作為疾病指標的免疫球蛋白裂解片段與用于檢測和結合所述片段的組合物的制作方法

專利名稱：作為疾病指標的免疫球蛋白裂解片段與用于檢測和結合所述片段的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及診斷和預后指標以及用于檢測它們的方法和試劑。本發明還涉及監測 患者疾病自然史的方法。相關領域描述在醫學上，生物標記是可用于檢測疾病進展或治療效果的生物化學物質，也就是， 診斷或預后指標。一種有效反映疾病自然史和疾病控制的生物標記是用于反映糖尿病患者 的血糖控制的血紅蛋白Ale。由于血紅蛋白Alc(HbAlc)在血清中的半衰期長，它用作血糖 自理想水平偏移和這種偏移的持續時間的最近記錄。當前使用的全身炎性病癥的生物標記 是 C 反應性蛋白(CRP) (Pepys MB 等人，J. Clin. Invest. Ill ；1805-1812, 2003) CRP 是一 種響應許多種急性炎性病癥而產生的急性期反應物。CRP響應細胞因子信號而在肝臟中合 成，所述信號包括TNF和IL-6，它們自身從遠方的炎癥部位遷移而來。血清中CRP增加發生 于感染、中風、血管疾病、心肌梗塞以及幾種其他急性炎性疾患。循環免疫球蛋白，特別是IgG類的那些抗體，是主要的血清蛋白。公知的是，人蛋 白酶與炎性疾病、增殖性疾病、轉移性疾病以及感染性疾病有關。如細菌蛋白酶如谷氨酰基 內肽酶(金黃色葡萄球菌(Staph, aureus)或鏈球菌(化膿性鏈球菌(Str印.pyogenes)) 的免疫球蛋白降解酶那樣，人蛋白酶諸如基質金屬蛋白酶(MMP)和嗜中性粒細胞彈性蛋白 酶在各蛋白酶特有的殘基處裂解gG重鏈多肽。重鏈的裂解位點聚集在被稱為鉸鏈結構域 的區域周圍，兩條重鏈鏈間二硫鍵出現在該區域中。鉸鏈以下的區域構成Fc區，包含負責 IgG的效應子功能的結合位點。在微生物的情況中，蛋白酶表達是潛在的附屬致病途徑，允 許生物體避免調理作用(Rooijakkers 等人，Microbes and Infection 7 :476_484，2005)， 以致鉸鏈下游由裂解導致的Fc結構域的蛋白酶解釋放有效地中和會否則導致病理細胞的 靶向和殺傷的功能。因此，特異性蛋白酶的活動可以代表無數疾病狀態，包括癌癥、炎性疾 病以及感染性疾病。在體內病理環境中，IgG裂解增強，這通過結合裂解的鉸鏈結構域的天然IgG自身 抗體的存在得以證明(Knight 等人，1995 ；Nasu 等人，1980 ；Persselin 和 Stevens, 1985， Terness等人，1995 J Imunol. 154 :6446_6452)。這些自身抗體還結合由幾種蛋白酶(包括 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)產生的Fab和？(油’)2片段，對于作為F(ab’)2分子的C末端殘基 剩余的下游鉸鏈結構域具有特別強的反應性(Terness等人，1995)。已有報道檢測到實際 裂解產物(Fick 等人，1985 ；Goldberg 和 Whitehouse. 1970 ；Waller，1974)，但尚未開發出 能使這些片段作為生物標記的強力測定方法，這可能是由于各片段被快速清除導致血清中 濃度低，或由于在血液和組織中的大量完整免疫球蛋白當中檢測所述片段的技術問題。過 去制備了特異性抗體(Eckle等人，1988. Adv. Exp. Med. Biol. 240 :531_534)，用于檢測人嗜 中性粒細胞彈性蛋白水解裂解的Fc結構域，在類風濕性關節炎患者的滑液中直接檢測到0.62ug/ml的中位濃度的Fc，但在患有其他類型的關節疾病的患者的滑液中沒有檢測到。因此，若能夠評估受試者的體液或血液中的IgG裂解產物的類型和數量，這可用 作特定疾病活動的生物標記。用于這些測定的特定試劑和方法將可提供用于診斷性和預后 性醫學測定的有用工具。

發明內容
本發明涉及用于檢測與蛋白酶活動有關的疾病過程的試劑以及所述試劑的該用 途，所述蛋白酶是疾病病理的表現，并且是限制宿主免疫防御的因子。在本發明的一方面， 涉及所述試劑和所述試劑在檢測抗疾病抗體的測定方法中的用途，所述抗體對于與疾病病 理相關的靶標具有特異性。所述試劑用于評價所述蛋白水解裂解導致的IgG分解產物。在本發明的另一個實施例中，本發明的方法用于檢測IgG裂解產物，所述裂解產 物的特征在于1)在生理條件下具有可與完整哺乳動物IgG相比的分子量；2)在變性但非 還原條件下可分離成兩個片段，包括抗原結合片段和32kDa片段；3)在體外測定中不顯示 ADCC活性。在本發明的檢測IgG裂解產物的方法的一方面，提供了能夠檢測所述裂解產物 的特異性試劑，所述試劑為至少一種能夠結合所述裂解產物的抗體。在本發明的另一個實施例中，提供了用于產生可用于檢測IgG裂解產物的試劑的 序列，所述序列可用于本發明的抗IgG裂解產物試劑的免疫、淘洗以及選擇。一方面，所述 序列選自至少5個連續的氨基酸組成的組，所述氨基酸選自人IgG鉸鏈區序列SEQ ID NO
1、2、3或4，位于蛋白水解裂解位點的氨基末端一側。在一個實施例中，所述序列選自SEQ ID N0:5-ll及其N末端截短形式。另一方面，提供了一種基于人IgG分子的蛋白酶水解裂 解位點來設計肽免疫原的方法。在本發明的另一個實施例中，提供了制備本發明抗IgG裂解產物抗體的的方法， 包括用于重組產生抗IgG裂解產物抗體的核酸序列、載體以及宿主細胞。在制備抗IgG裂解 產物抗體的方法的另一方面，提供了免疫宿主動物，所述動物的血清是本發明抗體的來源， 從中通過所述方法或本領域已知的方法制備所述試劑。 在本發明的另一個實施例中，提供了 一種用于檢測抗IgG裂解產物的試劑盒，其 包含本發明的抗IgG裂解產物抗體。本發明的又一個實施例是一種進行抗IgG裂解特異性抗體給藥來治療患者以恢 復對于IgG裂解產物的效應子功能的方法。


圖1描繪了典型的哺乳動物IgG類抗體的多種結構域，顯示了它們與鉸鏈和被確 定為Fab、F (ab ’)2以及Fc的的胃蛋白酶和木瓜蛋白水解裂解產物的關系。圖2顯示了四種單獨的Agilent Biosizing微毛細管電泳分析，為在人IgGl k抗 體Mabl在37°C下被1 % w/w的人MMP-3 (A)、鏈球菌IdeS (B)、葡萄球菌谷氨酰基內肽酶I (C) 以及人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(D)各蛋白酶消化過程中各時間的凝膠圖像。各凝膠上的 標準品(泳道1)對應于完整的人/鼠嵌合IgGl和已知的裂解片段。圖3顯示了鉸鏈區周圍的人IgGl重鏈的序列，主要的蛋白水解裂解的位置由箭頭 表不。
圖4是蛋白質印跡(Western Blot)，顯示了生物素化的鼠/人IgG被創傷滲出物 降解的時程。圖5的柱狀圖顯示了用綴合的F(ab’)2降解產物免疫的家兔中產生的抗血清的相 對特異性，所述裂解產物由三種不同的蛋白酶MMP_3、V8以及IdeS產生TCPPCPAP，其為對 應于MMP-3裂解位點的SEQ ID N0:1的殘基7-14;TCPPCPAPE，其為對應于谷氨酰基內肽酶 位點的SEQ ID NO :1的殘基7-15 ；以及TCPPCPAPELLG，其為對應于IdeS位點的SEQ ID NO: 1的殘基7-18。顯示了三種家兔多克隆抗鉸鏈肽抗體制品各自與Mab3 IgGlK的F(ab’)2 片段的ELISA反應性。？(油’)2片段是用人重組匪 -3、葡萄球菌谷氨酰基內肽酶1以及來 自化膿性鏈球菌的重組IdeS來產生。家兔抗體制品的混合匯集物表現了與各Mab3F (ab’)2 片段幾乎等同的反應性。條形對應于三個重復孔的均值士標準差。圖6是家兔多克隆抗體制品與抗體消化物的蛋白質印跡反應性。通過SDS-PAGE分 離完整的Mab3人IgGl或已經使用MMP-3、谷氨酰基內肽酶(V8)或IdeS部分消化的Mab3 人IgGl，然后進行免疫印跡分析。(A)使用抗人IgG(H+L)抗體[泳道1-4]或抗...LLG家 兔多克隆抗體[泳道6-10]進行印跡。(B):使用抗...PAP抗體[泳道2-5]或抗...APE 抗體[泳道7-10]進行印跡。切下印跡，然后與通過小圖A泳道5和小圖B泳道6的抗體 一起溫育，以使得可用單獨的抗血清進行檢測。圖7是使用RAH-1試劑對來自5名類風濕性關節炎的滑液中IgG降解的分析樣品 進行顯影的蛋白質印跡，并與來自使用MMP-3、谷氨酰基內肽酶(V8)以及IdeS進行的單克 隆IgG 1的體外蛋白水解消化物的樣品進行比較。圖8顯示了不同蛋白水解裂解片段完整IgG、scIgG以及F(ab’)2隨時間推移的血 清濃度；這是在指定的純化片段注射至小鼠之后使用山羊抗人IgG(H+L)檢測的。圖9是在來自經診斷患有圖中所示疾病的患者的人血清樣品中通過試劑RAH-1檢 測到的scIgG各數值的點圖，與正常人血清樣品組中相比較，其中線條表示各組的均值。圖10顯示了使用改進形式的ELISA用試劑RAH-1檢測到的10個類風濕性關節炎 (RA)個體和同樣數量的健康正常對照的稀釋血清中scIgG的濃度；RA組中的“⑵”表示在 兩個分開的個體中獲得的相同數值。圖11顯示了靶向作為肽類似物的人IgGl鉸鏈的裂解片段和在指定殘基處終止的 抗體片段(見圖3)的家兔單克隆抗體的相對反應性。圖12顯示了三種不同的靶向人IgGl鉸鏈裂解片段的家兔單克隆抗體在對用IdeS 消化IgGl而產生的F(ab’)2恢復補體依賴性細胞裂解(CDC)時的濃度依賴性，與所制備的 抗裂解肽類似物的家兔多克隆抗體(rbpoly)相比較。序列表簡述
