保持為未成熟胚集簇或通過單個體細胞胚的成熟和萌芽再生為完整的植物。實施例ll.向日葵分生組織轉化如下用含有與泛素啟動子可操作地連接的SCW序列的表達盒轉化向日葵分生組織(也可參見，歐洲專利號EP0486233，以引用形式并于本文，及Malone-Schoneberg.，(1994)PlantScience103:199-207)。使用單一麥穗脫粒機將成熟向日葵種子(HelianthusannuusL.)脫殼。將種子表面用20%Clorox漂白劑溶液(每50ml溶液中加入兩滴吐溫2())滅菌3()分鐘。用無菌蒸餾水洗滌種子兩遍。按照Schra咖eijer等(Schra騰ijer等.，(1990)PlantCellR印.9:55-60)所述法的變體制備分裂胚軸外植體。將種子于蒸餾水中吸脹60分鐘然后進行表面滅菌歩驟。將各種子的子葉折斷，在胚軸平面形成整齊的裂痕。在切除根尖之后將外植體在初葉之間縱向對切。將兩半切面朝上放置于組成為Murashige和Skoog礦物元素(Murashige.,(1962)Physiol.Plant.，15:473-497)、Sh印ard's維生素添力口劑(Sh印ard(1980)，EmergentTechniquesfortheGeneticImprovementofCrops(UniversityofMinnesotaPress,St.Paul,Minnesota)、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/1蔗糖、0.5mg/l6-芐基-氨基嘌呤(BAP)、()25mg/l噴哚-3-乙酸(]:AA)、().lmg/1赤霉酸(GA3)，pH5.6和8g/lPhytagar的GBA培養基中。在用農桿菌處理前用微粒槍轟擊該外植體(Bidney等，(1992)PlantMol.Biol.18:301-313)。在該處理中將三十至四十株外植體在60X20mm平板的中心擺放成圓58形。將約4.7mg1.8mm的鴇微粒重懸于25ml的無菌TE緩沖液(10mlTrisHCl，lmMEDTA，pH8.0)中，每次轟擊使用1.5ml等分試樣。穿過150mmnytex篩(放置于PDS1000(g)顆粒加速裝置中的樣品上方2cm)將各板轟擊兩次。"解除武裝的"(Disarmed)根癌農桿菌株EHA105被用于所有的轉化試驗。將含有表達盒(包含與泛素啟動子可操作地連接的SCW基因)的二元質粒載體通過如Holsters等.，(1978)Mol.Gen.Genet.163:181-187描述的凍融法導入農桿菌株EHA105。該質粒進一步包含卡那霉素選擇標記基因(即nptll)。用于植物轉化試驗的細菌在含有維持細菌株和二元質粒的適當抗生素的液體YEP培養基(10gm/:[酵母提取物、l()gm/1細菌用蛋白胨和5gm/lNaCl，pH7.0)中生長過夜(28°C，100RPM持續攪動)。當其0D600達到約0.4至0.8時使用該混懸液。將農桿菌細胞沉淀并重懸于含有12.5mMMESpH5.7、lgm/lNH4Cl和0.3gm/lMgS04的接種培養基中至終0D6Q。為0.5。將剛轟擊的外植體放置于農桿菌混懸液中、混合并靜置30分鐘。然后將該外植體轉移至GBA培養基，切面朝下,于26°C、每天18小時的條件下共培養。共培養三天后將該外植體轉移至添加了250mg/l頭孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B中(不含生長調節物質并且蔗糖水平降至1%的GBA培養基)。將外植體在選擇條件下培養二至五周，然后轉移至不含卡那霉素的新鮮374B培養基中繼續發育一至兩周。將還未產生適合切割的枝條的具有分化中的和抗生素抗性生長區域的外植體轉移至含有250mg/l頭孢噻肟的GBA培養基中進行第二個為期三天的植物激素處理。通過ELISA測定來自綠色、卡那霉素抗性枝條的葉樣品中是否存在NPTII以及通過檢測分生組織發育的調節(即枝條和花分生組織大小和外觀的改變)測定是否存在轉基因表達。將NPTII-陽性枝條嫁接至Pioneer雜種6440體外-生長的向日葵幼苗根狀莖(rootstock)。表面已滅菌的種子在48-0培養基(半強度的Murashige和Skoog鹽、().5X蔗糖、0.3^gelrite，pH5.6)中萌芽，并在對外植體培養所述的條件下生長。去除幼苗的上面部分，在下胚軸處做-個1cm的垂直切口，將已轉化的枝條插入該切口。用石蠟膜(parafilm)包裹整個部位以固定枝條。體外培養一周后的已嫁接植物可轉移至土壤中。土壤中的嫁接植物應在高濕度條件下維持，然后緩慢適應溫室環境。通過NPTIIELISA和/或通過分析葉提取物的SCW活性鑒定在溫室中成熟的T。植物(親代)的已轉化部分，同時通過分析干種子子葉一小部分的SCW活性鑒定從NPTII-陽性T。植物收獲的轉基因種子。另一種向日葵轉化方案可回收轉基因子代而不需使用化學選擇壓力。