Rsv特異性結合分子和產生它們的方法

專利名稱：：Rsv特異性結合分子和產生它們的方法RSV特異性結合分子和產生它們的方式本發明涉及生物學和醫學領域。呼吸道合胞病毒(RSV)是常見的感冒病毒，屬于副粘病毒科。RSV有毒力、容易傳播，并且是2歲以下兒童的下呼吸道疾病的最常見病因。在一個RSV季節中，高達98%的日托兒童將被感染。感染RSV的兒童中0.5X至3.2X需要住院治療。在美國，每年約有90，000例就醫和4500例死亡。由于RSV導致住院治療的主要風險因素是早產、慢性肺病、先天性心臟病、免疫機能不全和其他方面健康的6周齡以下的兒童。對RSV陽性細支氣管炎沒有有效治療，只能進行足夠營養和氧療形式的支持性護理。抗病毒治療如利巴韋林在RSV感染中無效。一種單克隆抗體帕麗珠單抗(也稱為Synagis)注冊用于預防RSV感染。帕麗珠單抗是遺傳改造(人源化)的RSV融合蛋白的單克隆抗體。然而，帕麗珠單抗不總是有效。因此，本領域需要其他抗體和治療來對抗RSV。本發明的目的是提供對抗和/或預防RSV相關疾病的方式和方法。本發明的另一個目的是提供另選和/或改進的RSV抗體或其功能等同物，并提供能夠產生RSV抗體或其功能等同物的穩定細胞。本發明提供能夠特異性結合RSV的抗體和其功能等同物。這類抗體和/或功能等同物在本文中也稱為"抗-RSV抗體"或"RSV-特異性抗體"，它們能夠特異性結合RSV的至少一種組分，例如RSV蛋白質的某表位。術語"特異性結合"不包括非特異性粘附。本發明抗-RSV抗體和功能等同物特別適合對抗和/或至少部分預防RSV感染和/或RSV感染的不良影響。本發明的一種特別優選的抗-RSV抗體是稱為"D25"的抗體，它具有如圖11A-D所示的重鏈區和輕鏈區。具體產生D25的抗原結合特性的D25的CDR序列見圖11D。與已注冊的抗-RSV抗體帕麗珠單抗相比，抗體D25似乎具有優異的性能(圖8)。例如，D25在HEp-2細胞感染RSV的體外中和實驗中的IC50值約為0.4_1.5ng/ml，而帕麗珠單抗的IC50值約為453ng/ml。在本文中，將抗體的功能等同物定義為抗體的功能性部分、衍生物或類似物。抗體的功能性部分定義為與所述抗體具有至少一種相同特性(種類相同，而量不一定相同)的部分。所述功能性部分能夠與所述抗體結合相同抗原，但結合程度不一定相同。抗體的功能性部分優選包括單結構域抗體、單鏈抗體、單鏈可變區片段(scFv)、Fab片段或F(ab')2片段。抗體的功能性衍生物定義為經改造所得化合物的至少一種特性_優選抗原結合特性-種類基本相同，而量不一定相同的抗體。以多種方式，例如通過保守性氨基酸取代提供衍生物，其中氨基酸殘基被性質(大小、疏水性等)基本相似的另一殘基取代，使得總體功能不大可能受到嚴重影響。本領域技術人員能夠產生抗體的類似化合物。通過篩選肽文庫或噬菌體展示文庫進行這種操作。這種類似物基本上與所述抗體具有至少一種種類相同而量不一定相同的特性。如本領域技術人員所熟知，抗體重鏈是構成免疫球蛋白分子的兩種鏈類型中較大的那種類型。重鏈包括恒定區和可變區，其中可變區參與抗原結合。抗體的輕鏈是構成免6疫球蛋白分子的兩種鏈類型中較小的那種類型。輕鏈包括恒定區和可變區。可變區與重鏈可變區一起參與抗原結合。互補決定區(CDR)是重鏈可變區和輕鏈可變區中的高變區。抗體的重鏈和連接的輕鏈的CDR—起形成抗原結合位點。既然本發明認識到圖ll所示CDR序列提供所需RSV結合特性，技術人員就能夠產生包含至少一個改變的CDR序列的變體。例如，應用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代包括用性質(大小、疏水性等)基本相似的另一種氨基酸取代一種氨基酸，使得總體功能不大可能受到嚴重影響。也可能改變圖11所示的至少一種CDR序列，以便產生與D25相比至少一種特性改變的變異抗體或其功能等同物。優選地，提供的抗體或功能等同物包含與圖ll所示CDR序列至少70%相同的CDR序列，以便至少部分保持、甚至改進D25的有利結合特性。優選改變圖11所示CDR序列，以使得到的抗體或功能等同物與D25相比包含至少一種改進的特性，例如改進的結合親和力、選擇性和/或穩定性。因此，包含與圖11所示CDR序列至少70%相同的氨基酸序列的變異抗體或其功能等同物屬于本發明范圍。本領域可獲得各種改變氨基酸序列的方法。例如，人工合成具有所需CDR序列的重鏈或輕鏈序列。優選地，利用(例如)隨機或定位誘變使編碼CDR的核酸序列突變。因此，本發明在第一個方面提供一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能等同物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含與序列NYIIN至少70%相同的序列，和/或-重鏈CDR2序列，其包含與序列GIIPVLGTVHYAPKFQG至少75%相同的序列，和/或-重鏈CDR3序列，其包含與序列ETALVVSTTYLPHYFDN至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含與序列QASQDIVNYLN至少85%相同的序列，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含與序列VASNLET至少70%相同的序列。優選地，所述抗體還包含輕鏈CDR3序列，該序列含有與序列QQYDNLP至少70%相同的序列。優選地，本發明抗體或功能等同物包含與圖IID所示的至少一種CDR序列至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，更優選至少90%相同的CDR序列。最優選地，本發明抗體或功能等同物包含與圖11D所示的至少一種CDR序列至少95%相同的CDR序列。上述特別優選的抗體D25包含由圖IID所示CDR序列組成的CDR序列。因此，本發明特別優選的實施方式提供一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能等同物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含序列NYIIN，和/或-重鏈CDR2序列，其包含序列GIIPVLGTVHYAPKFQG，和/或-重鏈CDR3序列，其包含序列ETALVVSTTYLPHYFDN,和/或-輕鏈CDR1序列，其包含序列QASQDIVNYLN，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含序列VASNLET。優選地，所述抗體還包含含有序列QQYDNLP的輕鏈CDR3序列。