具體實施例方式MMAbs =抗體；ADCC =抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用；⑶C =補體介導的細胞 毒作用；HNE =人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶；IdeS =化膿性鏈球菌的免疫球蛋白降解酶；Ig =免疫球蛋白；Mab =單克隆抗體；MMP =基質金屬蛋白酶；scIgG =單鏈裂解的IgG ；SA = 鏈霉親和素；V8 =來自金黃色葡萄球菌的谷氨酰基內肽酶I。紅抗體片段Fab、F(ab’)2以及Fc是描述IgG抗體的蛋白水解裂解產物的術語，所述 產物可進一步通過重鏈之間的二硫鍵(核心鉸鏈區)的還原而離解。典型的蛋白水解產生 的抗體片段包括Fab(例如，通過木瓜蛋白酶消化)，Fab’(例如，通過胃蛋白酶消化和部分 還原)以及F(ab’)2 (例如，通過胃蛋白酶消化)，facb (例如，通過纖溶酶消化)，pFc’(例 如，通過胃蛋白酶或纖溶酶消化)，Fd(例如，通過胃蛋白酶消化，部分還原以及重聚合)，其 中還原去除半胱氨酸殘基之間形成鏈間鍵的二硫鍵(參見圖1)。由于Fc片段被描述為木 瓜蛋白裂解片段，所述木瓜蛋白酶在相對于鉸鏈處在N末端的殘基224(EU編號)處解離 人IgGl，所以認為Fc片斷保留鉸鏈以及重鏈間二硫鍵，然而，由于抗體中重鏈CH2-CH3 二 聚體之間高度締合，甚至在不存在二硫鍵(鉸鏈)的情況下二聚體結構也得以保留。因此， 如本文所使用，“Fc”是指由重鏈CH2-CH3區段締合(不管是共價結合還是非共價結合)而 形成的二聚體結構。應理解，由于非共價結合的Fc具有在變性劑如去污劑的存在下離解成 CH2-CH3單體的能力，它可與二硫鍵連接的Fc相區別。 術語“蛋白水解的”、“蛋白水解裂解”，“蛋白酶”和“蛋白水解酶，，可替換使用，意指能夠裂解多肽鏈產生兩個或多個片段的物質，例如酶，其中所述酶在正常溫度下和在生 理條件下或生理相容性條件下起作用。生理條件包括自然存在于健康或有疾病的活哺乳動 物體內的任何溫度、緩沖劑、陽離子、陰離子、底物、催化劑、PH、輔因子等。然而，蛋白酶可衍 生自非哺乳動物來源，諸如來自可為任何類型的生命形式的病原體。“scIgG”或“單鏈裂解的IgG”是指具有包含兩個重鏈和兩個輕鏈的異二聚體結構 的任何免疫球蛋白G類分子，其中一個重鏈已經經受在單條重鏈上的蛋白水解裂解，而另 一個重鏈保持完整。與從N末端到C末端殘基書寫的氨基酸序列有關的“上游”是指該序列中自給定 的殘基起至N末端的殘基。相反地，與氨基酸序列相關的“下游”是指該序列中自給定的殘 基起至C末端的殘基。亞結構的抗體功能通常，免疫球蛋白、抗體由包含約100個氨基酸的連續多肽鏈區域組成，所述區 域顯示特征性折疊的球形結構域并代表結構的不同元件。每100個氨基酸區域代表約 10-llkDa的球形結構域。對于免疫球蛋白(IgG)，這些結構域集合成片段，Fab片段由 輕鏈可變區與輕鏈恒定區連接成單鏈而構成，該單鏈通過二硫鍵與重鏈第一恒定區(CH1) 連接，重鏈第一恒定區鄰近重鏈可變區。Fc由兩個鄰近的重鏈恒定區(CH2和CH3)通過鉸 鏈區中的兩個或三個二硫鍵鏈接而構成。研究表明，蛋白酶，諸如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶， 優先地在片段之間的位點裂解抗體。兩個完全相同的Fab片段通過鉸鏈區與一個Fc片段 連接，由此形成Y形構象的150kDa結構(見圖1)。使用木瓜蛋白酶產生的Fab片段通常具 有46kDa的分子量，非還原的F(ab，)2通常具有90_100kDa的分子量，非糖基化非還原Fc 具有約50-60kDa的表觀分子量。然而，由于各抗體種類和某種類中各亞類抗體稍有不同， 確切的裂解性質和位置以及和裂解產物也不同。抗原通過每對輕重鏈的可變結構域中的抗原結合位點來結合抗體(圖1)。被稱 為效應分子的其他分子或細胞結合分子其余部分中的其他位點，即抗原結合位點以外的位 點，抗體的這個部分包括變異性較弱的免疫球蛋白序列抗體的“恒定部分”，這些位點尤其 位于由重鏈的延伸超過輕鏈末端的部分構成的Fc區。抗體具有通過效應分子的結合而介導的幾種效應子功能。例如，補體的C1組分結 合抗體會激活補體系統。補體的激活在調理作用和細胞病原體的裂解(被稱為補體介導的 細胞毒作用或CDC的過程)中重要。補體的激活會刺激炎癥反應，且還可涉及自身免疫性 超敏反應。另外，抗體通過Fc區結合細胞，即抗體Fc區上的Fc受體位點結合細胞上的FC 受體(FcR)。有許多種對不同類別的抗體有特異性的Fc受體，所述抗體包括IgG ( Y受體)、 IgE(n受體)、IgA(a受體)以及IgM(ii受體)。抗體結合細胞表面的Fc受體會引發許 多重要的和各式各樣的生物反應，包括吞噬和破壞抗體包裹顆粒，清除免疫復合物，殺傷細 胞裂解抗體包裹的靶細胞(被稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用，或ADCC)，釋放炎癥 介質，胎盤轉移和調節免疫球蛋白產生。通常，在IgG同種型(SEQ ID NO :1_4)和哺乳動物物種中，鉸鏈結構域周圍的序列 是保守的。IgGl (SEQ ID NO 1)和IgG3(SEQ ID NO 1)同種型包含Leu-Leu對，它是用于 結合Fcy受體和用于Fc效應子功能的結構基序。“鉸鏈核心”下游的其他殘基也是保守 的，所述鉸鏈核心通常包括至少由兩個非半胱氨酸殘基分開的半胱氨酸。
申請人已經發現，當構成IgG的兩條重鏈多肽之一發生蛋白酶解時，通過人和細 菌蛋白酶形成人IgGl的裂解產物scIgG，而同時不破壞異二聚體分子的總體組成。其次， 申請人:已經通過對含有人重鏈恒定區的IgG分子進行蛋白酶解攻擊的動力學分析而確定， scIgG可能是體內蛋白酶解的較豐富的產物。對于MMP-3酶，先前注意到scIgG作為IgG 蛋白酶解過程中產生F(ab’)2的蛋白酶解中間物而存在(Gearing AJH等人，Immunol. Lett. 81 :41-48，2002)。先前也注意到鏈球菌蛋白酶IdeS裂解IgG而產生通過尺寸排阻層 析鑒定的類似完整 IgG 的產物(Vincents B 等人，Biochemistry 43 15540-15549, 2004)。 然而，未有報道該中間物的功能表征，也沒有提供用于檢測生物樣品中的scIgG的方法。申請人:還已經證實了，在體內，scIgG顯示出與疾病活動評價一致的幾天至幾個月 的血清半衰期，由此使得能夠使用scIgG作為潛在的或受抑制的疾病過程的標記，或者可 用于理解疾病的最近自然史和反應或恢復。簡而言之，申請人已經發現，在生理條件下蛋白水解裂解的動力學導致蛋白水解 裂解的IgG處于scIgG構象的比例大于作為多個裂解事件的產物的物質(例如F(ab’ )2) (參見圖1))的比例。在檢測大量蛋白酶的過程中確定到，完整IgG中的重鏈恒定區的第 一裂解進行得比第二裂解要快，這樣的順序導致單鏈裂解的物質暫時聚集這種單鏈裂解形 式的IgG分子與其完整母體在許多方面(例如，分子大小、抗原結合、被蛋白A/G識別的能 力)不能區分。根據本發明，申請人已經產生了適合檢測蛋白水解裂解產物(包括F(ab’)2和 scIgG)的試劑。使用本發明的裂解位點類似物肽產生的本發明的試劑能識別人IgGl裂解 產物，但不識別完整IgG。申請人:還已經證實，能識別保留抗原結合特異性的IgG裂解產物的抗體能夠恢復 裂解的IgG的效應子功能，諸如⑶C和ADCC。蛋白水解酶和疾病的相關性申請人:證實，在患有類風濕性關節炎的患者的炎性滲出物如滑液中，可檢測到其 大小與體外酶組(enzyme panel)所產生的那些產物相似的抗體裂解產物，包括scIgG在 內。另外，在多種疾病的患者的血清中可檢測到scIgG，在所述疾病中，局部的蛋白酶解活性 是已知的病理特征。這些疾病狀態中的scIgG的濃度比健康正常志愿者高，且比患有較不 嚴重的炎性疾病的患者的血清高。通過產生親和純化的多克隆抗體(家兔)使得能夠檢測到scIgG，所述抗體特異性 結合裂解的重鏈的鉸鏈二硫鍵處或周圍的新暴露表位，但與完整的非裂解的IgG分子不起 反應。