將種子去殼并在20%Clorox漂白溶液(每100ml溶液加中入兩至三滴吐溫20)中表面滅菌20分鐘，然后用蒸餾水沖洗三遍。將已滅菌的種子在用水濕潤的濾紙上于26。C在黑暗中吸脹20小時。去除子葉和根基(rootradical),將分生組織外植體于374E(由MS鹽、Sh印ard維生素、40mg/1硫酸腺嘌呤、3%蔗糖、0.5mg/l6_BAP、0.25mg/lIAA、0.lmg/1GA和O.8%Phytagar組成的GBA培養基,pH5.6)中在黑暗條件下培養24小時。去除初生葉以暴露頂端分生組織，將約40株外植體頂端頂面向上放置于374M(含有1.2%Phytagar的GBA培養基)中央的2cm圓形中然后于該培養基上黑暗中培養24小時。將約18.8mg1.8um的鎢顆粒重懸于150u1無水乙醇中。超聲處理后將8u1滴至大載體表面中央。在第一架中以26mm汞柱氦槍真空(Hgheliumgunvacuum)用650psi破裂盤(65()psirupturediscs)對每板轟擊兩次。通過之前所述的凍融法將相關質粒導入根癌農桿茵株EHA105。將28t:在液體YEP培養基(10g/l酵母提取物、10g/1細菌用蛋白胨和5g/lNaCl，pH7.0)中在50ug/1卡那霉素存在下的細菌過夜生長的沉淀重懸于接種培養基(12.5mM2mM2(N-嗎啉代)乙磺酸，MES，Ig/1NH4C:[和0.3g/lMgS()4，pH5.7)至終濃度為()D600=4.0。將經顆粒轟擊的外植體轉移至GBA培養基(374E)并將細菌混懸液小滴直接置于分生組織的頂部。在該培養基中將外植體共培養4天，之后將該外植體轉移至374C培養基(含有1%蔗糖并不含BAP、IAA、GA3，并添加了250yg/ml頭孢噻后的GBA)。將小植株在該培養基上在每天16小時和26。C溫育條件下培養約兩周。篩選在374C培養基中培養兩周的外植體(約2cm長)的分生組織發育的調節(即枝條和花分生組織大小和外觀的變化)。鑒定出陽性(即scw表達改變)外植體后，丟棄未呈現scw活性變化的枝條并將各陽性外植體細分為結節外植體。一個結節外植體含有至少一個潛在的結節。將結節片段在G:BA培養基上培養三至四天以促進各結節腋芽(auxiliarybud)的形成。然后將其轉移至374C培養基并繼續發育四周。分離正在發育的芽并于374C培養基上繼續培養四周。通過適當的蛋白質活性測定再次篩選來自各新回收枝條的已匯集(pooled)的葉樣品。這時，回收自單個結節的陽性枝條通常會富集于結節培養前初始分析中所檢測到的轉基因部分中。將所回收的具有陽性SCW表達改變的枝條嫁接至Pioneer雜種6440體外生長的向日葵幼苗根狀莖(seedlingrootstock)。按照F列方式制備根狀莖。將種子去殼并用20%Clorox漂白溶液(每100ml溶液加入兩至三滴吐溫20)表面滅菌20分鐘，用蒸餾水沖洗三遍。將已滅菌的種子在用水濕潤的濾器上發芽三天，然后轉移至48培養基(半強度的MS鹽、0.5%蔗糖、0.3%gelrite，pH5.0)并于26。C黑暗中生長三天，然后在每天16小時的培養條件下溫育。去除所篩選幼苗的上部，在各下胚軸做一個垂直切口，將已轉化的枝條插入該V-切口中。用石蠟膜包裹切割區域。在培養基中培養一周后將嫁接植物轉移至土壤。在開始的兩周內使其在高濕度條件下維持以適應溫室環境。實施例12.SCW序列變體A.不改變被編碼氨基酸序列的SCW變異體核苷酸序列SCW核苷酸序列用于產生含有與對應SEQIDNO的起始未改變的0RF核苷酸序列相比具有約70%、75%、80%、85%、90%和95%核苷酸序列同一性的開放閱讀框的核苷酸序列的變異體核苷酸序列。使用標準的密碼子表產生這些功能變異體。雖然這些變異體的核苷酸序列被改變但是由該開放閱讀框編碼的氨基酸序列沒有變化。這些變異體與決定生物量產量和質量的成分性狀相關。然后將顯示相關性的那些用做選擇每種成分性狀的標記物。B.非編碼區中的SCW變異體核苷酸序列SCW核苷酸序列用于產生變異體核苷酸序列，所述變異體核苷酸序列具有5'-非翻譯區，3'-非翻譯區，或啟動子區的核苷酸序列，其與對應的SEQIDN0的原始核苷酸序列具有大約70%，75%,80%，85%，9()%和95%的同一性。隨后，這些變異體與種質中用于生物量產量和質量相關的成分性狀的天然變異關聯。相關的變異體用做標記物單倍體以選擇期望的性狀。C.SCW多肽的變異體氨基酸序列產生SCW多肽的變異體氨基酸序列。在該實施例中改變了一個氨基酸。具體而言，檢查該開放閱讀框以確定適當的氨基酸改變。通過參考蛋白質比對(與其它直系同源體和來自多個物種的其它基因家族成員)篩選需要改變的氨基酸。篩選一個被認為不處于高篩選壓力(不高度保守)下的氨基酸，其可被具有相似化學特性(即相似的功能側鏈)的氨基酸輕易取代。使用蛋白質比對可改變一個適當的氨基酸。一旦確定了目標氨基酸，按照以下部分C列出的步驟進行。