一種cxc趨化因子受體4(cxcr4)拮抗多肽的制作方法

專利名稱：：一種cxc趨化因子受體4(cxcr4)拮抗多肽的制作方法一種CXC趨化因子受體4(CXCR4)拮抗多肽本發明的領域本發明涉及CXC趨化因子受體4(CXCR4)拮抗多肽(蛋白)，它能抑制CXCR4依賴型病毒，如HIV-1的感染，并且阻斷與CXCR4結合的CXCL12所介導的腫瘤細胞轉移人類循環抗病毒白蛋白片段(ALB408-423)及其治療和診斷用途。本發明包括天然存在形式的ALB408-423以及由它衍生的片段和/或類似物或衍生物，以及最終的含有所述天然，重組和合成肽的藥品，它被用于醫學指示，并被用作診斷劑。另外，本發明包括ALB408-423的修飾形式和衍生物，它具有特別有效的治療效果。另外，還包括能與ALB408-423雜交的核酸探針或它的片段之一和/或衍生物，和針對ALB408-423或它的片段之一和/或衍生物的抗體或拮抗劑，其用于診斷或治療目的，特別是用于治療HIV-1和HIV-2感染等病毒性疾病的治療目的，以及用于治療腫瘤病患，以便預防癌細胞轉移或用于治療慢性炎性疾病，如哮喘，肺纖維化或類風濕性關節炎等。本
背景技術：
：趨化因子受體是在某些細胞表面上表達的，它能與被稱為趨化因子的細胞因子相互作用。CXC趨化因子受體4(CXCR4)是G-蛋白結合受體，它能轉導它的內源配體，即趨化因子CXCL12(基質細胞衍生的因子-1，SDF-1)的信號。在CXCR4/CXCL12相互作用之后，啟動了細胞內鈣(Ca2+)離子流通。這導致了一些細胞響應，包括允許細胞在有機體內移動的趨化現象。CXCR4是在骨髓細胞，T-淋巴細胞，B-淋巴細胞，上皮細胞，內皮細胞和樹狀細胞上表達的。趨化因子CXCL12是唯一已知的CXCR4的剌激性配體。CXCL12和CXCR4之間的相互作用，在心血管，造血或中樞神經系統處于胚胎發育期間的祖細胞遷移方面起著關鍵作用。已知這種相互作用與若干疾病相關，如HIV感染/AIDS，癌細胞轉移，白血病細胞發展，肺纖維化和類風濕性關節炎等。該相互作用可能是上述所有疾病的關鍵治療目標。干擾CXCR4/CXCL12信號傳導的物質被認為具有藥物潛力，例如，用于HIV/AIDS治療，或預防和癌轉移相關的細胞轉移過程，白血病，以及炎性疾病，如肺纖維化，類風濕性關節炎或哮喘等(參見Tsutsumietal.，2007，P印tideScience88:279-289)。與CXCL12之類的i秀導細胞響應的受體剌激劑相反，受體拮抗劑是在與它們的受體結合之后不能誘導生物學響應，即細胞轉移或鈣離子信號傳導的配體或藥物。受體拮抗劑是業已在臨床上使用的有用藥物(例如，血管緊縮素拮抗劑，13-腎上腺素能拮抗劑，血清素拮抗劑或CCR5拮抗劑)，它能抑制HIV-1感染(CCR5拮抗劑)或減弱剌激劑介導的細胞響應。受體拮抗劑與所述受體的相互作用能抑制剌激劑的功能。大部分藥物拮抗劑是通過在受體的結構限定的結合位點上與內源配體或底物競爭實現它們的效力。業已在體外和體內證實，CXCR4拮抗劑能抑制癌細胞轉移，并因此抑制腫瘤轉移。CXCR4是在多種細胞(骨髓細胞，T-淋巴細胞，B-淋巴細胞，上皮細胞，內皮細胞和樹狀細胞)的表面上，以及在23種不同類型的癌細胞中表達的。CXCL12-CXCR4相互作用與若干種類型的癌的轉移相關，包括乳腺癌，腎癌，前列腺癌，肺癌和胰腺癌，以及黑素瘤，成神經細胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，多發性骨髓瘤，卵巢癌，和惡性腦瘤(參見Tsutsumietal.，2007，P印tideScience88:279-289)。業已證實，CXCR4拮抗劑，如T140類似物能抑制CXCL12誘導的胰腺細胞轉移和入侵或乳腺癌細胞轉移，在體外和體內試驗中都是如此(參見Tsutsumietal.，2007，P印tideScience88:279-289)。業已證實，CXCR4拮抗劑能在體外有效抑制小細胞肺癌(SCLC)的入侵和粘連(參見Tsuts咖ietal.，2007，P印tideScience88:279-289)，證實了CXCL12-CXCR4相互作用與SCLC轉移的相關性。CXCR4/CXCL12相互作用還與先兆-B(pre-B)急性成淋巴細胞白血病(ALL)和慢性淋巴細胞白血病(CLL)的發展相關。CXCR4拮抗劑還能減弱pre-BALL細胞的轉移(參見Tsutsumietal.，2007，P印tideScience88:279-289)。另外，業已證實，類風濕性關節炎是表達CXCR4的CD4+記憶T細胞在發炎的滑膜中積累導致的。CXCL12濃度在類風濕性關節炎患者的滑膜中大幅度提高，從而吸附記憶T細胞。CXCR4拮抗分子能阻止記憶T細胞向所述滑膜轉移(參見Tsuts咖ietal.，2007，P印tideScience88:279-289)。CXCR4拮抗劑不僅能抑制剌激劑CXCL12與CXCR4結合，而且還能抑制HIV糖蛋白gpl20與CXCR4的相互作用，從而抑制病毒感染。人類免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2)使用細胞表面表達的CD4作為主要受體，使用趨化因子受體CCR5或CXCR4作為細胞進入的輔助受體。通過CD4和CXCR4感染細胞的病毒被稱為嗜CXCR4(X4)病毒，HIV-1變體使用CD4和CCR5感染細胞稱為嗜R5病毒，而可使用這兩種輔助受體的病毒被稱為雙嗜性病毒。嗜X4的HIV-1變體僅出現在大約50%的AIDS患者體內，而嗜R5的HIV變體在HIV-1感染的早期階段和無癥狀階段占主導地位。業已證實，通過用AMD3100之類的CXCR4拮抗劑治療細胞或患者，能在體外以及HIV-1感染的人體內抑制嗜X4的HIV-1感染。值得注意的是，一種CCR5拮抗劑Maraviroc，是第一個臨床上批準的用于AIDS治療的藥物，它能抑制嗜R5的HIV-l變體感染(參見Tsibris禾口Kuritzkes，2007，AnnualReviewofMedicine58:445-459)。因此，趨化因子受體CXCR4是用于治療HIV/AIDS、癌相關的病理和慢性炎性疾病，如哮喘或肺纖維化等有吸引力的治療劑。抑制CXCL12介導的細胞響應的CXCR4拮抗劑能夠抑制疾病發生和發展的重要途徑。本發明概述本發明涉及具有以下氨基酸序列的肽Z「LVRYTKKVPQVSTPTL-Z2(ALB-408)及其生物學活性衍生物，特別是酰胺化，乙酰化，硫酸化，磷酸化和/或糖基化衍生物，以及通過多重合成獲得的具有ALB408-423的生物學活性的肽；其中，Z表示0-10個氨基酸殘基的數字。本發明還涉及本發明的如下所述的肽，特別是本發明的ALB408-423肽，其中，所述序列上的一個或若干個氨基酸殘基被交換，缺失或添加；或在本發明的肽，特別是ALB408-423的單一氨基酸上引入了化學修飾，它具有與本發明的肽，特別是ALB408-423相似或相同的生物學或藥理學活性。特別考慮的是，可以通過保守方式交換所述序列的氨基酸而方便地獲得的肽。就是說，用疏水性氨基酸交換疏水性氨基酸，或用芳族氨基酸交換其他芳族氨基酸或用堿性氨基酸交換其他堿性氨基酸等。這一點是技術人員所熟知的。另外，本發明肽的逆反(retro-inverso)肽也屬于本發明的范圍，還包括能穩定所述肽與肽酶結合的其他衍生物。所謂"衍生物"表示所有長度的片段，包括在N和C末端截短的片段，含有包括D-氨基酸殘基和修飾的氨基酸殘基在內的氨基酸殘基取代的ALB408-423，以及包含二硫鍵和在N和C末端延長的肽。本發明的另一個主題是編碼本發明的肽，特別是編碼ALB408-423和/或其衍生物的多核苷酸。本發明的多核苷酸的特征在于是由DNA，RNA，基因組DNA或PNA組成。編碼本發明肽的多核苷酸可用于在原核或真核細胞中的重組肽表達，誘變研究，克隆在感興趣的載體中，特別是可用于基因轉移目的。本發明的另一個主題是含有本發明多核苷酸的載體。