質子受體亞銨/碳陽離子型偶聯劑的制作方法

專利名稱：質子受體亞銨/碳陽離子型偶聯劑的制作方法
技術領域：
本發明的領域和背景 本發明在其一些實施方案中涉及偶聯劑和，更尤其，但不唯一地，涉及可有益地用于合成物質如肽和低聚核苷酸的新型偶聯劑的制備和用途。
治療肽，或藥物肽在活性藥物成分(API)市場，尤其作為，例如，抗生素，荷爾蒙，免疫調節劑，抗血管生成劑，用于治療CNS和其他神經病學病癥的治療劑，止痛藥，抗肥胖藥物，和作為用于治療免疫病癥如變態反應，哮喘，血友病，貧血和自身免疫疾病的治療劑而不斷增長[關于概述，參見，Loffet，A.，″作為藥物的肽存在市場嗎？，2002，J.PeptideSci.8，1]。根據Frost&Sullivan報道，目前世界上有超過40種上市的肽藥物，約270肽種處于臨床階段測試，和約400種處于超前的臨床前階段。肽占所有總API的1％，市場份額估計在US$300-500M/年和年增長速度為15-25％。人們期望，如果最近被認可的新型化學物質進入市場，那么該市場在今后幾年會加倍。
盡管肽具有巨大的治療潛力，但其廣泛使用已受到幾個限制性技術因素的限制。目前，制造公司面臨產生數百千克至數噸量的配合物肽的空前挑戰。這種大量生產通常使用昂貴的和復雜的現代技術，使得肽制造與其他″小分子″藥物相比困難和成本低效。生物活性形式的肽的大規模制造和純化可因此是肽-基藥物商業化的一個限制性步驟。
肽生產工藝的一個主要步驟是在兩種氨基酸之間受控形成肽鍵(在羧酸基團和胺基團之間形成的酰胺鍵)(所謂″偶聯″反應)。在肽合成中，肽鍵的形成通常需要合適地處置保護基團，和活化羧酸，或一般來說羧基團，這通常涉及肽偶聯劑的使用[關于肽偶聯劑的全面概述，參見，F.Albericio，S.A.Kates，固相合成實際向導，S.A.Kates，F.Albericio Eds；Marcel Dekker，New York，NY，2000，PP.273-328和F.Albericio，R.Chinchilla，DJ.Dodsworth，C.Najera，2001，Org.Prep.Proc.Int.，33，202]。
磷酸鹽基團也可按照在肽合成中將羧基團活化用于偶聯至氨基團上的類似方式活化。磷酸鹽基團的活化是合成用于構建DNA和RNA的各種核酸和低聚核苷酸，以及模擬其化學結構的分子的基本步驟和因此后者的活性可受到各種各樣活化或偶聯試劑的影響。可用于活化磷酸鹽基團的這些活化試劑和反應條件描述于肽合成領域(參見例如，L.Carpino(1997)酶學方法，289104和WO 2006/063717)，本文對此進行討論。
盡管用于基礎研究的中至大肽的合成是完全確實的步驟，20種自然存在的氨基酸和不斷增加的人造氨基酸的組合使得每一肽合成在工業水平上是獨特的，時常需要更精細地注意每一氨基酸偶聯。在研究尺度上有效的用于偶聯劑的某些規則可在工業水平上應用，但結果仍難以預測。
兩種主要的偶聯技術包括(a)需要現場活化羧酸的那些和(b)取決于已被事先制備，分離，純化，和表征的活化氨基酸物質的那些。第一種類型迄今最方便地用于肽鏈的逐步伸展和更常用于會聚性工藝，其中使用被保護的肽替代被保護的氨基酸。
如本文所述，偶聯劑的作用是活化一種氨基酸的羧基團，這有助于其與另一氨基酸的氨基團的偶聯。活化工藝或許是近年來已最廣泛發展的肽合成的一個方面。所有偶聯方法的一個基本特點在于，除了提高肽鍵形成的產率，羧酸組分的構型完整性必須也得到保持，即在任何氨基酸手性中心不應發生外消旋化。
偶聯劑要求的這種雙重性，即高肽鍵形成產率和氨基酸外消旋的不存在通常難于實現，因為最有效肽鍵形成方法通常包括將酸轉化成帶有良好的離去基團的中間體。這些離去基團往往增加活化氨基酸的α-質子的酸度，這增加去質子化和噁唑酮的形成，兩者都導致立體-構型的損失。
外消旋是在制備肽過程中發生的副反應。在生產規模上，少量差向異構體的形成難以檢測，而且更重要的是，它使得這些雜質的去除在任何規模上，尤其在工業規模工藝中非常具有挑戰性。這構成了用于實現肽作為API′s的最嚴重缺陷之一。
目前最廣泛使用的偶聯試劑包括碳二亞胺(一方面)，和鏻和亞銨鹽(另一方面)。值得注意的是，可用于肽合成的偶聯劑也可用于需要活化羧酸部分的其他有機合成。這些合成可用于產生具有生物重要性的有機化合物，例如，類胨，低聚氨基甲酸酯，低聚酰胺，β-內酰胺，酯，聚烯酰胺，苯并地西泮，二酮哌嗪，和乙內酰脲。
碳二亞胺是目前已知的試劑中最可得到的低價格偶聯劑，和包括二環己基碳二亞胺(DCC)，1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)。原有的反應性物質，O-酰基異脲，用于肽偶聯的最反應性物質之一。與使用碳二亞胺作為偶聯劑有關的缺點因此大部分源自其高的和相對無法控制的反應性和包括，例如，外消旋，副反應和低產率(由于形成活性較差的N-酰基脲)。另外，盡管低介電常數溶劑如CHCl3或CH2Cl2是用于碳二亞胺最佳的，但有助于形成N-酰基脲的具有較高介電常數的溶劑如DMF的使用排除了其單獨使用。另外，二環己基碳二亞胺也與Fmoc/t-Bu固相化學不相容，因為形成在這些合成中形成的脲衍生物通常不溶于常用溶劑。這些脲衍生物也難以在溶液化學中去除。
在70年代初，1-羥基苯并三唑(HOBt)作為DCC的添加劑被提出。加入HOBt的目的是減少與DCC偶聯有關的外消旋化。該添加劑的相對成功發出了開始一個時期的信號，在該時期，其他苯并三唑衍生物如1-羥基-6-氯苯并三唑(6-Cl-HOBt)和1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)被開發初并成功使用。在稍后的年代，苯并三唑衍生物作為DCC和其他碳二亞胺的添加劑的加入變得幾乎強制性以保證肽鍵形成時避免碳二亞胺活化的低產率，非所需副反應和手性損失。
在最近十年中，在本文中被簡稱為″鎓鹽″的羥基苯并三唑衍生物的鏻和亞銨/脲鹽作為肽偶聯劑的應用被引入。盡管這些試劑已迅速地用于研究目的，僅僅少數已被發現與目前的工業要求和合成策略相容和被工業所采用。與鎓鹽反應的物質是氨基/有機酸的羧酸鹽。因此，在至少1當量堿的存在下進行偶聯反應是使用這些試劑是所必需的。目前最反應性亞銨鹽偶聯劑是1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶鎓六氟磷酸鹽3-氧化物(HATU)。
對這些和其他偶聯劑的結構的誤解被Carpino，L.A.等人[Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，No.3，p.441]解決，現在認為，這些試劑中的離去基團通過三唑氮而不通過氧在鍵接至亞銨部分上，保持為其N-氧化物形式。HATU及其類似物的化學結構在以下方案1中給出。
方案1
亞銨鹽，如HATU，TBTU，HBTU，HCTU，或TCTU可能是已知的最有效的偶聯劑，由離去基團和碳陽離子骨架而形成。但目前已知的肽偶聯劑通常受其低所需反應性，由此所形成的副產物和/或高成本的限制。
U.S.專利No.6,825,347和WO 94/07910教導了脲和亞銨鹽及其在酰胺形成時，尤其在肽合成過程中影響酰化步驟的用途。這些出版物中教導的偶聯劑具有連接到脲和亞銨部分上的離去基團，其特征在于具有N-烷基或P-烷基取代的氮或磷原子。這些偶聯劑，盡管是創新的，但仍提供與以前已知的偶聯劑類似的偶聯效率。
鏻-基偶聯劑在工業上正在增加，和包括7-氮雜苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸鹽(PyAOP)，和苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)。但這些僅或多或少地比其碳陽離子/亞銨對應物更有效和因此通常是不合理地更昂貴的偶聯劑。最近，6-氯-1-羥基苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸鹽(PyClock)，一種最有效鏻-基偶聯劑，由本受讓人引入(參見，例如，WO 2007/020620)。
本發明的綜述 在找尋新型偶聯劑時，本發明人設計，制備和成功地實踐了一組比常用偶聯劑更有效和更安全，且生產和在現代肽和低聚核苷酸合成技術中使用時簡單和安全的新偶聯劑。
因此，根據本發明一些實施方案的一個方面，提供了一種具有選自以下的通式的偶聯劑
結構式I 結構式II 其中 A是無機陰離子； L是離去基團； n是整數1至4， 每一R1，R2，R3，R4，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分別獨立地連接形成雜脂環族部分，前提是，至少一個R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基和/或至少一個R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6連接形成雜脂環族部分。
根據本發明的一些實施方案，雜原子選自O，S，N，P和B。
根據一些實施方案，雜脂環族部分選自吡咯烷，哌啶，嗎啉，硫代嗎啉，咪唑烷，氮雜膦烷，氮雜磷烷，氮雜烴基硼烷，氮雜硼烷，氮雜膦烷，氮雜磷烷和哌嗪。例如，雜脂環族部分是嗎啉。
根據一些實施方案，無機陰離子選自鹵化物，六鹵代磷酸鹽，六鹵代銻酸鹽，四鹵代硼酸鹽，三鹵代甲烷磺酸鹽和二(三鹵代甲基磺酰基)酰亞胺。例如，無機陰離子是六氟磷酸鹽。
根據一些實施方案，離去基團選自鹵代，乙酸鹽，甲苯磺酸鹽，三氟甲磺酸鹽，磺酸鹽，疊氮化物，羥基，硫代羥基，烷氧基，氰酸鹽，硫氰酸鹽，硝基，氰基，苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亞胺，酮肟，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，咪唑，吲哚啉酮-1-氧基，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
根據一些實施方案，苯并三唑具有通式III
結構式III 其中X是O或S； Z1和Z2分別獨立地是CH或N；和Z3是F，Cl，Br，CF3或NO2。
根據一些實施方案，X是O或S；Z1和Z2分別為CH；和Z3是Cl。優選X是O。
根據一些實施方案，X是O或S；Z1和Z2分別為CH；和Z3是CF3或NO2。例如，X是O；和Z3是CF3或NO2。
根據一些實施方案，苯并三嗪酮具有通式IV
結構式IV 其中X是O或S。
根據一些實施方案，琥珀酰亞胺具有通式V
結構式V 其中X是O或S。
根據一些實施方案，酮肟具有通式VI
結構式VI 其中 Z4和Z5分別獨立地選自F，Cl，Br，CORa，COORa，CONRa，CN，CF3或NO2；和Ra是烷基。
根據一些實施方案，Z4是COORa；Ra是乙基；和Z5是CN。
根據其他實施方案，Z4和Z5都是COORa，其中Ra是乙基。
根據其他實施方案，Z4和Z5都是CN。
根據進一步其他實施方案，Z4和Z5分別獨立地是COORa或CN和Ra是乙基或甲基。
根據一些實施方案，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基具有通式VII
結構式VII 根據一些實施方案，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基具有通式VIII
結構式VIII 其中Z6和Z7分別獨立地選自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
根據一些實施方案中的其他特征，Z6是CH3；和Z7是Cl。
根據一些實施方案，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基具有通式IX
結構式IX 其中Z1是CH或N，和Z8和Z9分別獨立地選自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
根據一些實施方案Z1是CH，Z8是苯基，和Z9是H或Cl。
根據其他實施方案，Z1是N，Z8是甲基和Z9是H。
根據一些實施方案，吲哚啉酮-1-氧基具有通式X
結構式X 其中Z10選自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
根據本發明的一些實施方案，提供了選自以下的偶聯劑

根據本發明的一些實施方案，提供了一種制備本文所述偶聯劑的方法，該方法包括將具有以下通式的化合物
結構式XI 結構式XII 其中每一R1，R2，R3，R4，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分別獨立地連接形成雜脂環族部分，前提是，至少一個R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基和/或至少一個R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6連接形成雜脂環族部分；和n是整數1至4；與 (i)鹵化劑；和 (ii)無機陰離子的飽和水溶液接觸；這樣得到本文所給出的偶聯劑，其中L是鹵代。
根據一些實施方案，該方法進一步包括，在接觸之前將具有通式XIII的化合物
結構式XIII 其中每一R1和R2獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R1和R2連接形成雜脂環族部分；與具有通式XIV的化合物
結構式XIV 其中每一R3和R4獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R3和R4連接形成雜脂環族部分；在堿的存在下反應，這樣得到具有通式XI的化合物； 或與具有通式XV的化合物
結構式XV 其中 每一R3，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R5和R6連接形成雜脂環族部分；n是整數1至4；在堿的存在下反應，這樣得到具有通式XII的化合物。
根據一些實施方案，該方法進一步包括將偶聯劑(其中L是鹵代)與離去基團的前體化合物在三乙胺的存在下反應。
根據一些實施方案，離去基團選自乙酸鹽，甲苯磺酸鹽，三氟甲磺酸鹽，磺酸鹽，疊氮化物，羥基，硫代羥基，烷氧基，氰酸鹽，硫氰酸鹽，硝基，氰基，苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亞胺，酮肟，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種合成肽的方法，該方法將多個氨基酸順序地，一個接一個地，在本文所給出的偶聯劑的存在下偶聯，這樣得到包含所述多個氨基酸的肽。根據一些實施方案，每個偶聯步驟的外消旋化比率是8％至0.3％。
根據一些實施方案，每個偶聯步驟的偶聯產率是80％至99％。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種合成多核苷酸的方法，該方法將多個核苷酸順序地，一個接一個地，在本文所給出的偶聯劑的存在下偶聯，這樣得到包含所述多個核苷酸的多核苷酸。
根據一些實施方案，肽或多核苷酸的合成通過固相合成而進行。根據一些實施方案，肽或多核苷酸的合成通過溶液相合成而進行。
根據本發明的一些實施方案，提供了肽的一種粗組合物，所述肽在C-末端至N-末端方向上由多個氨基酸合成，所述組合物由基本上具有所需氨基酸順序的肽和具有非所需氨基酸順序且相對該具有所需氨基酸順序的肽為雜質的多個肽組成，其中具有所需氨基酸順序的肽在組合物中的濃度比具有所需氨基酸順序的相同肽在下述肽的組合物中的濃度高至少5％所述肽在C-末端至N-末端方向上使用本文所給出的偶聯劑作為偶聯劑，在相同條件下制備。
根據一些實施方案，所述肽的粗組合物的形式選自粉狀組合物，凍干組合物，鍵接至固體載體上的組合物，增溶組合物和溶解組合物。
根據一些實施方案，至少一種氨基酸選自具有仲α胺的氨基酸，具有叔α胺的氨基酸，具有取代的α碳原子的氨基酸，具有取代的α胺的氨基酸，具有含氨基的側鏈的氨基酸，和其任何組合。
根據一些實施方案，α碳被烷基取代。
根據一些實施方案，具有取代的α碳原子的氨基酸是α-氨基異丁酸(Aib)。
根據一些實施方案，具有取代的α胺的氨基酸是苯基甘氨酸(Phg)。
根據一些實施方案，具有含氨基的側鏈的氨基酸是精氨酸。
根據一些實施方案，肽或多核苷酸的合成通過固相合成而進行。
根據一些實施方案，肽或多核苷酸的合成通過溶液相合成而進行。
單數形式的″一個″，和″該″包括多個指示物，除非另外明確地表示。例如，術語″蛋白質″或″至少一種蛋白質″可包括多種蛋白質，包括其混合物。
在本公開內容中，本發明的各方面可以范圍形式給出。應該理解，范圍格式的描述僅為了方便和簡潔而不應理解為對本發明范圍的僵硬的限制。因此，對范圍的描述應該被理解為已具體地公開了所有可能子范圍以及在該范圍內的各個數值。例如，對范圍如1至6的描述應該被認為已具體地公開了子范圍如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6，等，以及在該范圍內的各個數，例如，1，2，3，4，5，和6。其適用性與范圍的寬度無關。
只要在本文中提出數值范圍，它意味著包括在所述范圍內的任何所引用的數字(分數或整數)。詞語″在第一表示數和第二表示數之間的范圍″和″從第一表示數至第二表示數的范圍″在本文中可互換使用且意味著包括第一和第二表示數和在其之間的所有分數和整數。