能在血清中檢測scIgG的確證理由是它具有與完整IgG相似的長期循環壽命。能夠 檢測患病個體的體液或血液中的scIgG，這是一種潛在新型的生物標記策略。應理解，除了 家兔以外的其他物種(諸如小鼠、大鼠和駱駝)的抗體也可使用，例如通過克隆編碼特定抗 體結合區域序列的抗體基因而產生的單克隆抗體被包括作為本發明的試劑，所述多克隆或 單克隆抗體保留結合人IgGl裂解產物的能力但不識別完整的IgG。其他產生抗體的方法， 例如，通過篩選抗體結構域文庫來產生，對于本領域技術人員來說是已知的，可用作本發明 抗體的來源。抗體試劑可使用標準品和本申請人設計的用來引生或選擇可用于本發明的實施的抗體的免疫原，以本領域公知的幾種方式來制備本發明的抗體。一方面，從雜交瘤方便地獲得抗體，所述雜交瘤通過使用觀察到的裂解片段或由 此衍生的裂解位點類似物肽來免疫動物而制備。因此，可通過使用抗體裂解片段(包括 F(ab’)2和scIgG或其N末端截短形式或結構類似物)免疫動物或篩選抗體文庫來獲得抗 體。在一個實施例中，用于產生抗體的肽選自示于SEQ ID NO 5-11的IgGl的14-mer肽片 段，其中，多肽或肽的C末端殘基代表殘基裂解對的裂解位點(如表1所示)上游(N末端 側)的殘基。包含鉸鏈基序(例如IgGl的-T-C-P-P-C-(SEQ ID NO 1的殘基7_11))的片 段由于二硫鍵的形成而為多聚體，除非半胱氨酸殘基(C)被例如丙氨酸(A)殘基取代。在一個具體的實施例中，使用對應于MMP-3裂解位點氨基末端一側的氨基酸序 列(TCPPCPAP，SEQ ID NO :1的殘基7-14)的8-mer肽、或對應于谷氨酰基內肽酶位點 (TCPPCPAPE，SEQ ID NO 1 的殘基 7-15)或 IdeS 位點(TCPPCPAPELLG, SEQ ID NO 1 的殘基 7-18)的延長的肽，來產生抗體。當肽用作免疫原時，其可通過N末端或通過添加的接頭殘 基或接頭肽而與匙孔賊.血藍蛋白(KLH)連接。因此，可使用本領域公知的任何雜交瘤技術獲得抗體，見例如Ausubel，等人編輯， Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)； Sambrook 等人，MolecularCloning :A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, NY(1989) ；Harlow 禾口 Lane, antibodies, a Laboratory Manual, ColdSpring Harbor, NY(1989) ；Colligan 等人編輯，Current Protocols inlmmunology, John Wiley & Sons, Inc. , NY(1994-2001) ；Colligan 等人’ Current Protocols in Protein Science, John Wiley & SonS，NY，NY，(1997-2001)，上述文獻各自以引用方式并入本文中。本發明的抗體 可包括或衍生自任何哺乳動物，例如但不限于人、小鼠、家兔、大鼠、嚙齒動物、靈長類動物 或它們的任何組合，且包括分離的人的、靈長類動物的、嚙齒動物的、哺乳動物的、嵌合的、 人源化的和/或CDR移植的抗整聯蛋白抗體、免疫球蛋白、裂解產物和其他特定部分及其變 異體。也可用噬菌體展示抗體文庫來鑒定對scIgG和其他抗體片斷有期望的特異性的 新型結合結構域。在引生或選擇可用于本發明的抗體或其他結合物時，用于這個目的的特異性試劑 是本發明的又一方面。所開發的用于這個目的的特異性免疫原或檢測試劑的特征在于包 含IgGl的鉸鏈核心周圍的殘基，包括但不限于圖3所示的殘基S⑶KTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFP(SEQ ID N0:1)。其他的當與蛋白水解酶接觸時產生抗體片段的人同種型抗體的 鉸鏈區，也可充當用于產生、選擇或檢測抗體或其他與酶裂解產物結合的分子的目的的類 似物的來源。人IgG4重鏈的類似物區域包括殘基TCNVDHKPSN TKVDKRVESKYGPPCPSCPA PEFLGGPSVF LF (SEQ ID NO :2)，對于 IgG2 和 IgG3，分別如 SEQ ID NO :3 禾口 4 中所示。在 各種情況中，肽都由至少5個連續的氨基酸組成，所述氨基酸選自SEQ ID N0:l、2、3或4 的在蛋白酶裂解位點的氨基末端一側的人IgG鉸鏈區序列。一方面，用于產生抗體的特異 性免疫原或肽包含至少IgGl的鉸鏈核心，其被定義為殘基-T-C-P-P-C-。在一個具體實 施例中，所述肽為人IgGl下游鉸鏈和鄰接的CH2結構域的12-mer肽類似物，其具有序列 TCPPCPAPELLG (SEQ ID NO 1的殘基7_18)。用于產生可用于產生、選擇或檢測抗體或其他 與酶裂解產物結合的分子的肽片段的一般方法是a)鑒定抗體重鏈的被蛋白酶所裂解的
10一對殘基的N末端殘基，所述蛋白酶如實例1中通過具體蛋白酶舉例說明的和表1中所示 的；b)確定自該裂解位點起的5-14個或更多個上游殘基，其中該N末端殘基將變成所確定 的序列的C末端；以及c)產生足量的用于所需目的的肽。諸如所述的那些的肽為選自SEQ ID N0:5-ll或其N末端截短形式的那些。所述肽可進行標記、綴合或交聯或者互相混合混 合或與佐劑混合使用，目的是檢測結合，或者作為免疫原或者用于例如從噬菌體展示文庫 選擇結合物(binder)的淘選靶標。一方面，本發明還提供了這樣的分離核酸，其包含與編碼前述特異性肽或其抗體 的多核苷酸、與該多核苷酸互補、或與該多核苷酸雜交，包括至少一種指定序列、結構域、其 部分或變異體。本發明包括編碼至少一種如本文所述對scIgG具有特異性的分離單克隆 抗體的分離核酸，和包含所述分離核酸的核酸載體，和/或包含所述分離核酸的原核或真 核宿主細胞。所述宿主細胞可任選為選自以下的至少一種大腸桿菌(E. Coli)、C0S-1、 C0S-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2，653、SP2/0, 293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆 蟲或植物細胞，或它們的任何衍生細胞、永生細胞或轉化細胞。還提供了一種用于產生至少 一種本發明的抗體的方法，其包括在體外、體內或原位條件下翻譯編碼抗體的核酸，使得所 述肽或抗體以可檢測或可回收的量表達。使用方法當疾病過程引發、造成蛋白水解活性和蛋白水解酶、蛋白酶，或者由蛋白水解活性 和蛋白水解酶、蛋白酶所致，或者另外與蛋白水解活性和蛋白水解酶、蛋白酶有關聯時，本 發明的試劑可用于檢測疾病病理。所述疾病和過程包括促成、加劇、產生于或起因于感染、 中風、血管疾病、心肌梗塞和幾種其他急性和慢性炎性病癥的那些疾病和過程。申請人已經 證實，蛋白酶解活性的一種特別有用的生物標記是scIgG，其在某些前述病癥中以增加的水 平檢測到。由于scIgG在病理或病理過程或感染的部位局部產生，所以scIgG提供了這些 過程的獨特和特異性標記，作為特定組織或細胞類型在疾病部位的參與情況的度量。在本發明的方法的一個實施例中，從懷疑正患有、已經患有具有蛋白酶水平升高 特征的疾病或因患有該疾病而進行了治療的受試者獲取樣品。使樣品與對IgG裂解片段具 有特異性的結合劑(諸如抗體制品)接觸，已知所述IgG裂解片段因疾病刺激的蛋白酶和 血清IgG群體之間的接觸而產生。本發明的方法可用于評價先前診斷患有疾病或病癥的患者是否處于重病的危險 (例如，癌癥轉移、迅速蔓延的腫瘤生長、持續感染等)之中。在某些情況中，例如在癌癥患者中，scIgG的檢測可用于指示涉及轉移擴散的重病 進展，已知轉移擴散涉及蛋白酶的活動(elaboration)，尤其是MMP。在某些方面，腫瘤性 疾病通常和炎癥過程、組織修復以及痊愈共有這些機制(Coussens，L. M.和Werb，Z. 2002. Nature 420(19) :860_867)。其他研究已經顯示，例如脂質降低與心臟和血管事件(例如， 血栓形成)的危險降低有關，也與MMP(例如，MMP-2和MMP-9)的降低有關，這些酶是由動 脈粥樣硬化斑塊產生(Deguchi，J, Maanori, A.，Ching-Hsuan, T.等人，2006 Circulation 114:555-62)。因此，本發明的方法特別可適用于但不限于患有嚴重關節炎綜合征(RA，強 直性脊柱炎)、某些癌癥(尤其是炎性乳腺癌)、重癥冠狀動脈疾病(心肌梗塞和充血性心 力衰竭)以及其他疾病例如哮喘的患者。本發明的方法可用于將其中病理生理涉及或誘導 能夠作用于IgG的蛋白酶的那些疾病和病癥與不具有水平增高的分泌性蛋白酶或其中蛋白酶不裂解IgG的疾病區分開來。