專利名稱：快速作用的胰島素類似物的制作方法
技術領域：
本發明涉及快速作用的胰島素類似物和包含快速作用的胰島素類似物的藥物組
合物，以及包含該快速作用的胰島素類似物與長效胰島素類似物的混合物的藥物組合物。
背景技術：
胰島素是胰腺的13 -細胞分泌的多肽激素，并且由兩個多肽鏈A和B組成，兩個多
肽鏈通過兩個中間鏈二硫橋來連接。此外，A鏈以一個內鏈二硫橋為特征。 激素是以前胰島素(前胰島素原)的單鏈前體物形式合成的，前胰島素包含
24個氨基酸的前肽，后面是含有86個氨基酸的前胰島素，構型為前肽B-Arg Arg-C-Lys
Arg-A，其中C是31個氨基酸的連接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是連接肽從A和B鏈上分裂的
分裂位點，形成兩個鏈的胰島素分子。胰島素主要維持正常代謝調節。 激素是以所定義的六聚體形式分泌的，其首先通過稀釋分離為二聚體，然后分離
為單體。活性激素是胰島素單體。胰島素六聚體和/或胰島素二聚體的不穩定化可以產生
快速作用的胰島素，例如B28 Asp人胰島素，其公開在EP 214826中。 目前，糖尿病(I型和II型糖尿病)的治療依賴所謂的增強胰島素療法的增加程 度。按照這種方案，每天用許多胰島素注射液來治療患者，包括每天一或兩次注射長效胰島 素，通過快速起作用的胰島素的快速濃注補充來保證基本的胰島素需求，保證與膳食相關 的胰島素要求。 因為每天注射多次來治療糖尿病患者，包括多次注射快速作用的胰島素來提供胰 島素的長效性，因此，一次注射快速和長效胰島素的組合將會潛在地免去許多次注射。WO 2003/094951公開了快速作用的胰島素類似物胰島素阿速帕(aspart) (B28Asp人胰島素) 和地特胰島素(Lys^(NE-十四酰)desB30人胰島素)的混合物。然而，快速作用和長效胰 島素類似物的混合物具有有限的混合性，導致快速作用的胰島素變得快速作用不足、長效 胰島素變得長效不足。 本發明的目的是提供改進的快速作用的胰島素，與已知快速作用胰島素相比，在 與可溶性長效胰島素類似物的可混合性方面，具有改進的性能。
本發明概述 在第一個方面，本發明涉及快速作用的胰島素類似物，其可以與長效胰島素類似 物形成可溶性混合物(預混合物或自身混合物)。快速作用是通過人胰島素B鏈的C末端 中的單體化替代/缺失所獲得的，與長效胰島素類似物的混合性是通過用Ile、 Val、 Ala、 Phe或Ser來替代人胰島素中B10位的Zn-結合的His所獲得的。 在一個實施方案中，本發明涉及快速作用的胰島素類似物，其中在人B鏈的 B22-B30位中的至少一個天然氨基酸殘基已被另一個氨基酸殘基替代，而所述另一個氨基 酸殘基具有促進胰島素形成單體形式的效果，B鏈中10位的His氨基酸殘基被Ile、 Val、 Ala、Phe或Ser替代，且其中在B22-B30位的進一步的一個或多個氨基酸殘基任選已缺失。
在一個實施方案中，本發明涉及胰島素類似物，其中在人B鏈的B22-B30位中的 至少一個天然氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基替代，而所述另一個氨基酸殘基具有促進胰島素形成單體形式的效果，其中進一步的，B鏈中10位的天然His氨基酸殘基被Ile、 Val、 Ala、或Phe替代，并且任選，在人B鏈中B22-B30位的一水成汔水， 在一個實施方案中，B26位和30位的氨基酸已缺失，且B28位的氨基酸殘基已被 另一個氨基酸殘基替代。 在一個實施方案中，B26位和30位的氨基酸已缺失，且B27位的氨基酸殘基已被 另一個氨基酸殘基替代。 在另一個實施方案中，B25位和30位的氨基酸已缺失，且B28位的氨基酸殘基已 被另一個氨基酸殘基替代。 在另一個實施方案中，B25位和30位的氨基酸已缺失，且B27位的氨基酸殘基已 被另一個氨基酸殘基替代。 在另一個方面，本發明涉及按照本發明的胰島素類似物治療糖尿病的用途。
在進一步方面，本發明涉及藥學制劑，其包含本發明的快速作用的胰島素類似物 和任選一或多種適合于穩定、防腐或等滲的試劑，例如，鋅離子，苯酚，甲酚，對羥基苯甲酸 酯類(parabene)，氯化鈉，丙三醇或甘露糖醇。制劑中的鋅含量可以是每個胰島素六聚體存 在0和大約4個之間的鋅原子。 由此，在一個實施方案中，本發明涉及藥學制劑，其包含快速作用的胰島素類似物 以及合適佐劑和添加劑，例如一或多種適合于穩定、防腐或等滲的試劑，例如鋅離子，苯酚， 甲酚，對羥基苯甲酸酯類(parabene)，氯化鈉，丙三醇或甘露糖醇，在上述快速作用的胰島 素類似物中，人B鏈中的B22-B30位的至少一個天然氨基酸殘基已被另一個氨基酸殘基替 代，其中所述另一個氨基酸殘基具有促進胰島素形成單體形式的效果，B鏈中10位的His氨 基酸殘基被11e、Val、Ala、Phe或Ser替代，并且其中B22-B30位的進一步的一個或多個氨 基酸殘基任選已缺失。 本發明還提供了可溶性組合物，其是快速作用胰島素類似物和長效胰島素類似物
或衍生物的混合物，其中快速作用的胰島素類似物和長效胰島素類似物或衍生物從注射位
點的體內消失速度與以分開的組合物注射時的體內消失速度相同或基本上相同。 由此，在另一個方面，本發明涉及可溶性藥學制劑，其包含按照本發明的快速作
用人胰島素類似物與長效人胰島素類似物或衍生物的混合物以及合適佐劑和添加劑，例
如一或多種適合于穩定、防腐或等滲的試劑，例如，鋅離子，苯酚，甲酚，對羥基苯甲酸酯類
(parabene)，氯化鈉，丙三醇或甘露糖醇。 鋅含量可以是每個胰島素六聚體存在0和大約4個之間的鋅原子。藥物制劑的pH 值可以在大約3和大約8. 5之間，在大約3和大約5之間，或在大約6. 5和大約7. 5之間。
在一個實施方案中，本發明涉及藥學制劑，其包含快速作用的胰島素類似物與長 效人胰島素類似物或衍生物的混合物以及合適佐劑和添加劑，例如一或多種適合于穩定、 防腐或等滲的試劑，例如鋅離子，苯酚，甲酚，對羥基苯甲酸酯類(parabene)，氯化鈉，丙三 醇或甘露糖醇，在上述快速作用的胰島素類似物中，人B鏈中的B22-B30位的至少一個天然 氨基酸殘基已被另一個氨基酸殘基替代，其中所述另一個氨基酸殘基具有促進胰島素形成 單體形式的效果，B鏈中10位的His氨基酸殘基被Ile、 Val、 Ala、 Phe或Ser替代，并且其 中B22-B30位的進一步的一個或多個氨基酸殘基任選已缺失。 在本發明的一個實施方案中，長效人胰島素衍生物是人胰島素的酰化衍生物。酰 化的胰島素衍生物可以是其中親脂性基團與B29位賴氨酸殘基相連接的衍生物。商業產品