在一個實施方式中，提供的抗體或功能等同物包含如圖IID所示的三個重鏈CDR序列和三個輕鏈CDR序列，或者與其至少70%、優選至少80%、更優選至少85%相同的序列。因此，進一步提供一種分離、合成或重組的抗體或其功能等同物，其包含含有與序列NYIIN至少70%相同的序列的重鏈CDR1序列，含有與序列GIIPVLGTVHYAPKFQG至少70%相同的序列的重鏈CDR2序列，含有與序列ETALVVSTTYLPHYFDN至少70%相同的序列的重鏈CDR3序列，含有與序列QASQDIVNYLN至少70%相同的序列的輕鏈CDR1序列，含有與序列VASNLET至少70%相同的序列的輕鏈CDR2序列和含有與序列QQYDNLP至少70%相同的序列的輕鏈CDR3序列。所述抗體或功能等同物優選包含與圖IID所示的重鏈CDR序列和輕鏈CDR序列至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的CDR序列。也提供包含上述重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的抗體或功能等同物。也提供包含與圖11所示重鏈序列至少70%相同的重鏈可變區氨基酸序列的抗體或其功能等同物。這類重鏈序列提供所需的RSV結合特性，如抗體D25所證明的那樣。因此，還提供一種抗體或其功能等同物，其重鏈序列包含與序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASVVSTTYLPHYFD麗GQGTLVTVSS至少70%相同的序列。而且，與圖11所示輕鏈序列至少70%相同的輕鏈可變區氨基酸序列提供所需的RSV結合特性，如抗體D25所證明的那樣。因此，也提供一種抗體或其功能等同物，其具有與序列DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYL麗Y少70%相同的輕鏈序列。本發明抗體或功能性部分優選包含與圖11所示重鏈序列和/或輕鏈序列至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的重鏈可變區序列和/或輕鏈可變區序列。同源性越高，所述抗體或功能性部分越接近抗體D25。本發明抗體或功能性部分優選包含類似D25的重鏈和輕鏈的重鏈以及輕鏈。因此，還提供一種抗體或功能性部分，其包含與圖11所示重鏈序列和輕鏈序列至少70%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的重鏈序列和輕鏈序列。—個實施方式提供一種抗體或其功能等同物，其包含由圖11所示重鏈序列構成的重鏈序列和由圖ll所示輕鏈序列構成的輕鏈序列。或者，如本領域技術人員所熟知，可能產生縮短、但維持感興趣的結合特性的重鏈或輕鏈序列。優選地，與初始的重鏈或輕鏈相比，產生的這種縮短的重鏈或輕鏈具有較短的恒定區。優選保持可變區不變。例如，基于圖ll所示重鏈序列或輕鏈序列產生Fab片段或F(ab')2片段。因此，也提供至少包含圖11所示序列的功能性部分的抗體功能等同物。所述功能性部分的長度為至少20個氨基酸，包含與圖11D所示重鏈CDR1序列至少70%相同的序列，和/或與圖11D所示重鏈CDR2序列至少75%相同的序列，和/或與圖11D所示重鏈CDR3序列至少70%相同的序列，和/或與圖11D所示輕鏈CDR1序列至少85%相同的序列，和/或與圖11D所示輕鏈CDR2序列至少70%相同的序列。優選地，所述功能性部分還包含與圖11D所示輕鏈CDR3序列至少70%相同的序列。本發明的另一種特別優選的抗-RSV抗體是稱為"AM14"的抗體，它具有如圖14A所示的重鏈區和輕鏈區。具體產生AM14的抗原結合特性的AM14的CDR序列也參見圖14A。既然本發明認識到圖14A所示CDR序列提供所需RSV結合特性，技術人員就能夠產生包含至少一個改變的CDR序列的變體。例如，應用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代包括用性質(大小、疏水性等)基本相似的另一種氨基酸取代一種氨基酸，使得總體功能不大可能受到嚴重影響。也可能改變圖14A所示的至少一種CDR序列，以便產生與AM14相比至少一種特性改變的變異抗體或其功能等同物。優選地，提供的抗體或功能等同物包含與圖14A所示CDR序列至少70%相同的CDR序列，以便至少部分保持、甚至提高AM14的有利結合特性。優選改變圖14A所示CDR序列，以使得到的抗體或功能等同物與AM14相比包含至少一種改進的特性，例如改進的結合親和力、選擇性和/或穩定性。因此，包含與圖14A所示CDR序列至少70%相同的氨基酸序列的變異抗體或其功能等同物屬于本發明范圍。本領域可獲得各種改變氨基酸序列的方法。例如，人工合成具有所需CDR序列的重鏈或輕鏈序列。優選地，利用(例如)隨機或定位誘變使編碼CDR的核酸序列突變。因此，本發明在一個方面提供一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能性部分、衍生物和/或類似物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含與序列GFSFSHYA至少70%相同的序列，和/或-重鏈CDR2序列，其包含與序列ISYDGENT至少70%相同的序列，和/或-重鏈CDR3序列，其包含與序列ARDRIVDDYYYYGMDV至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含與序列QDIKKY至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含與序列DAS至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含與序列QQYDNLPPLT至少70%相同的序列。優選地，本發明抗體或功能等同物包含與圖14A所示的至少一種CDR序列至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，更優選至少90%相同的CDR序列。最優選地，本發明抗體或功能等同物包含與圖14A所示的至少一種CDR序列至少95%相同的CDR序列。上述特別優選的抗體AM14包含由圖14A所示CDR序列組成的CDR序列。因此，本發明特別優選的實施方式提供一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能等同物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含序列GFSFSHYA，和/或-重鏈CDR2序列，其包含序列ISYDGENT，和/或-重鏈CDR3序列，其包含序列ARDRIVDDYYYYGMDV,和/或-輕鏈CDR1序列，其包含序列QDIKKY，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含序列DAS，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含序列QQYDNLPPLT。