因此，盡管使用本發明描述的試劑的方法對于檢測裂解的片段具有特異性，但對 于裂解片段的更具有特異性的分析包括對于裂解的抗體的可變區的結合特異性的分析。例 如，將抗原結合選擇性與片段化抗體檢測相結合的固相測定可用于確定某些抗原和蛋白酶 是否在受試者中共定位，由此提供關于蛋白水解活性部位的組織、疾病或病理的性質的信 肩、o抽取血液是最常實踐的從健康或患病的人或動物受試者進行組織取樣的形式。在 此程度上，由于scIgG可見于全身，并不限于形成部位，即蛋白酶活性的部位，它是可能局 限于特定隔室的疾病活動的報告標記。一種這樣的隔室是滑液。因此，血液或血清采集提 供了用于使用本發明提供的試劑和方法檢測早期疾病的方便和可行的來源。可選地，局部 環境如RA滑液、肺滲出物、活組織檢查等的取樣也可在任何階段(包括診斷)應用于患者 或應用于重癥疾病的患者。裂解的抗體片段可在所述組織樣品中通過直接染色(免疫組織 化學法)檢測到或在衍生自所述樣品的切片樣品中檢測到。組織樣品包括血液應該進行處理，以抑制任何殘留的活性蛋白酶。金屬的螯合作 用(例如，)可有效抑制MMP。碘乙酰胺可阻斷半胱氨酸蛋白酶(例如，IdeS)，使用DFP和 相似的化合物可阻斷絲氨酸蛋白酶。活性蛋白酶存在于滑液中，因此應進行處理。樣品 還應冷凍維持直到測定時為止。一旦已經合適地處理樣品，可將本發明的scIgG特異性 試劑用于本領域已知或還待于開發的基于任何抗體的技術，例如ELISA、基于微珠的形式 (bead-based format)、RIA0本發明的抗IgG蛋白水解裂解片段試劑可包裝于試劑盒中用于研究或診斷用途， 和用于和其他試劑連同用于檢測的說明書一起商業銷售，所述其他試劑例如緩沖液和標準 物例如完整的人IgG和已知量的裂解的IgG，所述說明書指導如何測量和如果需要的話定 量來自受試者的組織樣品收獲物中的IgG蛋白水解裂解片段。對鉸鏈肽裂解片段具有免疫特異性的本發明抗體能夠結合保留抗原結合結構域 例如Fab、F(ab' )2、scIgG的酶裂解的IgG的殘留物，并由此通過提供完整Fc區而恢復Fc 相關的結合特性和伴隨的效應子功能。因此，通過本文教導的方法產生的抗體或具有體內 結合酶解產生的抗體片段的特性的抗體可用作治療分子。本發明的抗IgG裂解片段抗體可 用于治療患有具有疾病誘導的IgG蛋白水解裂解的特征的疾病的患者。一方面，抗IgG裂 解片段抗體可用于恢復保留靶標特異性結合能力的抗體片段的效應子功能。已對本發明進行了一般性的描述，以下實例將進一步公開本發明的實施例。實例1 人IGG重鏈的裂解分析研究了基質金屬蛋白酶、組織蛋白酶、人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)和選擇 的病原體酶例如葡萄球菌谷氨酰基內肽酶(V8蛋白酶)以及鏈球菌免疫球蛋白降解酶 (IdeS)對人IgG重鏈的蛋白酶解。使包IgG重鏈的純化的單克隆抗體與所述的蛋白酶接觸，在接觸的各時間段進行 取樣。使用用于體外生物分級(biosizing)的Agilent微流控“芯片實驗室”技術評價樣 品中的片段形成(Goetz H 等人，Biochemical and Biophysical Methods 60 ；281-293, 2004)。抗體底物.單克隆抗體是完全的人抗體、重組的人源化鼠抗體或具有人恒定結構域和IgGl k類/亞類和種類的鉸鏈區的人/鼠嵌合抗體Mabl是結合病原體的人IgGl， Mab2 (抗細胞因子)是具有人恒定區和鉸鏈結構域的人/鼠嵌合IgGl抗體，Mab3是CDR移 植人源化IgGl。所有所述抗體均含有k輕鏈。蛋白水解酶和檢測方法.人MMP-2、MMP-7酶原以及MMP-9酶原獲得自 Chemicon International (Temecula, CA)，并在使用前通過使用ImM醋酸氨基苯汞 (p-aminophenylmercuric acetate, APMA ；CalBiochem, SanDiego, CA)在 37 °C 溫育 16 小時而激活(March等人，1991)。重組的人活性MMP-12獲得自R&D Systems。重組的 MMP-1是Hideaki Nagase博士的慷慨饋贈品。人MMP-3酶原在HEK細胞中瞬時表達， 其中使用組氨酸標簽代替鉸鏈和血紅素結合蛋白結構域。如先前所述(Koklitis等人， 1991)通過在55°C溫育25分鐘激活MMP-3酶原變異體。組織蛋白酶B、D、G、S以及蛋 白酶 3 獲自 Athens Research & Technology (Athens，GA)。凝固酶凝血酶 F. Xa、F. IXa、 F. Xlla和血管舒緩素(kallekrein)以及纖溶酶和纖溶酶原購自Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN)。會且會只鄉千舌齊[J (Activase) ^Genentech (South San Francisco, CA)的產品。鏈激酶和激活的蛋白C獲自Sigma (St. Louis，M0)。葡激酶獲自 Affinity BioReagents (Golden, CO)。金黃色葡萄球菌V8谷氨酰基內肽酶I獲自Pierce Biotechnology(Rockville,IL)0化膿性鏈球菌的重組免疫球蛋白降解酶(IdeS)由隆德大 學(瑞典Lund)的Lars Bjorck博士提供。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中于pH 7. 5下對于純化的IgG進行蛋白酶消化，或對于 金屬蛋白酶，在Tris緩沖鹽水緩沖液中于37°C對于純化的IgG進行蛋白酶消化。在金屬蛋 白酶反應中，對于MMP-12包括ImM氯化鈣，對于MMP-3包括10mM氯化鈣，除此之外不使用 添加劑。抗體濃度通常為1或2mg/mL，通過添加酶至與IgG的比例為(w/w)來起始反 應。在指定時間移除等份(10-20 iiL)，并通過調整到20mM EDTA (金屬蛋白酶)或ImM碘乙 酰胺(半胱氨酸蛋白酶)或通過快速冷凍終止反應。通過對純化的Fc片段(MMP-3和MMP-12)進行N末端測序，和/或通過對純化的 Fab(嗜中性粒細胞彈性蛋白酶，纖溶酶)和F(ab’)2 (組織蛋白酶G，谷氨酰基內肽酶和 IdeS)片段進行高分辨率質譜分析，來對IgGl鉸鏈中的主要蛋白水解裂解位置鑒定酶產生 的片斷。使用Agilent微流控“芯片實驗室”技術來評價片段形成情況。結果檢測了一系列蛋白酶，表1中顯示了人IgGl的蛋白水解裂解主要產物的分析 結果。在所使用的條件下，有幾種酶不使IgGl形成片段。在活性蛋白酶中，在所述的條件 下的相對特異性活性為IdeS > MMP-12 > MMP-3，谷氨酰基內肽酶>嗜中性粒細胞彈性蛋 白酶> 組織蛋白酶G，纖溶酶> MMP-2，MMP-9 > MMP-7。圖2描繪了在蛋白酶處理之前和處理過程中對IgG的生物分級(biosizing)分 析。觀察到MMP-3、谷氨酰基內肽酶I以及IdeS各自以分步方式裂解IgGl (分別見圖2A、2B 以及2C)。在每種情況下，產生約135，000Da的早期中間物，其隨后被轉化為約100，OOODa 的片段。在這些反應過程中，還形成約35kDa的片段，推定是Fc單體。通過凝膠遷移測量 的分子量(35kDa)比通過重鏈片段氨基酸序列預測的要大，為211至215個殘基(在重鏈 C末端處的殘基232和237至第447個殘基之間)，但與在CH2結構域中含有糖基化位點的 片段一致。在這些條件下，使用MMP-3和谷氨酰基內肽酶I，完整的IgG(160，OOODa)經幾小 時的時間段消失，使用IdeS則在一分鐘或更少時間之內消失。所有消化是在所述的可比較