編碼本發明肽的編碼多核苷酸序列的載體可用于在原核細胞或真核細胞中進行重組肽表達，誘變研究，特別是用于將ALB408-423基因轉移到真核細胞中。本發明的另一個主題是含有本發明載體的遺傳工程的宿主細胞。可以將能表達遺傳工程的ALB408-423或相關衍生物的轉基因細胞用于基因治療法，以便ALB408-423和相關的衍生物在需要CXCR4拮抗劑的個體，特別是癌癥和AIDS患者體內進行表達和分泌。本發明的另一個主題是針對本發明多肽的抗體。所述抗體可用于通過ELISA，RIA或免疫熒光法檢測身體樣品，如血液，血清，血漿中的ALB408-423及相關肽，以便用于診斷目的。本發明的肽可在需要以本發明的肽，特別是ALB408-423進行治療的患者的治療法中施用。本發明的另一個主題是對需要ALB408-423抑制作用的患者的治療方法，包括通過施用治療劑量的本發明的肽拮抗劑/抑制劑。ALB408-423及其衍生物是CXCR4拮抗劑，可以治療若干疾病，如HIV感染/AIDS，癌細胞轉移，白血病細胞發展，肺纖維化和類風濕性關節炎，以及其他癌癥和炎性疾病。本發明的另一個主題是由本發明的多肽組成的蓋侖(galenic)制劑。根據本發明，還提供了用于治療患者的方法，其中，所述多肽的治療作用效果是通過服用編碼本發明肽的DNA并在所述患者體內進行體內表達實現的。本發明的肽可以通過下述方法提供，該方法包括通過陽離子交換萃取法從血液濾液中萃取，然后洗脫吸附的物質，對含有所述肽的萃取物進行復原的陽離子交換層析，以及進行反相層析分餾。另外，本發明肽的生產方法可以通過Merrifie1d合成法進行固相合成，或通過本領域技術人員本身公知的方法進行液相合成，其中使用經保護的氨基酸，并純化。用于生產本發明的肽的另一種方法采用本領域技術人員公知的異源表達法，使用常見的生物技術載體。本發明的另一個主題是一種診斷劑，其含有本發明的多克隆或單克隆抗體或含有編碼本發明的肽，特別是ALB408-423的核酸或mRNA。本發明的診斷劑包括所述肽，或本發明的多核苷酸，用在檢測系統中，用于分析該物質在諸如組織，血漿，尿液和腦脊髓液的樣品中的含量。具體地講，所述診斷劑和檢測本發明的肽的檢測系統被用于分析該物質在組織，血漿，尿液和腦脊髓液中的含量，采用質譜法，如MALDI-MS或ESI-MS，并配合通過RP-HPLC，蛋白沉淀和/或固相萃取進行的樣品制備。本發明的另一個目的是一種診斷劑，它包括本發明的肽作為病毒類疾病，細菌和真菌感染，炎性和腫瘤進程的標識物，以及作為炎性進程，紊亂炎性反應，腫瘤疾病，生長失調，免疫系統疾病的標識物，以及作為骨病的標識物。本發明還提供含有本發明肽作為活性成分的蓋侖(galenic)型的藥品，用于口服，靜脈內，肌內，皮內，皮下，鞘內給藥，以及作為氣溶膠用于經肺給藥。本發明的肽，多核苷酸，抗體/拮抗劑，和galenic配方可用于治療病毒性疾病，特別是HIV-1，HIV-2，細胞巨化病毒，單純皰疹病毒(l型和2型)，水痘帶狀病毒，甲肝和乙肝病毒，流感病毒，脊髓灰質炎病毒，鼻病毒，風疹病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒，勞氏肉瘤病毒，愛波斯坦-巴爾病毒，以及用于治療細菌和真菌感染，炎性過程，紊亂的炎性反應，腫瘤疾病，生長疾病，神經元疾病，凝血和造血作用疾病，血管病，免疫系統疾病，和用于傷口和骨骼愈合。下面將以ALB408-423作為具體例子對本發明作更具體說明。可以理解為，在以下說明中，本發明的所有肽均可以取代ALB408-423。本發明的詳細說明圖1A-F表示從人類血液濾液中分離ALB408-423的細節。圖2表示含有能抑制HIV-1NL4-3感染的含級份31的ALB408-423。圖3表示化學合成能特異性抑制嗜X4的HIV-1感染的ALB408-423。圖4表示ALB408-423能抑制嗜X4的慢病毒感染。圖5表示ALB衍生物的抗病毒活性。圖6表示ALB衍生物的抗病毒活性。圖7表示ALB衍生物的抗病毒活性。圖8表示ALB衍生物的抗病毒活性。圖9表示ALB衍生物的細胞毒性分析。圖10表示ALB408-423和截短的ALB衍生物能特異性抑制嗜X4的HIV-1感染。圖11表示ALB408-423和衍生物能抑制外周血單核細胞(PBMC)的嗜X4的HIV-1感染。圖12表示ALB408-423能抑制CXCL12與CXCR4的結合。圖13表示ALB408-423不是CXCR4，CCR5或CXCR1剌激劑。圖14表示ALB408-423能特異性抑制CXCL12-引起的Ca2+在CXCR4表達細胞中的運動。圖15表示ALB408-423抑制CXCL12介導的CXCR4內在化。圖16表示ALB408-423以劑量依賴性方式抑制CXCL-12介導的JurkatT細胞轉移。圖17表示ALB衍生物的CXCR4拮抗活性。令人吃驚的是，ALB408-423可以采用層析法和生物學分析從人血液過濾液中分離。本發明的肽的生物化學表征是通過質譜分析進行的，包括氨基酸的全序列分析。所述肽具有下面的SeqIDNo8氨基酸序列LVRYTKKVPQVSTPTL本發明肽ALB408-423的分子量為1830.2Da本發明肽ALB408-423的等電點(pi)是10.3。令人吃驚的是，本發明的肽是包括已知的人類血漿蛋白血清白蛋白(保藏號No.NP000468)的16個氨基酸的片段，所述血清白蛋白其加工過的形式由585個氨基酸組成。人類白蛋白是可溶性的單體血清蛋白，分子量為大約65，000，它占總的血漿蛋白的一半以上(濃度3.5-5g/dl)。所披露的人類白蛋白其主要功能是作為所有類型的疏水和親水物質的載體分子，例如類固醇和肽激素，脂肪酸，維生素，藥物和陽離子。由于它具有很高的血清濃度，它對穩定血液PH，細胞外液體體積和維持膠體滲透壓起著實質作用。白蛋白具有通過大量二硫鍵穩定化的球狀結構，并且通常不被糖基化，不過，由于乙酰化，酶促糖基化和非酶促糖基化導致的變化經常在分子老化或病理生理學變化中發生。它是肝臟以前原白蛋白形式合成的，具有609個氨基酸；包括18個氨基酸的N-末端信號肽在進入內質網時進行細胞內裂解；另外6個氨基酸在包括585個氨基酸的成熟白蛋白由肝細胞分泌之前在高爾基體中被去掉。白蛋白的清除是通過腎臟，胃腸道，以及肝臟的組織細胞中進行的。本發明的ALB408-423肽序列的起始氨基酸是408號氨基酸，因此包括循環形式的白蛋白的408-423號氨基酸，它明顯是通過相應的蛋白酶對白蛋白前體進行天然加工產生的。令人吃驚的是，本發明的肽是CXC趨化因子受體4(CXCR4)的拮抗劑，并且導致HIV-1感染和在人體細胞中復制的抑制作用，以及抑制CXCL12/CXCR4誘導的細胞反應，如細胞遷移，Ca2+移動或CXCR4內在化。本發明的肽可以通過從人血液濾液(HF)中層析純化獲得。HF是在對腎病患者的血液進行超濾期間大量獲得的(例1)。HF包括在人類血液中循環的分子量低于30kDa的所有肽和蛋白。HF中的肽和蛋白采用陽離子交換層析萃取。層析柱上結合的肽和蛋白使用各種pH值的緩沖液系統洗脫，并且對洗脫液進行反相層析(例1)。為了鑒定抑制HIV-1感染的級份，將肽的各級份溶解在PBS中，并且添加到HIV允許的指示細胞中。然后用嗜CXCR4的HIV-1感染細胞，并且在感染之后(dpi)三天測定感染率(例1)。一個級份表現出潛在的抗HIV活性，并且對它進行更多輪次的層析純化和HIV抑制試驗，以便鑒定出生物學活性肽(例l)。在經過四輪純化之后，對活性級份31進行的質譜分析發現了分子量為1830Da的單肽(例2)。序列分析得出了LVRYTKKVPQVSTPTL的鑒定結果，序列比對發現與包括氨基酸殘基408-423(ALB408-423)的數量豐富的血清蛋白"人類血清白蛋白；(ALB)"具有100%同源性(例2)。活性的驗證得到了證實，因為化學合成的肽(例3)以劑量依賴方式抑制嗜X4的HIV-1感染(例4)。ALB408-423能特異性抑制嗜X4的HIV-1變體，但是在指示細胞中對嗜R5的HIV-1(例4和5)感染沒有作用。ALB408-423還能抑制嗜X4的HIV-2感染(例5)。