這里所用的術語″包含″是指，可以加入對最終結果沒有影響的其他步驟和成分。該術語包括術語″組成為”和″基本上組成為”。
術語″方法″或″工藝″是指用于實現給定任務的方式，措施，技術和步驟，包括，但不限于，化學，藥物，生物，生物化學和醫學領域的從業人員已知的，或容易從已知的方式，是指，技術和步驟開發出的那么方式，措施，技術和步驟。
本文使用以下簡稱 BOP代表苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸鹽； Cl-HOBt代表6-氯-1-羥基苯并三唑； DCC代表N，N′-二環己基碳二亞胺，二環己基碳二亞胺； DIBOC代表二碳酸二t-丁基酯； DIEA代表N，N-二異丙基乙胺； DIC，DIP或DIPCDI代表N，N′-二異丙基碳二亞胺或1，3-二異丙基碳二亞胺； DMAP代表4-二甲基氨基吡啶；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺； EDC代表1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亞胺； EDCHCl代表1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二鹽酸鹽亞胺； Fmoc代表9-芴基甲氧基羰基； HATU代表2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽或1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶鎓六氟磷酸鹽3-氧化物； HBTU代表2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽或1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1H-苯并三唑鎓六氟磷酸鹽3-氧化物； HCTU，N-[(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽 HMPyOP代表1-(嗎啉代(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽 HDMOCC代表1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽 HDMODC代表1-[(1-(二氰基亞甲基氨基氧基)-二甲基氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽 HDMODeC代表1-[(1，3-二乙氧基-1，3-二氧代丙烷-2-叉基氨基氧基)-二甲基氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽 HDMOPC代表N-[(氰基(吡啶-2-基)亞甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亞甲基)-N-嗎啉代甲酰胺鎓六氟磷酸鹽 HOAt代表1-羥基-7-氮雜苯并三唑； HOBt代表1-羥基苯并三唑； HPTU代表N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑并-[4.5-beta]吡啶-1-基亞甲基]-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸鹽； PyAOP代表7-氮雜苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸鹽； PyBOP代表苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡啶基)鏻六氟磷酸鹽； TBTU代表N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亞甲基]-N-甲基甲酰胺鎓四氟硼酸鹽N-氧化物或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽； TCTU代表N-[(1H-6-氯苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亞甲基]-N-甲基甲酰胺鎓四氟硼酸鹽N-氧化物； TFA代表三氟乙酸； TFFH代表氟-N，N，N-，N″-四甲基形式脒鎓六氟磷酸鹽； TCP代表2，4，6-三甲基吡啶(可力丁)；和 TNBSA代表三硝基苯磺酸。
除非另有定義，本文所用的所有技術和/或科學術語具有與本發明所涉及領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。盡管與本文所述類似或相當的方法和材料可用于實施或測試本發明實施方案，但以下描述示例性方法和/或材料。在矛盾時，本專利說明書，包括定義，占優。另外，這些材料，方法，和實施例僅是說明性的和無意于進行必然性限定。
附圖的簡要描述 本發明的一些實施方案，例如僅參照附圖描述。現在詳細地具體參考附圖，但要強調指出，所示的細節是舉例性的和用于對本發明實施方案的說明性討論。在這方面，結合附圖的描述使得本領域熟練技術人員顯然看出如何可實施本發明的實施方案。
在附圖中

圖1給出根據本發明的示例性肽-偶聯劑，1-((二甲基亞氨基)(嗎啉代)甲基)3-H-苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇鹽六氟磷酸鹽(HDMB)的X-射線晶體結構，顯示該偶聯劑是其N-形式，其中苯并三唑部分直接通過一個三唑氮原子而不通過氧原子連接到亞銨部分上；和 圖2給出使用根據本實施方案的示例性肽-偶聯劑制備的五肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2所得的HPLC色譜圖，HDMB，顯示所得最終產物具有優異的產物純度。
優選實施方案的詳細描述 本發明在其一些實施方案中涉及在碳陽離子部分中包含質子受體的新型亞銨型偶聯劑，它可在各種化學合成中有益地用作偶聯劑和尤其作為偶聯劑用于肽和低聚核苷酸合成。本發明在其一些實施方案中進一步涉及一種制備這些偶聯劑的方法和采用該方法制備的肽和低聚核苷酸。
本發明的原理和操作可參照附圖和附圖描述而較好地理解。
在詳細解釋本發明的至少一個實施方案之前，本發明要被理解為在其申請不是必然地被限定至以下說明所給出或實施例所例舉的細節。本發明能夠以各種方式實施或進行其他實施方案。另外要理解，本文所用的詞語和術語用于說明和不應理解為限定。
如上所詳細討論，肽-偶聯劑是藥物肽工業中最有效工具。現代肽-偶聯劑基于其在正形成的肽的羧基端形成短暫活化羧基體的能力，同時避免由于其離去基團部分的作用而產生其外消旋化。盡管近年在偶聯劑發展領域的研究集中于識別最佳離去基團，對碳陽離子/亞銨部分的性質較少關注。
如上所進一步討論，用于肽合成的偶聯劑通常也有效地在低聚核苷酸合成中用作偶聯劑。目前已知的低聚核苷酸偶聯試劑，如1，1-二氧化物-3H-1，2-苯并二硫代-3-酮(Beaucage試劑)，2-氰基乙基四異丙基磷odiamidite(CAS No.102691-36-1)，4，5-二氰基咪唑(DCI)，4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl)，N，N-二乙基氨基磷酸二叔丁基酯(CASNo.117924-33-1)，N，N-二異丙基氨基磷酸二叔丁基酯CASNo.137348-86-8)，4-甲氧基三苯甲基氯CAS No.14470-28-1)和苯基乙酰基二硫化物(PADS)，通常用于活化一個核苷酸的端磷酸鹽基團使得與另一核苷酸的糖部分反應。因此，類似于肽合成中的羧基團的活化，磷酸鹽可使用相同種類的肽偶聯劑活化。
在找尋更有效偶聯劑的過程中，本發明人已意外地發現，將質子受體基團引入脲型偶聯劑的亞銨/碳陽離子部分，可明顯改進所述試劑，在偶聯效率和外消旋抑制方面的性能。所加的質子受體基團似乎有助于以較低的轉變能活化羧基中間體，基本上降低氨基酸外消旋的比率，同時增加偶聯反應動力學。
不愿局限于任何特殊理論，堿性點(質子受體)在亞銨/碳陽離子部分中的存在被假設可有助于羧酸的去質子化和離去基團的配合物酸的中和，在與目前可得偶聯試劑相比時增加偶聯產率和減少外消旋。另外，質子受體被假設在與目前可得偶聯試劑相比時可有助于增加偶聯劑在常用于肽化學的溶劑中的溶解度。
如上所討論，肽偶聯劑普遍還在核苷酸以及其衍生物和類似物的偶聯中有效。因此本文提出，在本發明的上下文中，對肽偶聯劑的偶聯能力的任何提及還包括其在核苷酸，以及其衍生物和類似物的偶聯中活化磷酸鹽基團的能力。
因此，根據本發明的一個方面，提供了一種具有選自以下的通式的偶聯劑
結構式I 結構式II 其中 A是無機陰離子； L是離去基團； n是整數1至4， 每一R1，R2，R3，R4，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分別獨立地連接形成雜脂環族部分， 其中至少一個R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一個雜原子中斷，封端和/取代的具有1-4個碳原子的烷基和/或至少一個R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6連接形成雜脂環族部分。
本文所用的術語″雜原子″是指可用作質子受體的非碳和非氫原子。雜原子可因此是，作為非限定性例子，氮(N)，氧(O)，硫(S)，磷(P)，硼(B)和硒(Se)。例如，雜原子是O，S，N，P或B，和另外，雜原子是O，S或N。
本文所用的詞語″質子受體″是指可在偶聯反應常用的pH范圍內被質子化的雜原子，其形式從形式-

-變化成形式-AH+-，其中-

-是在被質子化之前的雜原子和-AH+-是其質子化形式。一般來說，質子接受性雜原子具有至少一對非共有化合價電子，可在道質子(H+)和因此被稱作質子受體。
本文所用的詞語″被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的烷基″描述本文所述的一種烷基，它在烷基烴鏈內的一個或多個位置上，在烷基烴鏈的末端和/或作為烷基中的一個碳原子的取代基包含雜原子。被雜原子中斷的烷基的例子包括，但不限于，醚如甲氧基甲基，硫醚如3-硫代丁烷，胺如二乙胺和膦如三乙基膦；被雜原子取代的烷基的例子包括，但不限于，醇(用羥基團取代的烷基)如異丙醇，胺如2-氨基丁烷，和硫醇(用硫代羥基團取代的烷基)如丁烷-3-硫醇；被雜原子封端的烷基是其中烷基烴主鏈被雜原子在端碳上取代的特殊情形。
根據一些實施方案，在至少一對N-取代基，即，R1和R2對，R3和R4對，和R5和R6對中，取代基連接形成雜脂環族部分。因此，雙取代的胺的氮原子和連接其上的取代基形成包含至少兩個雜原子的雜脂環族環。
雜脂環族部分因此至少包含帶有R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6個取代基的氮原子和進一步包含本文所定義的另一雜原子。示例性雜原子包括，但不限于，氧，硫或氮。
雜脂環族部分的例子包括，但不限于，嗎啉，硫代嗎啉，噁唑烷，咪唑烷，1，4-氮雜膦烷(如4-甲基-1，4-氮雜膦烷)，氮雜磷烷，氮雜烴基硼烷(如4-甲基-1，4-氮雜烴基硼烷)，氮雜硼烷(如2-甲基-1，2-氮雜硼烷)和哌嗪(如，4-甲基哌嗪)。例如，R1和R2可分別是乙基，通過氧原子連接在一起，與它們所連接的氮一起形成嗎啉部分，如以下方案2所示。
方案2
如果這些R1和R2通過硫原子連接在一起，那么形成硫代嗎啉部分。如果這些R1和R2通過氮原子連接在一起，那么形成哌嗪部分。
類似地，如果R1是乙基和R2是甲基，通過氮原子連接在一起，那么與它們所連接的氮一起形成咪唑烷。如果R1是β-甲基硼乙烷和R2是乙基，通過硼原子連接在一起，那么與它們所連接的氮一起形成4-甲基-1，4-氮雜烴基硼烷，諸如此類。
這些實施方案也可適用于R3和R4，和R5和R6。
本文所用的詞語″部分″描述通常具有某些官能度或有區別的特點的化學體或化合物的一部分。
本文所用的術語″胺″描述一種-NR′R″基團，其中R′和R″分別獨立地是氫，烷基，環烷基，雜脂環族，芳基或雜芳基，這些術語如本文所定義。
本文所用的術語″烷基″描述脂族烴，包括直鏈和支化鏈基團。例如，烷基團具有1至20個碳原子或1-10個碳原子。只要在本文中描述數字范圍；如，″1-10-，這意味著，該基團(在這種情況下，烷基團)可包含1個碳原子，2個碳原子，3個碳原子，等，最高和包括10個碳原子。烷基可以是取代的或未取代的。如果取代，取代基可以是，例如，烷基，鏈烯基，炔基，環烷基，芳基，雜芳基，鹵化物，羥基，烷氧基和羥基烷基，其中這些術語在下文定義。本文所用的術語″烷基″還包括飽和或不飽和烴，因此該術語進一步包括鏈烯基和炔基。
術語″鏈烯基″描述本文所定義的具有至少兩個碳原子和至少一個碳-碳雙鍵的不飽和烷基。鏈烯基可被一個或多個在上文描述的取代基取代或未取代。
本文所定義的術語″炔基″是具有至少兩個碳原子和至少一個碳-碳三鍵的不飽和烷基。炔基可被一個或多個在上文描述的取代基取代或未取代。
術語″芳基″描述具有完全共軛的pi-電子體系的全碳單環或稠環多環(即，共有相鄰碳原子對的環)基團。芳基團可被一個或多個在上文描述的取代基取代或未取代。
術語″雜芳基″描述在環中具有一個或多個原子，如，例如，氮，氧和硫和，另外，具有完全共軛的pi-電子體系的單環或稠環(即，共有相鄰原子對的環)基團。雜芳基團的例子包括，但不限于吡咯，呋喃，噻吩，咪唑，噁唑，噻唑，吡唑，吡啶，嘧啶，喹啉，異喹啉和嘌呤。雜芳基團可被一個或多個在上文描述的取代基取代或未取代。代表性例子是噻二唑，吡啶，吡咯，噁唑，吲哚，嘌呤和類似物。
本文所用的術語″雜脂環族″描述在環中具有一個或多個原子如氮，氧和硫的單環狀或稠環基團。環也可具有一個或多個雙鍵。但環不具有完全共軛的pi-電子體系。雜脂環族可以是取代的或未取代的。取代的雜脂環族可具有一個或多個取代基，其中每一取代基團可獨立地是，例如，烷基環烷基，鏈烯基，炔基，芳基，雜芳基和雜脂環族。代表性例子是嗎啉，哌啶，哌嗪，四氫呋喃，四氫吡喃和類似物。
本文所用的術語″膦″描述一種-PR′R″R′″基團，其中R′，R″和R′″分別獨立地是氫，烷基，環烷基，雜脂環族，芳基或雜芳基，這些術語如本文所定義。
術語″羥基″和″硫代羥基″相應地是指-OH和-SH基團。
示例性無機陰離子包括，但不限于，鹵化物，六鹵代磷酸鹽，六鹵代銻酸鹽，四鹵代硼酸鹽，三鹵代甲烷磺酸鹽和二(三鹵代甲基磺酰基)酰亞胺。
本文所用的術語″鹵化物″是指鹵代原子的陰離子，即F-，Cl-，Br-和I-。
術語″鹵代″是指F，Cl，Br和I原子。
術語″六鹵代磷酸鹽″是指無機陰離子PX6-，其中X是鹵代。示例性六鹵代磷酸鹽是六氟磷酸鹽或PF6-，它是根據本實施方案的示例性無機陰離子。
術語″六鹵代銻酸鹽″是指無機陰離子SbX6-，其中X是鹵代。
術語″四鹵代硼酸鹽″是指無機陰離子BX4-，其中X是鹵代。
術語″三鹵代甲烷磺酸鹽″是指無機陰離子CX3SO3-，其中X是鹵代。
術語″二(三鹵代甲基磺酰基)酰亞胺″是指無機陰離子N(SO2CX3)2-，其中X是鹵代。
如本文所討論，在結構式I和II中表示為L的離去基團的類型和特征在作為偶聯劑的化合物的有效性方面，以及在其安全性方面起著重要的作用。
本文所用的詞語″離去基團″描述在化學反應過程中容易從有機分子上脫離的不安定原子，基團或化學部分，同時該脫離因此由離去原子，基團或部分的相對穩定性而輔助。通常，強酸的共軛堿的任何基團可用作離去基團。根據本實施方案的合適的離去基團的代表性實施例因此包括，但不限于，鹵化物，乙酸鹽，甲苯磺酸鹽，三氟甲磺酸鹽，磺酸鹽，疊氮化物，羥基，硫代羥基，烷氧基，氰酸鹽，硫氰酸鹽，硝基和氰基。
術語″乙酸鹽″是指乙酸陰離子。
術語″甲苯磺酸鹽″是指甲苯-4-磺酸陰離子。
術語″三氟甲磺酸鹽″是指三氟甲烷磺酸陰離子。
術語″磺酸鹽″是指磺酸陰離子。
術語″疊氮化物″是指N3-。
術語″羥基″和″硫代羥基″分別是指OH-和SH-陰離子。
術語″烷氧基″是指R′-O-陰離子，其中R′定義如上。
術語″氰酸鹽″和″硫氰酸鹽″分別是指[O＝C＝N]-和[S＝C＝N]-陰離子。
術語″硝基″是指NO2-。
術語″氰基″是指[C≡N]-。
根據一些實施方案，離去基團選自苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亞胺，酮肟，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，咪唑，吲哚啉酮-1-氧基，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
根據一些實施方案，苯并三唑具有通式III
結構式III 其中 X是O或S； Z1和Z2分別獨立地是CH或N；和 Z3是F，Cl，Br，CF3或NO2。
一種示例性苯并三唑是其中X是O或S；Z1和Z2分別為CH；和Z3是Cl的那種，導致離去基團具有以下結構式
其中X是O，和離去基團是
另一示例性苯并三唑是其中X是O或S；Z1和Z2分別為CH；和Z3是CF3或NO2的那種。例如X是O；和Z3是CF3或NO2，和另外Z3是CF3，得到離去基團
根據其他實施方案，苯并三嗪酮具有通式IV
其中X是O或S，或X是O。