13的條件下進行。發現135kDa中間體是由一條重鏈中下游鉸鏈結構域中的單一蛋白水解裂解所產 生。在非變性條件下，該中間物與完整的IgG在某些物理特性上不可區分，例如在尺寸排阻 層析中的遷移(數據未顯示)。然而，在SDS凝膠和目前的微毛細管電泳系統中，Fc區(重 鏈的CH2-CH3結構域)的裂解片段與結構的其余部分分離，從而顯示出分子大小減小的中 間物(135kDa)。該片段的大小與Gearing報道的單一裂解的IgG —致[2002 (同上文)]。 使用所述三種酶對IgGl進行長時間溫育導致scIgG中間物轉變成F(ab’)2片段和Fc。在顯示出具有裂解所檢測的基于不同單克隆IgGl的底物的IgGl能力的酶中，有 下述一致的發現初始裂解成單鏈裂解的中間體相對較快，而二次裂解成F (ab’)2則需要較 長時間。圖2D中還顯示了使用人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)對Mabl消化得到的消化 物。HNE不同于所述三種酶在于它在上游鉸鏈將IgG裂解而產生Fab片段和相應的二硫鍵 連接的Fc 二聚體。通過對純化的Fc片段(MMP-3和MMP-12)進行N末端測序，和/或通過對純化的 Fab(嗜中性粒細胞彈性蛋白酶，纖溶酶)和F(ab’)2 (組織蛋白酶G，谷氨酰基內肽酶和 IdeS)片段進行高分辨率質譜分析，來對IgGl鉸鏈中主要蛋白水解裂解位置鑒定酶產生的 片段。圖3中顯示了人IgGl鉸鏈區的氨基酸序列，指示了鑒定的酶裂解位置。使用在上游 鉸鏈中裂解的蛋白酶長時間消化產生兩個Fab片段，裂解下游鉸鏈(在核心鉸鏈二硫鍵之 下)的酶則產生F(ab' )2。分別基于對F(ab’)2或Fc片段中的羧基和氨基末端殘基的分析，鑒定或證實各種 酶的酶裂解主要位點，所述酶包括人MMP-3和MMP-12、人組織蛋白酶G、人HNE、葡萄球菌谷 氨酰基內肽酶I和鏈球菌IdeS(表1)。在長時間的溫育過程中，在某些情況下觀察到次級 裂解位點(例如，組織蛋白酶G和HNE)，不清楚這些是指定的蛋白酶的另選裂解位點，還是 由這些酶制品中輕微的蛋白酶污染物導致。先前未有報道IgG中的MMP-12和HNE裂解位 點。對于其他蛋白酶，所鑒定的IgG的主要裂解位置與先前報道的結果一致(Chuba，1994 ； Diemel 等人，2005 ；Gearing 等人，2002 ；Vincents 等人，2004 ；Yamaguchi 等人，1995)。酶的裂解位置稍有不同，對于MMP-3、V8和IdeS分別在脯氨酸_245、谷氨酸-246 以及甘氨酸-249之后進行蛋白酶解。這些裂解位置的不同不影響分子量，如使用微毛細管 電泳生物分級系統(Agilent Technologies)檢測的分子量。與MMP-3、V8以及IdeS—起 溫育更常時間可以完全轉變成F(ab’)2片段。HNE對IgGl的消化不同于其他蛋白酶，這是 因為它在核心鉸鏈二硫鍵(半胱氨酸238和241)之前組氨酸236處裂解而產生Fab產物 和二硫鍵連接的Fc (見圖2D)。裂解位點是基于EU編號，并與圖3和SEQ ID NO :1中顯示的殘基有關，包括人 IgGl類抗體的Ser219至Phe243幾種蛋白酶在鉸鏈結構域以下裂解IgGl，產生長度稍有不同 的F (ab’)2片段(跨越Ala231至Gly237)。這個研究所表征的IgG降解蛋白酶中有許多據報道 表達于或富含于炎癥部位(HNE、組織蛋白酶G、MMP-12)、在腫瘤或創傷愈合環境中(MMP-2、 MMP-3、MMP-7、MMP-9、纖溶酶)以及在感染部位(谷氨酰基內肽酶、IdeS) (Dollery等人， 2003 ；Kilian 等人，1996 ；Rooijakkers 等人，2005 ； Shonbeck 等人，1999 ； Shapiro,1999 ； Sukhova 等人，1998 ；van Kempen 等人，2006 ；Vincent s 等人，2004)。對于許多情況，特異 性蛋白酶的細胞外表達主要針對宿主IgG是不可能的，相反，它們的活動與疾病生理學有關(例如，腫瘤環境中的基質金屬蛋白酶)。盡管如此，這些體外的純化酶/單克隆抗體降 解研究表明人IgG對于許多與人疾病有潛在關聯性的蛋白酶沒有抵抗力。對于將IgGl轉化為F(ab’)2的酶(大多數)，裂解具有高度特異性和自限性(與 將Fc變為小肽的胃蛋白酶消化不同)。除了 IdeS之外，使用大部分這些細胞外蛋白水解 裂解IgGl的速率通常比使用胃蛋白酶在其優先條件(例如，pH 4. 0)下裂解IgGl的速率 要低。蛋白酶解形成F(ab’)2片段是以兩步驟過程經過單鏈裂解的中間體而進行。先前 認為IgGl的單一裂解中間體是使用MMP-3 (Gearing等人，2002)和使用IdeS (Vencents等 人，2004)進行的消化過程中的可能中間體。在目前的研究中，一致地觀察到首次裂解成單 鏈裂解中間體進行得比產生F(ab' )2的較緩慢的第二裂解相對要快。這里報道的研究集 中于IgGl，這是因為它是人血液循環中IgG的主要同種型。進行了有限數量的其他人同種 型實驗，以測定對MMP-3和IdeS的相對敏感性。在這些實驗中，觀察到IgG4在敏感性上 與IgGl相當，而IgG2和IgG3在這些條件下更具有抵抗力(數據未顯示)。沒有對于IgA、 IgM、IgE、IgD降解進行比較性研究。所有信息總結于表1，其中，“血凝蛋白酶”包括F.XIIa、FIXa、F.Xa、凝血酶以及 激活的蛋白C ；纖溶酶是與纖溶酶原激活物共溫育的纖溶酶原；tPA，鏈激酶和葡激酶；“單 獨纖溶酶原激活物”是沒有纖溶酶原；MMP是作為活性形式或酶原獲得的重組蛋白酶，如在 “材料”中所詳細描述的；以及，“無”是指在24小時內無可檢測到的裂解。除非指明，否則 所有的酶均為人類酶。殘基名稱用于EU編號系統用于IgGl抗體重鏈，其中，SEQ ID N0:1 的25個殘基對應于完整天然重鏈的殘基219至243。表 1.
+Fc(1) Barrett A. J.，Rawlings N. D.以及 ffoessner J. F (編輯)，Handbook ofProteolytic Enzymes Vol. 1, Elsevier, Amsterdam,2004.(2) Barrett A. J.，Rawlings N. D.以及 ffoessner J. F (編輯)，Handbook ofProteolytic Enzymes Vol. 2, Elsevier, Amsterdam,2004.(3) Powers, JC. "Proteolytic Enzymes and Disease Treatment，，1982. In :Feeney and ffhitaker(編 輯).Modification of Proteins :Food, Nutritional, and Pharmacological Aspects. Advances in Chemistry Seriesl98. ACS, Washington, D. C. 1982 pp 347-367.(4)Tchetverikov I. ， Ronday H. K. ， van El B. ， Kiers G. H. ， Verzijl N.， TeKoppele J. M. , Huizinga T. ff. J. , DeGroot J. VX R Hannemaaijer R. , 2004. MMP Profile in paired serum and synovial fluid samples ofpatients with rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 63,881-883.(5) Vincents B. , von Pawel-Rammingen U. ,Bjorck L.以及Abrahamson M. ,2004. 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Tween 20和10%封閉級 乳("Blotto")的0. lMTris緩沖鹽水封閉，使用AVIDIN-D辣根過氧化物酶試劑然后是 TMB(膜)底物對斑點進行顯影。如圖4中的凝膠圖像所顯現的，8小時時完整的IgG喪失，出現大小與F(ab’)2和 Fab標準品相似的條帶。該實驗的結果表明，經幾小時的時間段IgG被炎性液體中的酶酶 解，并產生與體外使用純化的酶酶解而產生的片段一致的片段。實例3 試劑的制備測定由內源性蛋白酶產生的宿主(患者)抗體片段的存在，需要能選擇性結合裂 解的IgG但不結合完整的IgG的試劑。裂解的組分的鑒定和來自患病的患者的樣品的片段 含量與正常群體相比的定量差異應該能夠使用該試劑來進行評價。檢測含有較高濃度的完整IgG的溶液中未知的但可能小量的IgG片段是困難的。 盡管已經認為scIgG是可能的IgG裂解片段(Gearing 2002，同上文)，但先前未進行在人 樣品中的定量。出于該目的，在家兔中產生具有必需的特異性的試劑，其對裂解的IgG但非 完整的IgG具有高度特異性。將人IgGl鉸鏈的三種綴合的和漸進地更長的單鏈肽類似物用于免疫 (Invitrogen Corporation)。使與MMP-3裂解位點的氨基末端一側氨基酸序列對應的 8-mer肽通過N末端(TCPPCPAP，SEQ ID NO 1的殘基7_14)與匙孔賊血藍蛋白(KLH)連 接。將對應于谷氨酰基內肽酶位點(TCPPCPAPE，SEQ ID N0:1的殘基7_15)和IdeS位點 (TCPPCPAPELLG，SEQ ID N0:1的殘基7_18)的延伸的肽分別制備成免疫原。通過皮下注射 0. 2mg于完全福氏佐劑中的綴合肽免疫新西蘭家兔(每種免疫原兩只)，并于第14、42以及 56天使用0. lmg于不完全福氏佐劑中的抗原再加強免疫三次。在4、8以及10周時收集血 清，將每種免疫原匯集用于抗體純化。