從結構活性相關性研究(SAR)中獲得的用于鑒定有重要抗病毒活性的殘基的數據歸納在例6中，并且表明了ALB408-423的N末端完整性對于它的抗病毒活性來說很重要。相反，在C末端截短高達6個氨基酸殘基不會消除抗病毒活性。所述SAR研究還可以鑒定出ALB408-423衍生物，如ALB408-419或ALBL408I-419，與野生型ALB408-423相比，它們表現出更高的抗病毒活性(例6)。所述ALB衍生物無一是細胞毒性的(例7)。ALB408-423，ALB408-419和ALBL408I-419以劑量依賴方式抑制多種嗜X4的，但不是嗜R5的HIV-1變體在指示細胞(例8)或原代血單核細胞(例9)中的感染。上述所有數據表明了ALB408-423或其衍生物與HIV輔助受體CXCR4的特異性相互作用。采用基于熒光的技術，可以證實ALB408-423直接與CXCR4結合并且相互作用，由此阻止CXCL12(天然CXCR4剌激劑)的結合(例10-12)。單獨的ALB408-423或其衍生物不能通過CXCR4或其他趨化因子受體，如CCR5和CXCR1誘導Ca2+轉移，這表明根據其定義ALB408-423是CXCR4拮抗劑(例10-12和14)。在存在ALB408-423的情況下，能夠抑制CXCL12介導的細胞轉移(例13)和CXCR4受體內在化，這進一步提供了ALB408-423是CXCR4拮抗劑的證據(例12)。綜上所述，通過采用HIV-1感染抑制試驗篩選HF衍生的肽文庫鑒定出ALB408-423，一種人類血清白蛋白的片段。所述化學合成的肽及其衍生物通過與CXCR4受體直接相互作用，以劑量依賴方式抑制嗜X4的HIV-1和HIV-2感染。ALB408-423及其衍生物起著拮抗劑的作用，因為它們不能介導細胞反應并且抑制CXCL12(天然存在的CXCR4剌激劑)的活性。以上數據表明ALB408-423是第一種人類CXCR4拮抗劑。ALB408-423及其衍生物可用于治療受嗜X4的HIV-1感染的個體，避免癌轉移，并且干擾慢性炎性疾病，其中，這些病與CXCR4/CXCL12信號傳導相關，并且通過CXCR4抑制CXCL12介導的信號傳導。本發明的肽和類似物，所述肽的片段和衍生物，它的cDNA，它的基因和可能中和ALB408-423活性的抗體可以被用作藥品。它的生物學活性相應于病毒抑制，癌細胞轉移抑制和CXCR4拮抗物質的活性。ALB408-423能特異性結合CXCR4，從而抑制嗜CXCR4的HIV-1變體感染并且避免其與天然CXCR4剌激劑CXCL12的結合。本發明的肽可以通過常見的肽給藥方式以非腸胃，靜脈內，肌內，鼻內，局部，皮下或口腔途徑施用。所施用的肽的數量為每天每單位劑量1Pg-lg。本發明肽的活性可以通過施用合適的抑制劑/拮抗劑來加以抑制。本發明的診斷劑包括抗本發明肽的多克隆或單克隆抗體，可選擇性地采用熒光標記或放射性標記形式，以便以本身已知的ELISA或RIA法使用。本發明的診斷劑包括DNA，RNA和/或PNA，可選擇性地采用修飾的/或標記的形式，以便用于本領域技術人員公知的檢測系統，如PCR或指紋識別。另外，本發明的診斷劑構成質譜分析方法(MALDI或ESI-MS)，該方法在經過了相應的樣品制備和富集(通過沉淀分離大蛋白，通過層析或RP介質、固相萃取富集ALB408-423)以后，能從其單電荷或多電荷離子(親代離子或MS-MS分裂之后的產物離子)明確地定量和定性地檢測所述物質。現在通過下面的實施例對本發明進行說明。例1:從人血液濾液中分離抗病毒活性ALB408-423人血液濾液根據具體情況用水稀釋和酸化。pH值優選為1.5-3.5，特別是2.5-3.0。然后，讓所述血液過濾液通過陽離子交換劑，例如，用磺酸基團改性的載體材料(FraktogelSP-650(M)，Merck，Darmstadt,Germany)。與所述陽離子交換劑結合的肽使用較高濃度的鹽溶液洗脫。洗脫液的離子濃度大體相當于0.5-1M醋酸銨溶液的離子濃度。收集到的洗脫液進行再一次陽離子交換層析.該層析優選用提高pH值的緩沖液進行分級洗脫。含有本發明肽的級份采用制備反相層析進一步純化，然后進行半制備反相層析，例如，在C18-改性的載體材料上進行。優選使用分析反相色譜，例如，在C18-改性的載體材料上，監測其純化程度。:血艦艦錢耳又用HCl將800-1000升的血液過濾液調整到pH值為2.7，并且用水稀釋到電導率為5.5mS/cm，并將其填充到強陽離子交換劑上，流速為31/min。層析條件柱VantageVA250(Amicon，Witten，Germany)柱材料FractogelTSKSP650(M)，25cmx20cm流速31/min檢測280nm，pH，電導率緩沖液A:血液過濾液pH2.7，電導率5.5mS/cm緩沖液B:0.5M乙酸銨設備AutopilotChromatographicSystem(PerS印tiveBiosystems，Wiesbaden,Germany)在用一夜時間填充總共1，000升體積液體之后，用幾個柱體積的5mMHC1漂洗。結合有肽的級份是以0.5M乙酸銨批量洗脫液形式洗脫的。以大約5升的洗脫液，借助斜坡式pH值(6.8-7.2)和斜坡式電導率(56mS/cm)達到所述肽的完全洗脫。第二歩第一次制備分離(批號01/2003)將批量萃取的乙酸銨洗脫液合并成10000升的血液濾液肽。在將pH調整到2.7之后，將所述肽萃取物填充到制備陽離子交換劑上，添加電導率為5.5mS/cm的完全脫鹽的水。層析條件柱Vantage250VA柱材料FractogelTSKSP650(M)，25cmx20cm流速在填充期間高達31/min在洗脫期間為0.5-11/min檢測280nm，pH，電導率樣品血液過濾液pH2.7，電導率5.5mS/cm設備AutopilotChromatographicSystem(PerS印tiveBiosystems,Wiesbaden,Germany)在填充之后，原始萃取物用時240分鐘，用0.01MHC1漂洗所述柱，直到電導率低于lmS/cm為止。洗脫是使用下面給出的緩沖液分若干步驟完成的。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>洗脫液1-7被命名為pH匯集庫I-VII。它們是各自分別收集的，并且最終用完全脫鹽的水漂洗。進行洗脫，直到達到新的基線，對于I-VII的每一個pH匯集庫來說，洗脫體積達到10-25升。m:m二翻^^m:各個pH匯集庫是通過反相層析分離的，以便分級并同時脫鹽。層析條件柱FineLine100(Pharmacia,Freiburg,Germany)柱材料SourceRPC，15um10x12.5cm(FineLine100)流速150ml/min(FineLine100)檢測280nm，電導率，pH緩沖液A:10mMHC1緩沖液B:用10mMHC1配制的80%乙腈梯度5X柱體積中的0-60%緩沖液B在填充各個pH匯集庫之后，用緩沖液A洗脫所述柱。在洗脫期間，收集200ml各級份。將所述級份凍干，并且在-2(TC下保存。通過HIV抑制試驗檢測所形成的所述各級份的等分試樣。來自PH匯集庫II的級份6-8含有本發明的肽。圖1A-F:從人血液過濾液中分離ALB408-423。通過pH分步洗脫分級的所述血液過濾液再通過RP-HPLC分級，并且通過HIV抑制試驗測定所獲得的級份。對照T20對照物。A.分離的第三步。pH庫2的RP分級后在級份6-8中表現出抑制活性。B-E.第四-七步。純化所述抑制活性物，直到獲得純的物質。F.對純化的ALB408-423進行質譜(MALDI-MS)和序列分析。通過將4000P4-R5MAGI細胞接種在lOOii1的DMEM(10XFCS，100U/ml青霉素G，和100iig/ml硫酸鏈霉素)中進行HIV抑制試驗(P.Charneauetal.，J.Mol.Biol.241:651，1994)。用LTR-lacZ框穩定轉染P4-R5細胞，并且在被HIV-1成功感染之后將以Tat-依賴方式表達P-半乳糖苷酶，這種酶可以化學發光試驗進行檢測。