本發明人還認為需要一種使用安全且有效的偶聯劑。包含三氮雜部分的物質要被確認是可能爆炸性的。最新報道[Wehourstedt等人，JHazard.Mat.A 126(2005)1]已經確認，HOBt衍生物在某些條件下具有爆炸性能，一般來說大概由于1-羥基-苯并三唑和苯并三唑衍生物的爆炸性能。類似地，基于其他含三氮雜的基團(如，三嗪，三唑)的偶聯劑與可爆性有關。
為此，本發明人已經開發出幾個系列的基于不太危害的離去基團，如琥珀酰亞胺-，酮肟-，吡啶-，喹唑啉-，咪唑-和吲哚啉酮-基離去基團的偶聯劑。這些偶聯劑因為其制備，儲存，傳輸和使用方面安全而高度有利。
因此，根據一些實施方案，琥珀酰亞胺型離去基團具有通式V
結構式V 其中X是O或S，或X是O。
根據一些實施方案中的其他特點，酮肟具有通式VI
結構式VI 其中Z4和Z5可分別獨立地是F，Cl，Br，CORa，COORa，CONRa，CN，CF3或NO2中的任何一種；其中Ra是氫或烷基。
例如，Z4是COORa；Ra是乙基；和Z5是CN，得到離去基團
另外，Z4和Z5都是COORa，其中Ra是乙基，得到離去基團
另外，Z4和Z5都是CN，得到離去基團
根據一些實施方案中的其他特點，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基具有通式VII
結構式VII 根據一些實施方案中的其他特點，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基具有通式VIII
結構式VIII 其中 Z6和Z7可分別獨立地是H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基中的任何一種。例如，Z6是CH3；和Z7是Cl。
根據一些實施方案，苯并[d]咪唑-1-氧基具有通式IX
結構式IX 其中 Z8和Z9可分別獨立地是H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基中的任何一種。
例如，Z1是CH，Z8是苯基；和Z9是Cl。
另外，Z1是N，Z8是甲基；和Z9是H。
根據一些實施方案，吲哚啉酮-1-氧基具有通式X
結構式X 其中 Z10可以是H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基中的任何一種。
根據本發明的另一方面，提供了一種制備本文所給出的偶聯劑的方法，該方法包括將具有選自以下的通式的在本文中也稱作脲衍生物的化合物
結構式XI 結構式XII 其中 每一R1，R2，R3，R4，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分別獨立地連接形成雜脂環族部分，和 其中 至少一個R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基和/或至少一個R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6連接形成雜脂環族部分；與(i)鹵化劑；和(ii)以上所給出的無機陰離子的飽和水溶液接觸，這樣得到本文所給出的偶聯劑，其中L是鹵代。
第一步驟(i)使用能夠鹵化脲衍生物和將羰基替代為鹵素的鹵化劑。
本實施方案中所用的詞語″鹵化劑″因此是指用于引入鹵代取代基以替代羰基的試劑。
示例性鹵化劑包括草酰鹵，光氣如COCl2，亞硫酰鹵(SOX2)如亞硫酰氯和磷氧基鹵化物(POX3)如磷酰氯(POCl3)。根據本實施方案的示例性鹵化劑是草酰鹵。
本文所用的詞語″草酰鹵″是指鹵化劑(COX)2或X(C＝O)(C＝O)X，其中X是鹵代。例如，所用的草酰鹵是草酰氯。亞硫酰鹵(X2S＝O，其中X是鹵代)，如亞硫酰氯也可用于進行相同轉化。
使用包含選擇無機陰離子的飽和水溶液的第二步驟(ii)提供具有亞銨/碳鎓陽離子和所選無機陰離子的鹽形式的偶聯劑，其中離去基團是從草酰鹵得到的鹵素。
本文所用的術語″亞銨″描述＝N+R′R″基團，其中R′和R″如本文所定義。
這里所用的詞語″亞銨/碳鎓陽離子″描述-{C(NR′R″)(NRmR″″)}+基團，其中R′，R″和R′″如本文所定義，和R″″定義如R′。
應該注意，進行步驟(i)和(ii)的順序可反轉或，視需要，步驟(i)和(ii)可同時進行。
具有通式XI或XII的脲衍生物通過將具有通式XIII的化合物
結構式XIII 其中每一R1和R2獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R1和R2連接形成雜脂環族部分；與具有通式XIV的化合物
結構式XIV 其中每一R3和R4獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R3和R4連接形成雜脂環族部分；在堿的存在下接觸而得到，這樣得到具有通式XI的化合物；或 與具有通式XV的化合物
結構式XV 其中每一R3，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R5和R6連接形成雜脂環族部分；和n是整數1至4；在堿的存在下接觸而得到，這樣得到具有通式XII的化合物。
堿可以是有機堿，如三乙胺，或無機堿如NaOH。
一旦制備出具有鹵代離去基團的堿性偶聯劑，該離去基團可被替換為在上文所給出的各種離去基團。
該步驟通過將堿性偶聯劑(其中L是鹵代)與具有所選離去基團的前體化合物在堿如，例如，三乙胺的存在下反應而進行。
本文所用的詞語″離去基團的前體化合物″是指作為離去基團的共軛酸的化合物，通常酸。例如，乙酸是離去基團乙酸鹽的前體化合物，甲苯-4-磺酸是離去基團最甲苯磺酸鹽的前體化合物，三氟甲烷磺酸是離去基團三氟甲磺酸鹽的前體化合物，等等。
另外例如，如果所選的離去基團是苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇鹽，那么該離去基團的前體化合物是1-羥基苯并三唑，還稱作HOBt。如果所選離去基團是6-氯-苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇鹽，那么該離去基團的前體化合物是6-Cl-HOBt。
如果所選離去基團是[1，2，3]三唑[4，5-b]吡啶-1-3-醇鹽，那么該離去基團的前體化合物是1-羥基-7-氮雜苯并三唑。
如果所選離去基團是[1，2，3]三唑[2，3-b]吡啶-1-鎓-3-醇鹽，那么該離去基團的前體化合物是4-HOAt。
如果所選離去基團是吡咯烷-2，5-二酮，那么該離去基團的前體化合物是1-羥基吡咯烷-2，5-二酮。類似地，五氟苯酚是離去基團氧基五氟苯基的前體化合物。
如果所選離去基團是2-(氧基亞氨基化物)丙二腈，那么該離去基團的前體化合物是2-(羥基亞氨基化物)丙二腈，在本文中也稱作KONDC。
如果所選離去基團是吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，那么該離去基團的前體化合物是N-羥基吡啶-2(1H)-酮。
如果所選離去基團是3-氧基-2-甲基喹唑啉-4(3H)-酮，那么該離去基團的前體化合物是3-羥基-2-甲基喹唑啉-4(3H)-酮，在本文中也稱作HOMQ。
如果所選離去基團是6-氯-2-苯基-1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，那么該離去基團的前體化合物是6-氯-2-苯基-1H-苯并[d]咪唑-1-醇，在本文中也稱作6-Cl-HOPBI。
如果所選離去基團是2-甲基-3H-咪唑[4，5-b]吡啶-3-氧基，那么該離去基團的前體化合物是2-甲基-3H-咪唑[4，5-b]吡啶-3-醇，在本文中也稱作HOMPI，和等等。
如以下實施例章節中所述，基于在本文所給出的雜脂環族部分取代的亞銨/碳鎓部分的偶聯劑要被制備并成功地用于肽合成。
根據本發明一些實施方案的示例性偶聯劑在下表1中給出。
表1





表1(繼續) 如上所討論，偶聯劑根據在肽合成中重要的幾個標準分級，這些標準是肽鍵形成中的大體產率和在具有特殊空間偶聯位阻的氨基酸之間的肽鍵形成的產率，和偶聯劑在其上施加活性的活化氨基酸的外消旋比率。
本文所用的術語″肽″包括包含一個接一個地通過肽鍵或其變型連接的多個氨基酸殘基的生物分子。肽包括至少2個氨基酸殘基和最高200個氨基酸殘基和甚至更多。本文所用的該術語還包括多肽，肽模擬物，以及是肽類似物的類胨和半類胨，可具有，例如，使得肽更穩定，同時整體上更能夠滲入細胞的變型。這里所用的詞語″氨基酸殘基″描述構成肽一部分，即，是偶聯至至少一個另一氨基酸殘基上的氨基酸的殘基。
正如本領域所完全認可，本文所用的術語″殘基″是指已經歷化學反應和現共價鍵接至另一分子體上的分子體的部分，和通常主要部分，如分子或分子的一部分如基團。例如，分子體可以是氨基酸分子，和在形成肽鏈之后構成肽鏈一部分的氨基酸的部分是氨基酸殘基。氨基酸殘基因此是在，例如，其α-胺基團與肽序列中的相鄰氨基酸的羧酸基團反應形成肽酰胺鍵和/或其α-羧酸基團與肽序列中的相鄰氨基酸的α-胺基團反應形成肽酰胺鍵時，存在于肽序列中的那部分氨基酸。本文在涉及氨基酸時所用的術語″側鏈″是指連接到氨基酸的α-碳原子上的化學基團。側鏈對每種類型的氨基酸是獨特的且不參與形成用于連接多肽中的氨基酸的肽鍵。例如，甘氨酸的側鏈是氫，丙氨酸的側鏈是甲基，纈氨酸的側鏈是異丙基和蛋氨酸的側鏈是甲基磺胺基-乙基。對于所有氨基酸的特定側鏈，參考A.L.Lehninger的生物化學(參見，第4章)。
本文在說明書和在以下權利要求章節中所用的術語″氨基酸″或″多個氨基酸″要被理解為包括20種自然存在的氨基酸；通常在體內翻譯后改性的那些氨基酸，包括，例如，羥基脯氨酸，磷絲氨酸和磷蘇氨酸；和其他未常規的氨基酸，包括，但不限于，2-氨基己二酸，羥基賴氨酸，異鎖鏈素，正纈氨酸，正亮氨酸和鳥氨酸。另外，術語″氨基酸″包括D-和L-氨基酸兩者。
本文用于氨基酸的簡稱和肽的名稱遵循IUPAC-IUB生物化學命名委員會的規則，J.Biol.Chem.1972，247，977-983。
下表2和3列出了可用于本發明的自然存在的氨基酸(表2)和非常規，改性的和未天然氨基酸(表3)。
表2 表3 肽鍵形成的產率可簡單地通過相對起始原料和/或副反應雜質的量測量產物(例如伸長肽)的量而確定。在偶聯特殊空間位阻氨基酸，如苯基甘氨酸，或更難以偶聯的氨基酸如2-氨基異丁酸時，所得肽的長度和順序用作偶聯產率的指示。
在以偶聯劑為媒的肽鍵形成的過程中，氨基酸的羧酸部分與偶聯劑相互作用，形成活化中間體，后者又與下一氨基酸的氨基部分相互作用。在該過程中，可發生活化氨基酸的立體構型的完全反轉，和更有可能的部分反轉，導致該特定氨基酸的手性中心的外消旋。
外消旋是肽合成中最主要的技術問題，其比率也最難以測定。本文所用的術語″外消旋″是指手性分子的一種對映體至其其他立體異構體形式的部分轉化，或其″鏡圖像″反轉。
本文所用的術語″對映異構體″是指化合物，如氨基酸的一種立體異構體，它可相對其相應物僅通過相互的完全反轉/反射(鏡圖像)而重合。對映異構體據說具有″偏手性-，因為它們相互參考，如同右和左手。對映異構體具有相同化學和物理性能，除了存在于本身具有偏手性的環境，如所有的生存體系中。
如以下實施例章節所示，本文所給出的偶聯劑在一些最具挑戰性的肽合成任務中測試，和根據其肽鍵形成產率和外消旋比率分級。
因此，根據本發明的另一方面，提供了一種合成肽的方法，該方法包括順序地將多個氨基酸，一個接一個地，在本文所給出的偶聯劑的存在下偶聯，這樣得到包含多個氨基酸的肽。
偶聯劑的質量因此根據所得肽的質量，即其生產效率(反應產率)和其中每一手性中心的內外消旋化比率(產物純度)而測定。對質量的這種評估可被量化成每個伸長步驟的階梯指標，或每個完全肽的總比率。顯然，在比較偶聯劑時，最好避免其中肽順序在其合成效率中其中關鍵作用的標準，和因此考慮到特殊氨基酸對的階梯標準可用作指示性的偶聯劑質量分級標準。
根據一些實施方案，每個一般偶聯步驟的偶聯產率為80％至99％，取決于偶聯劑和其他條件。實質上，具有質子受體取代基的偶聯劑與不具有這些取代基的其目前已知的相應物相比更有效至少5％，或至少10％。
特別重要的是在本文所給出的偶聯劑在用于合成引入氨基酸殘基的肽時的有效性，所述殘基否則會以相對低的產率引入和一些時間特別難以引入。
被任務難以在普通肽合成中引入的示例性氨基酸包括，但不限于，具有仲α胺的氨基酸，具有叔α胺的氨基酸，具有取代的α碳原子的氨基酸和具有含氨基的側鏈的氨基酸。
具有仲或叔α胺的氨基酸特別難以被引入合成制備的肽中，因為參與偶聯反應的胺具有位阻。
具有取代的α碳原子的氨基酸的引入也由于影響偶聯反應的取代基所引起的空間相互作用而基本上影響合成產率。兩個依次相連的這些氨基酸的引入甚至更復雜。正如本領域熟知，在α碳上甚至被低級烷基如甲基取代的氨基酸也難以被引入肽順序。
具有含氨基的側鏈的氨基酸的引入通常因為偶聯劑與側鏈胺基團的非選擇性反應而變得復雜。這種非選擇性反應導致肽鏈的終止。如上所述，根據本發明的該方面的方法因此特別可用于合成包括上述氨基酸的一個或多個殘基的肽。
因此，在本發明的一些實施方案中，用于合成肽的多種氨基酸中的至少一種是具有仲α胺的氨基酸，具有叔α胺的氨基酸，具有取代的α碳原子的氨基酸和/或具有含氨基的側鏈的氨基酸。通過該方法制備的肽因此包括這些氨基酸的至少一個殘基。
根據本發明的一些實施方案，多種氨基酸中的一種或多種是具有取代的α碳的氨基酸。
在一個實施方案中，α碳被烷基如甲基取代。在這方面的示例性氨基酸是α-氨基-異丁酸(Aib)。
在另一實施方案中，至少兩個這樣的氨基酸被順序地引入通過本文所述方法制備的肽中，使得肽包含兩個被相互偶聯的這樣氨基酸。
根據本發明的另一實施方案，包含被相互偶聯的這種氨基酸的兩個或多個殘基的肽以大于80％，大于85％，大于90％，大于95％，和甚至大于98％的產率得到。
在本發明該方面的示例性實施方案中，多種氨基酸中的一種或多種是具有取代的手性α碳的氨基酸。如上所討論，偶聯劑為媒的肽合成傾向于將活化氨基酸的立體-構型反轉，和更可能地會發生部分反轉，導致該特殊氨基酸的手性中心的外消旋化，和如果考慮到其立體異構體，最終導致形成肽的多相混合物肽。在α-碳上具有手性中心的任何氨基酸在立體構型的保持方面對偶合反應敏感。這些氨基酸的例子包括所有D/L-氨基酸(除了甘氨酸)，D/L-α-甲基-氨基酸如D-α-甲基異亮氨酸和類似物。根據本發明的另一實施方案，包含被相互偶聯的這種氨基酸的一個或多個殘基的肽以大于80％，大于85％，大于90％，大于95％，和甚至大于98％的產率得到。
如以下實施例章節中所述，本文所給出的偶聯劑在α-氨基-異丁酸(Aib)的挑戰性立體-位阻偶聯反應，甚至在兩個依次相連的Aib殘基的偶聯的產率上上優于目前已知的偶聯劑。本文所觀給出的示例性偶聯劑，6-Cl-HDMB，HDMA和HDMB分別具有每個特殊Aib-Aib偶聯步驟98.7％，98％和89％的產率，相比而言，兩種已知的偶聯劑，HATU的產率被測定為83％和HBTU的產率被測定為47％。
正如以下實施例章節所進一步說明，本文所給出的偶聯劑在一個序列超過10個氨基酸的挑戰性偶聯反應的產率方面優于目前已知的偶聯劑。如實施例章節所述，本文所給出的偶聯劑用于形成具有15個氨基酸的特定順序的肽，肽H-Glu-Lys-Ile-Thr-Thr-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-NH2。根據本發明的該實施方案，包含10個以上殘基的肽以大于40％，大于50％和甚至大于60％的產率得到。
根據一些實施方案，每個偶聯步驟的外消旋化比率不高于10％，和可以是約10％至約0.5％，或約5％至約0.1％。
如以下實施例章節中所述，在使用偶聯劑時在偶聯劑活化用于偶聯反應的手性中心上發生外消旋化的比率方面，本文所給出的偶聯劑上優于目前已知的偶聯劑。苯基甘氨酸(Phg)在脯氨酸殘基偶聯其上之后評估該標準；和纈氨酸在脯氨酸殘基偶聯其上之后評估。
在本發明該方面的另一實施方案中，在氨基酸的每一順序連接中，偶聯劑的用量是0.2mol當量至5mol當量，相對氨基酸的摩爾量，或約0.5mol當量至3mol當量，相對氨基酸的摩爾量，或另外使用化學計量的偶聯劑。
使用本文所述偶聯劑的高反應性和選擇性的上述方法，可得到包含高濃度所需肽的肽組合物，即，具有所需順序的肽。這些組合物通常具有的所需肽的濃度高于使用目前已知的偶聯劑所得的。
因此，根據本發明的另一方面，提供了一種肽的粗組合物，它在C-末端至N-末端方向上合成，和基本上由具有所需氨基酸順序的肽和作為具有所需氨基酸順序的肽的雜質的多個具有非所需氨基酸順序的肽組成。根據本發明的該方面，在使用本文所述偶聯劑在C-末端至N-末端方向上合成的肽的組合物中，具有所需氨基酸順序在組合物中的濃度比具有所需氨基酸順序的相同肽的濃度高至少5％，與在相同條件下使用目前已知的偶聯劑制備的組合物相比。
本文所用的詞語″具有所需順序的肽″描述在肽鏈中的氨基酸的順序和組成方面包含所需順序和在肽鏈中的氨基酸的數目方面包含所需鏈長的肽。
本文所用的詞語″具有非所需順序的肽″描述在肽鏈中的氨基酸的順序和組成方面包含不同順序和在肽鏈中的氨基酸的數目方面包含不同鏈長的肽，與具有所需順序的肽相比。
詞語″粗組合物肽″描述肽合成的粗品(其中肽在C-末端至N-末端方向上制備)。正如本領域所熟知，這種粗品由本文所定義的具有所需順序的肽，和對其污染的具有非所需順序的肽組成。根據用于制備肽的合成方法和其中所采用的條件和步驟，這種粗組合物可以是固體或溶液的形式。固體組合物可被，例如，粉碎或凍干。組合物可進一步被鍵接至其上合成由所述肽的固體載體。溶液可包括溶解在液體介質中的組合物。這種液體介質通常是除了水，還包含各種鹽，緩沖劑和類似物的水介質。