通過基于固相抗原肽的ELISA監測免疫滴度。抗體的親和純化應用固定于激活的載體上的各肽抗原。匯集使用相同抗原免疫的 兩只家兔的抗血清，并使其穿過抗原柱，之后充分洗滌柱子。分別使用3M KSCN和0. 1M甘 氨酸(pH 2.5)將特異性抗體洗脫為低親和力和高親和力匯集物。兩份匯集物產生不可區 分的結合特征，因此可互換使用和/或匯集。使三份分別洗脫的結合抗體匯集物接著進行 第二個親和吸附步驟，這次是在含有包含人IgGl重鏈恒定區的完整抗體(Mab3)的柱子上 進行。第二個親和層析步驟的意圖是去除不想要的可識別完整IgG的抗體。然而，很少家 兔抗體或無家兔抗體吸附至IgG柱，表明抗體群體僅以其暴露的羧基末端與“裂解的”序列 具有反應性。通過ELISA檢測各親和純化的家兔抗肽抗體與酶解產生的人IgG的片段和完整 的IgG結合的能力(圖5)。來自使用與SEQ ID NO 1的殘基7_14綴合的KLH(MMP_3位點 類似物)免疫的家兔的純化抗體并不結合完整的IgG，而對使用MMP-3消化IgG而產生的 scIgG和F(ab’)2具有高特異性。該抗體制品顯示對使用V8蛋白酶或IdeS產生的scIgG 和F(ab，)2具有最小的反應性。相比之下，從使用V8裂解位點鉸鏈肽類似物(SEQ ID NO 1的殘基7-15)和IdeS裂解位點鉸鏈肽類似物(SEQ ID NO 1的殘基7_18)免疫的家兔獲 得的抗體顯示對由這兩種酶的任一者產生的scIgG和F(ab’)2具有交叉反應性結合情況。然而，這些制品對MMP-3消化的產物顯示最小的反應性。所述抗體制品中無一結合完整的 IgG，且所述抗體制品中無一與由三種不同的酶產生的片段(包括F(ab’)2和scIgG)具有 同等反應性，如圖6中所示。抗鉸鏈試劑的預期用途是檢測scIgG和F(ab’)2 (以及其他潛在的片段)，它們在 體內復雜環境中由存在于疾病特異性組織中的酶產生，或由疾病特異性細胞類型或細胞群 體(例如浸潤的巨噬細胞或嗜中性粒細胞)產生。對于潛在的IgG片段的最佳涵蓋范圍， 認為優選的是具有盡可能廣泛的裂解位點識別譜。出于這個原因，將三種家兔抗體匯集物 各自以0. 33mg/mL各組分(總計=lmg/mL)制備混合物，用于后續的蛋白印跡和基于血清 的ELISA檢測。這個匯集的試劑被稱為RAH-1。實例4 單鏈裂解的免疫球蛋白測定下文詳細描述了用于檢測血清中scIgG的新型測定方法，其使用能夠結合裂解的 人IgG而非完整的人IgG的RAH-1作為捕獲試劑。使用化學發光ELISA，用 10mg/ml (于 PBS 中)RAH-1 包被 NuncChemiluminescence 96孔培養板的一些區域。培養板其余部分保持不包被(僅1XPBS)。在4°C下過夜溫育培 養板。洗滌培養板，將 200ml/孔的 Chemicon International 的 ChemiBL0CKER(C#2160)添 加至培養板，在37°C溫育30分鐘從孔吸去封閉緩沖液，并將標準品和樣品添加至培養板。 以雙份添加標準品Mab3、使用V8消化的scIgG，以于含有酪蛋白和3% BSA的PBS中 50mg/ml開始，使用系列四倍稀釋。以于相同緩沖液中1 50稀釋度添加疾病血清樣品。 洗滌培養板，將1 6000稀釋度的Jacksonlmmuno Research的HRP綴合的AffiniPure F(ab' )2片段驢抗人IgG(H+L)(對包括家兔在內的各種動物具有最低交叉反應性)添加至 所有孔中。將其于含有酪蛋白和3%BSA的PBS稀釋液中添加，在37°C溫育1小時。徹 底洗滌培養板，添加 100ml/孔的 HRP 底物(Roche 的 BMChemiluminescence POD, 582 950)， 并在幾秒鐘之后于發光讀板機上讀取培養板。從暴露于RAH-1包被層的所有孔扣除標準曲線上Ong/ml scIgG孔的平均發光。該 扣除控制了使用RAH-1的次級反應的任何非特異性反應。然后，從RAH包被的孔的先前調 節的數值扣除非RAH包被的孔上各供體的數值。這解決了血清中對于培養板的任何非特異 性反應。5 :i式齊I丨檢測丨與疾目關的g白 解活+ 牛的用涂檢測RAH-1試劑在另一種炎性液體患有類風濕性關節炎(RA)的患者的滑液中檢 測IgG片段的能力。RA患者的滑液采集樣品商購自Bioreclamation。樣品于LDS樣品緩沖液中稀釋 1 5，將10微升各樣品上樣于4-12% Bis-Tris凝膠。作為RAH-1反應性的對照，將完 整IgG(Mab3)或蛋白酶消化的IgG(使用MMP-3、谷氨酰基內肽酶以及IdeS對Mab3進行部 分消化)也上樣于凝膠。在SDSPAGE之后，將凝膠轉移至硝酸纖維素膜，并使用Blotto封 閉。然后使用于Blotto中的RAH-1的1 2，500稀釋液溫育該膜，使用pH 7.5含有0.1% Tween 20的0. 1M tris緩沖鹽水洗滌，并與山羊抗家兔IgG(H&L)辣根過氧化物酶綴合物 的1 5，000稀釋液溫育。然后使用TMB膜對斑點進行顯影。如圖7中所示，RAH-1制品 與完整的IgG不反應，但自所有三種蛋白酶消化物檢測到ScIgG、F(ab’)2、可能還有Fab’。 對于來自RA患者的所有五個滑液樣品，在scIgG、F(ab’ )2以及Fab’的大約大小下檢測到條帶，表明這些蛋白酶解片段存在于患有RA的個體的滑液中。實例6 使用試劑監測疾病對于生物標記檢測，血漿或血清比生物液體或組織提取物例如滑液更方便。然而， 滑液的優點是，它是自含的局部環境，在其中，蛋白酶具有活性，且預期IgG片段可積累，如 實例2中所描述。盡管如此，血清用于檢測的方便和普及使得它更有可能作為生物標記的 樣品組織，包括IgG裂解產物在內。在開始檢測不同類型和來源的血清中的IgG片段之前，理想的是確定哪些(如果 有的話)蛋白水解產生的IgG片斷會循環足夠的時間以使其能聚集和定量。為了回答該問 題，設計了比較性藥代動力學研究。以下在小鼠中進行的藥代動力學實驗是模擬幾個相似 的之前報道的研究，所述研究中IgG通常顯示10-20天的終末半衰期。用MMP-3產生的分級的蛋白酶解產物Mab2 IgGl和scIgG和F(ab’)2如下制備。 如實例1中所述使用熱激活的MMP-3消化20毫克量的Mab2IgG。在37°C通過將酶添加至于 含有10mM CaCl2的tris緩沖鹽水中的4mg/mL Mab2溶液(pH 7. 5)來啟動消化。在48小 時時，通過將EDTA添加至20mM終濃度來終止反應。基于Agilent生物分級(bio-sizing) 分析(8862-67)，沒有殘余的完整IgG，scIgG、F(ab)2以及Fc的百分數分別是24%、41 % 以及36%。使終止反應的消化物經受兩步驟純化，以去除Fc片段，并分離純化的scIgG和 F(ab)F(ab)2。在第一個步驟中，使用蛋白A_S印harose使消化物經受層析。從柱子出來的 未被結合的物質含有F(ab)2片段，不含有可檢測到的完整的IgG或scIgG。使用pH 3. 5的 0. 1M檸檬酸鈉處理柱子，導致含有Fc的組分即Fc片段和scIgG的混合物洗脫。通過添加 pH 7.0的1/10體積的2M Tris將所得級分立即中和至pH 7。將中和的物質濃縮至約lmL， 并透析至pH 7. 5的磷酸鹽緩沖鹽水中。于SuperdeX200(柱體積=100mL)上通過尺寸排阻 層析將Fc片段與scIgG分離。自柱子洗脫兩個峰，所述峰被接著使用先前描述的Agilent 生物分級技術鑒定為與scIgG的凝膠帶位置一致的135kDa，和鑒定為約35kDa的Fc單體片 段的較低分子量峰。使純化的scIgG和F(ab)2組分與ActicleanEtox接觸(每5mL各蛋 白溶液0. 5mL凝膠)，以將內毒素減少到可允許在小鼠中靜脈注射的AALAC規范(< 40EU/ kg)。對于這個研究，如下文所述檢測同等毫克量(1. 9mg/kg)的完整小鼠-人嵌合單克 隆抗體Mab2 IgGl以及MMP-3產生的scIgG和F(ab’)2。一組21只雌性Balb/c小鼠(Ace Animals)用于藥代動力學研究。在實驗之前， 通過心臟穿刺從3只隨機選擇的小鼠取終末血，作為基線對照。對剩下的18只雌性Balb/ c小鼠進行稱重，并將它們分成六個相等的組。兩組使用完整Mab2 IgGl注射，兩組使用 MMP-3產生的Mab2 scIgGl注射，兩組使用MMP-3產生的Mab2 F(ab，)2注射。所有注射均 為以0. 19mg/ml基于個體動物重量10ml/kg的恒定劑量體積進行腹膜內注射。因此，每只 動物在0天接受1.9mg/kg劑量。在lh、24h、7d、21d、35d從兩組中的第一組采集約80ul血 液，并在5h、48h、14d以及28d從第二組采集約80ul血液。將血清樣品儲存于20°C直至檢 測。所采集的血清的IgG和IgG片段濃度通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)進行定 量。將Jackson Immuno research的F(ab，)2片段特異性的山羊抗人IgG于PBS中的0. 5ug/ ml稀釋液(與牛、馬以及小鼠血清蛋白具有最小的交叉反應性)用于包被Costar 3369培