次日，添加所述各級份的等分試樣。為此，將凍干的級份重新懸浮在80iU的匿EM中，并且通過移液管分別將各25ii1試液轉移到P4-R5細胞中，在37t:下培養1小時，然后用HIV_1NL4_3感染(lng的p24抗原)。病毒原株是以磷酸鈣法通過前病毒DNA瞬時感染293T細胞獲得的(CalPhosMammalianTransfectionKit,Clontech)。病毒原株是在轉染之后48小時收獲的，過濾并且用于感染。感染三天之后，采用GalScreen試驗(Tropix)檢測感染的P4-R5細胞中的P-半乳糖苷酶活性，按照生產商推薦的方法檢測。簡單地講，除去上清液，添加40iU的PBS/GalScreen+底物的1:1稀釋液，然后在室溫下培養30分鐘。然后將30y1的裂解產物轉移到96孔lumiplates中。然后，檢測發光，以在照度計(Berthold,Orion)上的每秒鐘的相對光照單位表示。從所有測量值中扣除未感染的對照細胞的平均P-半乳糖苷酶背景活性值。計算每一種感染樣品相對不含肽的對照物(100%)的％感染值。將在沒有ALB408-423的條件下測量的酶活性設定為100%，所有其他值都是以此為基礎計算的。最終的純化(第七步)在完全相同的條件下在TZM-bl細胞中檢查(X.Weietal.，Antimicrob.AgentsChemother.46:1896,2002)。第四歩半制備反相C18層析:通過半制備反相柱分離來自pH匯集庫II的總共200mg(相當于1087升的血液濾液等同量)的級份6-8，所述級份在所述測定中具有生物活性(圖1A)。級份33+34含有本發明的物質(圖1B)。層析條件柱4.7cmx30cm鋼柱填充材料BakerbondRP_C18，15—30iim，300A)緩沖液A:100%水，10mMHC1緩沖液B:80%乙腈，20%水，10mMHC1梯度0-30%B，體積2000ml流速40ml/min(壓力40bar)檢測214nm禾P280nm層析設備BioCad250，Pers印tiveBiosystems級份從梯度開始各50ml(min10.75)第五歩半制備反相C18層析:通過類似的半制備反相柱，使用不同的流動相分離來自前面層析步驟的、經測定具有生物活性的級份33+34。隨后的HIV感染試驗表明，級份5+6含有本發明的物質(圖c)。0126]層析條件0127]柱4.7cmx30cm鋼柱0128]填充材料:BakerbondRP_C18，15-30iim，300A)0129]緩沖液A:30%甲醇，70%水，10慮HC10130]緩沖液B:100%甲醇，10慮HC10131]梯度0-15%B，體積40ml0132]15-60%B，體積1900ml流速40ml/min(壓力30bar)檢測214nm禾P280nm層析設備BioCad250，Pers印tiveBiosystems級份從梯度開始各50ml(min9.75)第六歩分析反相C4層析:通過分析用反相柱分離來自前面層析的生物活性級份5+6。通過生物測定(HIV抑制試驗)檢測等分試樣。級份51-57包含本發明的物質(圖ID)。層析條件柱2cmx25cm鋼柱填充材料RP-C4，5um，勵A，BiotekSilica,Ostringen,Germany)緩沖液A:水，0.1%TFA緩沖液B:80%乙腈，20%水，0.1%TFA梯度0-5%B，時間2min，5-35%B，時間60min，35-100%B，時間3min流速7ml/min檢測214nm禾P280nm層析設備Kontron級份lmin，各自從min1開始第七歩分析反相C18層析:通過分析用反相柱分離來自前面的層析的生物活性級份51-57。通過生物測定檢測等分試樣。級份31含有純的本發明物質(圖1E)。層析條件柱lcmx25cm鋼柱填充材料:RP-C18，5iim，300A，Vydac(Hesperia，USA)緩沖液A:水，O.1%TFA緩沖液B:80%乙腈，20%水，0.1%TFA梯度0-15%B，時間5min，15-45%B，時間60min，45-100%B，時間lmin流速2ml/min檢測214nm和280nm層析設備:Kontron級份lmin，各自從min1開始本發明的純物質包含在級份31中，然后通過生物測定法以劑量依賴方式檢測肽化學性為其特征(例2)。例2:質暈測定從血液過濾液中分離的肽(來自例1中第七步的級份31)和化學合成的肽(例3)的質量測定是使用MALDI質譜儀(VoyagerDE-Pro)進行的。測定的所述肽的分子質量相當于以下質量數據(麗)ALB408-423，從人血液過濾液中分離(圖1F):1830.9DaALB408-423，化學合成的肽1830.6Da序列測定通過由PR0TE0MEFACT0RYAG公司，Dorotheenstr.94，10117柏林(德國)提供的MS-MS偶聯分析裝置(ESI-TRAP)分析純化的天然肽，通過Mascot搜索引擎對已建立的ESIMS-MS質量數據庫進行比對，得到了具有最高可能性的以下序列LVRYTKKVPQVSTPTL(圖IF)。數據庫比對與SwissProt數據庫進行的進一步數據庫比對表明，所述肽序列與人類蛋白血清白蛋白(保藏號NP000468)的408-423號氨基酸具有100%的相同性，并且該序列包括以下氨基酸LVRYTKKVPQVSTPTL。純化的級份31在HIV-1抑制牛物測l定中具有活件將來自例1的第七步的1.6mg的級份31溶解在160y1的DMEM中。然后將來自含有ALB408-423的級份31的10系列稀釋液添加到60的TZM-bl細胞(60yl)中，并且用lng的p24抗原HIV-1NL4_3以100的總體積進行感染。三天之后，通過GalScreen試驗測定感染率(參見例1)。級份31以劑量依賴方式抑制嗜X4的HIV-1NL4_3的感染。抑制所述感染至最大值的一半(IC5。)的劑量為21.45g/ml(圖2)。圖2:含有級份31的ALB408-423能抑制HIV-1NL4-3感染。TZM-bl細胞與級份31的系列稀釋液一起培養，然后用嗜X4的HIV-lNL4-3感染。三天之后，通過GalScreen試驗測定感染率。示出來自一式三份感染試驗樣品相對只用PBS處理的對照物(100%)的測定平均值±標準誤差。例3:ALB408-423的化學合成ALB408-423的化學合成是通過常規固相合成在肽合成儀9050(AppliedBiosystems)上采用已知的Fmoc化學法進行的。通過反相層析純化所獲得的肽，并且通過分析RP-HPLC和在例2中所披露的MALDI-MS質量測定，確定它的相同性和純度。例4:合成的ALB408-423能特異性抑制嗜X4的HIV_1變體的感染5000TZM-bl細胞接種在100ii1的DMEM(腦FCS，100U/ml青霉素G禾口100iig/ml硫酸鏈霉素)中。將ALB408-423溶解在PBS(10mg/ml)中。一天之后，將ALB408-423在PBS中的20ill的系列稀釋液添加到細胞中，并且隨后用0.5ng的p24抗原HIV-1感染細胞，總體積為200ia。采用在輔助受體嗜性方面不同的HIV-l分子克隆，其按公開的方法制備(P即kallaetal.，J.Virol.76:8455-9，2002)。圖3:化學合成的ALB408-423能特異性能抑制嗜X4的HIV-1感染。含有所標明的肽稀釋液的TZM-bl細胞用輔助受體嗜性不同的HIV-1變體感染。三天之后，通過GalScreen試驗測定感染率。A)嗜X4的HIV-1變體NL4_3，P51_Sc，P59-S/27和P34-S或雙重嗜性的92ht593.1有劑量依賴性的抑制作用。B)存在500yg/mlALB408_423的條件下的感染率表明，所述肽能特異性抑制嗜X4，但不嗜R5的HIV-1感染。所示出的數據是來自一式三份感染試驗樣品相對于只含有PBS的細胞(100%感染)的測定平均值±標準誤差。三天之后，通過GalScreen試驗(Tropix)檢測感染(例1)。通過分析嗜X4的HIV-l變體(圖3A)發現，FALB408-423以劑量依賴方式抑制所述感染(平均IC5。