在本發明該方面的一些實施方案中，具有所需氨基酸順序的肽在組合物中的濃度比具有所需氨基酸順序的相同肽在組合物(在C-末端至N-末端方向上使用目前已知的偶聯劑在相同條件下合成的肽)中的濃度高至少5％，至少8％，至少10％，至少12％，至少15％，至少18％，至少20％，至少22％，至少25％，和甚至至少30％。
根據本發明該方面的示例性粗組合物是其中具有所需氨基酸順序的肽包含至少一種選自以下的氨基酸殘基的那些具有仲α胺的氨基酸的殘基，具有叔α胺的氨基酸的殘基，具有取代的α碳原子的氨基酸的殘基，和具有含氨基的側鏈的氨基酸的殘基，以上給出了具體定義。
根據本發明該方面的其他粗組合物是其中具有所需氨基酸順序的肽包含至少兩個偶聯的氨基酸殘基的那些，其中所述至少兩個氨基酸殘基中的至少一個選自具有仲α胺的氨基酸的殘基和具有叔α胺的氨基酸的殘基。
根據本發明該方面的其他粗組合物是其中具有所需氨基酸順序的肽包含至少兩個偶聯的氨基酸殘基的那些，所述殘基具有取代的α碳原子(如，Aib殘基)。
任何目前已知的用于化學合成肽的技術可用于本發明實施方案。這些包括，例如，標準固相技術，包括專用固相合成，部分固相合成方法，和片斷縮合，和傳統溶液合成。固相肽合成步驟是本領域熟知的和進一步由John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young描述，固相肽合成(2ndEd.，Pierce Chemical Company，1984)。
所得肽可，使用，例如，制備高性能液體色譜進一步純化[CreightonT.(1983)蛋白質，結構和分子原理。WH Freeman和Co.N.Y.]。其他示例性純化步驟可包括羥基磷灰石，尺寸排斥和固定金屬離子吸附(IMAC)色譜。
合適的色譜介質包括衍生的右旋糖酐，瓊脂，纖維素，聚丙烯酰胺，特殊硅石，和類似物。示例性色譜介質包括使用苯基，丁基，或辛基團衍生的那些介質，如苯基-瓊脂糖FF(Pharmacia)，Toyopearl butyl 650(TosoHaas，Montgomeryville，Pa.)，辛基-瓊脂糖(Pharmacia)和類似物；或聚丙烯酸樹脂，如Amberchrom CG 71(Toso Haas)和類似物。
合適的固體載體包括在它們使用的條件下不可溶的玻璃珠粒，硅石-基樹脂，纖維素樹脂，瓊脂珠粒，交聯瓊脂珠粒，聚苯乙烯珠粒，交聯聚丙烯酰胺樹脂和類似物。
這些載體可用反應性基團改性使得肽能夠被氨基團，羧基團，巰基團，羥基團和/或碳水化合物部分連接。這些和其他固體介質是本領域熟知的和廣泛使用的，且可得自商業供應商。對特定方法的選擇根據所選載體的性能確定。參見，例如，親合性色譜原理&方法，PharmaciaLKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。
通過根據本發明該方面的方法制備的肽是線性，但也可得到環形的肽。環狀肽可被合成成環狀形式或在所需條件(如，生理條件)下構造成環狀形式。
如上所討論，本文所給出的偶聯劑也可以用合成各種核酸，低聚核苷酸，多核苷酸，其類似物和衍生物。偶聯劑按照與它們活化氨基酸的羧基團的類似方式活化核苷酸的磷酸鹽基團，這樣將一個核苷酸偶聯至另一核苷酸上。
因此，根據另一方面本發明，提供了一種合成多核苷酸或低聚核苷酸的方法，該方法通過固相技術或溶液相技術進行，和順序地將多個核苷酸，一個接一個地，在本文所述偶聯劑的存在下偶聯，這樣得到包含多個核苷酸的多核苷酸。
在本文中可互換使用的術語″多核苷酸-，″低聚核苷酸″和″核酸″被通稱為″多核苷酸-，和包括，例如，一個以上核苷酸的單鏈或復式的RNA，DNA，或RNA/DNA混合順序。但在本實施方案中，因為低聚核苷酸的化學合成通常是包括單鏈物質，低聚核苷酸至少在使用偶聯劑化學合成的那部分基本上是單鏈物質。因此，核苷酸是多核苷酸或核酸如DNA和RNA的單體單元。
本文所用的術語″核苷酸″是指包含核堿-糖-磷酸鹽組合的分子，含義包含嘌呤，嘧啶或其類似物，核糖，脫氧核糖部分或其類似物，和磷酸鹽基團或磷二酯連接基團(在低聚核苷酸或多核苷酸內的核苷酸的情況下)的分子，或較大核酸分子中的單個單元。因此，術語″核苷酸″包括自然存在的核苷酸以及在連接的含磷酸鹽的基團，嘌呤或嘧啶，或糖部分中包含至少一個變型的″改性的核苷酸″。
術語″核苷酸″包括脫氧核糖核苷三磷酸鹽(″dNTPs″)如dATP(2′-脫氧腺苷5′-三磷酸鹽)，dCTP(2′-脫氧胞苷5′-三磷酸鹽)，dITP(2′-脫氧肌苷5′-三磷酸鹽)，dUTP(2′-脫氧尿嘧啶核苷5′-三磷酸鹽)，dGTP(2′-脫氧鳥嘌呤核苷5′-三磷酸鹽)，dTTP(2′-脫氧胸腺啶5′-三磷酸鹽)，或其衍生物。這些衍生物包括，例如，α-dATP，7-脫氮雜-dGTP，7-脫氮雜-dATP，氨基烯丙基-UTP(5-[3-氨基烯丙基]-尿嘧啶核苷-5′-三磷酸鹽)，氨基烯丙基-dUTP，氨基烯丙基-dUTP，生物素-11-dUTP(生物素-e-氨基己基-[5-{3-氨基烯丙基}-2′-脫氧尿嘧啶核苷-5′-三磷酸鹽])，熒光素-12-dUTP(熒光素-6-碳x氨基己基-[5-{3-氨基烯丙基}-2′-脫氧尿嘧啶核苷-5′-三磷酸鹽])，dm6ATP(2′-脫氧-N6-甲基腺苷5′-三磷酸鹽)，dm4CTP(2′-脫氧-N4-甲基胞苷5′-三磷酸鹽)或dm5CTP(2′-脫氧-5-甲基胞苷5′-三磷酸鹽)。這里所用的術語″核苷酸″還表示二脫氧核糖核苷三磷酸鹽(″ddNTPs″)和其衍生物，包括，但不限于，ddATP，ddCTP，ddGTP，ddITP，和ddTTP。另外，術語″核苷酸″包括核糖核苷三磷酸鹽(rNTPs)如rATP，rCTP，rITP，rUTP，rGTP，rTTP和其衍生物，它們類似于上述的dNTPs和ddNTPs，除了rNTPs在其糖-磷酸鹽主鏈中包含核糖而非脫氧核糖或二脫氧核糖。
可以理解，為清楚起見在單獨實施方案中描述的本發明某些特點也可在單個實施方案中組合提供。相反，為簡要起見而在單個實施方案中描述的本發明的各種特點也可單獨或以任何合適的子組合或如果合適，提供在本發明任何其他所述實施方案中。
各種實施方案中描述的某些特點不被認為是那些實施方案的基本特征，除非該實施方案在沒有這些要素時不起作用。
本文以上描述和在以下權利要求中所要求的本發明的各種實施方案和方面在以下實施例中具有實驗支持。
實施例 現在參考以下實施例及以上描述來，以非限定性方式說明本發明的一些實施方案。
材料和方法 溶劑購自Carlo Erba Reactifs-Sds和沒有進一步純化而施用(除非指出)。
N，N-二甲基甲酰胺用氮氣鼓泡2小時和保持在分子篩上。
乙腈在使用之前從無水碳酸鉀上蒸餾并保持在分子篩上。
二異丙基乙胺用nihydrine(2，2-二羥基茚滿-1，3-二酮)回流2小時，并隨后蒸餾和保持在分子篩上。
六氟磷酸鉀，嗎啉，三光氣，硫代嗎啉，4-氯-3-硝基三氟苯，和2-氯-3-硝基吡啶，N-羥基琥珀酰亞胺，五氟苯酚購自Sigma-Aldrich。
草酰氯，N，N，N-三甲基亞乙基二胺，N，N-二甲基氨基甲酰氯，N，N-二乙基氨基甲酰氯，氟化鉀購自Fluka。
氟化鉀在使用之前在100攝氏度爐中保持24小時進行干燥。
HOBt，HOAt，和Rink Amide樹脂購自Biotech GMBH。
6-Cl-HOBt購自Luxembourg industries。其他起始原料和試劑購自Carlo Erba Reactifs-Sds，Sigma-Aldrich，Fluka，Biotech GMBH或Luxembourg industries Ltd。
TLC在來自Albet的硅石板(8X4cm)上使用合適的溶劑體系和用CM-10型Spectroline UV燈(254nm)觀察而進行。
熔點在開口毛細管中使用Buchi熔點B-540裝置得到。
紅外光譜(IR)在FT-IR Thermo Nicolet系列Fourrier轉化器儀器上使用KBr粒料而記錄。吸收帶(vmax)以波數(cm-1)給出。
UV-Vis光譜在Shimadzu UV-250/PC分光光度計上記錄。
NMR光譜在Varian汞400MHz光譜計上在室溫下記錄，化學位移記錄為相對所用的內溶劑的ppm數。
HPLC分析通過使用Waters Symmetry柱C18，5μ，4.6X150mm和雙波長吸光率檢測器進行。
質譜測量在MALDI質譜計上使用ACH作為內基質而進行。
X-射線晶體學分析使用Bruker Appex-II CCD衍射計，使用3363反射和四圈衍射儀進行。
實施例1 稱作脲/亞銨型偶聯劑的各種脲衍生物的化學合成 脲衍生物的制備-一般步驟A 在0攝氏度下將N，N-二烷基-氨基甲酰氯(0.6mol)滴加至仲胺化合物(0.5mol)和三乙胺(0.5mol)在DCM(400ml)中的混合物。混合物在室溫下攪拌3-4小時并隨后用10％NaOH堿化。收集有機層并將水層用二氯甲烷(DCM，100ml)洗滌。將合并的DCM相用H2O(2x100ml)和用NaCl的飽和溶液(2x100ml)洗滌，在無水MgSO4上干燥，過濾，和在減壓下去除溶劑。通常得到油狀殘余物并通過真空蒸餾純化。
脲衍生物的制備-一般步驟B 脲衍生物通過使用由DCM和10％NaOH組成的二相體系而制成。將仲胺(0.5摩爾)溶解在DCM(300ml)和10％NaOH(300ml)中。滴加N，N-二烷基-氨基甲酰氯(0.6mol在200ml DCM)10分鐘。反應混合物在室溫下攪拌3小時和收集有機層。NaOH層用DCM(200ml)洗滌并將合并的DCM用水(2x100ml)，飽和NaOH(2x100ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并將溶劑在減壓下去除，得到通常為純無色油的脲衍生物。
一系列示例性脲衍生物根據一般步驟A或B(參見以下方案3)使用各種環仲胺(在方案3中表示為R1R2NH)，如吡咯烷，嗎啉，硫代嗎啉，N-甲基-2-(吡咯烷-1-基)乙胺，N-甲基-2-(哌啶-1-基)乙胺和N-甲基-2-嗎啉代乙胺而制成。
方案3
N，N-二甲基吡咯烷-1-甲酰胺的制備
將N，N-二甲基吡咯烷-1-甲酰胺，脲衍生物，根據一般步驟A或B使用吡咯烷作為仲胺在98-100攝氏度下蒸餾并收集成無色油，85.5％產率。
1H NMR(CDCl3)δ＝1.81-2.10(m，4H，2CH2)，2.81(s，6H，2CH3)，3.15-3.18(m，4H，2CH2)ppm N，N-二甲基嗎啉-4-甲酰胺的制備
N，N-二甲基嗎啉-4-甲酰胺，脲衍生物，根據一般步驟A或B使用嗎啉作為仲胺在127-129攝氏度下蒸餾和收集成無色油，92.4％產率(73克，來自0.5摩爾反應)。
1H NMR(CDCl3)δ＝2.84(s，6H，2CH3)，3.22-3.2(m，4H，2CH2)，3.68-3.70(m，4H，2CH2)ppm； 13CNMR(CDCl3)δ＝38.62，47.51，66.89，164.96ppm。
N，N-二甲基硫代嗎啉-4-甲酰胺的制備
N，N-二甲基硫代嗎啉-4-甲酰胺，另一脲衍生物，作為淺棕色晶體在89.5％產率下根據一般步驟A或B使用硫代嗎啉作為仲胺而得到。
m.p.61-62攝氏度； 1H NMR(CDCl3)δ＝2.62-2.65(m，4H，2CH2)，2.81(s，6H，2CH3)，3.48-3.50(m，4H，2CH2)ppm； 13C NMR(CDCl3)δ＝27.41，38.77，49.38，165.17ppm。
二嗎啉代甲酮的制備
二嗎啉代甲酮，另一脲衍生物，通過將嗎啉和三光氣(BTC)在二氯甲烷(DCM)中縮合而合成。將在DCM(200ml)中的嗎啉(0.4mol)放在裝配滴液漏斗的250ml三頸燒瓶中，并在氮氣氛下在0攝氏度下向其中加入BTC(0.033mol)溶解在DCM(100ml)中的溶液。反應混合物在0攝氏度下攪拌1小時，和在室溫下攪拌另外3-4小時。加入水(100ml)以溶解白色固體，收集有機層并隨后用飽和Na2CO3(50ml)，1N HCl(50ml)，飽和NaCl(50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，和過濾，并隨后將溶劑在減壓下去除，得到純白色固體，86％產率。
m.p.141-142攝氏度； 1H NMR(CDCl3)δ＝3.19-3.21(m，8H，4CH2)，3.59-3.62(m，8H，4CH2)ppm； 13C NMR(CDCl3)δ＝47.39，66.75，163.94ppm。
1，1，3-三甲基-3-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)脲的制備
1，1，3-三甲基-3-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)脲，另一脲衍生物，根據一般步驟A或B使用N-甲基-2-(吡咯烷-1-基)乙胺作為仲胺在134-135攝氏度下蒸餾和收集成淺黃色油，74.2％產率(11.6克，來自78mmol)。
1H NMR(CDCl3)δ＝1.75-1.78(m，4H，2CH2)，2.52-2.56(m，4H，2CH2)，2.65(t，2H，CH2)，2.79(s，6H，2CH3)，2.84(s，3H，CH3)，3.12(t，2H，CH2)，ppm。
13C NMR(CDCl3)δ＝23.67，37.18，38.91，49.80，53.94，54.54，165.68ppm。
m/z199.17。
1，1，3-三甲基-3-(2-(哌啶-1-基)乙基)脲的制備
1，3-三甲基-3-(2-(哌啶-1-基)乙基)脲，另一脲衍生物，根據一般步驟A或B使用N-甲基-2-(哌啶-1-基)乙胺作為仲胺在89-91攝氏度下蒸餾和收集成無色油，81.7％產率(34.8克，來自0.3摩爾)。
1H NMR(CDCl3)δ＝1.39-1.45(m，2H，CH2)，1.54-1.59(m，4H，2CH2)，1.60-1.65(br，1H，NH)，2.35-2.41(m，4H，2CH2)，2.37-2.44(m，5H，CH2，CH3)，2.66(t，2H，CH2)ppm。
1，1，3-三甲基-3-(2-嗎啉代乙基)脲的制備
1，1，3-三甲基-3-(2-嗎啉代乙基)脲，另一脲衍生物，根據一般步驟A或B使用N-甲基-2-嗎啉代乙胺作為仲胺在152-154攝氏度下蒸餾和收集成淺黃色油，76.8％產率。
1H NMR(CDCl3)δ＝2.45(t，4H，2CH2)，2.54(t，2H，CH2)，2.77(s，6H，2CH3)，2.82(s，3H，CH3)，3.29(t，2H，CH2)，3.66(t，4H，2CH2)ppm。
13C NMR(CDCl3)δ＝37.33，38.91，47.36，54.04，56.47ppm。
氯亞銨衍生物的制備-一般步驟C 氯亞銨衍生物的制備按照以下方案4所述而進行 方案4
在室溫下在5分鐘內將在DCM(100ml)中的草酰氯(100mmol)滴加至脲衍生物(100mmol)在干DCM(200ml)中的溶液。反應混合物在回流下攪拌3小時，和溶劑在減壓下去除，將殘余物用無水醚(2x100ml)洗滌，并隨后用N2鼓泡以去除過量醚。所得殘余物通常是非常吸水的，和因此將它直接溶解在DCM中；和將的飽和含水六氟磷酸鉀(100mmol，在50mL水中，KPF6)溶液在室溫下在劇烈攪拌下加入10-15分鐘。收集有機層，一次性用水(100ml)洗滌，在無水MgSO4上干燥，過濾并將溶劑在減壓下去除，得到通常白色固體，可從DCM-醚或乙腈-醚中重結晶，得到通常白色晶體。
4-((二甲基氨基)氯亞甲基)嗎啉-4-亞銨六氟磷酸鹽(DCMH)的制備
在室溫下在5分鐘內將在DCM(100ml)中的草酰氯(100mmol)滴加至根據一般步驟A或B制備的，在干DCM(200ml)中的N，N-二甲基嗎啉-4-甲酰胺(100mmol)的溶液。反應混合物在回流下攪拌3小時，溶劑隨后在減壓下去除，將殘余物用無水醚(2x100ml)洗滌，并隨后用N2鼓泡以去除過量醚。將所得白色固體溶解在DCM(500ml)中并將飽和含水KPF6(18.4克，在50ml H2O中)在室溫下在劇烈攪拌下加入10-15分鐘。收集有機層，一次性用水(50ml)洗滌，在無水MgSO4上干燥，過濾并將溶劑在減壓下去除，得到白色固體，從DCM-醚中重結晶，得到通常白色晶體，89.6％產率(28.9克)。
m.p.94-95攝氏度； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.39(s，6H，2CH3)，3.75(t，4H，2CH2)，3.86(t，4H，2CH2)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝44.36，52.82，65.99，162.79ppm。
N-(氯(吡咯烷-1-基)亞甲基)-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(DmPyCH)的制備
N-(氯(吡咯烷-1-基)亞甲基)-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(DmPyCH)根據一般步驟C和如上DCMH所述而制備，和得到白色固體，89.0％，產率。