使用該方法可產生具有約70%、75%、80%、85%、90%和95%核酸序列同一性的變異體。隨后,這些變異體與種質中用于生物量產量和質量相關的成分性狀的天然變異相關。相關的變異體用做標記物單倍體以選擇期望的性狀。D.SCW多肽其它的變異體氨基酸序列在該實施例中，可產生與參比蛋白質序列相比具有80%、85%、90%和95%同一性的人工蛋白質序列。后一項工作需要從比對中鑒定出保守和可變區域，然后慎重應用氨基酸替換表。以下更加詳細地討論這些部分。整體而言，確定哪些氨基酸序列被改變是基于SCW蛋白質之間或其它SCW多肽之間的保守區域。基于序列比對，有可能被改變的scw多肽的多個區域以小寫字母表示，而保守區域由大些字母表示。應該認識到可在以下保守區域進行保守替換而不改變其功能。此外，本領域技術人員應理解本發明的scw序列的功能變異體可在保守結構域中具有少數不保守氨基酸改變。然后產生人工蛋白序列，其與原始序列以80-85%、85-90%、90_95%和95-100%同一性區間而不同。將這些區間的中點作為目標，例如自由度為加減l^。通過customPerlscript完成氨基酸替換。替換表見表4。表4替換表<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>首先，鑒定蛋白質中不應改變的任何保守氨基酸并"劃清界限"不被替換。起始甲硫氨酸當然被自動加入這一行列。接下來再進行改變。在任何情況下都不改變II、C和P。變化首先發生在異亮氨酸,從N-末端直至C-末端。然后是亮氨酸，并按照列表一直向下直至達到期望的目標。可進行中間數字替換以不引起逆轉變化。該列表的順序為1-17，因此在亮氨酸之前進行如所需--樣多的異亮氨酸變化，然后直到甲硫氨酸。很明顯以這種方式很多氨基酸不必變化。L、I和V涉及兩個可替代最佳替換的50:50替換。寫出變異體氨基酸序列作為結果。使用Perlscript計算同一性百分比。使用該程序，產生具有與SEQIDN0:1、3、5和40-71的起始未改變的0RF核苷酸序列具有約80X、85%、90%和95%氨基酸同一性的SCW多肽變異體。該說明書中的所有出版物和專利申請指明了本發明所屬領域普通技術人員的水平。所有出版物和專利申請均以引用形式并于本文，與通過引用方式明確和單獨指明各單獨出版物或專利申請的程度相同。己通過參考多種具體和優選的實施方案和技術闡述本發明。但是應當理解的是可進行多種變化和改變但是仍屬于本發明的精神和范圍。權利要求分離的多核苷酸，選自a.由GAP算法在缺省參數條件下測定，與選自SEQIDNOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，77-114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386，388，390，392，394，396，398，400，402，404，406，408和410-424的多核苷酸的全長序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；其中該多核苷酸編碼用作次生細胞壁發育調節物的多肽；b.編碼選自SEQIDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199，201，203，205，207，209，211，213，215，217，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，247，249，251，253，255，257，259，261，263，265，267，269，271，273，275，277，279，281，283，285，287，289，291，293，295，297，299，301，303，305，307，309，311，313，315，317，319，321，323，325，327，329，331，333，335，337，339，341，343，345，347，349，351，353，355，357，359，361，363，365，367，369，371，373，375，377，379，381，383，385，387，389，391，393，395，397，399，401，403，405，407和409的多肽的多核苷酸；及c.選自SEQIDNOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，77-114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386，388，390，392，394，396，398，400，402，404，406，408和410-424的多核苷酸；及d.與(a)、(b)或(c)的多核苷酸互補的多核苷酸。2.重組表達盒，其包含權利要求l的多核苷酸，其中該多核苷酸與啟動子以有義或反義方向可操作地連接。