為24.2iig/ml)。雙重嗜性的(使用CXCR4和CCR5)變體92ht593.1的抑制效果較小。相反，嗜CCR5的HIV-l變體即使在存在很大劑量的ALB408-423(500yg/ml)的條件下也不能抑制(圖3B)。由于對嗜X4的HIV-l變體導致的感染的特異性抑制作用，可以假設ALB408-423與趨化因子受體CXCR4相互作用。從血液過濾液中純化的ALB408-423(例2)和化學合成的ALB408-423(例4)都在靶細胞中表現出HIV-l復制的劑量依賴性抑制作用，提供了ALB408-423是天然的人類HIV-l抑制分子的證據。例5:合成的ALB408-423以劑量依賴方式抑制嗜CXCR4的慢病毒(lentivirus)感染。通過瞬時轉染293T細胞，制備嗜X4的HIV-1NL4-3和HIV-2R0D10或嗜CCR5的HIV-lNL4-392th014，HIV-1-7312和SlVmac239，并且用于感染含有所標明濃度的ALB408-423的TZM-bl細胞。兩天之后，按所披露的方法測定和計算感染率(例4)。結果表明，ALB408-423以劑量依賴方式抑制嗜X4的HIV-1和HIV-2感染(IC5。10-20yM)，而所述肽對嗜R5的慢病毒感染沒有作用，表明了它對嗜CXCR4的HIV-l和HIV-2的特異性抑制作用(圖4)。圖4.ALB408-423能抑制嗜X4的慢病毒感染。用感染率標準化的HIV_1，HIV_2和SIV母株感染含有ALB408-423的TZM-bl細胞。三天之后，通過GalScreen試驗測定感染率。所示出的是來自三次測量的平均值士標準誤差。不含肽的細胞的感染率=100%。表1.各種ALB片段針對嗜X4的HIV-1NL4-3感染的抗病毒活性。含有合成肽系列稀釋液的TZM-bl細胞用HIV-1NL4-3感染，并且按照例1和2所披露的方法感染兩天之后測定和計算感染率。IC5。值是使用Gr即hPadPrism軟件包測定的。縮略語Da，分子量；IC5。M，半最大(50%)抑制濃度，通過進行三次實驗獲得；SEM，平均值的標準誤差；e鄧，所進行實驗的數量表lALB415ALB414ALB413ALB412ALB411ALB410ALB409ALB408ALB408ALB408ALB408ALB408ALB408DeiIC50士SEMexpSeq.423VPQVSTPTL941>10031.423KVPQVSTPTL1068>10032.423KKVPQVSTPTL1196>10033.423TKKVPQVSTPTL1298>10034.423YTKKVPQVSTPTL1461>10035.423RYTKKVPQVSTPTL1618>10036.423VRYTKKVPQVSTPTL1717>10037.423LVRYTKKVPQVSTPTL18327.6±1.278.422LVRYTKKVPQVSTPT172011.8±3.149.421LVRYTKKVPQVSTP161911.3±3.3410.420LVRYTKKVPQVST152211.2±2.9411.419LVRYTKKVPQVS14224.4±1.0812-418LVRYTKKVPQV133418.3±6.8413ALB408-417LVRYTKKVPQ123219.9±4.1214ALB408-416n.d.n.d.15ALB408-415LVRYTKKV100617.4±6.5216ALB408-414L雷TKK907>50217ALB408-413LVRYTK779>50218ALB407-414LLVRYTKK1025>100219ALB407-419LLVRYTKKVPQVS153611.1±1.0220ALB408I-419IVRYTKKVPQVS14211.55±1.2421ALB408F-419FVRYTKKVPQVS145493.2±2.1222ALB408A-419AVRYTKKVPQVS1378>100223ALB408G-419GVRYTKKVPQVS1366>100224ALB408-415變體ALB-wtLVRYTKKV100617.4±6.5225ALB-V415ALVRYTKKA97833.0126ALB-K414ALVRYTKAV94931.0127ALB-K413ALVRYTAKV94956.0128ALB-T412ALVRYAKKV97611.2±0.1229ALB-Y411ALVRATKKV91491130ALB-R410ALVAYTKKV921>1000131ALB-V409ALARYTKKV97832.9132例6:用ALB408-423衍生物進行結構活性相關性(SAR)研究。化學合成包含N或C末端缺失或氨基酸取代(表l)的各種ALB408-423衍生物，并且將冷凍干燥的肽溶解在PBS中。按上述方法使用嗜X4的HIV-1NL4-3(例4)在TZM-bl細胞中分析抗病毒活性。ALB408-423的N末端缺失(409-423，410-423，411-423，412-423，413-423，414-423，415-423)會嚴重破壞或消除抗病毒活性，表明所述N末端亮氨酸(L408)對于ALB408-423介導的嗜X4的對HIV-1的抑制作用是重要的(圖5和圖6)。圖5.ALB衍生物的抗病毒活性。用嗜X4的HIV_1NL4_3感染含有ALB衍生物系列稀釋液的TZM-bl細胞。兩天之后，通過GalScreen試驗測定感染率。所示出的是來自一式三份感染試驗樣品相對不含肽的樣品(感染率=100%)的測定平均值。圖6.ALB衍生物的抗病毒活性。用嗜X4的HIV_1NL4_3感染含有ALB衍生物若干稀釋液的TZM-bl細胞。兩天之后，通過GalScreen試驗測定感染率。所示出的是來自一式三份感染試驗樣品相對不含肽的樣品(感染率=100%)的測定平均值。在C末端有最多至8個氨基酸殘基截短的ALB408-423衍生物(408-422，408-421，408-420，408-419，408-418，408-417，408-416，408-415，408-414，408-413)，它們大都保留了抑制嗜X4的HIV-1感染的活性(圖5和6，表1)。不過，在C末端的其他缺失(408-414和408-413)導致了肽活性的失活(IC5。值〉50iiM)(圖6)。有趣的是，C末端缺失變體ALB408-419比野生型ALB408-423更有效地抑制嗜X4的HIV-1感染(分別為4.4±1.0和7.6±1.2;平均ICso值(iiM)士sem)(表1;圖5'6，7，禾口8)。圖7.ALB衍生物的抗病毒活性。用嗜X4的HIV_1NL4_3感染含有ALB衍生物若干稀釋液的TZM-bl細胞。兩天之后，通過GalScreen試驗測定感染率。所示出的是來自一式三份感染試驗樣品相對不含肽的樣品(感染率=100%)的平均值。圖8.ALB衍生物的抗病毒活性。用嗜X4的HIV_1NL4_3感染含有ALB衍生物若干稀釋液的TZM-bl細胞。兩天之后，通過GalScreen試驗測定感染率。所示出的是來自一式三份感染試驗樣品相對不含肽的樣品(感染率=100%)的平均值。因為僅包括8個氨基酸殘基的ALB408-415衍生物表現出有效的抗病毒活性(17.4±6.5)，通過合成并且檢測包括特殊氨基酸取代的ALB408-415衍生物(表1)進行丙氨酸掃描。在圖7和表1中所示出的數據表明，大部分取代破壞了ALB408-415的抗病毒活性。具體地講，精氨酸410(ALB-R410A，IC50>1000iiMversusALB408-415;17.4士6.5versus)在HIV-1抑制中發揮重要作用(圖7，表1)。蘇氨酸412取代丙氨酸(ALB-T412A)得到適當增強了抗病毒活性的肽(11.2±0.1)(圖7和表1)。為了進一步說明N末端亮氨酸(L408)對于ALB408-419的抗病毒活性的作用，該殘基被苯基丙氨酸(F)，丙氨酸(A)，甘氨酸(G)或異亮氨酸(I)取代。