m.p.93-95攝氏度； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝2.00-2.13(m，4H，2CH2)，3.49(s，6H，2CH3)，3.90-4.02(m，4H，2CH2)ppm。
1-(氯(嗎啉代)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽的制備 1-(氯(嗎啉代)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽按照以下方案5所述而制備 方案5
將在100ml DCM中的4-嗎啉代羰基氯(36克，1.2當量)在10分鐘內加入吡咯烷(0.2摩爾，17ml)在100ml DCM和100ml 10％NaOH中的攪拌溶液。反應混合物在室溫下攪拌3小時并隨后收集有機層并將NaOH層用100ml DCM洗滌。將合并的DCM用水(2X100ml)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并將溶劑在真空下去除，得到在室溫下凝固的無色油，產率92.4％(34克)。
粗脲衍生物進一步通過真空蒸餾而純化和收集在165-169攝氏度下的級分。
1H NMR(CDCl3)δ＝1.76-1.81(m，4H，2CH2)，3.24(t，4H，2CH2)，3.32-3.35(m，4H，2CH2)，3.64(t，2H，CH2)ppm； 13C NMR(CDCl3)δ＝25.72，46.84，48.52，66.97，162.84ppm； 氯亞銨鹽根據一般步驟C如上所述而制備。所得產物作為白色固體得到，產率83.9％。
m.p.99-100攝氏度。
1H NMR(丙酮-d6)δ＝2.10-2.14(m，4H，2CH2)，3.87(t，4H，2CH2)，4.00(t，4H，2CH2)，4.04-4.06(m，4H，2CH2)ppm； 13C NMR(CDCl3)δ＝25.80，51.75，55.97，65.97，154.85ppm。
實施例2 稱作偶聯劑中的離去基團的各種化合物的化學合成 N-羥基二氫吲哚-2-酮(HOI)的制備 該合成是對現有技術[Kenneth H.Collins，J Amer.Chem.Soc，78，221-224(1956)]的修改和在以下方案6中說明。
方案6
2-硝基苯基乙酸(9克，50mmol)溶解在50％H2SO4(40ml)中并隨后在1小時內加入7克鋅粉。反應混合物在30-35攝氏度下攪拌3小時并將不可溶部分過濾掉。產物溶解在Na2CO3溶液中和用HCl再沉淀，過濾，干燥和從水中重結晶，得到淺黃色固體，產率20％(1.5克)。
m.p.198-199攝氏度； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝3.97(s，2H，CH2)，7.51-7.56(m，2H，ar)7.68(t，1H，ar)，8.04(d，1H，ar)，12.51(br，1H，OH)ppm。
3-羥基-2-甲基喹唑啉-4-酮(HOMQ)的制備 該合成是對已有技術[F.Gutierrez，C.Tedeschi，L.Maron，J-P.Daudey，R.Poteau，J.Azema，P.Tisnes，和C.Picard，DaIt.Trans.1334-1347(2004)]的修改和在以下方案7中說明。
方案7
將K2CO3(0.93克)慢慢加入o-芐基羥胺/HCl(2.16克，12.58mmol)在水(60ml)中的溶液。該混合物攪拌30分鐘并隨后向其中加入衣托酸酐(2克，12.3mmol)。反應混合物在室溫下在攪拌下保持24小時并隨后過濾。將固體在減壓下干燥并隨后從形式二氯甲烷-己烷中重結晶，得到淺棕色固體，產率89.7％(5.34克)。
m.p.105-106攝氏度； 1H NMR(CDCl3)δ＝5.02(s，2H，CH2)，6.58-6.62(m，1H，ar)，6.67-6.69(m，1H，ar)，7.1-7.25(m，3H，ar)，7.37-7.46(m，6H，ar，NH)，8.37-8.46(brs，1H，NH)ppm。
2-氨基-N-芐基氧基苯并酰胺(2克，8.25mmol)和乙酸酐(9.12ml，8.5mmol)的混合物在回流下加熱2小時。在冷卻之后，趁熱加入水(3.9ml)和活性炭并將混合物另外煮沸30分鐘，隨后濾過Celite墊。Celite墊用甲醇洗滌并將合并的濾液在減壓下蒸發。將殘余物使用(DCM-MeOH，9∶1)濾過硅膠，并隨后將溶劑在減壓下蒸發。粗殘余物在室溫下溶解在MeOH中并用(0.02克)Pd/C處理30分鐘，濾過Celite和洗滌與MeOH洗滌。將合并的MeOH在真空下蒸發，得到產物，產率48.1％。
m.p.161-162攝氏度； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝2.27(s，3H，CH3)，7.13(t，1H，ar)，7.61(t，1H，ar)，8.13(d，1H，ar)，8.73(d，1H，ar)，11.04(s，1H，OH)ppm。
相同化合物使用在乙酸中的乙酰氯-三乙胺制備如下。
在室溫下，2-氨基-N-羥基苯并酰胺(10mmole)懸浮在10mmol三乙胺中(放熱溶解)并隨后加入乙酸(10ml)，隨后加入乙酰氯(1ml)。反應混合物在室溫下攪拌1小時并隨后向其中加入20ml水。沉淀物通過過濾而收集，干燥得到純產物，產率78.5％。
3-羥基喹唑啉-4-酮(HOQ)的制備 該合成是對現有技術[Robert H.Clark和E.C.Wagner，J.Org.Chem.，1，55-67(1944)]的修改，和從2-氨基-N-羥基苯并酰胺的合成開始，如下方案8所示。
方案8
將Na2CO3(5.5克，0.55摩爾，1當量)加入羥胺鹽酸鹽(6.9g，0.1摩爾，1當量)在250ml水中的溶液。將衣托酸酐(8.15克，0.05摩爾)加入溶液，自發地啟動反應。反應混合物在室溫下放置過夜。將固體產物過濾和從水中在40攝氏度下重結晶，簡短地風干并在減壓下完全干燥(該化合物對潮濕空氣敏感)，得到產物，產率85.8％。
m.p 86攝氏度。
該步驟在合成3-羥基喹唑啉-4-酮(HOQ)時，通過兩種方法如下進行。
方法(A)1.52克(10mmol)異羥肟酸和4ml 98％甲酸的混合物在回流下加熱15分鐘，在加入10ml水之后，將整個混合物煮沸15分鐘和冷卻至室溫。沉淀物通過過濾而收集和用冷水(2x5ml)洗滌，干燥得到0.35克(22％產率)黃白色固體。
m.p.212-21A攝氏度(分解)； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝7.54(td，1H，ar)，7.71(dd，1H，ar)，7.82(td，1H，ar)，8.17(dd，1H，ar)，8.53(s，1H，ar)，11.92(br，1H，OH)ppm。
方法(B)8mmol異羥肟酸溶解在包含8mmol NaOH的20ml MeOH中，并將溶液在室溫下攪拌30分鐘。將溶劑蒸發至無水并將殘余固體溶解在8ml 98％甲酸中。反應混合物回流30分鐘并隨后冷卻至室溫。用水(20ml)稀釋，得到黃白色固體，過濾，干燥并隨后從水中重結晶，得到淺棕色固體0.59克(37％產率)。
m.p.270-272攝氏度(分解)； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝7.54(td，1H，ar)，7.71(dd，1H，ar)，7.82(td，1H，ar)，8.17(dd，1H，ar)，8.53(s，1H，ar)，11.92(br，1H，OH)ppm。
6-氯-3-羥基喹唑啉-4-酮(6-Cl-HOQ)的制備 化合物根據上述的方法(B)制備，如下方案9所示。
方案9
所得產物是0.71克(36.6％產率，來自10mmol反應)，淺棕色固體。
m.p.268-269攝氏度； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝7.74(d，1H)，7.85(dd，1H)，8.09(d，1H)，8.56(s，1H)，12.02(s，1H，OH，可與D2O交換)。
6-氯-3-羥基2-甲基喹唑啉-4-酮(6-Cl-HOMQ)的制備 6-氯-3-羥基2-甲基喹唑啉-4-酮(6-Cl-HOMQ)的合成在以下方案10中說明。
方案10
在室溫下將2-氨基-5-氯-N-羥基苯并酰胺(186克，10mmole)懸浮在三乙胺(1.3ml，10mmole)中并隨后加入乙酸(10ml)，然后加入乙酰氯(1ml)。反應混合物在室溫下攪拌1小時并隨后向其中加入20ml水。沉淀物通過過濾而收集，用冷水洗滌，干燥得到1.69克純產物，產率80.3％。
m.p.183-185攝氏度； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝2.11(s，3H，CH3)，7.63(dd，1H)，7.87(d，1H)，8.45(d，1H)，10.93(s，1H，OH)ppm。
N-羥基-2-苯基苯并咪唑(HOPBI)的制備 N-羥基-2-苯基苯并咪唑(HOPBI)的合成在以下方案11中說明 方案11
方法(A)由現有技術[N.D.Kokare，R.R.Nagwade，V.P.Rane，D.B.Shinde，合成，766-772(2007)]修改，進行如下。將懸浮在干THF(30ml)和2-硝基苯胺(2.68克，20mmol)中的NaH(48mmol，3.25克，60％，分散在礦物油中，在使用之前用干THF洗滌三次)在冷卻下分批加入。在15分鐘之后，慢慢加入芐基溴(5.8克，50mmol)并將反應混合物在80攝氏度下加熱4小時。反應混合物冷卻至室溫，用水(25ml)淬滅和提取到乙酸乙酯(2x15ml)中。將有機層干燥(Na2SO4)和在真空下濃縮。產物通過用己烷研磨和過濾而分離，得到黃白色固體，產率87.2％(5.1克)。NMR顯示一些痕量的起始原料(約12-15％)，和需要進一步重結晶或通過柱而純化。
1H NMR(CDCl3)δ＝5.10(s，2H)，7.20-7.40(m，5H)，7.60-7.80(m，5H)，7.8(d，2H)，8.20(d，2H)ppm。
方法(B)由現有技術[J.M.Gardiner，C.R.Loyns，C.H.Schwallabe，G.C.Barrett，P.R.Lowe，四面體，51，4101-4110(1995)]修改，進行如下。O-硝基苯胺(14.5mmol)溶解在干THF(100ml)中，和在環境溫度下加入NaH(60％在油，1.45mmol)。慢慢加入芐基溴(14.5mmol)，并將反應回流4小時。反應冷卻至環境溫度，和進一步慢慢加入14.5mmol NaH，將反應加熱另外4小時，和加入第二部分的芐基溴(14.5mmol)。在另外4小時之后，將反應再次冷卻至環境溫度，加入第三部分的NaH(14.5mmol)并將反應加熱另外4小時(NaH必須在使用之前用THF洗滌三次)。將反應冷卻和用NaCl溶液淬滅，用DCM(3X100ml)提取。將有機提取物合并，用飽和NaCl溶液(100ml)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并將溶劑在真空下去除。粗固體產物用己烷研磨三次(3X100ml)，得到白色固體，產率88.4％。
粗品(5.3克，0.17mol)溶解在MeOH(50ml)中，加入Pd/C(10％，500mg)并將反應混合物在H2氣氛下在室溫下攪拌15-30分鐘(TLC，AcOEt，己烷1∶1)。將反應混合物濾過高流動Celite并將濾液濃縮和通過柱色譜(MeOH-CHCl3，1∶9)純化，得到N-羥基化合物作為白色固體，產率75.9％(2.75克)。
1H NMR(DMSO-d6)δ＝7.23-7.46(m，2H)，7.61-7.83(m，5H，Ph)，8.22(d，2H)，12.22(s，1H，OH)ppm。
o-氯-N-羥基-1-苯基苯并咪唑(6-Cl-HOPBI)的制備 6-氯-N-羥基-2-苯基苯并咪唑(6-Cl-HOPBI)如下方案12所述而制備。
方案12
產物使用方法(B)得到，淺棕色晶體4.22克，來自20mmol(65.8％產率)。
m.p.123-124攝氏度； 1H NMR(CDCl3)δ＝5.03(s，2H，CH2)，7.19-7.38(m，7H)，7.51(t，3H)，7.68(d，1H)，8.13-8.16(m，2H)。
OBn衍生物(3.345克，10mmol)溶解在10ml MeOH和10ml THF中。然后加入Pd/C(10％，500mg)并將反應混合物在H2氣氛下在室溫下攪拌15-30分鐘(TLC，AcOEt，己烷1∶1)。反應混合物濾過高流動Celite并將濾液濃縮和用醚(2x10ml)洗滌而純化，得到純產物作為米白色固體，產率73％(1.78克)。
m.p.262-264攝氏度； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝7.25(dd，1H)，7.53-7.57(m，4H，Ph)，7.68(d，1H)，8.20-8.25(m，2H)，12.19(s，1H，OH)ppm。
13C NMR(DMSOd6)δ＝123.72，125.90，130.35，131.35，132.36，133.87，134.88，135.58，136.35，147.34，148.17，159.99，165.26ppm。
2-甲基-3H-咪唑[4，5-b]吡啶-3-醇(HOMPI)的制備 2-甲基-3H-咪唑[4，5-b]吡啶-3-醇(HOMPI)如下方案13所述而制備。
方案13
8-硝基-[1，2，4]三唑[1，5-a]吡啶根據公開步驟[CharlotteK.Lowe-Ma，Robin A.Nissan，William S.Wilson，J Org.Chem.，55，3755-3761(1990)]制備如下。2-氯-3-硝基吡啶(4克，25.6mmol)和疊氮化鈉(4克，61.6mmol)在環境溫度下溶解在10％含水乙醇(400ml)中，和加入10％HCl(40ml)。溶液隨后在回流下加熱48小時。蒸發至無水，加入水(80ml)和過濾，得到固體殘余物，從乙醇中重結晶，得到淺棕色晶體2.4g(74.1％產率)。
m.p.176-178攝氏度； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝7.65(t，1H)，8.88(d，1H)，9.76(d，1H)ppm。
[1，2，5]-噁二唑[3，4-b]吡啶1-氧化物制備如下。8-硝基-[1，2，4]三唑[1，5-a]吡啶(1克，6mmol)溶解在甲苯(100ml)中和在回流下加熱4小時。將溶液用活性炭脫色和過濾，蒸發至無水，得到淺黃色固體，從環己烷中重結晶，得到黃色晶體，產率62.4％(0.52克)。
m.p.54-56攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝7.47(dd，1H)，8.25(dd，1H)，8.65(dd，1H)ppm。
3-羥基-2-甲基-3H-咪唑[4，5，b]吡啶1-氧化物根據公開步驟[M.Boiani，L.Boiani，A.Denicola，S.Torres de Ortiz，E.Serna，N.VeradeBilbao，L.Sanabria，G.Yaluff，H.Nakayama，A.Rojasde Arias，C.Vega，M.Rolan，A.Gomez-Barrie，H.Cerecette，M.Gonzalez，J.Med.Chem.，49，3215-3224(2006)]制備如下。
[1，2，5]噁二唑[3，4-b]吡啶1-氧化物(3mmol)和硝基乙烷(3mmol)溶解在5ml THF中。滴加哌啶(3mmol)(放熱反應)。在完全加入加入之后，將反應混合物在室溫下放置12小時。過濾得到棕色沉淀物，從DCM-己烷中重結晶。
羥基碳亞氨基二氰化物的鉀鹽的制備 合成根據公開步驟[Mitsuru Kitamura，Shunsuke Chiba，KoichiNarasaka，Bull.Chem.Soc.Jpn，76，1063-1070(2003)]制備，如下方案14所示。
方案14
亞硝酸鈉(14.2克，206mmol)在0攝氏度在下20-30分鐘內慢慢加入丙二腈(9.06克，138mmol)在乙酸(20ml)和水(50ml)中的溶液并隨后將混合物在相同溫度下攪拌45分鐘。在將反應用2N HCl(100ml)淬滅之后，反應用醚(3x100ml)提取三次。將提取物在無水Na2SO4上干燥，并將醚在真空下去除，得到油狀殘余物。將油狀產物慢慢加入KOH(8.0克)在MeOH(100ml)中的冷溶液，并隨后將反應混合物在0攝氏度下攪拌20分鐘。加入過量醚，得到罐鹽作為黃色晶體，產率77.5％(14.1克)。
2-(羥基亞氨基)丙二酸二乙酯的鉀鹽的制備 2-(羥基亞氨基)丙二酸二乙酯的鉀鹽根據公開步驟[KennethN.F.Shaw和Chis Nolan，J Org.Chem.，22，1668-1670(1957)]制備，如下方案15所示。
方案15