6是Levemi^,其包含LysB29(NE-十四酰)des(B30)人胰島素(地特胰島素)作為活性組分。 長效胰島素的其它例子是包含帶正電荷的氨基酸例如Arg的胰島素，其中氨基酸 與B鏈的C端連接。商業產品是1^11加5@,其包含八21617，83^化，832八化人胰島素(甘精
胰島素)。 在一個實施方案中，本發明涉及藥物組合物，其包含按照本發明的快速作用的胰
島素類似物與Lys^(『-十四酰)des(B30)人胰島素(地特胰島素)的混合物。 在另一個實施方案中，本發明涉及藥物組合物，其包含按照本發明的快速作用的
胰島素類似物與Lys，(n^石膽酰(lithocholyl)-Y-谷氨酰))des(B30)人胰島素的混合物。 在進一步實施方案中，本發明涉及藥物組合物，其包含按照本發明的快速作用的
胰島素類似物與neb29_ (na - (H00C (CH2) 14C0) - y -Glu) des (B30)人胰島素的混合物。 在進一步實施方案中，本發明涉及藥物組合物，其包含按照本發明的快速作用的
胰島素類似物與A21Gly，B31Arg，B32Arg人胰島素(甘精胰島素)的混合物。 在進一步方面，本發明涉及按照本發明的快速作用胰島素類似物用于制備藥物制
劑的用途，該藥物制劑用于降低哺乳動物的血糖水平，尤其用于治療糖尿病，任選在與長效
人胰島素類似物或衍生物的混合物中使用。 在進一步實施方案中，本發明涉及降哺乳血動物血糖水平的方法，該方法給予需 要這種治療的患者治療活性劑量的按照本發明的快速作用胰島素類似物，任選在與長效人 胰島素類似物或衍生物的混合物中使用。
圖1顯示了按照本發明的胰島素類似物A21Gly， B3Gln， B10Ser， desB26， B28Glu， desB30和甘精胰島素(A21Lys， B31Arg， B32Arg人胰島素)在各別制劑中(在純水中)的 平衡溶解度。B3Q，B10S，DesB26，B28E，-desB30，A21G由灰色標記代表，甘精胰島素由黑色 標記代表。連接各別測試點的線條用于引導肉眼觀看。 圖2顯示了按照本發明胰島素類似物A21Gly， B3Gln， B10Ser， desB26， B28Glu， desB30的nuv-CD譜，濃度范圍是O. 005mM至1. OmM，在純水中，個別濃度如圖所表明。在整 個實測濃度范圍內，B3Q， B10S， DesB26， B28E， _desB30， A21G的nuv-CD譜是穩定的，這表明 胰島素類似物是從PM至mM濃度的單體。
本發明的說明 在對形成二聚體和六聚體有影響的胰島素分子的某些位置中，修飾按照本發明的 胰島素，并且按照本發明的胰島素類似物的特點在于與長效胰島素類似物可以形成可溶 性混合劑(預混合物或自身混合物)。快速作用是通過B鏈的C端中的單體化替代/缺失所 獲得的，與長效胰島素類似物的可混合性是通過用疏水性氨基酸殘基替代B10位的Zn-結 合的His獲得的。 替代人胰島素B鏈C端中的一個或多個氨基酸殘基從而獲得單體的和由此快速作 用的胰島素類似物，可以從例如EP 214826更好地了解。 除了按照本發明的突變之外，只要得到的胰島素分子仍然具有期望性能，B鏈和A鏈可以包含額外的突變，也就是說，所述性能是具有快速作用、可溶性和與長效胰島素類似 物或衍生物可混合性，以便形成不鈍化的可溶性混合物。這種進一步突變可以對所修飾胰 島素分子的物理的或化學的穩定性或對兩者都具有穩定作用。 在一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10Ile， B28E， desB30人胰 島素；BIOI， B27E， desB30人胰島素；BIOI， B26E， desB30人胰島素；和BIOI， B25E， desB30 人胰島素。 在一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10V， B28E， desB30人胰島 素；B10V， B27E， desB30人胰島素；B10V， B26E， desB30人胰島素；和B10V， B25E， desB30人
胰島素。 在一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10A， B28E， desB30人胰島 素；B10A， B27E， desB30人胰島素；B10A， B26E， desB30人胰島素；和B10A， B25E， desB30人
胰島素。 在一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10F， B28E， desB30人胰島 素；B10F， B27E， desB30人胰島素；B10F， B26E， desB30人胰島素；和B10F， B25E， desB30人
胰島素。 在一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10S， B28E， desB30人胰島 素；B10S， B27E， desB30人胰島素；B10S， B26E， desB30人胰島素；和B10S， B25E， desB30人
胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10I，B28E，desB30，A21G 人胰島素；BIOI， B27E， desB30， A21G人胰島素；BIOI， B26E， desB30， A21G人胰島素；和 BIOI， B25E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10V，B28E，desB30，A21G 人胰島素；B10V， B27E， desB30， A21G人胰島素；B10V， B26E， desB30， A21G人胰島素；和 B10V， B25E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10A，B28E，desB30，A21G 人胰島素；B10A， B27E， desB30， A21G人胰島素；B10A， B26E， desB30， A21G人胰島素；和 B10A， B25E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10F，B28E，desB30，A21G 人胰島素；B10F， B27E， desB30， A21G人胰島素；B10F， B26E， desB30， A21G人胰島素；和 B10F， B25E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10S，B28E，desB30，A21G 人胰島素；B10S， B27E， desB30， A21G人胰島素；B10S， B26E， desB30， A21G人胰島素；和 B10S， B25E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自BIOI， desB27， B28E， desB30人胰島素；BIOI， desB26， B28E， desB30人胰島素；和BIOI， desB25， B28E， desB30人
胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10V， desB27， B28E， desB30人胰島素；B10V， desB26， B28E， desB30人胰島素；和B10V， desB25， B28E， desB30人
胰島素。
在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10A， desB27， B28E， desB30人胰島素；B10A， desB26， B28E， desB30人胰島素；和B10A， desB25， B28E， desB30人
胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10F， desB27， B28E， desB30人胰島素；B10F， desB26， B28E， desB30人胰島素；和B10F， desB25， B28E， desB30人
胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10S， desB27， B28E， desB30人胰島素；B10S， desB26， B28E， desB30人胰島素；和B10S， desB25， B28E， desB30人
胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自BIOI， desB27， B28E， desB30，A21G人胰島素；BIOI， desB26， B28E， desB30， A21G人胰島素；和BIOI， desB25， B28E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10V， desB27， B28E， desB30， A21G人胰島素；B10V， desB26， B28E， desB30， A21G人胰島素；和B10V， desB25， B28E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10A， desB27， B28E， desB30， A21G人胰島素；B10A， desB26， B28E， desB30， A21G人胰島素；和B10A， desB25， B28E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10F， desB27， B28E， desB30， A21G人胰島素；B10F， desB26， B28E， desB30， A21G人胰島素；和B10F， desB25， B28E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10S， desB27， B28E， desB30，A21G人胰島素；B10S， desB26，B28E， desB30，A21G人胰島素；和B10S， desB25， B28E， desB30， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自BIOI， B28E人胰島素； BIOI， B27E人胰島素；BIOI， B26E人胰島素；和BIOI， B25E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10V， B28E人胰島素； B10V， B27E人胰島素；B10V， B26E人胰島素；和B10V， B25E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10A， B28E人胰島素； B10A， B27E人胰島素；B10A， B26E人胰島素；和B10A， B25E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10F， B28E人胰島素； B10F， B27E人胰島素；B10F， B26E人胰島素；和B10F， B25E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10S， B28E人胰島素； BIOS, B27E人胰島素；B10S， B26E人胰島素；和BIOS, B25E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自BIOI， B28E， A21G人胰島 素；101， B27E， A21G人胰島素；BIOI， B26E， A21G人胰島素；和BIOI， B25E， A21G人胰島素。