HIV-1抑制試驗發現，N末端的以上大部分取代導致了無活性的肽(ALB408F-419，ALB408A-419和ALB408G-419)(圖8)。不過，與異亮氨酸的同源交換(ALBL408I-419)導致了肽具有適當增強了的抗病毒活性(1.55±1.2)(圖8)。位于ALB408-419N末端的(407-419)其他亮氨酸能減弱其抗病毒活性(圖8)。綜上所述，SAR分析可以確定截短的ALB衍生物具有增強了的抗病毒活性，并且表明，與C末端相反，N末端部分對于ALB408-423介導的嗜X4的HIV-1感染的抑制作用來說是關鍵的。例7:ALB衍生物無一是細胞毒性的為了評估ALB變體的可能的細胞毒性作用，將5X103TZM-bl細胞與濃度逐漸提高的上述肽一起培養，產生最有效的抗病毒活性(表1和圖9)的時間為3天。用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay(Promega，#G7571)按照生產商推薦的方法測定細胞活力。這種基于發光的試驗能根據細胞內ATP的數量測定活細胞的數量。在添加試劑IO分鐘之后，使用照度計記錄數據。將來自僅與PBS—起培養的細胞的發光活性設定為100%。在圖9中示出的結果清楚地表明，檢測出的ALB衍生物在高達300iiM的濃度下無一表現出細胞毒性作用。圖9.ALB衍生物的細胞毒性分析。將ALB衍生物的系列稀釋液添加到TZM-bl細胞中。兩天之后，采用CellTiter-GloLuminescentCellViability測量細胞ATP含量。所得到的值來自三次測量的結果。^活力是相對只含有PBS(無肽)的細胞的ATP值(100X)計算的。例8:ALB408-423和大部分潛在衍生物的抗病毒活性為了研究大部分活性ALB肽對各種HIV-1克隆的作用，通過用前病毒質粒轉染293T細胞制備了在輔助受體使用方面不同的病毒(P即kallaetal.，J.Virol.76:8455-9，2002)。病毒原株首先在TZM-bl細胞上滴定。然后用傳染性標準化數量的嗜X4，雙重嗜性(X4/R5)或嗜R5的HIV-1感染含有100yM肽的TZM-bl細胞。按前述方法測定感染率(例4)，表明野生型ALB408-423，C末端截短的ALB408-419和ALBL408I-419變體以及ALB-T412A幾乎能完全抑制所有分析的嗜X4的HIV-1克隆(NL4-3，P51-Sc，P34-s)的感染(圖10)。所述肽對嗜R5的HIV-1感染沒有作用，并且僅能適度抑制雙重嗜性HIV-1克隆92ht593.1對TZM-bl細胞的感染。以上數據表明，具有增強了的抗病毒活性(與ALB408-423相比)的ALB變體(表1)同樣是嗜X4的HIV-1變體的廣譜抑制劑。圖10.ALB408-423和截短的ALB衍生物能特異性抑制嗜X4的HIV-1感染。用標準化感染力的嗜X4，雙重嗜性或嗜R5的HIV-1克隆感染含有PBS或100iiM所標明的肽的TZM-bl細胞。在感染2天之后通過GalScreen試驗測定感染率。所示出的是來自三次測量的平均值(PBS處理的對照物的％)±標準誤差。例9:ALB408-423，ALB408-419和ALBL408I-419能抑制嗜X4的HIV-1感染以及在PBMC中的復制。為了分析ALB408-423及其衍生物在相關原代細胞中的作用，通過Ficoll密度離心從來自DRK-BlutspendedienstBaden-Wiirttemberg-Hessen的血沉棕黃層中分離夕卜周血單核細胞。IX106PBMC/ml用1iig/ml植物血球凝集素(PHA，Oxoid，#3085280)和10ng/ml白介素2(IL-2，Strathmann，#9511192)剌激三天時間。然后離心使細胞沉淀，并且重新懸浮在含有IL-2的培養基中。將1.5X105PBMC(250iil)接種在96孔培養皿上，添加肽，并且用嗜X4的HIV-lNL4-3的50pg/mlp24抗原感染細胞。在感染之后第1，3，和6天收集含有子代病毒的上清液。通過p24抗原ELISA(SAIC-Frederick，Inc[AIDS&Cancervirusprogram])測量病毒的產生。在來自第6天的含有100iiMALB408-423和ALBL408I-419的樣品中檢測不到p24抗原，在含有100iiMALB408-419的上清液中只能檢測到微量水平的p24(圖11)。在存在20M肽的條件下，病毒復制受到嚴重妨礙。以上數據表明，ALB408-423及其兩種測試的衍生物能在天然HIV耙細胞中抑制嗜X4的HIV-1的感染和復制。圖11.ALB408-423和衍生物能抑制嗜X4的HIV-1感染外周血單核細胞(PBMC)。細胞與標明濃度的ALB408-423或截短的變體一起培養，并且用嗜X4的HIV-1感染。6天之后獲得的上清液通過p24ELISA進行分析。所示出的是來自一式三份感染樣品平均p24抗原值(ng/ml)±標準誤差。例10:ALB408-423肽能抑制CXCL12與CXCR4的結合。為了測試ALB408-423抑制趨化因子CXCL12與它的受體CXCR4相結合的能力，按照前面公開的方法對所有活細胞進行熒光結合試驗(Valenzuela-Fernandez，etal.;2001，JBC276:26550-26558)。將CXCR4受體穩定轉染到人胚胎腎(HEK)細胞中，作為融合蛋白與EGFP熒光蛋白一起和所述受體的細胞外氨基末端部分融合(EGFP-CXCR4)。按公開的方法合成人類趨化因子CXCL12和CXCL12-TexasRed(Amaraetal.，1999，JBC274:23916-23925;Vale證ela-Fer薩dez，etal.，2001，JBC276:26550-26558)。按以下方法進行配體_受體相互作用的實時熒光監測。表達EGFP-hCXCR4的HEK293細胞收獲在補充了5mMEDTA，pH7.4的磷酸緩沖的鹽溶液中，離心并且重新懸浮在HEPES-牛血清白蛋白緩沖液(10mMHEPES，137.5mMNaCl，1.25mMMgC12，1.25mMCaC12，6mMKCl，10mM葡萄糖，0.4mMNaH2P04，1%牛血清白蛋白(w/v)，pH7.4)中，補充了蛋白酶抑制劑(40yg/mL貝他定(bestatin)禾口木干菌月太，20iig/mL石粦酉先二月太，50iig/mLchymostatin，禾口1iig/mL亮J卬醇月太)。對懸浮在HEPES-BSA緩沖液中的細胞(濃度通常為106細胞/mL)進行實驗。在2rC下采用光譜熒光計(fluorolog2，Spex)對在510nm(激發波長為470nm)發射的熒光按時間進行記錄，并且每隔0.3秒進行采樣。通過在30秒時添加100nM的CXCL12-TR到lmL細胞懸浮液中開始熒光結合測量。為了進行競爭實驗，將表達EGFP-CXCR4的細胞在沒有或有各種濃度的競爭劑的條件下預培養10分鐘。然后，添加CXCL12-TR(100nM)并且記錄熒光，直到達至U平衡(300秒)。采用Kaleidagraph3.08軟件(SynergySoftware,Reading,PA，USA)分析數據。與熒光CXCL12的關系被測定是表現出EGFP熒光發射減弱，它是由于能量轉移到CXCL12的Texas-red(TR)基團而造成的。CXCL12結合飽和是在超過300nM的濃度下達到的，CXCR4受體與熒光CXCL12的解離常數等于55士15nM(Valenzuela-Fernandezetal.，(2001)，JBC276，26550-26558)，Hachet-Haasetal;(2008)，JBC]。未標記的分子與熒光CXCL12競爭，由于占據受體位點而阻止了EGFP發射減弱。可以對檢測到的熒光強度變化進行定量測定(Palancheetal.，(2001)，JBC276:34853-34861;Vollmeretal.，1999，JBC274:37915-37922;Ilienetal.，2003，Neurochem85:768-778)，以便推算出競爭劑的結合常數。