3.包含權利要求2的表達盒的宿主細胞。4.包含權利要求2的重組表達盒的轉基因植物。5.權利要求4的轉基因植物，其中所述植物為單子葉植物。6.權利要求4的轉基因植物，其中所述植物為雙子葉植物。7.權利要求4的轉基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、黍、花生和可可。8.來自權利要求4轉基因植物的轉基因種子。9.-種調節植物次生細胞壁發育的方法,其包括a.向植物細胞中導入含有與啟動子可操作地連接的權利要求l的多核苷酸的重組表達盒；b.在植物細胞生長的條件下培養該植物；其中所述植物細胞的次生細胞壁發育被調節。10.權利要求9的方法，其中所述植物細胞來自選自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、黍、花生和可可的植物。11.一種調節整個植物或植物中次生細胞壁發育的方法,包括a.向植物細胞中導入含有與啟動子可操作地連接的權利要求1的多核苷酸的重組表達盒；b.在植物細胞生長的條件下培養所述植物細胞；及c.從所述植物細胞再生植物；其中所述植物的次生細胞壁發育被調節。12.權利要求ll的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、黍、花生和可可。13.來源于加工處理表達編碼SCW基因的分離的多核苷酸的轉基因植物組織的方法的產物，該方法包括a.用含有與選自SEQIDNO:1，3，S，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，77-114，116，118，120，122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150,152,154,156,158,160，162,164，166,168，170,172，174,176，178,180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276,278，280,282，284,286，288，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386，388，390，392，394，396，398，400，402，404，406，408和410-424的多核苷酸全長序列具有至少90%序列同一性并與啟動子可操作地連接的多核苷酸的重組表達盒轉化植物細胞;及b.在植物細胞生長的條件下培養該已轉化的植物細胞；其中所述已轉化的植物細胞的生長被調節；c.使所述植物細胞在植物形成的條件下生長，以在所述植物組織中表達該多核苷酸；及d.加工處理所述植物組織得到產物。14.根據權利要求13的產物，其中所述多核苷酸進--步編碼選自SEQIDNO:2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52,54，56，58，60，62，64，66,68,70，72，74，76，115,117，119,121，123,125，127，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>和409的多月太。15.權利要求13的轉基因植物，其中所述植物為單子葉植物。16.權利要求13的轉基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥和黍。17.根據權利要求13的產物，其可通過過度表達所述多核苷酸提高植物的莖強度。18.根據權利要求13的產物，其可通過增加生物量增加產量。19.根據權利要求13的產物，其是乙醇的構成物。20.權利要求9的方法,其中所述植物具有改善的株冠形狀。21.權利要求9的方法，其中所述植物具有提高的葉組織中光合成能力。22.權利要求9的方法，其中所述植物具有改善的莖強度。23.權利要求9的方法，其中所述植物具有改善的植物站立性。24.權利要求9的方法，其中所述植物具有改變的維管束結構或數量。25.權利要求9的方法，其中所述植物具有提高的根生物量。26.權利要求9的方法，其中所述植物具有增強的根生長。27.權利要求9的方法，其中所述植物具有調節的枝條發育。28.權利要求9的方法，其中所述植物具有調節的葉發育。29.權利要求9的方法，其中所述植物具有改善的青貯飼料質量和可消化性。全文摘要本發明提供了涉及玉米次生壁(ZmSCW)形成的基因種類的多核苷酸和相關多肽。本發明提供了ZmSCW基因的基因組序列。ZmSCW負責控制植物生長、次生細胞壁發育和作物植物的產量。文檔編號C07K14/415GK101784667SQ200880103729公開日2010年7月21日申請日期2008年6月13日優先權日2007年6月15日發明者C·R·西蒙斯,K·S·杜加,R·B·米利申請人:先鋒高級育種國際公司