16克(0.1摩爾)丙二酸二乙酯在17.5ml(0.3摩爾)冰乙酸中的溶液在0-5攝氏度下劇烈攪拌，同時將20.7克NaNO2(0.3摩爾)在250ml水中的溶液在3-4小時過程中滴加。去除冰浴并將混合物劇烈攪拌另外20小時。硝化反應在具有合適的接頭和用于氮氧化物脫逸的小排氣口的三頸燒瓶中進行。反應混合物用400ml并隨后用三次100ml部分的DCM提取。將合并的DCM提取物在無水Na2SO4上干燥。DCM在真空下去除并將所得油狀產物溶解在400ml DCM中，用無水K2CO3(32克)攪拌15分鐘和過濾，并將DCM濃縮至200ml。然后加入醚直至溶液變渾濁，并隨后在冷凍機中保持過夜，得到米白色晶體，產率63.4％。
m.p.116-118攝氏度； 1H NMR(CDCl3)δ＝1.24-1.29(q，6H，2CH3)，4.20-4.29(m，4H，2CH2)ppm。
2-吡啶基羥基亞氨基乙腈的制備 2-吡啶基羥基亞氨基乙腈根據公開步驟[Jan Izdebski，PolishJ.Chem.，53，1049-1057(1979)]制備，如下方案16所示。
方案16
將亞硝酸鈉(4.5克，0.065摩爾，在5ml水中)的溶液慢慢加入2.2克(0.019摩爾)2-吡啶基乙腈在4.5ml冰乙酸中的溶液。在12小時放置之后，將沉淀物過濾，用水洗滌，干燥并隨后從乙醇中重結晶，得到產物，產率65％。
m.p 220-222攝氏度； 1H NMR(DMSO-d6)δ＝7.45-7.52(IH)，7.87-7.90(2H)，8.67(d，1H)，14.12(OH)ppm。
實施例3 各種脲/亞銨型偶聯劑的化學合成 1-((二甲基亞氨基)(嗎啉)甲基)3-H-苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇鹽六氟磷酸鹽(HDMB)的制備
在0攝氏度下將4-((二甲基氨基)氯亞甲基)嗎啉-4-亞銨六氟磷酸鹽(6.45克)加入HOBt(20mmol，2.7克)和三乙胺(20mmol，2.8克)在DCM(50ml)中的溶液。反應混合物在該溫度下攪拌和暖至室溫過夜。將所得白色沉淀物過濾，用冷DCM洗滌，和從乙腈-醚中重結晶，得到白色晶體，88.27％產率(7.54克)。
m.p.196-197攝氏度(分解)； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.22(s，3H，CH3)，3.51(s，3H，CH3)，3.66-3.88(m，4H，2CH2)，4.03-4.06(m，4H，2CH2)，7.65-7.96(dt，1H，ar)，7.86-7.92(dm，2H，ar )，7.98.7.99(dd，1H，ar)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝41.76，42.23，50.81，51.51，66.19，66.41，109.99，114.56，127.52，133.54ppm。MS(MALDI，ACH基質)m/z＝421.23 圖1給出HDMB了的X-射線晶體結構顯示其N-形式的偶聯劑，而非O-形式，這意味著，苯并三唑部分通過一個三唑氮原子而不是通過氧原子(在已知的偶聯劑，HBTU的情況下)直接連接到亞銨部分上。
1-((二甲基亞氨基)(嗎啉代)甲基)3-H-6-氯苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇鹽六氟磷酸鹽(6-Cl-HDMB)的制備
6-Cl-HDMB是根據上述用于制備HDMB的方法，使用6-Cl-HOBt而非HOBt制備。產物在93.5％產率下得到。
m.p.193-194攝氏度(分解)； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.31(s，3H，CH3)，3.69(s，3H，CH3)，3.94-3.951(m，4H，2CH2)，4.12-4.14(m，4H，2CH2)，7.96-8.03(qd，2H，ar)，8.12-8.13(dd，1H，ar)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝41.78，42.30，50.84，51.58，66.21，66.39，115.77，116.18，132.85，133.93，150.49ppm。
1-((二甲基亞氨基)(嗎啉代)甲基)3-H-[1，2，3]三唑[4，5-b]吡啶-1-3-醇鹽六氟磷酸鹽(HDMA)的制備
HDMA根據上述用于制備HDMB的方法，使用HOAt而非HOBt制備。白色固體從乙腈-醚中重結晶，得到白色晶體，91％產率。
m.p.194-195攝氏度(分解)； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.27(s，3H，CH3)，3.64(s，3H，CH3)，3.85-3.89(m，4H，2CH2)，4.00-4.07(m，4H，2CH2)，7.93-7.96(dd，1H，ar)，8.44-8.47(dd，1H，ar)，8.76-8.77(dd，1H，ar)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝41.74，42.35，50.82，51.58，66.19，66.42，124.37，127.84，149.65ppm；MS(MALDI，ACH基質)m/z＝422.2。
1-((二甲基亞氨基)(嗎啉代)甲基)3-H-[1，2，3]三唑[2，3-b]吡啶-1-鎓-3-醇鹽六氟磷酸鹽(4-HDMA)的制備
4-HDMA根據上述用于制備HDMB的方法，使用4-HOAt而非HOBt制備。白色固體從乙腈-醚中重結晶，得到淺黃色固體，產率88.9％(7.5克)， m.p.208-210攝氏度(分解)； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.30(s，3H，CH3)，3.71(s，3H，CH3)，3.75-4.02(m，4H，2CH2)，4.11-4.16(m，4H，2CH2)，7.86-7.89(dd，1H，ar)，8.58-8.61(dd，1H，ar)，9.09-9.11(dd，1H，ar)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝42.09，42.52，50.66，51.78，66.14，123.25，126.34，155.36ppm。
1-((二甲基亞氨基)(嗎啉代)甲基)3-H-6-三氟甲基苯并[1，2，3]三唑-1-鎓-3-醇鹽六氟磷酸鹽(6-CF3HDMB或6-HDMFB)的制備
6-CF3HDMB根據上述用于制備HDMB的方法，使用6-CF3-HOBt而非HOBt制備。產物在81.5％產率下得到。
m.p.194-195攝氏度； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.34(s，3H，CH3)，3.72(s，3H，CH3)，3.95-3.961(m，4H，2CH2)，4.08-4.15(m，4H，2CH2)，8.24-8.27(qd，2H，ar)，8.43(t，1H，ar)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝41.84，42.42，50.88，51.66，66.21，66.35，114.45，116.35，129.9，150.47ppm。
1-((二甲基氨基)(嗎啉代))吡咯烷-2，5-二酮亞甲基亞銨六氟磷酸鹽(HDMS)的制備
HDMS根據上述用于制備HDMB的方法，使用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)而非HOBt制備。白色固體從乙腈-醚中重結晶，得到產物，78％產率。
m.p.192-194攝氏度； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.03(s，4H，2CH2)，3.35(s，6H，2CH3)，3.82-3.85(m，8H，4CH2)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝25.88，49.42，65.78，161.5，170.16ppm。
1-((二甲基氨基)(嗎啉代))氧基五氟苯基亞甲基亞銨六氟磷酸鹽(HDMPfp)的制備
HDMPfp根據上述用于制備HDMB的方法，使用五氟苯酚(Pfp-OH)而非HOBt制備。產物在91％產率下得到。
m.p.202-203攝氏度； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.38(s，6H，CH3)，3.80-3.83(m，4H，CH2)，3.86-3.89(m，4H，2CH2)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝40.58，49.25，65.69，159.72ppm。
四甲基脲/亞銨型偶聯試劑的制備-一般步驟D 在0攝氏度下將如上在方案4中制備的氯亞銨鹽(20mmol)加入離去基團羥基-前體的鉀鹽(在方案17中表示為表示KOLi，20mmol)在乙腈(50ml)中的溶液。反應混合物在該溫度下攪拌30分鐘并在攪拌6小時的同時暖至室溫。將所得沉淀物過濾并用乙腈洗滌，將溶劑在減壓下濃縮至小體積(1/4)，并隨后加入干醚，得到產物，通常為純態的白色固體。
方案17
1，1，3，3-四甲基-2-(2-氧代吡啶-1(2H)-基)異脲六氟磷酸鹽(HTOP)的制備
1，1，3，3-四甲基-2-(2-氧代吡啶-1(2H)-基)異脲六氟磷酸鹽(HTOP)根據一般步驟D制備，和得到白色固體，產率85.6％(6.08克)。
m.p.204-205攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.12(s，12H，4CH3)，6.49(d，1H)，6.74(dd，1H)，7.63(td，1H)，8.42(dd，1H)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝40.76，107.11，122.05，135.98，142.14，156.66，162.22ppm。
O-[氰基(乙氧基羰基)甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HTOCC)的制備
O-[氰基(乙氧基羰基)甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽根據一般步驟D制備，和得到白色固體，產率82.1％(6.32克)， m.p.135-137攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝1.37(1，3H，CH3)，3.37(s，12H，4CH3)，4.82(q，2H，CH2)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝13.46，40.71，64.56，106.78，135.09，156.11，161.43ppm。
O-[(二氰基甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HTODC)的制備
O-[(二氰基甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HTODC)根據一般步驟D制備，和得到白色固體，產率74.0％(5.0克)。
m.p.180-181攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.27(s，12H，4CH3)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝40.80，105.10，108.21，119.65，160.67ppm。
O-[(二乙氧基羰基甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HTODeC)的制備
O-[(二乙氧基羰基甲叉基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HTODeC)根據一般步驟D制備，和得到淺黃色油，產率84.5％。
1H NMR(CDCl3)δ＝1.35(t，6H，2CH3)，3.18(s，12H，4CH3)，4.39-4.48(q，4H，2CH2)ppm。
二甲基嗎啉代脲/亞銨型偶聯試劑的制備-一般步驟E 一系列二甲基嗎啉代脲/亞銨型偶聯試劑的制備如下方案18所示而進行。
方案18
1-(N-甲基-N-嗎啉代亞甲基)-(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基1)甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMOP)的制備
1-(N-甲基-N-嗎啉代亞甲基)-(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基1)甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMOP)根據一般步驟E制備，和的白色固體，產率78.1％(6.2克)。
1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.21(s，6H，2CH3)，3.51(brs，4H，2CH2)，3.61-3.64(m，4H，2CH2)，6.44(td，1H)，6.71(dd，1H)，7.58(td，1H)，8.13(dd，1H)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝49.33，65.47，106.98，122.22，134.98，141.73，156.94，162.06ppm。
1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMOCC)的制備
1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基1氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMOCC)根據一般步驟E制備，和得到白色晶體，產率88.8％(7.6克)。
m.p.143-144攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝1.38(t，3H，CH3)，3.41(s，6H，2CH3)，3.82(t，4H，2CH2)，3.89(t，4H，2CH2)，4.48(q，2H，CH2)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝13.48，40.70，49.94，64.59，66.04，106.76，135.03，156.14，160.61ppm。
1-[(1-(二氰基亞甲基氨基氧基)-二甲基氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMODC)的制備
1-[(1-(二氰基亞甲基氨基氧基)-二甲基氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMODC)根據一般步驟E制備，和得到白色固體，產率74.8％(5.7克)， m.p.118-119℃； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.42(s，6H，2CH3)，3.80-3.88(m，8H，4CH2)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝40.97，49.93，65.92，105.13，108.15，119.84，159.77ppm。
1-[(1，3-二乙氧基-1，3-二氧代丙烷-2-叉基氨基氧基)-二甲基氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMODeC)的制備
1-[(1，3-二乙氧基-1，3-二氧代丙烷-2-叉基氨基氧基)-二甲基氨基-嗎啉代亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMODeC)根據一般步驟E制備，和得到淺黃色油，產率84.3％。
1H NMR(CDCl3)δ＝1.35(t，6H，2CH3)，3.21(s，6H，2CH3)，3.35(t，2H，CH2)，3.61(t，2H，CH2)，3.78(t，2H，CH2)，3.87(t，2H，CH2)，4.37-4.50(q，4H，2CH2)ppm。
二甲基吡啶基脲/亞銨型偶聯試劑的制備-一般步驟F 一系列二甲基吡啶基脲/亞銨型偶聯試劑的制備如下方案19所示使用與以上方案17和方案18所示相同種類的離去基團部分(OL1)進行。
方案19
6-氯-1-((二甲基氨基)(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸鹽(6-Cl-HDmPyB)的制備
6-氯-1-((二甲基氨基)(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸鹽(6-Cl-HDmPyB)根據一般步驟F制備，和得到白色固體，產率88.6％(7.8克)。