在一個實施方式中，提供的抗體或功能等同物包含如圖14A所示的三個重鏈CDR序列和三個輕鏈CDR序列，或者與其至少70%相同的序列。因此，進一步提供一種分離、合成或重組的抗體或其功能等同物，其包含含有與序列GFSFSHYA至少70%相同的序列的重鏈CDR1序列，含有與序列ISYDGENT至少70%相同的序列的重鏈CDR2序列，含有與序列ARDRIVDDYYYYGMDV至少70%相同的序列的重鏈CDR3序列，含有與序列QDIKKY至少70%相同的序列的輕鏈CDR1序列，含有與序列DAS至少70%相同的序列的輕鏈CDR2序列和含有與序列QQYDNLPPLT至少70%相同的序列的輕鏈CDR3序列。所述抗體或功能等同物優選包含與圖14A所示的重鏈CDR序列和輕鏈CDR序列至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的CDR序列。也提供包含上述圖14A的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述圖14A的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的抗體或功能等同物。也提供包含與圖14A所示重鏈序列至少70%相同的重鏈氨基酸序列的抗體或其功能等同物。這類重鏈序列提供所需的RSV結合特性，如抗體AM14所證明的那樣。因此，還提供一種抗體或其功能等同物，其重鏈序列包含與序列EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSYYYGMDVWGQGATVTVSS至少70%相同的序列。而且，與圖14A所示輕鏈序列至少70%相同的輕鏈氨基酸序列提供所需的RSV結合特性，如抗體AM14所證明的那樣。因此，也提供一種抗體或其功能等同物，其具有與序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYL麗YHQKPGKV相同的輕鏈序列。本發明抗體或功能性部分優選包含與圖14A所示重鏈序列和/或輕鏈^列至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的重鏈可變區序列和/或輕鏈可變區序列。同源性越高，所述抗體或功能性部分越接近抗體AM14。本發明抗體或功能性部分優選包含類似AM14的重鏈和輕鏈的重鏈以及輕鏈。因此，還提供一種抗體或功能性部分，其包含與圖14A所示重鏈序列和輕鏈序列至少70%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的重鏈序列和輕鏈序列。—個實施方式提供一種抗體或其功能等同物，其包含由圖14A所示重鏈序列構成的重鏈序列和由圖14A所示輕鏈序列構成的輕鏈序列。或者，如本領域技術人員所熟知，可能產生縮短、但維持感興趣的結合特性的重鏈或輕鏈序列。優選地，與初始的重鏈或輕鏈相比，產生的這種縮短的重鏈或輕鏈具有較短的恒定區。優選保持可變區不變。例如，基于圖14A所示重鏈序列或輕鏈序列產生Fab片段或F(ab')2片段。因此，也提供至少包含圖14A所示序列的功能性部分的抗體功能等同物。所述功能性部分的長度為至少20個氨基酸，包含與圖14A所示的至少一種CDR序列至少70%相同的序列。本發明的另一種特別優選的抗-RSV抗體是稱為"AM16"的抗體，它具有如圖14B所示的重鏈區和輕鏈區。具體產生AM16的抗原結合特性的AM16的CDR序列也參見圖14B。既然本發明認識到圖14B所示CDR序列提供所需RSV結合特性，技術人員就能夠產生包含至少一個改變的CDR序列的變體。例如，應用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代包括用性質(大小、疏水性等)基本相似的另一種氨基酸取代一種氨基酸，使得總體功能不大可能受到嚴重影響。也可能改變圖14B所示的至少一種CDR序列，以便產生與AM16相比至少一種特性改變的變異抗體或其功能等同物。優選地，提供的抗體或功能等同物包含與圖14B所示CDR序列至少70%相同的CDR序列，以便至少部分保持、甚至提高AM16的有利結合特性。優選改變圖14B所示CDR序列，以使得到的抗體或功能等同物與AM16相比包含至少一種改進的特性，例如改進的結合親和力、選擇性和/或穩定性。因此，包含與圖14B所示CDR序列至少70%相同的氨基酸序列的變異抗體或其功能等同物屬于本發明范圍。本領域可獲得各種改變氨基酸序列的方法。例如，人工合成具有所需CDR序列的重鏈或輕鏈序列。優選地，利用(例如)隨機或定位誘變使編碼CDR的核酸序列突變。因此，本發明在一個方面提供一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能性部分、衍生物和/或類似物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含與序列GFTFSSYN至少70%相同的序列，和/或-重鏈CDR2序列，其包含與序列ISAGSSYI至少70%相同的序列，和/或-重鏈CDR3序列，其包含與序列AREDYGPGNYYSP麗FDP至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含與序列SSNIGAGYD至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含與序列GNT至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含與序列HSYDRSLSG至少70%相同的序列。優選地，本發明抗體或功能等同物包含與圖14B所示的至少一種CDR序列至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，更優選至少90%相同的CDR序列。最優選地，本發明抗體或功能等同物包含與圖14B所示的至少一種CDR序列至少95%相同的CDR序列。上述特別優選的抗體AM16包含由圖14B所示CDR序列組成的CDR序列。