我們的分析表明，ALB408-423以劑量依賴方式抑制CXCL12_Tr與它的受體CXCR4的相互作用(圖12)。ALB408-423表現出的解離常數(EC50)等于8±3yM，相當于KI值等于3±1M。解離常數EC50值類似于在HIV-1抑制試驗中獲得的IC5。值。圖12.ALB408-423能抑制CXCL12與CXCR4結合。用能表達EGFP-hCXCR4的293細胞進行配體-受體相互作用的實時熒光監測。在沒有或有各種濃度的ALB408-423的條件下預培養細胞10分鐘。然后添加CXCL12-TR(100nM)，并且記錄熒光直到達到平衡(300sec)。用Kaleidagraph3.08軟件(SynergySoftware,Reading,PA，USA)進行數據分析。所示出的數據是相對僅用CXCL12-Tr處理的細胞的熒光強度(100%)進行三次測量獲得的平均值±標準誤差。例11:肽ALB408-423不會通過CXCR4，CCR5和CXCR4誘導Ca2+轉移，并且抑制CXCL12-誘導的鈣細胞響應用加載f丐指示劑的HEK293細胞研究了ALB408-423調控CXCR4，CCR5或CXCR1-介導的細胞響應的能力。按公開的方法進行細胞內Ca"釋放測定(Palancheetal.，2001，JBC276:34853-34861;Vollmeretal.，1999，JBC274:37915-37922)，用卩引哚-1乙酰氧甲基酯作為鈣探針。細胞響應是在37t:下在攪拌的lmL樣品池中記錄的，激發波長設定為355nm，發射波長設定為405nm和475nm，使用光譜熒光計。人類趨化因子CCL5和CXCL8是從BectonDickinsonBiosciences(SanJose，CA)購買的。使用CXCR4，CCR5或CXCR1表達細胞進行的C轉移試驗證實了用來進行比較的趨化因子剌激劑CXCL12(CXCR4)，CCL5(CCR5)和CXCL8(CXCR1)能誘導Ca2+轉移(圖13)，而ALB408-423本身不能誘導任何鈣響應，因此沒有表現出CXCR4，CCR5和CXCR1剌激特性(圖13)。圖13.ALB408-423不是CXCR4，CCR5或CXCR1剌激劑。能表達所標明的趨化因子受體的HEK293細胞用來進行比較的趨化因子[10nMCXCL12(CXCR4);20nMCCL5(CCR5)或50nMCXCL8(CXCR1)]或50yMALB408-423處理。使用譜熒光計測量Ca2+響應。示出了用ALB408-423處理之后獲得的熒光強度，并與測量的相比較的趨化因子的熒光強度(100%)進行比較。圖14.ALB408-423能在CXCR4表達細胞中特異性抑制CXCL12-誘導的Ca2+轉移。A)ALB408-423對CXCL12介導的細胞內Ca2+有劑量依賴性抑制作用。B)ALB408-423對在HEKCCR5細胞中CCL5-誘導的f丐響應或在HEKEGFP-CXCR1細胞中CXCL8-誘導的響應沒有作用。黑色條框僅有相比較的趨化因子；灰色條框有相比較的趨化因子和50PMALB408-423。所示出的值是相對僅用趨化因子處理的細胞(100%)進行的重復實驗的平均牽丐峰值響應。為了確定ALB408-423是否具有CXCR4拮抗特性，我們分析了ALB408-423對剌激劑CXCL12與CXCR4受體結合的影響。因此，CXCR4表達細胞與各種濃度的ALB408-423—起培養，然后用CXCL12處理。記錄Ca2+響應。在圖14A中示出的數據表明ALB408-423能以劑量依賴方式抑制CXCL12-誘導的鈣響應，表觀抑制常數為85iig/ml。為了了解化合物的選擇性，我們隨后表征了所述肽對各種趨化因子/受體對的鈣響應。與來自圖14A的數據一致，50iiM的肽能在HEKEGFP-CXCR4細胞中抑制70X的CXCL12-誘導的鈣響應(圖14B)。相反，它對在HEKCCR5細胞中的CCL5-誘導的鈣響應或在HEKEGFP-CXCR1細胞中CXCL8-誘導的響應沒有作用(圖14B)。以上結果支持了所述肽表現出對CXCR4受體具有選擇性并且是CXCR4拮抗劑的觀點。例12:ALB408-423能抑制CXCL12-誘導的CXCR4內在化在用合適的趨化因子剌激時，多種G-蛋白結合的受體通過被膜小窩而內在化。作為有CXCR4響應的拮抗劑，ALB408-423還能夠改變趨化因子誘導的CXCR4受體內在化。為了分析ALB408-423對CXCL12介導的CXCR4內在化的拮抗特性，分離了EGFP-CXCR4受體表達細胞，并且在24孔平板中在用大鼠I型膠原涂敷的12-mm蓋玻片上生長2天。然后在補充了蛋白酶抑制劑的HEPES-BSA緩沖液中培養0-30分鐘，所述緩沖液含有100nMCXCL12或50iiM的ALB408-423或100nMCXCL12加上50iiM的ALB408-423，培養溫度為37°C。通過細胞放置在冰上終止內在化，并且馬上用冰鎮HEPES-BSA緩沖液洗滌它們。然后在用PBS制備的4X多聚甲醛中在4t:下固定15分鐘，然后在50mMNH4C1中培養15分鐘。使用抗退色劑M6vio1(Calbiochem)將蓋玻片安裝到顯微鏡載玻片上，在室溫下保持24小時，然后在-2(TC下保存。然后用倒置顯微鏡(Leica)和激光掃描共焦成像系統(LeicaAOBSSP2MP)分析細胞，使用HCXPLAPOlbd.BL63X1.400ILUV物鏡(n°506192)。電子變焦設定為3，針孔為1Airy，所得到的像素尺寸為0.154ym。用氬激光器的488nm激光線激發EGFP，檢測并通過光電倍增管(PMT)在495到550nm的所謂mCFP通道(PMT1610HighVoltage-HV-，offset0)中放大。為了獲得良好的信噪比，所述圖像來自4次連續獲取的平均結果。圖15.ALB408-423能抑制CXCL12介導的CXCR4內在化。在表達EGFP-CXCR4的HEK細胞上監測受體內吞作用，并且在添加CXCL12，ALB408-423或這兩種化合物之后馬上(0分鐘，上部圖片)或30分鐘之后(下部圖片)通過共焦顯微技術分析。30分鐘之后，CXCL12處理的細胞將CXCR4內在化。在存在ALB408-423的情況下，CXCL12介導的受體的內在化被消除。共焦成像表明，在37。C下用100nMCXCL12處理30分鐘，EGFP-CXCR4內在化到細胞外周和多孔結構中(圖15)。正如所預期的，ALB408-423不能誘導所述受體內在化，而是抑制CXCL12介導的CXCR4內在化(圖15)，因為大部分熒光保留在所述細胞表面上。該結果提供了ALB408-423對CXCR4受體發揮拮抗作用的進一步的證據。例13:ALB408-423能抑制CXCL-12介導的JurkatT細胞轉移CXCL12-CXCR4信號傳導在若干疾病中發揮關鍵作用，如HIV/AIDS，癌癥，白血病和關節炎。表達CXCL12的器官、組織或細胞能吸引表達CXCR4的腫瘤細胞，并使腫瘤轉移。為了研究ALB408-423是否能夠抑制CXCL12介導的腫瘤細胞轉移，用表達CXCR4的JurkatT細胞模型系統進行轉移測定(Princenetal.，2004，J.Virol.78:12996-13006)。JurkatT細胞以0.4X106(200iil)的濃度懸浮在含有10%FBS的培養基中，然后將該細胞懸浮液(200添加到5iim孔過濾裝置的上部腔室(Transwell，24孔細胞培養器，Costar)。然后，將有或沒有CXCL12(100ng/ml)的600yl培養基添加到下部腔室中，使其吸引來自上部腔室的細胞。為了研究對CXCL12-誘導的JurkatT細胞轉移的抑制作用，將下部腔室中的CXCL12與各種濃度的ALB408-423混合。將細胞培養平板在細胞培養培養箱中在37。C下培養2小時。在培養之后，取出平板，并且將移至下部腔室的100iU細胞使用計數室直接計數或采用增殖測定法進行分析(CellTiter-GloReagent，Promega)，使用生產商推薦的方法。增殖試驗測定的細胞內ATP含量直接與細胞數量成正比(數據未發表)。