在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10V， B28E， A21G人胰島 素；10V， B27E， A21G人胰島素；B10V， B26E， A21G人胰島素；和B10V， B25E， A21G人胰島素。
在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10A， B28E， A21G人胰島素；10A， B27E， A21G人胰島素；B10A， B26E， A21G人胰島素；和B10A， B25E， A21G人胰島素。在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10F， B28E， A21G人胰島
素；10F， B27E， A21G人胰島素；B10F， B26E， A21G人胰島素；和B10F， B25E， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10S， B28E A21G人胰島
素；10S， B27E， A21G人胰島素；B10S， B26E， A21G人胰島素；和B10S， B25E， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自BIOI， desB27， B28E人胰
島素；BIOI， desB26， B28E人胰島素；和BIOI， desB25， B28E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10V， desB27， B28E人胰
島素；B10V， desB26， B28E人胰島素；和B10V， desB25， B28E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10A， desB27， B28E人胰
島素；B10A， desB26， B28E人胰島素；和B10A， desB25， B28E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10F， desB27， B28E人胰
島素；B10F， desB26， B28E人胰島素；和B10F， desB25， B28E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10S， desB27， B28E人胰
島素；B10S， desB26， B28E人胰島素；和B10S， desB25， B28E人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10I，desB27，B28E，A21G
人胰島素；BIOI， desB26， B28E， A21G人胰島素，和BIOI， desB25， B28E， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10V，desB27，B28E，A21G
人胰島素；B10V， desB26， B28E， A21G人胰島素；和B10V， desB25， B28E， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10A，desB27，B28E，A21G
人胰島素；B10A， desB26， B28E， A21G人胰島素；和B10A， desB25， B28E， A21G人胰島素。在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10F，desB27，B28E，A21G
人胰島素；B10F， desB26， B28E， A21G人胰島素；和B10F， desB25， B28E， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B10S，desB27，B28E，A21G
人胰島素；B10S， desB26， B28E， A21G人胰島素；和B10S， desB25， B28E， A21G人胰島素。 在另一個實施方案中，按照本發明的胰島素類似物選自B3Q，B10S，desB25，B28E，
desB30， A21G人胰島素；B3Q， B10S， desB26， B28E， desB30， A21G人胰島素；B3Q， B10S，
desB26， B27E， desB30， A21G人胰島素和B3Q， B10S， desB26， B27E， desB30， A21G人胰島素。 按照本發明的快速作用胰島素類似物可以與長效胰島素類似物或衍生物混合，沒
有或基本上沒有鈍化效果。"鈍化"是指在混合物中的快速作用胰島素和長效胰島素的活性
特性分別受到改變，使得快速作用胰島素變得較慢，長效胰島素變得更快。 由此，本文使用的術語"不鈍化"是指當在一個制劑中配制時，快速作用胰島素和
長效胰島素兩者都具有作用特性，這種作用特性與以分開的制劑給予時的作用特性相同或
基本上相同。 措辭"基本上相同"是指當以分開的制劑給予時，作用特性與各別胰島素的作用 特性至少70-95%相同。 在一個實施方案中，各別胰島素的作用特性與以分開制劑給予時的作用特性至少 75%相同。 在另一個實施方案中，各別胰島素的作用特性與以分開制劑給予時的作用特性至少85%相同。 在另一個實施方案中，各別胰島素的作用特性與以分開制劑給予時的作用特性至 少95%相同。 術語"可混合的"用于表現快速作用和長效胰島素的混合物的特性，其中不會或基 本上沒有出現鈍化現象。"快速作用的胰島素"是指比正常或常規的人胰島素具有更快作用起始的胰島
素，"長效胰島素"是指比正常或普通的人胰島素作用時間更長的胰島素。
—組長效胰島素是酰化的胰島素衍生物。人胰島素具有三個伯氨基A鏈和B鏈
的N端基團，和B29位的賴氨酸殘基的e-氨基。含有親脂性取代基(其與B29位的賴氨