因此，本發明特別優選的實施方式提供一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能等同物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含序列GFTFSSYN，和/或-重鏈CDR2序列，其包含序列ISAGSSYI，和/或-重鏈CDR3序列，其包含序列AREDYGPGNYYSP麗FDP，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含序列SSNIGAGYD，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含序列GNT，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含序列HSYDRSLSG。在一個實施方式中，提供的抗體或功能等同物包含如圖14B所示的三個重鏈CDR序列和三個輕鏈CDR序列，或者與其至少70%相同的序列。因此，進一步提供一種分離、合成或重組的抗體或其功能等同物，其包含含有與序列GFTFSSYN至少70%相同的序列的重鏈CDR1序列，含有與序列ISAGSSYI至少70%相同的序列的重鏈CDR2序列，含有與序列AREDYGPGNYYSP麗FDP至少70%相同的序列的重鏈CDR3序列，含有與序列SSNIGAGYD至少70%相同的序列的輕鏈CDR1序列，含有與序列GNT至少70%相同的序列的輕鏈CDR2序列和含有與序列HSYDRSLSG至少70%相同的序列的輕鏈CDR3序列。所述抗體或功能等同物優選包含與圖14B所示的上述重鏈CDR序列和上述輕鏈CDR序列至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的CDR序列。也提供包含上述圖14B的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述圖14B的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的抗體或功能等同物。也提供包含與圖14B所示重鏈序列至少70%相同的重鏈氨基酸序列的抗體或其功能等同物。這類重鏈序列提供所需的RSV結合特性，如抗體AM16所證明的那樣。因此，還提供一種抗體或其功能等同物，其重鏈序列包含與序列EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTYYSP麗FDPWGQGTLVTVSS至少70%相同的序列。而且，與圖14B所示輕鏈序列至少70%相同的輕鏈氨基酸序列提供所需的RSV結合特性，如抗體AM16所證明的那樣。因此，也提供一種抗體或其功能等同物，其具有與序列QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLP相同的輕鏈序列。本發明抗體或功能性部分優選包含與圖14B所示重鏈序列和/或輕鏈^列至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的重鏈可變區序列和/或輕鏈可變區序列。同源性越高，所述抗體或功能性部分越接近抗體AM16。本發明抗體或功能性部分優選包含類似AM16的重鏈和輕鏈的重鏈以及輕鏈。因此，還提供一種抗體或功能性部分，其包含與圖14B所示重鏈序列和輕鏈序列至少70%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的重鏈序列和輕鏈序列。—個實施方式提供一種抗體或其功能等同物，其包含由圖14B所示重鏈序列構成的重鏈序列和由圖14B所示輕鏈序列構成的輕鏈序列。或者，如本領域技術人員所熟知，可能產生縮短、但維持感興趣的結合特性的重鏈或輕鏈序列。優選地，與初始的重鏈或輕鏈相比，產生的這種縮短的重鏈或輕鏈具有較短的恒定區。優選保持可變區不變。例如，基于圖14B所示重鏈序列或輕鏈序列產生Fab片段或F(ab')2片段。因此，也提供至少包含圖14B所示序列的功能性部分的抗體功能等同物。所述功能性部分的長度為至少20個氨基酸，包含與圖14B所示的至少一種CDR序列至少70%相同的序列。本發明的另一種特別優選的抗-RSV抗體是稱為"AM23"的抗體，它具有如圖14C所示的重鏈區和輕鏈區。具體產生AM23的抗原結合特性的AM23的CDR序列也參見圖14C。既然本發明認識到圖14C所示CDR序列提供所需RSV結合特性，技術人員就能夠產生包含至少一個改變的CDR序列的變體。例如，應用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代包括用性質(大小、疏水性等)基本相似的另一種氨基酸取代一種氨基酸，使得總體功能不大可能受到嚴重影響。也可能改變圖14C所示的至少一種CDR序列，以便產生與AM23相比至少一種特性改變的變異抗體或其功能等同物。優選地，提供的抗體或功能等同物包含與圖14C所示CDR序列至少70%相同的CDR序列，以便至少部分保持、甚至提高AM23的有利結合特性。優選改變圖14C所示CDR序列，以使得到的抗體或功能等同物與AM23相比包含至少一種改進的特性，例如改進的結合親和力、選擇性和/或穩定性。因此，包含與圖14C所示CDR序列至少70%相同的氨基酸序列的變異抗體或其功能等同物屬于本發明范圍。本領域可獲得各種改變氨基酸序列的方法。例如，人工合成具有所需CDR序列的重鏈或輕鏈序列。優選地，利用(例如)隨機或定位誘變使編碼CDR的核酸序列突變。因此，本發明在一個方面提供一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能性部分、衍生物和/或類似物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含與序列GFNFHNYG至少70%相同的序列，和/或-重鏈CDR2序列，其包含與序列VWYDGSKK至少70%相同的序列，和/或-重鏈CDR3序列，其包含與序列VRDKVGPTPYFDS至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含與序列NIGSET至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含與序列DDD至少70%相同的序列，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含與序列QVWDRSNYHQV至少70%相同的序列。優選地，本發明抗體或功能等同物含與圖14C所示的至少一種CDR序列至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，更優選至少90%相同的CDR序列。最優選地，本發明抗體或功能等同物包含與圖14C所示的至少一種CDR序列至少95%相同的CDR序列。