20養板。使用PBS/酪蛋白/BSA封閉培養板。在封閉之后，將標準品和樣品添加在PBS/1% 酪蛋白BSA中。標準品包括以下系列稀釋液以lOOOng/ml開始的鼠/人IgGl、鼠/ 人 scIgGl MMP-3 或鼠 / 人 F(ab，)2 MMP-3。在 PBS/1 %酪蛋白BSA 中從 1 10 至 1 163，840系列稀釋各時間點樣品。使用50ul/孔Jackson Immuno-research的山羊抗 人IgG(H+L)(與牛、馬以及小鼠血清蛋白具有最小交叉反應性，109-035-083)并在室溫下 溫育1小時檢測到與包被抗人捕獲抗體的培養板結合的人IgG。徹底洗滌培養板，并將其暴 露于50ul/孔0-苯二胺底物大約10分鐘，使用50ul/孔3M HCL終止，在490_650nm讀取 數值。結果在圖8顯示。小鼠藥代動力學實驗結果表明，scIgG具有延長的循環壽命，而F(ab’)2沒有。小 鼠中F(ab，)2非常快速清除與該片段在人體中快速消失相一致(Roskos LK等人，Drug Dev. Res. 61 108-120，2004)。這些結果表明scIgG是用于生物標記目的的最豐富、壽命最長以 及最有用的IgG組分。實例7 疾病中的蛋白水解酶為了使scIgG成為有用的疾病生物標記，它必須在從所確定的疾病范疇的患者獲 得的樣品中表現出與健康人相比有差異的數量。患病個體血清的商業來源是Genomics Collaborative (現在的SeraCare Life Sciences Inc.)。購買了來自8種疾病的每一種的10個不同個體的小量血清(300微升)。 所述疾病范疇為類風濕性關節炎、骨關節炎、哮喘、1型糖尿病、乳腺癌、肺癌、心肌梗塞、以 及充血性心力衰竭。另外，從該商業來源獲得來自28名年齡和性別相匹配的正常健康志愿 者的血清作為對照。使用如實例4中所描述的測定方法，分析樣品，結果示于圖9中。基于RAH-1試劑 的選擇性的測定證明，與由已知的特異性蛋白酶產生的那些IgG裂解產物相當的IgG裂解 產物是明顯可檢測的，并且對于炎性自身免疫性疾病類風濕性關節炎來說大于在健康或正 常供體中維持的水平。相比之下，骨關節炎患者顯示了與正常個體樣品相似和在其范圍內 的水平。實例8 修飾的單鏈裂解的IGG測定方法使用RAH-1試劑的固相測定方法ELISA用于檢測血清中的scIgG在實施例4中進 行了描述。為了優化scIgG濃度的檢測范圍，對血清樣品進行了特定改變。所使用的培養板是Immulon 4HBX培養板(VWR)，所述培養板是通過使用于pH 7. 2PBS中5mg/mL濃度的家兔多克隆抗體(RAH-1)在室溫下封閉和溫育1小時進行包被 的(100mL/孔)。之后，于自動洗板機上使用PBS，0.05% Tween(Sigma)洗滌培養板三 次。所有樣品和標準品使用含有BSA、0. 05% Tween的PBS稀釋。抗IgG Fc生物素 (USBIologicals，Swampscott，MA)是檢測scIgG標準品或血清稀釋液中scIgG未知物的工 具。使用200 ii L的SuperBlock (Pierce)在室溫(RT)下搖動15分鐘封閉培養板，然 后于自動洗板機上使用PBS，0. 05% Tween洗滌培養板三次。將標準材料Mabl蛋白酶消化產物以600ng/mL(100ii L/孔，3倍稀釋度)開始添 加至雙份孔。將血清樣品適當地稀釋成1 100、1 200,1 400等。以雙份同時添加樣 品，并于振蕩器上在室溫下溫育1小時，之后于自動洗板機上使用PBS，0. 05% Tween洗滌三次。將1 20，000的IgG Fc生物素稀釋液(于測定緩沖液中適當地稀釋)添加至 所有孔(100 y L/孔)，并于振蕩器上在室溫下溫育1小時，之后于自動洗板機上使用PBS， 0. 05% Tween洗滌三次。將SA-HRP (與辣根過氧化物酶綴合的鏈霉親和素，Sigma,以于PBS (0. 05% Tween, 1%BSA)中1 30，000的稀釋度使用)(100 yL/孔)，并于振蕩器上在室溫下溫育1小時， 之后于自動洗板機上使用PBS，0. 05% Tween洗滌三次。最后，將100mL的由生產商(Sigma)提供的TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺，一 種過氧化物酶底物)添加至各孔，并讓其溫育約10分鐘，用于顯色。使用75 y L的IN H2S04 終止反應，并在450nm下對培養板進行讀數。使用上述ELISA型式(format)測定表明scIgG在正常健康血清中具有很大改善 的線性和加料回收率(spike recovery)。在兩個血清匯集物中測定出該測定法的稀釋線 性，所述匯集物稀釋1 100，然后使用Mabl以150ng/mL和300ng/mL的濃度加料(spike), 再進一步稀釋成0 %、25 %、75 %以及100 %的血清濃度。以一式三份測定各樣品稀釋液，并 計算平均的分析物回收率。通過從各樣品匯集物的所觀察的(y軸)和預期的(x軸)分析 物回收率結果的曲線圖計算R2相關系數來評價線性。R2值為樣品1低0. 9983 ；樣品1高 0. 9913 ；樣品2低0. 9852 ；樣品2高0. 973 ；所有稀釋液的稀釋線性都是100%。實例9 血清中單鏈裂解IGG的檢測專門使用類風濕性關節炎患者的血清，以進一步研究實例4中的結果，其中來自 該組患者的某些血清樣品與對照相比具有顯著較高的scIgG。從Genomics Collaborative獲得來自10個患有類風濕性關節炎(RA)的受試者 和10個年齡和性別匹配的健康個體的血清樣品。使用實例8中所述的修改的測定法，分析 樣品，結果示于圖10。結果表明，10個患有類風濕性關節炎的受試者中有4個顯示出血清 scIgG濃度> 60 u g/mL。在健康對照組中，scIgG的濃度范圍是從< 8. 2 y g/mL至52. 7 u g/ mL。用于這個比較的樣品沒有對于病期、治療方案等進行嚴格選擇。因此，預期在對來自良 好控制和前瞻性設計的臨床試驗的患者的縱向分析中可進一步區分健康的和疾病相關的 血清scIgG。然而，目前對這些商業樣品的測定提示在患有疾病的患者中可檢測到升高的 scIgG濃度。實例10 抗鉸鏈IGG單克隆抗體的制備產生出用于生產和潛在用于人類患者的確定的(defined)分子將是合乎需要的， 所述分子結合裂解的IgG而不結合完整的IgG，諸如單克隆抗體。下列程序代表著用于產生 這樣的分子的方法。人IgGl下游鉸鏈及鄰接CH2結構域的12-mer肽類似物是免疫原 TCPPCPAPELLG(SEQ ID NO 1的殘基7_18)。天然存在的半胱氨酸被丙氨酸替代，得到變異 體TAPPAPAPELLG。添加N末端半胱氨酸，以使得可以通過用于進行與游離巰基的反應的標 準化學方法來與匙孔賊.血藍蛋白(KLH)綴合。最終免疫原是KLH-CTAPPAPAPELLG。使用多個皮下部位(5個)，用在完全福氏佐劑中的0.5mg KLH肽來免疫新西蘭白 色家兔(3只)。以3周間隔使用在不完全福氏佐劑中的0.25mg免疫原對動物加強免疫，共 進行4次附加免疫。
22