酸殘基的e-氨基連接)的可溶性胰島素衍生物公開在例如WO 95/07931和W0 2005/1234中。 酰基是親脂基，并且典型地是包含大約6至大約32個碳原子的脂肪酸部分，更典 型地是6至24個碳原子，8至20個碳原子，12至20個碳原子，12-16個碳原子，10-16個碳 原子，10-20個碳原子，14-18或14-16個碳原子。脂肪酸的例子是癸酸，月桂酸，十四酸(肉 豆蔻酸)，十五酸，棕櫚酸，十七酸，硬脂酸，十二烷酸，十三酸和十四酸。酰基可以源自于二 羧基的脂肪酸或可以是石膽酸。 酰基可以直接與所述的游離氨基連接。然而，酰基還可以通過一個連接基借助于
酰胺鍵連接，該連接基使胰島素分子中的游離氨基與所述的酰基連接在一起。 與人胰島素相比，酰化的胰島素可以具有一或兩個額外負凈電荷。額外的負電荷
可以由脂肪酸中的游離羧基提供，或由包含一個或多個氨基酸殘基的連接基提供，其中至
少一個氨基酸殘基含有游離羧酸，或在中性pH值下帶負電荷的基團。 酰化胰島素類似物的非限制性例子是Lys^(『-十四酰)des(B30)人胰島素； Lys，(N^十六酰)des(B30)人胰島素；LysB29 (NE -十四酰)人胰島素；LysB29 (NE -十六 酰)人胰島素；LysB29(NE-(N-十六酰-y-Glu)des(B30)人胰島素；LysB29(NE-(N-石膽 酰(lithocholyl) - y -Glu)) des (B30)人胰島素;LysB29 (NE -("-羧基十七酰))des (B30) 人胰島素；LysB29 (NE -("-羧基十七酰))人胰島素；NEB29_(Na-(H00C(CH2) 13C0) - y -Glu) des(B30)人胰 島素；N EB29_ (N° _ (H00C (CH2) 14C0) _ y-Glu) des (B30) 人胰島素；N EB29(Na-(H00C (CH2) 15C0) - y -Glu) des (B30)人胰 島 素；N EB29_ (N°- (H00C (CH2) 16C0) - y -Glu) des (B30) 人 胰 島 素；N EB29_ (N a- (H00C (CH2) 17C0) - y -Glu) des (B30)人胰島素； NE B29_ (Na - (H00C (CH2) 18C0) - y -Glu) des (B30)人胰島素;(NE B29_ (Na - (H00C (CH2) 13C0) - y _A sp)des(B30)人胰島素^PNEB29-(Na-(H00C(CH2)14C0)-y-Asp)des(B30)人胰島素。
長效胰島素類似物的進一步類型公開在EP 368， 187中，其公開了具有帶電基團 (例如，與C端基團B30連接的Arg)胰島素類似物，例如甘精胰島素。 利用例如公開在EP1，246，845中的眾所周知的技術，在合適宿主細胞中，通過表 達編碼所述單鏈胰島素的DNA序列來制備該快速作用胰島素。胰島素在轉化的宿主細胞 中以前體物分子形式被表達，通過EP163, 529和EP 214， 826公開的酶催和化學體外方法， 該前體物分子被轉變為目標胰島素分子。前體物分子可以用N端延長來表達，隨后其按照 EP1246, 845公開的方式斷裂。在本發明中合適類型的N端延長的例子公開在美國專利US5， 395， 922和EP專利765， 395中。 用于制備與按照本發明的快速作用胰島素混合的長效、酰化胰島素的胰島素前體 物產品，可以用類似于如上所述的方法來制備。胰島素前體物可以在目標位置酰化，例如在 EP 214， 826、 EP 375， 437和EP 383，472中所描述。 本文使用的"胰島素"是指具有人胰島素(在CysA7和CysB7之間、在CysA2°和CysB19 之間具有二硫橋，在CysA6和CysA11之間具有內部二硫橋)的兩個鏈結構的人胰島素、豬胰 島素和牛胰島素。 B鏈是指具有30個氨基酸殘基的人胰島素B鏈，A鏈是指具有21個氨基酸殘基的
人胰島素A鏈。在按照本發明的胰島素類似物中，除了按照本發明的突變以外，B鏈和A鏈
都可以包含額外的突變，只要得到的胰島素分子仍然具有目標性能即可。 進一步突變的數目典型地不高于3個，更典型地是兩個或一個。 由此，B1中的氨基酸殘基可以被另一個氨基酸殘基例如Asp或Gly替代，或缺失。
此夕卜，B3位的Asn可以改變為Thr、 Lys、 Gln、 Glu或Asp。 B鏈也可以包含N端延長，并且
Bl可以缺失。 在A鏈中，A21位的Asn可以改變為Ala、 Gln、 Glu、 Gly、 His、 Ile、 Leu、 Met、 Ser、 Thr、Trp、Tyr或Val，尤其是改變為Gly、Ala、Ser或Thr，優選Gly。 A18也可以改變為Gln。 最后，A鏈可以包含C端延長，例如A22和A23。 A22和A22位的氨基酸殘基可以是賴氨酸 殘基，其可以在酸pH值范圍內得到良好的溶解度，并且進一步使分子針對脫酰胺作用而保 持禾急定。 "desB30或B(l_29)"是指缺少B30氨基酸殘基的天然胰島素B鏈或其類似物， "A(l-21)"是指天然胰島素A鏈或其類似物或衍生物。"類似物"是指與天然分子有差別的分子，差別在于具有一個或多個氨基酸替代、 添加或缺失和其任一組合。"胰島素衍生物"是指具有與一個或多個骨架氨基酸殘基連接的化學基團的胰島 素分子。 在按照本發明的類似物中的位置編號基于人胰島素分子。由此，分別地，"B27"是 指人胰島素B鏈中的B27位氨基酸殘基(從N端計算)，"A1"是指人胰島素A鏈中的1位 氨基酸殘基(從N端計算)。即使一個或多個天然氨基酸殘基已經缺失，也保持這種編號 系統。由此，稱為"B10Q， desB25， B28E， desB30人胰島素"的胰島素類似物在B鏈中具有C 端序列Thr-Asp-Lys。 用三個字母氨基酸編碼或一個字母氨基編碼來表示氨基酸殘基。除非明確表示， 否則本文提到的氨基酸是L-氨基酸。進一步的，肽的氨基酸序列的左和右端分別是N-和
c-端，除非另作說明。 本文使用的術語"單體胰島素"是指與人胰島素相比不容易自我結合(結合為二 聚體和六聚體)的人胰島素類似物。