m.p.192-193攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝1.98(bs，3H，CH3)，2.14(brs，3H，CH3)，2.70(t，4H，2CH2)，4.10(t，4H，2CH2)，7.83-7.84(m，2H，ar)，7.99(q，1H，ar)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝24.52，26.02，41.60，52.83，115.76，132.50，132.59，134.06，137.34，148.32ppm。
1-((二甲基氨基)(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽(HDmPyOP)的制備
1-((二甲基氨基)(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽(HDmPyOP)根據一般步驟F制備，和得到白色固體，產率6.6g(86.7％)。
m.p.146-147攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝1.98-2.15(m，4H，2CH2)，3.06(s，6H，2CH3)，3.71-3.8O(m，4H，2CH2)，6.41(td，1H)，6.73(dd，1H)，7.50(td，1H)，7.94(dd，1H)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝25.16，39.77，51.25，106.70，122.04，135.40，156.73，159.84ppm。
1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吡咯烷亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDmPyOCC)的制備
1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吡咯烷亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDmPyOCC)根據一般步驟F制備，和得到白色固體，產率82.7％(6.8克)。
m.p.126-127攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝1.37(t，3H，CH3)，2.10，2.13(m，4H，2CH2)，3.36(s，6H，2CH3)，3.95-3.99(m，4H，2CH2)，4.48(q，2H，CH2)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝13.47，25.09，40.40，51.58，64.52，106.74，134.82，156.12，158.66ppm。
1-[(1-(二氰基甲叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吡咯烷亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDmPyODC)的制備
1-[(1-(二氰基甲叉基氨基氧基)-二甲基氨基-吡咯烷亞甲基)]甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDmPyODC)根據一般步驟F制備，和得到淺黃色固體，產率74％(5.4克)， m.p.146-147攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝1.97-2.00(m，4H，2CH2)，3.28(s，6H，2CH3)，3.96-4.04(m，4H，2CH2)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝25.07，40.41，51.77，105.06，108.23，119.30，157.86ppm。
吡咯烷嗎啉代脲/亞銨型偶聯試劑的制備-一般步驟G 一系列二甲基吡啶基脲/亞銨型偶聯試劑的制備如下方案20所示使用與以上方案18所示相同種類的離去基團部分(OL1)進行。
方案20
1-(嗎啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸鹽(HMPyB)的制備
1-(嗎啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-7H-苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸鹽(HMPyB)根據一般步驟G制備，和得到白色固體，產率82.8％(7.4克)。
mp 203-204攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝2.12-2.15(m，2H，CH2)，2.16-2.29(m，2H，CH2)，3.42-3.58(m，2H，CH2)，3.80-4.26(m，1OH，5CH2)，7.75(td，1H)，7.97-8.02(m，2H)，8.07(d，1H)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝25.09，41.76，42.23，50.81，51.51，66.19，66.41，109.99，114.56，127.52，143.54ppm。
1-(嗎啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H-[1，2，3]三唑[4，5-I]吡啶3-氧化物六氟磷酸鹽(HMPyA)的制備
1-(嗎啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-7H-[1，2，3]三唑[4，5-I]吡啶3-氧化物六氟磷酸鹽(HMPyA)根據一般步驟G制備，和得到白色固體，產率81.3％(7.3克)。
mp 206-208攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝2.11-2.15(m，2H，CH2)，2.18-2.30(m，2H，CH2)，3.48-3.63(m，2H，CH2)，3.79-4.16(m，1OH，5CH2)，8.02(dd，1H)，8.53(dd，1H)，8.85(dd，1H)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝25.09，41.74，42.35，50.82，51.58，66.19，66.42，124.37，127.84，149.65ppm。
5-氯-1-(嗎啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸鹽(6-HMPyCB)的制備
5-氯-1-(嗎啉代(吡咯烷鎓-1-叉基)甲基)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑3-氧化物六氟磷酸鹽(6-荕PyCB)根據一般步驟G制備，和得到白色固體，產率82.7％(7.96克)。
m.p.217-218攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝2.10-2.15(m，2H，CH2)，2.19-2.29(m，2H，CH2)，3.45-3.65(m，2H，CH2)，3.81-4.09(m，1OH，5CH2)，7.99(d，1H)，8.02(d，1H)，8.12(dd，1H)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝25.93，52.89，53.36，66.09，66.42，115.79，115.84，132.57，132.62，134.06，134.12，147.38ppm。
1-(嗎啉代(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽(HMPyOP)的制備
1-(嗎啉代(2-氧代吡啶-1(2H)-基氧基)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽(HMPyOP)根據一般步驟G制備，和得到白色固體，產率70％(5.9克)。
m.p.145-146攝氏度(分解)； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝2.05-2.13(m，4H，2CH2)，3.54(t，4H，2CH2)，3.65(t，4H，2CH2)，3.94-3.98(m，4H，2CH2)，6.85(dd，1H)，7.72(td，1H)，8.21(dd，1H)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝25.16，39.77，51.25，52.87，106.70，122.04，135.44，156.76，159.94ppm。
1-((1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)(嗎啉代)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽(HMPyOCC)的制備
1-((1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙叉基氨基氧基)(嗎啉代)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽(HMPyOCC)根據一般步驟G制備，和得到白色固體，產率90.3％(8.2克)，mp 171-172攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝1.26(t，3H，CH3)，1.98-2.02(m，4H，2CH2)，3.65-3.68(m，4H，2CH2)，3.74-3.76(m，4H，2CH2)，3.84-3.87(m，4H，2CH2)，4.37-4.40(q，2H，CH2)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝13.49，25.09，49.20，51.57，55.98，51.76，64.54，66.06，106.69，134.63，156.11，157.88ppm。
1-((二氰基亞甲基氨基氧基)(嗎啉代)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽(HMPyODC)的制備
1-((二氰基亞甲基氨基氧基)(嗎啉代)亞甲基)吡咯烷鎓六氟磷酸鹽(HMPyODC)根據一般步驟G制備，和得到淺黃色固體，產率78.6％(6.4克)。
m.p.158-159攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝2.11-2.14(m，4H，2CH2)，3.79.3.85(m，4H，2CH2)，3.86-3.88(m，4H，2CH2)，3.98-4.01(m，4H，2CH2)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝25.28，49.15，65.95，105.07，108.17，119.48，157.00ppm。
2-氰基-2-(二苯氧基磷酰基氧基亞氨基)乙酸乙酯的制備 2-氰基-2-(二苯氧基磷酰基氧基亞氨基)乙酸乙酯的制備根據公開步驟[F.Hoffmann，L.Jager，C.Criehl，磷，硫，和硅，178，299-309(2003)]修改和如下方案21所示而進行。
方案21
TEA(1.3ml，10mmol)在氬氣氛下加入氯磷酸二苯基酯(2.69克，10mmol)和相應添加劑(10mmol)在無水THF(50ml)中的溶液。在室溫下攪拌3小時之后，將反應混合物過濾并將溶劑在減壓下去除。所得油用n-戊烷洗滌和在真空下干燥。所得產物為油，產率64.5％(2.42克)。
1H NMR(CDCl3)δ＝1.41(t，3H，CH3)，4.47(q，2H，CH2)，7.22-7.44(m，1OH，2Ph)ppm。
含2-吡啶基乙腈肟的偶聯試劑的制備-一般步驟H 一系列含2-吡啶基乙腈肟的偶聯試劑的制備按照如下方案22所示而進行。
方案22
N-[(氰基(吡啶-2-基)亞甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亞甲基)-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HTOPC)的制備
N-[(氰基(吡啶-2-基)亞甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亞甲基)-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HTOPC)根據一般步驟H制備，和得到淺微紅色棕色固體，產率82.7％(6.2克)。
m.p.169-171攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.30(s，12H，4CH3)，7.57-7.61(m，1H)，7.94(td，1H)，8.10(dd，1H)，8.70(dd，1H)ppm。
13C NMR(丙酮-d6)δ＝40.48，107.56，122.52，127.87，138.18，142.46，146.67，150.68，162.03ppm。
N-[(氰基(吡啶-2-基)亞甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亞甲基)-N-嗎啉代甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMOPC)的制備
N-[(氰基(吡啶-2-基)亞甲基氨基氧基)(二甲基氨基)亞甲基)-N-嗎啉代甲酰胺鎓六氟磷酸鹽(HDMOPC)根據一般步驟H制備，和得到淺棕色固體，產率89.4％(7.74克)。
m.p.154-155攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.34(s，12H，4CH3)，3.79-3.83(m，8H，4CH2)7.58-7.62(m，1H)，7.96(td，1H)，8.12(dd，1H)，8.71(dd，1H)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝40.76，49.79，66.13，107.60，122.53，127.92，138.23，142.74，146.63，150.69，161.06ppm。
4-((二甲基氨基)氟亞甲基)嗎啉-4-亞銨六氟磷酸鹽(DFMH)的制備
DFMH通過將根據上述和用于制備DCMH的一般步驟C制備的4-((二甲基氨基)氯亞甲基)-嗎啉-4-亞銨六氟磷酸鹽(DCMH)用在乙腈中的KF處理而得到，90％產率。
m.p.92-93攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.31(d，6H，2CH3)，3.70-3.81(m，4H，2CH2)3.84-3.86(m，4H，2CH2)ppm； 13C NMR(丙酮-d6)δ＝39.15，48.11，65.57，157.09ppm。
4-(氯(嗎啉代)亞甲基)嗎啉-4-亞銨六氟磷酸鹽(CMMH)的制備
CMMH根據以上描述和用于制備DCMH的一般步驟C，使用二嗎啉代甲酮而得到，產率72.6％(白色晶體)。
m.p.136-137攝氏度； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝3.27(t，8H，4CH2)，3.68(t，8H，4CH2)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝47.44，66.60，163.99ppm。
4-(氟(嗎啉代)亞甲基)嗎啉-4-亞銨六氟磷酸鹽(FMMH)的制備
FMMH通過處理根據上述一般步驟C制備的4-(氯(嗎啉代)亞甲基)嗎啉-4-亞銨六氟磷酸鹽(CMMH)而得到，84％產率。
m.p.168-170攝氏度； 1H NMR(丙酮-d6)δ＝3.21-2.38(m，8H，4CH2)，3.61(t，8H，4CH2)ppm。
HDTMA的制備
在0攝氏度下將4-((二甲基氨基)氯亞甲基)硫代嗎啉-4-亞銨六氟磷酸鹽(20mmol)加入HOAt(20mmol，2.72克)，和三乙胺(20mmol)在DCM(50ml)中的溶液。反應混合物在0攝氏度下在N2下攪拌，和然后溫度暖至室溫過夜。將淺黃色固體過濾和用冷DCM洗滌和從乙腈-醚中重結晶，得到白色晶體，76％產率。