在免疫過程中通過標準ELISA方法監測BSA綴合形式的相同肽的血清抗體滴度。 基于滴度數據選擇動物(2只)用于脾切除術。從與家兔融合伴侶細胞融合的脾衍生淋巴 細胞生成家兔雜交瘤(Spieker-Polet，1995PNASUSA 92:9348-9352)。在多個培養板中融 合之后2-3周檢查細胞生長情況。在包被有BSA免疫原肽綴合物的培養板上通過ELISA篩選陽性雜交瘤。鑒定來 自各融合的多個陽性克隆。進一步的篩選涉及到與完整IgGl和IgGl的各種酶解產生的 F(ab’)2片斷的結合。從這些篩選和反篩選策略，選擇了 3個克隆，該選擇基于結合免疫原 肽和結合末端位于或接近免疫原肽末端的F(ab’)2片段以及對于完整IgGl具有最小結合 的強選擇性。對陽性雜交瘤進行亞克隆和擴增。通過標準的方法(包括在固定化蛋白A上的層析)從各細胞上清液純化家兔IgG。 在標準ELISA方案中，檢測純化的家兔IgG結合人IgGl鉸鏈以及完整的IgG和純化的IgG F(ab’)2片段的的肽類似物的特異性，所述IgG F(ab’)2片段使用IdeS和MMP-3酶使用單 鏈或雙鏈裂解的Mab產生。簡而言之，將通過標準肽化學合成和進行了 N末端生物素酰化 的肽捕獲在鏈霉親和素包被的孔上。以10 y g/mL直接包被IgG和片段。通過得到很好表 征的山羊抗家兔IgG Fc辣根過氧化物酶和0PD底物系統檢測家兔mAb的結合。家兔mAb 91-2的ELISA結果示于圖11。對在SEQ ID NO :1的殘基 16-22 (L-L-G-G-P-S-V-F)終止的下游鉸鏈肽具有明顯的結合選擇性。對與上游鉸鏈、核心 鉸鏈或早期下游鉸鏈的被SEQ ID NO 1的3-16(D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E-L_)所涵蓋 的那些區段對應的上游殘基很少結合或不結合。對MMP-3產生的F(ab’)2片段和scIgG 片段具有可忽略的結合(這和與在SEQ ID NO 1的殘基14和15之間的MMP-3裂解位點 (P-A-P*E-L-L)的肽類似物無結合相一致)。相比之下，與Ides產生的F(ab’)2片段和 scIgG具有顯著結合。因此，家兔mAb的結合特異性與引生它的免疫原非常一致。直接包被 的rb (家兔)IgG是陽性對照。補體測定.將表達⑶20(ATCC)的類淋巴母細胞B細胞系WIL2-S細胞用作⑶C測定的靶細胞。 將于RPMI[5%熱滅活的FBS，0. ImM非必需氨基酸，ImM丙酮酸鈉，青霉素(500U/ml)，鏈霉素 (500U/ml),2mM L-谷氨酰胺]中的50 yl細胞添加至96孔培養板的各孔，最終濃度為于 每孔8X104個細胞。將另外50 yl與或不與多個濃度的抗體一起添加至各孔，在室溫下溫 育培養板2小時。將50iU 10%家兔補體(Invitrogen)添加至各孔，在37°C下溫育培養 板20分鐘。所有樣品以一式三份操作。在200g下對培養板離心3分鐘，將50 yl上清液 移取到分開的培養板，使用LDH細胞毒性檢測試劑盒(Roche)檢測⑶C。使用Spectra max Plus 384 (PerkinElmer)檢測吸光度。將數據歸一化到使用 Triton X-100 (Sigma Aldrich) 的最大細胞毒性和僅含細胞和單獨補體的最小對照。圖12顯示了，當在固定濃度的結合⑶20的抗體的F(ab' ) 2片段的存在下滴定3 個家兔抗鉸鏈mAb時，其能夠恢復對靶細胞的補體依賴性細胞裂解。家兔mAb比多克隆抗鉸 鏈mAb制品(用于先前描述的血清scIgG的相同檢測系統的組分)更有效且濃度較低。如 所預期的，CD20的完整抗體具有活性，但單獨其F(ab’)2片段和scIgG形式無活性。在無 結合細胞的F(ab’)2片段的情況下，家兔抗鉸鏈mAb不能夠指導細胞裂解。這些結果確立 的是，單克隆抗鉸鏈抗體能夠重建IgGl的無活性的蛋白酶解產物的補體介導效應子功能。
權利要求
一種抗體組合物，其包含至少一種特異性結合IgG蛋白酶裂解產物的抗體，所述裂解產物的特征在于a)在非變性條件下具有與完整哺乳動物IgG相當的分子量，和b)在變性但非還原條件下可分離成兩個片段，包括135kDa的抗原結合片段和含有CH2的片段，以及c)其中，所述試劑不與完整IgG反應。
2.根據權利要求1所述的抗體組合物，其包含多克隆抗血清。
3.根據權利要求1所述的抗體組合物，其包含至少一種單克隆抗體。
4.根據權利要求1所述的抗體組合物，其特異性結合人IgGl中由選自以下的蛋白酶產 生的蛋白酶特異性裂解位點MMP-3、MMP-7、MMP-12、HNE、纖溶酶、組織蛋白酶G、胃蛋白酶、 IdeS或來自金黃色葡萄球菌的谷氨酰基內肽酶I。
5.根據權利要求1所述的抗體組合物，其包含通過用多肽來免疫動物或篩選抗體文庫 而產生的抗體，所述多肽包括通過如下步驟制備的裂解產物類似物肽a)鑒定抗體重鏈的被蛋白酶所裂解的一對殘基的N末端殘基；b)鑒定包含至少5個位于蛋白酶裂解位點上游的連續氨基酸殘基的肽序列，其中所述 蛋白酶裂解位點的N末端殘基將變成所確定的序列的C末端；以及c)制備用于所述免疫或篩選的足夠量的肽溶液。
6.根據權利要求1所述的抗體組合物，其含有至少一種特異性結合這樣的多肽的抗 體，所述多肽包含選自SEQ ID NO :1、2、3或4的人IgG鉸鏈區序列的至少5個連續的氨基 酸，所述序列位于蛋白酶裂解位點的氨基末端一側的上游。
7.根據權利要求6所述的抗體組合物，其中所述多肽包含至少IgGl的鉸鏈核心，所述 鉸鏈核心被定義為殘基-T-C-P-P-C-(SEQ ID NO 1的殘基7-11)。
8.根據權利要求6所述的抗體組合物，其中所述肽是人IgGl下游鉸鏈和鄰接的CH2結 構域的12-mer肽類似物，其具有序列TCPPCPAPELLG (SEQ ID NO 1的殘基7-18)。
9.根據權利要求1所述的抗體組合物，其特異性結合裂解產物肽類似物，所述類似物 包括具有選自SEQ ID NO :5-11的氨基酸序列的肽及其N末端截短形式，包括至少5個氨基 酸和含有位于IgG蛋白酶裂解位點的N末端一側的上游的氨基酸序列。
10.根據權利要求1所述的抗體組合物，其特異性結合具有選自SEQIDNO :5_11的氨 基酸序列的多肽。
11.根據權利要求1所述的抗體組合物，其特異性結合具有選自如下的氨基酸序列的 多肽(a)包含位于IgGlMMP-3裂解位點的氨基末端一側氨基酸序列的肽(TCPPCPAP，SEQ ID NO :1的殘基7-14) ； (b)或包含谷氨酰基內肽酶IgGl裂解位點的肽(TCPPCPAPE，SEQ ID NO 1 的殘基 7-15)；或(c)包含 IdeS IgGl 裂解位點的肽(TCPPCPAPELLG, SEQ ID NO 1 的 殘基7-18)。
12.—種人IgG蛋白酶裂解位點肽類似物，其由選自SEQ ID NO :5_11的氨基酸序列組成。
13.根據權利要求12所述的肽，其通過N末端與匙孔賊.藍蛋白(KLH)共價連接。
14.一種用根據權利要求12所述的肽類似物免疫的動物。
15.根據權利要求14所述的動物，其中所述動物是家兔。
16.一種使用根據權利要求15所述的被免疫動物制備根據權利要求1所述的抗體組合物的方法，其中，通過在人IgG親和基質上預吸附而從所述動物血清純化所述試劑。
17.—種通過分析受試者的組織樣品來檢測所述受試者的疾病過程的方法，其中所述 方法包括檢測蛋白水解裂解的IgG，所述裂解的IgG的特征在于，a)在生理條件下具有與 完整哺乳動物IgG相當的分子量，和b)在變性但非還原條件下可分離成兩個片段，包括 135kDa的抗原結合片段和25kDa的片段。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述疾病選自關節炎疾病、惡性病、感染性疾病 和血管疾病。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述疾病是類風濕性關節炎。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述疾病是類風濕性關節炎，所述樣品是滑液。
21.根據權利要求17所述的方法，其中所述樣品是血液或其分級制品。
22.根據權利要求17所述的方法，其中所述檢測離體進行。
23.根據權利要求17所述的方法，其中所述檢測程序選自ELISA、免疫組織化學染色以 及蛋白質印跡。
24.根據權利要求17所述的方法，其中所述檢測是對除血液分級制品以外的組織樣品 進行。
25.—種試劑盒，其包含用于檢測受試者的組織中的疾病標記的試劑，所述試劑包含至 少一種特異性結合裂解的IgG的抗體，所述抗體能夠檢測有如下特征的IgG裂解產物a) 在非變性條件下具有與完整哺乳動物IgG相當的分子量，和b)在變性但非還原條件下可分 離成兩個片段，包括135kDa的抗原結合片段和含有CH2的片段，以及c)其中所述試劑與完 整I gG不反應。
26.一種使用根據權利要求1所述的抗體組合物治療具有病理狀態的受試者的方法， 所述病理狀態的特征是釋放能夠產生IgG裂解產物的蛋白酶。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述抗體識別人IgGl中由選自以下的蛋白酶產 生的蛋白酶特異性裂解位點MMP-3、MMP-7、MMP-12、HNE、纖溶酶、組織蛋白酶G、胃蛋白酶、 IdeS或來自金黃色葡萄球菌的谷氨酰基內肽酶I。
28.根據權利要求1所述的抗體組合物用于恢復用以治療病理狀況的抗體的效應子功 能的用途，其中所述用以治療病理狀態的抗體經受一種或多種蛋白酶的裂解。
全文摘要
本發明涉及抗體組合物和所述組合物用于檢測與蛋白酶活動相關的疾病過程的用途。所述試劑用于評價這種蛋白水解裂解所產生的IgG裂解產物。本發明還涉及對保留抗原結合功能但已喪失效應子功能的IgG裂解產物有免疫特異性的治療劑。
文檔編號C07K14/435GK101889021SQ200880102840
公開日2010年11月17日 申請日期2008年8月4日 優先權日2007年8月10日
發明者D·D·佩特羅恩, M·瑞安, R·喬丹 申請人:森托科爾公司