藥物組合物 含有本發明的快速作用胰島素(任選在與長效胰島素類似物或衍生物的混合物 中)的組合物可以用于治療對胰島素敏感的狀態。由此，它們可以用于治療I型、II型糖 尿病和高血糖癥 例如在受到嚴重傷害的人和進行大手術的人中有時所看到的癥狀。對于任何患者，最佳劑量水平取決于各種因素，包括所使用的具體胰島素類似物或衍生物的效 果，患者的年齡、體重、實際活動和飲食，取決于與其它藥物的合適組合，和取決于所治療狀 況的嚴重程度。推薦的是，對于每個個體患者，由本領域技術人員按照與已知胰島素組合物 類似的方法來確定本發明的胰島素類似物或混合物的日劑量。 通常，可以皮下給予本發明的藥物組合物。然而，該組合物也可以在胰島素泵中使 用，并且可以配制成肺部(pulm皿al)給藥形式。 藥物組合物可以含有常見的佐劑和添加劑，并且優選配制成水溶液劑。用例如氯
化鈉、乙酸鈉或丙三醇使水介質變成等滲的。此外，水介質可以含有鋅離子、緩沖液和防腐
劑。將組合物的PH值調節至要求值，并且可以在大約3至大約8. 5之間，優選在大約3和
大約5或大約6. 5和大約7. 5之間，這取決于所述胰島素的等電點pl。 快速作用的胰島素類似物和長效胰島素可以以大約10/90%、大約30/70%或大
約50/50%的比例混合。在一個實施方案中，長效和快速作用胰島素之間的摩爾比大于
2/1。 在按照本發明的藥物制劑中使用的緩沖液可以選自乙酸鈉，碳酸鈉，檸檬酸鹽， 雙甘氨肽，組氨酸，甘氨酸，賴氨酸，精氨酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸鈉，和三(羥甲 基)_甲胺，N- 二羥乙基甘氨酸，麥黃酮(tricine)，蘋果酸，琥珀酸鹽，馬來酸，富馬酸，酒石 酸，門冬氨酸或其混合物。 可藥用防腐劑在本領域是眾所周知的。為方便起見，參考文獻Remington :The Science and Practice of Pharmacy,19th edition,1995。 等滲試劑可以選自鹽(例如氯化鈉)，糖或糖醇，氨基酸或多羥糖醇(例如丙三醇 (甘油))。等滲試劑在藥物組合物中的用途對于技術人員是眾所周知的。為方便起見，參 考文獻Remington :The Science and Practiceof Pharmacy, 19th edition, 1995。等滲試 劑存在的濃度典型地是lmg/ml至50mg/ml。在進一步實施方案中，等滲藥劑存在的濃度是 lmg/ml至7mg/ml， 8mg/ml至24mg/ml或25mg/ml至50mg/ml。 下面的實施例進一步詳細地描述本發明，然而，其不能以任何方式來限制權利要 求所規定的本發明范圍。附圖是本發明說明書和描述部分的組成部分。將本文中引用的所 有參考文獻(包括出版物，專利申請和專利)以其整體引入本文作為參考，其程度如同每個 參考文獻是單獨和具體地注明引入作為參考那樣，并且本文以其整體列出(法律所允許的 最大程度)。 本文使用所有標題和副標題，僅僅為方便起見，并且不應該將其理解為以任何方 式對本發明進行限制。 本文提供的任何和所有實施例或示范性術語(例如，"例如")的應用僅僅是為了 更好地說明本發明，不造成對本發明范圍的限制，除非另外所要求的。在說明書中沒有任何 文辭將被視為指示對本發明的實踐是必需的、任何未要求保護的要素。 本文引用和引入的專利文件僅僅為方便起見，并不反映這種專利文件的有效性、 專利性和/或可實施性的任何觀點。
實施例 重組制備按照本發明的胰島素類似物的一般方法。
13
所有的表達質粒是C-POT類型，類似于EP 171， 142所描述的那些，其特點在于為 了在釀酒酵母中的質粒選擇性和穩定性，其含有粟酒裂殖酵母磷酸丙糖異構酶基因(POT)。 質粒也含有釀酒酵母磷酸丙糖異構酶啟動子和終止子。這些序列與質粒pKFN1003中的相 應序列相似(在WO 90/100075中描述)，如同除了EcoRI-XbaI片段(其編碼先導物和胰島 素產物的融合蛋白)的序列之外的所有序列一樣。為了表達不同的融合蛋白，PKFN1003的 EcoRI-XbaI片段簡單地被編碼所感興趣的先導物_胰島素融合的EcoRI-XbaI片段替代。 這種EcoRI-XbaI片段可以按照標準技術、使用合成的寡核苷酸和PCR來合成。
通過宿主菌株釀酒酵母菌株MT663 (MATa/MAT a p印4-3/p印4-3HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir+)的轉化，制備酵母轉化體。與提交WO 92/11378有關的酵母菌 株MT663保藏在Deutsche Samml皿g vonMikroorganismen皿d Zellkulturen，并且得至lj保 藏編號DSM 6278。 使MT663在YPGaL(lX Bacto酵母抽提物，2% Bacto蛋白胨，2%半乳糖，1 %乳酸 鹽)上生長至0. 6的0. D.(在600nm)。離心采集100ml培養物，用10ml水洗滌，再次離心， 再懸浮在10ml含有1. 2M山梨糖醇、25mM Na2EDTA(pH = 8. 0)和6. 7mg/ml 二硫蘇糖醇的溶 液中。將懸浮液在3(TC培養15分鐘，離心，并將細胞再懸浮在10ml含有1. 2M山梨糖醇、 10mM Na2EDTA、0. 1M枸櫞酸鈉，pH 05. 8和2mg Novozym 234的溶液中。將懸浮液在 3(TC培養30分鐘，離心收集細胞，在10ml的1. 2M山梨糖醇和10ml的CAS(l. 2M山梨糖醇， 10mM CaCl2，10mM Tris HC1 (Tris =三(羥基甲基)氨基甲烷)pH = 7. 5)中洗滌，并再懸 浮在2ml CAS中。為了轉化，將lml CAS懸浮的細胞與大約0. lmg質粒DNA混合，并在室溫 下放置15分鐘。加入lml(20X聚乙二醇4000，10mM CaCl2， 10mM Tris HCl，pH = 7. 5)，并 在室溫下將混合物進一步放置30分鐘。將混合物離心，并將球粒再懸浮在0. lml SOS (1. 2M 山梨糖醇，33^v/v YPD，6. 7mM CaCl2)中，并在3(TC培養2小時。然后將懸浮液離心，并將 球粒再懸浮在O. 5ml的1. 2M山梨糖醇中。然后，在52t:加入含有1. 2M山梨糖醇加上2. 5% 瓊月旨的6ml top瓊月旨(Sherman等人的SC medium(1982) ， Methods in Yeast Genetics, Cold Spring HarborLaboratory)，并將懸浮液傾倒在含有相同瓊脂凝固的、含有山梨糖醇 的介質的平皿上。 在3(TC，使用表達質粒轉化的釀酒酵母菌株MT663在YPD中生長72小時。通過常