上述特別優選的抗體AM23包含由圖14C所示CDR序列組成的CDR序列。因此，本發明特別優選的實施方式提供一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能等同物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含序列GFNFHNYG，和/或-重鏈CDR2序列，其包含序列VWYDGSKK，和/或-重鏈CDR3序列，其包含序列VRDKVGPTPYFDS，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含序列NIGSET，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含序列DDD，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含序列QVWDRSNYHQV。在一個實施方式中，提供的抗體或功能等同物包含如圖14C所示的三個重鏈CDR序列和三個輕鏈CDR序列，或者與其至少70%相同的序列。因此，進一步提供一種分離、合成或重組的抗體或其功能等同物，其包含含有與序列GFNFHNYG至少70%相同的序列的重鏈CDR1序列，含有與序列VWYDGSKK至少70%相同的序列的重鏈CDR2序列，含有與序列VRDKVGPTPYFDS至少70%相同的序列的重鏈CDR3序列，含有與序列NIGSET至少70%相同的序列的輕鏈CDR1序列，含有與序列DDD至少70%相同的序列的輕鏈CDR2序列和含有與序列QVWDRSNYHQV至少70%相同的序列的輕鏈CDR3序列。所述抗體或功能等同物優選包含與圖14C所示的上述重鏈CDR序列和上述輕鏈CDR序列至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的CDR序列。也提供包含上述圖14C的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述圖14C的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的抗體或功能等同物。也提供包含與圖14C所示重鏈序列至少70%相同的重鏈氨基酸序列的抗體或其功能等同物。這類重鏈序列提供所需的RSV結合特性，如抗體AM23所證明的那樣。因此，還提供一種抗體或其功能等同物，其重鏈序列包含與序列EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHDSWGQGTLVTVSS至少70%相同的序列。而且，與圖14C所示輕鏈序列至少70%相同的輕鏈氨基酸序列提供所需的RSV結合特性，如抗體AM23所證明的那樣。因此，也提供一種抗體或其功能等同物，其具有與序列SYVLTQPPSVSLAPGGTAAITCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLVVYDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV至少70%相同的輕鏈序列。本發明抗體或功能性部分優選包含與圖14C所示重鏈序列和/或輕鏈序列至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的重鏈可變區序列和/或輕鏈可變區序列。同源性越高，所述抗體或功能性部分越接近抗體AM23。本發明抗體或功能性部分優選包含類似AM23的重鏈和輕鏈的重鏈以及輕鏈。因此，還提供一種抗體或功能性部分，其包含與圖14C所示重鏈序列和輕鏈序列至少70%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%相同的重鏈序列和輕鏈序列。—個實施方式提供一種抗體或其功能等同物，其包含由圖14C所示重鏈序列構成的重鏈序列和由圖14C所示輕鏈序列構成的輕鏈序列。或者，如本領域技術人員所熟知，可能產生縮短、但維持感興趣結合特性的重鏈或輕鏈序列。優選地，與初始的重鏈或輕鏈相13比，產生的這種縮短的重鏈或輕鏈具有較短的恒定區。優選保持可變區不變。例如，基于圖14C所示重鏈序列或輕鏈序列產生Fab片段或F(ab')2片段。因此，也提供至少包含圖14C所示序列的功能性部分的抗體功能等同物。所述功能性部分的長度為至少20個氨基酸，包含與圖14C所示的至少一種CDR序列至少70%相同的序列。本發明提供與現有技術抗體相比具有改進特性的RSV-特異性抗體或其功能等同物。本發明者成功產生具有低IC50值的RSV特異性抗體。這類抗體對RSV的親和力特別高或特別強，因此特別適合對抗和/或至少部分預防RSV感染和/或RSV感染的不良影響。一個實施方式提供在HEp-2細胞感染RSV的體外中和實驗中IC50值小于10ng/ml的抗體以及所述抗體的功能等同物。所述抗體或功能等同物的IC50值優選小于5ng/ml，更優選小于2ng/ml。在實施例所述的體外中和實驗中，優選抗體D25的IC50值約為0.5_1.5ng/ml(參見圖8)。本發明抗體優選為人抗體。將人抗體用于治療人能降低由于人個體對非人序列產生免疫反應所致的副作用的幾率。在另一優選實施方式中，本發明的抗體或功能性部分、衍生物或類似物是嵌合抗體。以此方式，可以將感興趣的序列，例如感興趣的結合位點包括到本發明抗體或功能等同物內。本發明還提供分離、合成或重組的編碼本發明抗體或功能等同物的核酸序列或其功能性部分、衍生物或類似物。例如，這類核酸分離自能夠產生本發明抗體的B細胞，如下文更詳細地描述。優選的實施方式提供包含至少與圖11、圖12、圖14A、圖14B和/或圖14B所示核酸序列的功能性部分至少70%同源的序列的核酸序列。所述核酸序列優選包含至少與圖11、圖12、圖14A、圖14B和/或圖14B所示核酸序列的功能性部分至少75X、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%同源的序列。所述功能性部分的長度為至少30個核苷酸，優選至少50個核苷酸、更優選至少75個核苷酸。優選地，所述功能性部分編碼圖11D、圖12、圖14A、圖14B和/或圖14B所示的至少一種核酸序列。所述序列優選為CDR序列。本發明的抗體或功能等同物特別適合用作藥物或預防劑。本文也提供用作藥物和/或預防劑的本發明抗體或其功能性部分、衍生物或類似物。在特別優選的實施方式中，所述抗體包括抗體D25、AM14、AM16和/或AM23，或其功能性部分、衍生物或類似物。所述藥物或預防劑優選用于抵抗或至少部分預防RSV感染，或者抵抗或至少部分預防RSV感染的不良影響。