圖16所示出的數據表明，ALB408-423以劑量依賴方式抑制CXCL12介導的JurkatT細胞轉移。在高濃度(360iig/ml)下，ALB408-423幾乎能完全抑制CXCL12誘導的細胞轉移，與缺少任何肽(既無CXCL12，也無ALB408-423)的條件下觀察到的抑制率相當。數據表明，CXCR4拮抗劑ALB408-423能抑制由CXCL12介導的腫瘤細胞的吸引。圖16.ALB408-423以劑量依賴方式抑制CXCL-12介導的JurkatT細胞轉移。將JurkatT細胞添加到具有5iim孔過濾器的transwell裝置的上部腔室。然后將PBS，CXCR4剌激劑CXCL12(100nM)或ALB408-423的系列稀釋液添加到細胞培養平板的下部腔室中。在37"C下培養2小時之后，使用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssaykit(Promega)測量細胞內ATP含量，檢測在下部腔室中轉移的細胞數量。所有值表示來自三次實驗的轉移的細胞數相對僅用CXCL12處理的細胞轉移數(100%轉移)的平均值士標準誤差。例14:ALB408-423與CXCR4的結合取決于N-末端氨基酸的完整性。為了確定ALB408-423中，介導與CXCR4結合并因此抑制嗜X4的HIV-1感染和CXCL12結合的部位，我們分析了若干ALB408-423衍生物(參見表1)對CXCL12誘導的Ca2+轉移和CXCL12-Tr結合的影響。有關實驗細節可以參見實施例x和y。如圖17A和B所示，缺少N末端亮氨酸的ALB409-423不能抑制CXCL12介導的Ca2+響應或CXCL12-Tr與CXCR4受體的結合。有趣的是，ALB409-423在HIV-1抑制試驗中也是無活性的，表明ALB409-423不能結合CXCR4，同樣說明了缺少抗病毒活性。相反，所有C末端截短的ALB衍生物仍然能夠與CXCR4受體相互作用(圖17A)并且抑制CXCL12介導的Ca2+響應(圖17B)，并表現出接近野生型肽(30iiM)的解離常數，408-413是例外，它對所述受體具有較低的親和力(>200iiM)并且在抑制嗜X4的HIV-1感染方面同樣大多是無效的(圖6和表1)。綜合以上數據可以發現，若干C末端截短的ALB衍生物是CXCR4拮抗劑，它能夠結合CXCR4，從而抑制CXCL12結合和信號傳導或嗜X4的HIV-1感染。圖17.ALB衍生物的CXCR4拮抗活性。A)ALB片段能抑制CXCL12，但不能抑制CCL5誘導的Ca2+轉移。表達CXCR4或CCR5的HEK293細胞分別用CXCR4剌激劑CXCL12(10nM)或CCR5剌激劑CCL5(20nM)處理，處理是在沒有(無ALB)或有所標明的ALB衍生物(50yM)的條件下進行的。按公開的方法記錄鈣響應。所示出的數據是重復試驗樣品相對僅用剌激劑處理之后的峰值鈣響應(100%)的平均值±標準誤差。B)ALB衍生物能破壞CXCR4與CXCL12的結合。在有或沒有ALB肽的條件下，用TexasRed標記過的CXCL12(CXCL12-Tr)處理表達CXCR4的HEK293細胞。配體-受體相互作用的實時熒光監測是按公開的方法進行的。所示出的是，有ALB肽的樣品相對僅用CXCL12-Tr處理的細胞(100%結合)其結合CXCL12-Tr的水平。所給出的值來自重復實驗的結果。權利要求一種肽，具有以下氨基酸序列Z1-LVRYTKKVPQVSTPTL-Z2(ALB-408)及其生物學活性片段和/或變體和/或衍生物，特別是酰胺化，乙酰化，硫酸化，磷酸化和/或糖基化衍生物，以及通過多重合成獲得的具有ALB408-423的生物學活性的肽；其中，Z表示0-10個氨基酸殘基的數字。2.如權利要求l的ALB408-423肽，其中，所述序列上的一個或若干個氨基酸殘基被交換，缺失或添加，或對ALB408-423的單一氨基酸進行化學修飾，使ALB408-423的生物學或藥理學活性加以改善。3.如權利要求1和/或2的肽，其中，所述肽具有SeqIdNo1_32的氨基酸序列。4.編碼如權利要求1-3中任意一項的ALB408-423和/或它的片段，變體，衍生物和類似物的多核苷酸。5.如權利要求4的多核苷酸，其特征在于由DNA，RNA，基因組DNA或PNA組成。6.—種載體，包含如權利要求4的多核苷酸。7.—種遺傳工程的宿主細胞，包含如權利要求6的載體。8.能夠與編碼有ALB408-423活性的多肽、如權利要求4的多核苷酸雜交的多核苷酸。9.針對如權利要求l-3中任意一項的多肽的抗體。10.—種針對如權利要求1-3中任意一項的多肽的拮抗劑/抑制劑。11.一種通過施用治療劑量的如權利要求1-3中任意一項的多肽來治療需要ALB408-423治療的患者的方法。12.—種通過施用治療劑量的拮抗劑/抑制劑來治療需要ALB408-423抑制作用的患者的方法。13.—種蓋侖制劑，由如權利要求1-3中任意一項的多肽和兼容性載體組成。14.一種用于治療患者的方法，其中，所述多肽的治療效果是通過施用編碼ALB408-423的DNA并在所述患者體內進行體內表達來實現的。15.—種用于制備如權利要求1的ALB408-423的方法，包括通過陽離子交換萃取法從血液濾液中萃取，然后洗脫所述吸附的物質，對含有所述肽的萃取物進行復原的陽離子交換層析，以及進行分餾反相層析。16.—種用于制備如權利要求1-3中任意一項的ALB408-423的方法，包括采用稱為Merrifield合成法的固相合成，或采用本領域技術人員公知的液相合成法來制備，其中使用經保護的氨基酸，并進行純化。17.—種用于制備如權利要求1-3中任意一項的ALB408-423的方法，包括采用本領域技術人員公知的異源表達法，使用常見的生物技術載體。18.—種診斷劑，含有如權利要求8的多克隆或單克隆抗體或含有編碼如權利要求1-3中任意一項的ALB408-423的核酸或mRNA。19.一種診斷劑，含有如權利要求1-3中任意一項的肽或如權利要求4的多核苷酸，用在分析該物質在組織，血漿，尿液和腦脊髓液中的含量的檢測系統中。20.檢測如權利要求1-3中任意一項的肽的診斷劑和檢測系統，即分析該物質在組織，血漿，尿液和腦脊髓液中的含量，包括采用質譜法，如MALDI-MS或ESI-MS，結合采用RP-HPLC，蛋白沉淀和/或固相萃取進行的樣品制備。21.—種診斷劑，含有如權利要求1-3中任意一項的肽作為病毒類疾病，細菌和真菌感染，炎性和腫瘤進程的標識物，并且作為炎性進程，紊亂性炎性反應，腫瘤疾病，生長失調，免疫系統疾病的標識物，以及作為骨病的標識物。22.—種含有如權利要求1-3中任意一項的肽作為蓋侖制劑的活性成分的藥品，用于口服，靜脈內，肌內，皮內，皮下，鞘內給藥，以及作為氣溶膠用于經肺給藥。23.將如權利要求1-3中任意一項的肽和如權利要求4的多核苷酸和如權利要求9和10的抗體/拮抗劑和如權利要求13的蓋侖制劑用于制備藥品的用途，所述藥品用于治療病毒疾病，特別是HIV-1，HIV-2，細胞巨化病毒，單純皰疹病毒(l型和2型)，水痘帶狀病毒，甲肝和乙肝病毒，流感病毒，脊髓灰質炎病毒，鼻病毒，風疹病毒，麻疹病毒，狂犬病病毒，勞氏肉瘤病毒，愛波斯坦-巴爾病毒感染，和用于治療細菌和真菌感染，炎性過程，紊亂的炎性反應，腫瘤疾病，生長失調，神經元疾病，凝血和造血作用疾病，血管病，免疫系統疾病，和用于傷口和骨骼愈合。全文摘要一種具有以下氨基酸序列Z1-LVRYTKKVPQVSTPTL-Z2(ALB-408)的肽及其生物學活性片段和/或變體和/或衍生物，特別是其酰胺化，乙酰化，硫酸化，磷酸化和/或糖基化衍生物，以及通過多重合成獲得的具有ALB408-423的生物學活性的肽；其中，Z表示0-10個氨基酸殘基的數字。文檔編號C07K14/435GK101730709SQ200880023313公開日2010年6月9日申請日期2008年7月3日優先權日2007年7月3日發明者盧德格爾·施坦德克,弗蘭克·基爾霍夫,沃爾夫-格奧爾·福斯曼,簡·蒙克申請人:法瑞斯生物技術有限公司