規方法分離表達和分泌的胰島素前體物，并利用上述的常規體外酶轉化法轉變為按照本發
明的目標胰島素類似物。 實施例1 胰島素制劑的平衛溶解度 制備含有Zn"、苯酚和丙三醇(濃度接近銷售產品)或120rnM NaCl的按照本發明 快速作用胰島素類似物的儲備溶液或快速作用胰島素類似物和長效胰島素(甘精胰島素) 的混合物的儲備溶液，并將PH值調節至目標值(相當于pH-溶解度圖的堿性終點)。從這 些儲備溶液中取出樣品，將PH值調節至pH3-8范圍的目標值，并在23t:將0. 3ml樣品培養 至少4天。將每個樣品離心(在23t:，20，000g，20分鐘)之后，測定pH值，利用反相HPLC 分析(在XTerra RP8 Guard柱(Waters)上，50 X 20mm， 5微米粒徑，在35°C以2mL/分鐘的 速度洗脫，或在Gemini 3u C18 110A柱(Phenomenex)上，50 X 2. Omm， 3微米粒徑，在35°C 以0. 8mL/分鐘的速度洗脫)，通過定量分析上清液中的胰島素含量，測定溶解度。用磷酸鹽
14緩沖液(PH = 7. 2)洗脫胰島素，從大約7% (w/w)乙腈起始，而后用增加乙腈至大約65% (w/V)濃度的梯度步驟。 測定本發明胰島素類似物在純水或在與長效胰島素的混合制劑中相對于pH值的
平衡溶解度(胰島素阿速帕(aspart)可以用作參比)，并將每個胰島素類似物在非混合制
劑中(在水中)相對于pH值的溶解度與長效胰島素的溶解度進行比較。B3Q， B10S， desB26， B28E， desB30， A21G(由灰色標記代表)和甘精胰島素(由黑
色標記代表)在水中相對于pH值的溶解度示于圖1中。連接各別測試點的線條用于引導
肉眼觀看。 實施例2對胰島素類似物B3Q，B10S，desB26，B28E，-desB30，A21G測定NUV-CD。在至多lmM
的濃度下，類似物是單體形式的。 結果示于圖2中。 藥理學方法 試驗(I) 基本上按照Havelund等人(2004Pharmaceutical research, 21， 1498-1504)描述 的方法進行篩析色譜法(SEC)。色譜系統是Superose 6 HRPC 6/30柱(GE healthcare)， 用tris-緩沖的等滲鹽水(NaCl 140mM， tris/HCl 10mM， NaN3 0， 01%， pH7. 5，在37°C )洗 脫，注射1 %的柱體積，使用每柱體積90min的流速，在276nm進行UV檢測。參比是穩定的 胰島素單體胰島素X2(AspB9，GluB27人胰島素，不含鋅)，穩定的六聚胰島素Co(III)胰島 素、白蛋白(HSA)和共價白蛋白(在溶液中形成)。
試驗(II)
胰島素受體結合 用SPA試驗(閃爍近似測定法)微量滴定平皿抗體捕捉試驗，測定胰島素類 似物對人胰島素受體的親合性。將SPA-PVT抗體_結合珠粒、抗小鼠試劑(Amer sham Biosciences, Cat No. PRNQ0017)與25ml結合緩沖液(lOOmM HEPES， pH7. 8 ;100mM氯化 納，10mM MgS04，0. 025% Tween—20)混合。單一 Packard Optiplate (Packard No. 6005190) 的試劑混合物由下列組成2.4iU的l : 5000稀釋的純化重組體人胰島素受體-外顯子 ll，適量的A14Tyr[125I]-人胰島素的儲備溶液(相當于每100 試劑混合物5000cpm)， 12 ill的1 : 1000稀釋的F12抗體，3ml的SPA-珠粒和結合緩沖液，總共12ml 。然后加入 總共100iU，并用合適的樣品制備稀釋系列。然后向稀釋系列中加入100 試劑混合物， 將樣品培養16小時，同時輕輕地搖動。然后離心分離各相1分鐘，并在Topco皿ter中將平 皿計數。在Gr即hPad Prism 2.01(Gr即hPad Software, San Diego， CA)中，使用非線性回 歸算法來擬合結合數據。 所測定的B3Q， BIOS, desB26， B28E， _desB30， A21G的胰島素受體親合性是9. 1 % 。
試驗(III) 胰島素類似物的生物效能，大鼠游離脂肪細胞試驗 將大鼠殺死，除去附睪油脂墊，并放入降解緩沖液中。在大力搖動下，在37t:進行 降解1小時。為了除去組織碎片，將細胞懸浮液過濾，洗滌脂肪細胞兩次，并再懸浮在培養 緩沖液中。在溫和搖動下，將0. 1ml細胞懸浮液與lOiU葡萄糖溶液和lOiU胰島素或其它化合物一起在37t:下培養兩個小時。通過加入150 閃爍劑來終止培養，并計數。
通過比較內標和未知樣品的EC50值，進行效能的計算。曲線擬合是期望恒定最小 和最大反應的四參數logistic模型。
試驗(IV) 胰島素類似物與人胰島素樣生長因子-1受體(hIGF-lR)的結合
用SPA(閃爍近似測定法)微量滴定板抗體捕捉試驗測定胰島素類似物對人胰 島素樣生長因子-l受體(hIGF-lR)的親合性。將抗小鼠PVT SPA珠粒(500mg， GE Life Sciences#RPNQ0017)與25ml結合緩沖液(lOOmMHEPES， lOOmM NaCl，lOmM MgS04，0.025% Tween-20，pH = 7.8)混合。對于單個96孔微量滴定板(0ptiplate-96Perkin-Elmer#6005 190)，試劑混合物由下列組成40 ii 1的純化重組體hIGF-lR(Novo Nordisk A/S) ， 12 的 1 : 16稀釋的抗hIGF-lR單克隆抗體(克隆24-31)， 3ml SPA珠粒懸浮液和結合緩沖液，總 共12ml 。然后向25iU IGF-1、胰島素或胰島素類似物的稀釋系列中加入100 試劑混合 物和25iU的[1251]A14Tyr-人IGF-l的稀釋物(相當于IO， 000cpm)。將樣品在室溫下培養 16小時，同時輕輕地攪拌。然后在1， OOOrpm下將平皿離心1分鐘，而后在PackardTopCount NXT中計數。在GraphPad Prism 4. 03 (Gr即hPad Software, SanDiego， CA)中，使用四參數