因此，也提供本發明抗體、功能性部分、衍生物或類似物在制備用于至少部分治療和/或預防RSV相關疾病的藥物和/或預防劑中的應用，以及用于至少部分治療和/或預防RSV相關疾病的方法，所述方法包括給予需要的個體治療有效量的本發明抗體或功能等同物。所述抗體優選包括抗體D25、AM14、AM16和/或AM23，或其功能性部分、衍生物或類似物。為了抵抗RSV，本發明抗體或功能等同物優選在發生RSV感染之前給予個體。或者，在個體已經感染RSV時給予本發明抗體或功能等同物。所述抗體或功能等同物優選給予患RSV相關疾病風險提高的個體，如早產兒、患有慢性肺病、先天性心臟病和/或免疫功能不全的個體，以及6周齡以下的兒童。老年人患RSV相關疾病的風險也升高。本發明抗體或功能等同物優選通過口服或者一次或多次注射給予。根據需要嚴格制定方案的臨床試驗中的臨床劑量遞增研究，設計用于本文所述治療應用的本發明抗體和/或功能等同物的14劑量范圍。典型劑量為O.l至10mg/kg體重。在治療應用中，本發明抗體或功能等同物一般與藥學上可接受的載體、輔料、稀釋劑和/或賦形劑聯合使用。例如，合適載體的例子包括鑰孔血藍素(KLH)、血清白蛋白(如BSA或RSA)和卵清蛋白。本領域技術人員了解許多合適的油基和水基輔料。在一個實施方式中，所述輔料包括Specol。在另一實施方式中，所述合適的載體包括溶液，如鹽水。在另一實施方式中，使用編碼本發明抗體或功能性部分的核酸。給予這種核酸后，通過宿主的細胞機器產生抗體或功能等同物。所產生的抗體或功能等同物能夠預防和/或對抗RSV感染和/或RSV感染的不良影響。因此，本文也提供用作藥物和/或預防劑的本發明核酸序列、功能性部分、衍生物和/或類似物。所述核酸優選用于對抗RSV。因此，還提供本發明核酸序列、功能性部分、衍生物和/或類似物在制備至少部分治療和/或預防RSV相關疾病的藥物和/或預防劑中的應用。至少為本發明核酸的功能性部分指所述核酸的一部分，長度為至少30個堿基對、優選至少50個堿基對、更優選至少100個堿基對，其包含與本發明核酸相同的至少一種表達特征(種類相同，而量不一定相同)。所述功能性部分至少編碼包含與圖11D、圖14A、圖14B和/或圖14C所示CDR序列至少70%相同的序列的氨基酸序列。本發明還提供產生分離抗體的細胞，它能夠產生本發明抗體、功能性部分、衍生物或類似物。實施例中詳細描述了獲得這類產生抗體的細胞的可能(而非限制性)方式。本發明人開發和使用新方法來提高產生RSV特異性抗體的細胞的穩定性。使用這種方法產生的RSV特異性抗體產生細胞至少穩定6個月。因此，本發明也提供能穩定至少9周、優選至少3個月、更優選至少6個月的本發明RSV特異性抗體產生細胞。本發明者認識到，通過影響RSV特異性抗體產生細胞中BCL6和/或Blimp-l表達產物的量，能夠實現所述抗體產生細胞的穩定性。BCL6和/或Blimp-l表達產物的量受直接或間接影響。優選地，對所述抗體產生細胞內BCL6和Blimp-l表達產物的量均作調節，因為這兩種表達產物都涉及抗體產生細胞的穩定性。抗體產生細胞的穩定性定義為所述抗體產生細胞保持在某個發育階段的能力(優選在所述細胞進入所述階段后)。細胞的不同發育階段包括至少一種不同的所述細胞的特征。例如，已知記憶B細胞在剌激后通過一些研究者稱之為漿母細胞的階段分化成抗體分泌型漿細胞。記憶B細胞、漿母細胞和漿細胞是其中B細胞具有不同特征的B細胞的不同發育階段。記憶B細胞具有低增殖和低抗體分泌特性。與記憶B細胞相比漿母細胞具有較高的增殖水平和較高的抗體分泌水平，而漿細胞分泌高抗體水平，但不能增殖。使用本發明者所述的方法可能調節抗體產生細胞的復制壽命。在本文中，抗體產生細胞的復制壽命定義為B細胞和其后代細胞能夠復制并且維持其產生抗體和/或發育成抗體產生細胞的能力的時間。優選延長抗體產生細胞的復制壽命，這意味著所述抗體產生細胞將不發生終末分化，或者與目前使用的相同種類的抗體產生細胞相比只在較長時間后才發生終末分化，并且在體外持續增殖。按照本發明，可能調節抗體產生細胞中BCL6和/或Blimp-l表達產物的量，使得該抗體產生細胞進入和/或保持在預定的細胞持續增殖的發育狀態。因此，使用本發明方法可能延長抗體產生細胞的復制壽命，因為有可能將B細胞維持在發生復制的某個發育階段。參見本申請人提交的PCT/NL2006/000625。本發明提供產生穩定的RSV特異性抗體產生細胞的方式和方法。抗體產生細胞定義為能夠產生和/或分泌抗體或其功能等同物的細胞，和/或能夠發育成能夠產生和/或分泌抗體或其功能等同物的細胞的細胞。在本文中，RSV特異性抗體產生細胞定義為細胞能夠產生和/或分泌抗體或其功能等同物，所述抗體或其功能等同物能夠特異性結合RSV和/或RSV組分，如RSVF(融合)蛋白、RSVG(附連)蛋白或RSVSH(小疏水)蛋白的表位。優選地，所述RSV特異性抗體產生細胞包括B細胞和/或B細胞衍生的漿細胞。B細胞在本文中稱為抗體產生細胞，甚至在該B細胞處于抗體產量很低或根本不產生抗體的階段，如活化或未經活化的原始B細胞或記憶B細胞，因為這種細胞能夠發育成產生抗體的細胞，如漿母細胞和/或漿細胞。本發明RSV特異性抗體產生細胞優選包含哺乳動物細胞。非限制性例子包括衍生自人個體、嚙齒動物、兔、駱駝、豬、牛、山羊、馬、猿、大猩猩的抗體產生細胞。所述抗體產生細胞優選包括人細胞、鼠細胞、兔細胞和/或駱駝細胞。BCL6編碼正常B細胞和T細胞的發育和成熟所需以及生發中心形成所需的轉錄阻抑蛋白。(Ye，1997)。BCL6在生發中心B細胞中高表達，而在漿細胞中幾乎不表達。BCL6抑制活化B細胞向漿細胞的分化。轉錄阻抑蛋白B淋巴細胞誘導的成熟蛋白-l(Blimp-l)是B細胞發育成漿細胞必需的因子。Blimp-l的人變體稱為Prdml。如本文所用，任何提及Blimp-l的地方均包括Prdml。Blimp-l驅動槳細胞分化。BCL6和Blimp-l互相抑制表達；因此在天然狀況下，其中一種達到的表達水平高于另一種時，強制達到某分化狀態。在人體中，從活化原始B細胞或記憶B細胞分化成漿細胞涉及BCL6的下調和Blimp-l的上調。在生發中心，細胞BCL6表達水平高，Blimp-l表達水平低。在靜息的記憶細胞中，BCL6和Blimp-l的表達水平均較低。觸發分化的信號引起Blimp-l上調，此種Blimp-l對抗BCL6的表達。BCL6和Blimp-l均表達的階段很短，稱為漿母細胞。隨著Blimp-l水平的不斷提高，BCL6表達消失，導致形成漿細胞。在本發明的一個實施方式中，提供BCL6和Blimp-l共同表達的RSV特異性抗體產生細胞(意味著BCL6和Blimp-l均在所述抗體產生細胞中表達至少1天、優選至少1周、更優選至少6周、最優選至少3個月)。提供合適的信號時，所述RSV特異性抗體產生細胞能夠增殖。已發現，BCL6和Blimp-l共同表達產生能夠增殖和產生抗體的抗體產生細胞。