m.p.197-199攝氏度(分解)； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝2.76-2.77(m，1H，CH)，2.97-3.01(dt，1H，CH)，3.14-3.23(m，2H，CH2)，3.56(s，3H，CH3)，3.71(s，3H，CH3)，3.72-3.73(dt，1H，CH)，3.96-4.00(dt，1H，CH)，4.11-4.18(m，1H，CH)，4.39-4.458(dt，1H，CH)，8.00-8.03(dd，1H，ar)，8.47-8.50(dd，1H，ar)，8.84-8.85(dd，1H，ar)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝14.70，27.02，38.75，45.47，59.72，120.50，128.75，135.17，140.23，150.20ppm。
HDTMB的制備
HDTMB根據上述用于制備HDTMA的方法，但使用HOBt而非HOAt制備。白色晶體通過從乙腈-醚中重結晶而得到，80％產率。
m.p.190-191攝氏度(分解)； 1H NMR(CD3COCD3)δ＝2.67-2.70(m，1H，CH)，2.91-2.96(m，1H，CH)，2.97(s，3H，CH3)，3.33-3.48(m，5H，CH2，CH3)，3.65-3.69(m，1H，CH)，3.88-3.95m，1H，CH)，4.09-4.12(m，1H，CH)，8.00-8.03(dd，1H，ar)，7.68-7.72(td，1H，ar)，7.86-7.88(d，1H，ar)，7.93-7.97(d，1H，ar)，8.08(d，1H，ar)ppm； 13C NMR(CD3COCD3)δ＝14.70，27.28，40.61，40.82，42.82，43.09，52.94，53.17，115.44，116.46，127.94，133.60，150.79ppm。
實施例4 肽-偶聯劑的表征 氧對偶聯劑的溶解度的影響 各種已知的和新型肽-偶聯劑的最大溶解度在DMF中測試以評估其參與溶液-和固體-載體肽形成反應的能力。表4給出了測試的偶聯劑(已知的或新的)的名稱，其化學結構，每體積DMF的試劑質量和在DMF中的計算摩爾濃度。
表4

從表4可以看出，本文給出的質子受體亞銨型偶聯劑明顯比其碳衍生物相應物更可溶。
二肽Z-Phg-Pro-NH2的溶液合成 新型亞銨型肽-偶聯劑用于偶聯兩個氨基酸而不造成其外消旋的能力在溶液中測試。芐基氧基羰基(Z)-保護苯基甘氨酸(Z-Phg-OH)與H-Pro-NH2在DMF中在堿和偶聯劑的存在下溶液偶聯得到Z-Phg-Pro-NH2，這用于將新的和已知的肽-偶聯劑的分級，和測定Phg殘基外消旋的程度并用作分級標準。
表5給出了偶聯劑的名稱，用于反應的堿的種類和量，偶聯反應的產率和在DMF中形成Z-Phg-Pro-NH2(溶液相合成)時造成的外消旋。
表5




DIEA＝二異丙基乙胺；和TMP＝2，4，6-三甲基吡啶(可力丁)。
從表5可以看出，本文給出的新型質子受體亞銨型偶聯劑與其碳相應物衍生物相比造成較小的外消旋，同時在其肽鍵形成能力上更有效。例如，6-Cl-HOBt，6-CF3-HOBt，和HONCC的衍生物在減少外消旋方面比類似HOAt偶聯劑明顯更有效，在相同時間提供較好的產率。這些結果清楚地表明，本文給出的新型偶聯劑優于其目前已知的相應物。
以上表5中給出的結果強調了偶聯劑的亞銨部分中的質子受體的存在所造成的明顯影響，與類似已知的偶聯劑(其與新偶聯劑的差異僅在于結構特點)相比。因此，這些結果應該被認為比較了偶聯劑對，新試劑對已知的相應物 HDMA(新的)/HDTMA(新的)對HATU(已知的)； HDMB(新的)/HDTMB(新的)對HBTU(已知的)； 6-Cl-HDMB(新的)對6-Cl-HBTU(已知的)； DFMH(新的)對TFFH(已知的)；和 DCMH(新的)對TCFH(已知的)。
本文給出的偶聯劑的相比目前已知的偶聯劑的驚人益處通過分離和比較這些結果而表達。
表5A 表5A中的結果分離和比較了HDMB和HDTMB與HBTU，和HDMA和HDTMA與HATU，和清楚地表明，在使用二異丙基乙胺作為堿用于偶聯反應時，嗎啉(HDMB和HDMA)或硫代嗎啉基團(HDTMA和HDTMB)對二甲基團(HBTU和HATU)在外消旋抑制和產率方面的有益效果。
該效果在考慮偶聯劑DCMH和DFMH(新的)對TCFH和TFFH(已知的)時甚至更明顯。
表5B 表5B中給出的結果分離和比較了DCMH與TCFH，和DFMH與TFFH，和清楚地表明嗎啉(DCMH和DFMH)對二甲基(TCFH和TFFH)在外消旋抑制和產率方面的有益效果。
三肽Z-Phe-Val-Pro-NH2的溶液合成 新型亞銨型肽-偶聯劑用第三殘基延長二肽的能力在DMF中在Z-Phe-VaI-OH與H-PrO-NH2在堿存在下的溶液相偶聯反應中測試，該反應得到三肽Z-Phe-VaI-PrO-NH2。測定纈氨酸殘基的外消旋的程度和用作分級標準。
表6給出了偶聯劑的名稱，用于反應的堿的種類和量，偶聯反應的產率和在DMF中形成Z-Phe-Val-Pro-NH2(2+1)(溶液相合成)過程中造成的外消旋。
表6 DIEA＝二異丙基乙胺；和TMP＝2，4，6-三甲基吡啶(可力丁)。
從表6可以看出，本文給出的新型質子受體亞銨型偶聯劑與其碳相應物相比造成明顯較少的外消旋，同時至少在其肽鍵形成能力上有效。
本文給出的具有質子受體的偶聯劑相比不具有質子受體但其他方面相同的目前已知的偶聯劑的驚人益處通過分離和比較這些結果而帶來。
表6A 表6A中給出的結果分離和比較了HDMB與HBTU，和HDMA與HATU，和清楚地表明嗎啉基團(HDMB和HDMA)對二甲基團(HBTU和HATU)在外消旋抑制和產率上有益效果。可以看出，肟衍生物，HDMOCC在與HOBt衍生物相比時是有利的。
五肽H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2的合成 五肽H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2通過溶液相合成使用新型肽-偶聯劑HDMB和Boc-保護的氨基酸(除了最后一個，Fmoc-Tyr(OtBu)-OH)制備。在反應結束時，Fmoc-基團通過使用在乙腈中的30％二乙胺1小時去除并將而粗肽用TFA-DCM(1∶1)在室溫下處理2小時。
圖2給出了五肽Tyr-Gly-Gly-Phe-LeU-NH2所得的HPLC色譜圖。從圖2可以看出，優異產物純度的最終產物使用HDMB作為偶聯劑而得到。
Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-NH2在固相中的合成 挑戰性地將一個α-氨基異丁酸殘基與另一殘基偶聯(Aib-Aib)的肽Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-NH2在固相使用Fmoc保護氨基酸在堿DIEA(2當量)的存在下合成。不能形成Aib-Aib肽鍵的程度，即在五肽的固相組裝過程中(Tyr-Aib-Aib-Phe-LeU-NH2)五肽對(Tyr-Aib-Phe-Leu-NH2)四肽形成的比率用于評估偶聯劑的效力。
表7給出了偶聯劑的名稱，五肽占總粗品的百分數和四肽占總粗品的百分數。
表7 從表7可以看出，新型質子受體亞銨型偶聯劑明顯比其碳相應物更有效地用于包含挑戰性立體位阻偶聯反應的肽的固相合成。五肽產率一致性地高于使用已知的偶聯劑所得的。
酰基載體蛋白質(ACP)的(60-74)鏈段的15-聚體的合成 肽H-Glu-Lys-Ile-Thr-Thr-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-NH2(15-聚體肽)手工在Fmoc-Rink酰胺-AM-樹脂上使用Fmoc-保護氨基酸伸長。偶聯時間是30分鐘，過量試劑是3當量，和過量堿DIEA是6當量。
表8給出了通過反-相HPLC分析測定的所得肽的純度。
表8 從表8可以看出，新型質子受體亞銨型偶聯試劑在15-聚體肽的固相合成方面明顯優于其對應物。
盡管本發明已結合其特定實施方案描述，但本領域熟練技術人員顯然得出許多替代物，變型和變化。因此，所有這些變化，改變，和變型意味著落入所附權利要求的主旨和寬范圍內。
在本說明書中提及的所有出版物，專利和專利申請在此作為參考完全并入本發明，如同每一出版物，專利或專利申請被特定地和各個地指出要作為參考并入本發明。另外，對本申請中的任何參考文件的引用或確認不應理解為，這些參考文件被認為可用作本發明的已有技術。關于所使用的章節，它們不應被理解為必然性限定。
權利要求
1.一種具有選自以下的通式的偶聯劑
結構式I結構式II
其中
A是無機陰離子；
L是離去基團；
n是整數1至4，
每一R1，R2，R3，R4，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分別獨立地連接形成雜脂環族部分，前提是至少一個R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基和/或至少一個R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6連接形成雜脂環族部分。
2.權利要求1的偶聯劑，其中所述雜原子選自O，S，N，P和B。
3.權利要求1的偶聯劑，其中所述雜脂環族部分選自吡咯烷，哌啶，嗎啉，硫代嗎啉，咪唑烷，氮雜膦烷，氮雜磷烷，氮雜烴基硼烷，氮雜硼烷，氮雜膦烷，氮雜磷烷和哌嗪。
4.權利要求3的偶聯劑，其中所述雜脂環族部分是嗎啉。
5.權利要求1的偶聯劑，其中所述無機陰離子選自鹵化物，六鹵代磷酸鹽，六鹵代銻酸鹽，四鹵代硼酸鹽，三鹵代甲烷磺酸鹽和二(三鹵代甲基磺酰基)酰亞胺。
6.權利要求1的偶聯劑，其中所述無機陰離子是六氟磷酸鹽。
7.任一權利要求1-6的偶聯劑，其中所述離去基團選自鹵代，乙酸鹽，甲苯磺酸鹽，三氟磺酸鹽，磺酸鹽，疊氮化物，羥基，硫代羥基，烷氧基，氰酸鹽，硫氰酸鹽，硝基，氰基，苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亞胺，酮肟，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，咪唑，吲哚啉酮-1-氧基，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
8.權利要求7的偶聯劑，其中所述苯并三唑具有通式III
結構式III
其中
X是O或S；
Z1和Z2分別獨立地是CH或N；和
Z3是F，Cl，Br，CF3或NO2。
9.權利要求7的偶聯劑，其中所述苯并三嗪酮具有通式IV
式IV
其中X是O或S。
10.權利要求7的偶聯劑，其中所述琥珀酰亞胺具有通式V
結構式V
其中X是O或S。
11.權利要求7的偶聯劑，其中所述酮肟具有通式VI
結構式VI
其中
Z4和Z5分別獨立地選自F，Cl，Br，CORa，COORa，CONRa，CN，CF3或NO2；和
Ra是烷基。
12.權利要求7的偶聯劑，其中所述吡啶-2(1H)-酮-1-氧基具有通式VII
結構式VII
13.權利要求7的偶聯劑，其中所述喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基具有通式VIII
結構式VIII
其中
Z6和Z7分別獨立地選自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
14.權利要求7的偶聯劑，其中所述1H-苯并[d]咪唑-1-氧基具有通式IX
結構式IX
其中
Z1是CH或N；
Z8和Z9分別獨立地選自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
15.權利要求7的偶聯劑，其中所述吲哚啉酮-1-氧基具有通式X
結構式X
其中
Z10選自H，F，Cl，Br，CN，CF3，NO2，芳基或烷基。
16.權利要求8的偶聯劑，其中X是O或S；
Z1和Z2分別為CH；和Z3是Cl。
17.權利要求16的偶聯劑，其中X是O。
18.權利要求16的偶聯劑，其中X是O或S；
Z1和Z2分別為CH；和Z3是CF3或NO2。
19.權利要求18的偶聯劑，其中X是O；和
Z3是CF3或NO2。
20.權利要求11的偶聯劑，其中
Z4是COORa；Ra是乙基；和Z5是CN。
21.權利要求11的偶聯劑，其中Z4和Z5分別獨立地是COORa或CN；和Ra是甲基。
22.權利要求13的偶聯劑，其中Z6是CH3；和
Z7是Cl。
23.權利要求14的偶聯劑，其中Z1是CH；
Z6是苯基；和Z7是H或Cl。
24.權利要求14的偶聯劑，其中Z1是N；
Z6是甲基；和Z7是H。
25.一種選自以下的偶聯劑
26.一種制備權利要求1的偶聯劑的方法，該方法包括將具有選自以下的通式的化合物
結構式XI結構式XII
其中每一R1，R2，R3，R4，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或者，R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6分別獨立地連接形成雜脂環族部分，前提是至少一個R1，R2，R3，R4，R5和R6是被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基和/或至少一個R1和R2，和/或R3和R4，和/或R5和R6連接形成雜脂環族部分；和n是整數1至4；與
(i)鹵化劑；和
(ii)所述無機陰離子的飽和水溶液接觸；這樣得到權利要求1的偶聯劑，其中L是鹵代。
27.權利要求26的方法，進一步包括，在所述接觸之前將具有通式XIII的化合物
結構式XIII
其中每一R1和R2獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R1和R2連接形成雜脂環族部分；與具有通式XIV的化合物
結構式XIV
其中每一R3和R4獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R3和R4連接形成雜脂環族部分；在堿的存在下反應，這樣得到具有通式XI的化合物；或與具有通式XV的化合物
結構式XV
其中每一R3，R5和R6獨立地選自具有1-4個碳原子的烷基和被至少一個雜原子中斷，取代和/或封端的具有1-4個碳原子的烷基，或R5和R6連接形成雜脂環族部分；n是整數1至4；在堿的存在下反應，這樣得到具有通式XII的化合物。
28.權利要求26的方法，進一步包括將其中L是鹵代的所述偶聯劑與所述離去基團的前體化合物在三乙胺的存在下反應。
29.權利要求28的方法，其中所述離去基團選自乙酸鹽，甲苯磺酸鹽，三氟甲磺酸鹽，磺酸鹽，疊氮化物，羥基，硫代羥基，烷氧基，氰酸鹽，硫氰酸鹽，硝基，氰基，苯并三唑，苯并三嗪酮，琥珀酰亞胺，酮肟，吡啶-2(1H)-酮-1-氧基，喹唑啉-4(3H)-酮-3-氧基，1H-苯并[d]咪唑-1-氧基，咪唑，吲哚啉酮-1-氧基，五氟苯酚，五氟苯酚，五氟硫代苯酚，2-硝基苯酚和2-硝基苯硫醇。
30.一種合成肽的方法，該方法包括將多個氨基酸順序地，一個接一個地，在權利要求1的偶聯劑的存在下偶聯，這樣得到包含所述多個氨基酸的肽。
31.權利要求30的方法，其中每個偶聯步驟的外消旋比率是8％至0.3％。
32.權利要求30的方法，其中每個偶聯步驟的偶聯產率偶聯是80％至99％。
33.一種合成多核苷酸的方法，該方法包括
將多個核苷酸順序地，一個接一個地，在權利要求1的偶聯劑的存在下偶聯，這樣得到包含所述多個核苷酸的多核苷酸。
34.任一權利要求30或33的方法，通過固相合成而進行。
35.任一權利要求30或33的方法，通過溶液相合成而進行。
36.肽的粗組合物，所述肽在C-末端至N-末端方向上由多個氨基酸合成，所述組合物基本上由具有所需氨基酸順序的肽和具有非所需氨基酸順序且為所述所需氨基酸順序的所述肽的雜質的多個肽組成，其中具有所述所需氨基酸順序的所述肽在所述組合物中的濃度比具有所述所需氨基酸順序的相同肽在所述C-末端至N-末端方向上使用權利要求1的偶聯劑作為偶聯劑，在相同條件下合成的肽組合物中的濃度高至少5％。
37.權利要求36的肽的粗組合物，其形式選自粉狀組合物，凍干組合物，鍵接至固體載體上的組合物，增溶組合物和溶解組合物。
38.任一權利要求31-36的方法或組合物，其中至少一種所述氨基酸選自具有仲α胺的氨基酸，具有叔α胺的氨基酸，具有取代的α碳原子的氨基酸，具有取代的α胺的氨基酸，具有含氨基的側鏈的氨基酸，和其任何組合。
39.權利要求38的方法或組合物，其中所述α碳被烷基取代。
40.權利要求39的方法或組合物，其中具有取代的α碳原子的所述氨基酸是α-氨基異丁酸(Aib)。
41.權利要求38的方法或組合物，其中具有取代的α胺的所述氨基酸是苯基甘氨酸(Phg)。
42.權利要求38的方法或組合物，其中具有含氨基的側鏈的所述氨基酸是精氨酸。
全文摘要
公開了在其亞銨部分中包含質子受體的具有結構式I或II的新型亞銨型偶聯劑，它可有益地作為偶聯劑用于各種化學多肽和/或多核苷酸合成，和特別可作為產率增加性和外消旋抑制性偶聯劑用于肽合成。進一步公開了一種制備這些亞銨型偶聯劑的方法及其在制備多肽和/或多核苷酸中的應用。
文檔編號C07D213/89GK101784522SQ200880024762
公開日2010年7月21日 申請日期2008年5月15日 優先權日2007年5月16日
發明者F·艾貝里西奧, A·埃爾-法翰, Y·盧森堡, A·埃文森 申請人:盧森堡生物科技有限公司