非線性回歸算法來擬合結合數據。
試驗(V) 胰島素類似物與長效類似物的可混合性，基于NMR的方法。 在NMR譜中，來自蛋白和肽的信號對局部化學環境很敏感。因此，我們可以使用 NMR信號來檢驗胰島素的混合性。對于"N標記的desB30胰島素，在111-1^ HSQC NMR譜中， 來自NH基團的信號位置是已知的。當將"N標記的desB30胰島素與未標記的類似物混合 時，可以檢測^-"N NMR譜的變化。將desB30胰島素的^-"N HSQC NMR譜和與類似物混 合的desB30的NMR譜進行比較。當類似物存在于混合物中時，如果在15N desB30的^-"N HSQC譜中出現新峰，它表示"N desB30胰島素中的NH基團的局部環境發生了變化。這也 表明形成了混合的二聚體/六聚體，意味著這兩個組份不可混合。 將^-"N HSQC NMR譜記錄在配備有低溫探針的Varian Inova 600NMR光譜儀上。 所有的數據都在37t:的溫度下記錄。將胰島素CSNdesB30和選擇的類似物)分開溶解在 水中，混合，最終溶劑系統是30mM苯酚-d， 10mM NaCl， 14mg/ml propylenglycol-d和8mM 磷酸鹽緩沖液(pH7. 4) ，0. ImM Zn，90% H20/10% D20。 胰島素濃度是O. 2mM 15N desB30和所選擇胰島素類似物的濃度是0.05mM。為了 對比，在相同溶劑條件下記錄15N desB30的NMR譜。 當在該試驗中試驗按照本發明的胰島素類似物時，如果其可與desB30胰島素混 合，這表明它們也可以與地特胰島素(其在分子的這一區域中具有與desB30胰島素相同的 氨基酸組成，只不過在B29添加了酰基)混合。
試驗(VI) 單體/ 二聚體平衡的評價，基于NUV-CD的方法。
胰島素類似物的單體化，NUV-CD 在350-250nm范圍內，NUV-CD (近紫外圓二色光譜)譜反映了酪氨酸發色團 的環境，且對聚集很敏感，并且用(+)-10-樟腦磺酸校正。將CD表示為在近紫外范圍
16(250-350nm)對蛋白的摩爾濃度歸一化的A e (M-lcm-1)，并且在276nm處相對于濃度的信 號用作單體化的指示。該試驗表明了胰島素類似物是否主要是單體形式。
權利要求
快速作用的胰島素類似物，其中在人B鏈的B22-B30位中的至少一個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基替代，而所述另一個氨基酸殘基促進胰島素形成單體形式，其中進一步的，B鏈中10位的天然His氨基酸殘基被Ile、Val、Ala、Phe或Ser替代，并且任選，在人B鏈中B22-B30位的一個或多個氨基酸殘基已缺失。
2. 快速作用的胰島素類似物，其中在人B鏈的B22-B30位中的至少一個氨基酸殘基被 另一個氨基酸殘基替代，而所述另一個氨基酸殘基促進胰島素形成單體形式，其中進一步 的，B鏈中10位的天然His氨基酸殘基被11e、Val、Ala或Phe替代，并且任選，在人B鏈中 B22-B30位的一個或多個氨基酸殘基已缺失。
3. 按照權利要求1的胰島素類似物，其中B鏈中10位的天然His氨基酸殘基被lie或 Val替代。
4. 按照權利要求l的胰島素類似物，其中B鏈中lO位的天然His氨基酸殘基被Val或 Phe替代。
5. 按照權利要求1的胰島素類似物，其中B鏈中10位的天然His氨基酸殘基被Ala或 Phe替代。
6. 按照權利要求1的胰島素類似物，其中B鏈中10位的天然His氨基酸殘基被Phe或 Ser替代。
7. 按照權利要求1-6的任一項的胰島素類似物，其中人B鏈中的B22-B30位的1-2個 氨基酸殘基被另 一個氨基酸替代。
8. 按照權利要求1-6的任一項的胰島素類似物，其中人B鏈中的B22-B30位的一個氨 基酸殘基被另 一個氨基酸替代。
9. 按照權利要求1-8的任一項的胰島素類似物，其中B22-B30位的氨基酸替代是Glu 或Asp殘基。
10. 按照權利要求1-8的任一項的胰島素類似物，其中B27位的氨基酸是Glu。
11. 按照權利要求1-8的任一項的胰島素類似物，其中B28位的氨基酸是Glu。
12. 按照權利要求1-11的任一項的胰島素類似物，其中B30位的氨基酸缺失。
13. 按照權利要求1-11的任一項的胰島素類似物，其中B25、B26或B27位的氨基酸已 缺失。
14. 藥物制劑，其包含按照權利要求1-13的任一項的胰島素類似物與長效胰島素類似 物或衍生物的混合物。
15. 按照權利要求14的藥物組合物，其中長效胰島素是Lys，(N^十四酰)des(B30) 人胰島素(地特胰島素)或A21Gly， B31Arg， B32Arg人胰島素(甘精胰島素)。
全文摘要
本發明涉及快速作用的胰島素類似物，其可以與長效胰島素類似物形成可溶性混合物(預混合物或自身混合物)。快速作用是通過人胰島素B鏈的C末端中的單體替代/缺失所獲得的，與長效胰島素類似物的可混合性是通過用Ile、Val、Ala或Phe來替代人胰島素中B10位的Zn-結合的His所獲得的。在一個實施方案中，本發明涉及快速作用的胰島素類似物，其中在人B鏈的B22-B30位中的至少一個天然氨基酸殘基已被另一個氨基酸殘基替代，而所述另一個氨基酸殘基具有促進胰島素形成單體形式的效果，B鏈中10位的His氨基酸殘基被Ile、Val、Ala或Phe替代，且其中在B22-B30位的進一步的一個或多個氨基酸殘基任選已缺失。
文檔編號C07K14/62GK101796071SQ200880103343
公開日2010年8月4日 申請日期2008年8月12日 優先權日2007年8月13日
發明者H·B·奧爾森, P·巴爾施米特, S·哈夫倫, T·B·克爾德森, T·格倫多夫 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司