BCL6和Blimp-l優選在B細胞，優選人B細胞中共同表達。BCL6和Blimp-l在B細胞中共同表達導致所述B細胞穩定在漿母細胞狀階段。漿母細胞類似于漿細胞，能夠分泌抗體。然而，漿母細胞仍然能夠增殖，而漿細胞已喪失增殖能力。因此，漿細胞不適合培養抗體產生細胞系。—個優選的實施方式提供RSV特異性抗體產生細胞，其包含編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列。外源性核酸在本文中定義為在天然情況下不屬于細胞基因組的核酸序列。使用這類外源性核酸分子，可能在不依賴內源性BCL6表達的情況下調節抗體產生細胞中的BCL6濃度。因此，即使內源性BCL6的表達水平較低或者不表達(例如Blimp-l所致)，編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列仍然能夠產生足夠影響抗體產生細胞穩定性的濃度的BCL6。所述編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列優選為為組成型活性，因此即使在所述細胞的內源性BCL6表達被內源性阻抑物如Blimp-l抑制時也能維持BCL6表達。最優選地，所述編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列的表達受阻抑物的外源性誘導物的調節，使得能夠任意調節BCL6表達的程度。優選地，如下文所詳述，本發明RSV特異性抗體產生細胞包含編碼Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列。如果存在Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物，則可能在低細胞密度的條件下培養漿母細胞。優選地，所述編碼Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列的表達受阻抑物的外源性誘導物的調節，使得能夠任意調節Bcl-xL表達的程度。因此，一個優選實施方式提供一種RSV特異性抗體產生細胞，其包含-編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列，和/或-編碼Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列。所述RSV特異性抗體產生細胞優選同時包含編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列和編碼Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列。優選地，所述編碼BCL6、Bcl-xL或者BCL6或Bcl-xL的功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列的表達受外源性化合物誘導的激活物和/或阻抑物的調節。例如，使用誘導型啟動子系統，例如Tet-on或Tet-off系統。優選通過在RSV特異性抗體產生細胞中共同表達BCL6和Blimp-l產生本發明的穩定的RSV特異性抗體產生細胞。RSV特異性抗體產生細胞優選獲自已接觸RSV的個體。分離抗體產生細胞的方法是本領域已知的。例如，用標記物或標簽作標記的RSV衍生化合物與接觸RSV的個體的樣品一起孵育，該樣品包含抗體產生細胞。分離識別該標記的RSV衍生化合物的RSV特異性抗體產生細胞，同時洗掉未結合的細胞。隨后，通過共同表達BCL6和Blimp-l使得到的RSV特異性抗體產生細胞穩定化。—個實施方式包括，首先穩定來自RSV接觸供者的全部抗體產生細胞，然后分離識別標記的RSV衍生化合物的細胞。在另一實施方式中，抗體產生細胞在其B細胞受體(BCR，抗體的膜表達形式)下游具有(熒光)標記物，所述受體在抗體產生細胞通過BCR結合未標記/未標簽的抗原時傳導信號。選擇該標記物翻轉的抗體產生細胞，隨后通過共同表達BCL6和Blimp-l使其穩定。在另一實施方式中，在沒有抗原衍生化合物可用，但有實驗可用于篩選獨特抗體時，通過共同表達BCL6和Blimp-l，任選還表達Bcl-XL來穩定全部/大批抗體產生細胞。按照這個實施方式，在L細胞存在下以低密度培養細胞，優選96孔板每孔中10至100個細胞(小批量培養物，MBC)。培養物上清液可直接用于篩選實驗，例如ELISA、Western印跡或功能試驗如ELISP0T，中和實驗或細胞遷移實驗。在一個實施方式中，選擇MBC，為了獲得感興趣抗體產生細胞的單克隆細胞系，對培養物進行有限稀釋，優選在2-3周后，再次用優選實驗篩選這些培養物的上清液。如本領域技術人員所熟知，本領域可獲得許多替換方法。上述實施方式是非限制性的。因此，還提供一種產生抗體產生細胞的方法，其穩定至少三個月并且能夠產生RSV-特異性抗體或其功能等同物，所述方法包括-提高能夠產生RSV-特異性抗體或其功能等同物的細胞中的Blimp-l表達水平；和-提高和/或維持所述細胞中的BCL6表達水平。利用本發明方法，可能將RSV特異性記憶B細胞轉變為漿母細胞樣細胞，并穩定所述細胞，因此不會快速分化成漿細胞。這與漿細胞的天然發育不同，其中Blimp-l在記憶B細胞中的表達導致快速發育成漿細胞，從而抑制BCL6表達，因此得到的漿細胞幾乎不表達BCL6。因此，本發明的一個實施方式包括在RSV特異性B細胞中共同表達BCL6和Blimp-l，產生能夠增殖和產生抗體的細胞。所述RSV特異性B細胞中BCL6表達水平優選被調整到或維持在與漿母細胞相同或更高的水平。以此種方式產生RSV特異性B細胞的穩定培養物，該細胞保持產生RSV-特異性抗體的能力。優選通過加入抗_凋亡基因Bcl-xL，進一步穩定共同表達BCL6和Blimp-l的這些RSV特異性B細胞。通過引入Bcl-xL，現在可能在低細胞密度條件下培養漿母細胞。因此，本發明也提供一種在低細胞密度的條件下培養漿母細胞的方法，所述方法包括用本文所述的任何方法產生具有BCL6、Blimp-l和Bcl-xL表達水平的RSV特異性抗體產生細胞。通過各種方式調節BCL6表達產物(優選BCL6蛋白)在RSV特異性抗體產生細胞中的含量。在一個實施方式中，向抗體產生細胞提供能夠直接或間接影響BCL6表達的化合物。優選向抗體產生細胞提供能夠增強BCL6表達的化合物，以對抗Blimp-l表達期間的BCL6下調。這類化合物優選包含信號轉導及轉錄活化蛋白5(STAT5)或其功能性部分、衍生物和/或類似物，和/或編碼它們的核酸序列。STAT5是能夠增強BCL6表達的信號轉導蛋白。STAT5有兩種已知形式STAT5a和STAT5b，它們由兩種不同的串聯基因編碼。給予和/或激活STAT5導致BCL6水平提高。因此，STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物對BCL6表達的上調作用至少部分補償了Blimp-l對BCL6的下調作用。因此，STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物能夠直接影響BCL6表達。也可能間接影響BCL6表達。例如，這可通過調節能夠直接或間接激活STAT5和/或調節STAT5表達的化合物的用量實現。因此，在一個實施方式中，提高內源性和/或外源性STAT5的表達和/或活性。例如，可能通過在能夠激活STAT5的白介素(IL)2和/或IL4存在下培養抗體產生細胞，間接增強BCL6表達。在一個實施方式中，向RSV特異性抗體產生細胞提供編碼STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列，其中所述核酸序列具有組成型活性，這意味著STAT5不依賴(內源性)調節物的存在而持續表達。在內源性STAT5表達水平較低或不表達的情況下，優選施加編碼STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性組成型活性核酸序列導致STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物的濃度足以增加BCL6表達。最優選地，向RSV特異性抗體產生細胞提供編碼包含STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物的化合物，優選融合蛋白的核酸序列，其活性受阻抑物的外源性誘導物的調節，因此可隨意調節BCL6表達的激活程度。提供誘導BCL-6的另一系統Tet-on系統，其中加入四環素和/或四環素衍生物誘導反式激活蛋白的活性，反式激活蛋白能誘導BCL6基因的轉錄，然后是BCL蛋白合成。在一個優選實施方式中，向抗體產生細胞提供編碼雌激素受體(ER)和STAT5的融合蛋白ER-STAT5的核酸序列。此種融合蛋白無活性，因為它在胞漿中與熱激蛋白形成復合物。STAT5不能以此種方式到達細胞核，無法提高BCL6表達。給予外源性誘導物4羥基-他莫昔芬(4HT)后，融合蛋白ER-STAT5與熱激蛋白解離，因此STAT5能夠進入細胞核并激活BCL6表達。此外或或者，在能夠直接或間接增強BCL6表達的化合物存在下培養所述抗體產生細胞，從而提高RSV特異性抗體產生細胞中的BCL6表達。因此，一種實施方式提供一種產生RSV特異性抗體產生細胞的方法，所述方法包括-向RSV特異性抗體產生細胞提供能夠直接或間接增強BCL6表達的化合物；和/或-在能夠直接或間接增強BCL6表達的化合物存在下培養RSV特異性抗體產生細胞。能夠直接或間接增強BCL6表達的所述化合物優選包含STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物。因此，本發明提供一種方法，其包括向所述RSV特異性抗體產生細胞提供STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物，或者編碼STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列。在一個實施方式中，在將編碼STAT5或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列引入所述細胞后，培養所述抗體產生細胞。例如，通過轉染和/或病毒介導的基因轉移將所述核酸序列引入所述細胞。本領域可獲得將核酸序列引入細胞的許多另選方法，在這里無須進一步解釋。使用能夠直接或間接增強BCL6表達的化合物，可能提高內源性BCL6的表達。然而，在一個優選的實施方式中，向抗體產生細胞提供編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列。如前所述，優選編碼BCL6的外源性核酸，因為這能夠在不依賴內源性BCL6表達的情況下調節細胞內的BCL6濃度。因此，即使內源性BCL6的表達水平較低或者不表達(例如Blimp-l所致)，編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列仍然能夠產生足夠影響抗體產生細胞穩定性的濃度的BCL6。因此，本發明也提供一種方法，其包括向RSV特異性抗體產生細胞提供編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列。優選地，向所述抗體產生細胞提供編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的組成型活性核酸序列，從而在所述細胞的內源性BCL6表達被內源性阻抑物如Blimp-l抑制時，維持BCL6表達。最優選地，通過阻抑物的外源性誘導物調節編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的所述核酸序列的表達，從而隨意調節BCL6的表達程度。例如，使用已有記載的誘導型啟動子系統，例如Tet-on或Tet-off系統。在另一優選的實施方式中，本發明提供一種方法，其中通過向RSV特異性抗體產生細胞提供編碼E47或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列間接調節BCL6含量。E47編碼的轉錄因子屬于螺旋-環-螺旋蛋白質家族，即E-蛋白家族。有四種E-蛋白，即E12、E47、E2-2和HEB參與淋巴細胞發育。E12和E47由一種基因即E2A編碼，但剪接不同。E-蛋白可被E蛋白抑制劑Id2和Id3，以及ABF-1抑制(MathasS.，2006)。E蛋白被描述為腫瘤抑制劑，其過度表達能誘導凋亡。E47的特異性靶點之一是Socsl和Socs3基因。這些Socs基因被稱為STAT5b的負調節基因，因而是BCL6的間接調節劑。換言之，E47在B細胞內的表達增強了Blimp-l表達，這導致B細胞向抗體產生表型(漿細胞)分化。也通過各種方式調節Blimp-l在RSV特異性抗體產生細胞中的表達量。在一個實施方式中，向RSV特異性抗體產生細胞提供能夠直接或間接影響Blimp-l表達的化合物。此外或或者，在能夠直接或間接影響Blimp-l表達的化合物存在下培養抗體產生細胞。因此，本發明還提供一種方法，其包括向RSV特異性抗體產生細胞提供能夠直接或間接影響Blimp-l表達的化合物。本發明還提供一種方法，其包括在能夠直接或間接影響Blimp-l表19達的化合物存在下培養所述抗體產生細胞。優選使用能夠增強Blimp-1表達的化合物，以對抗BCL6表達期間Blimp-1的下調。所述化合物最優選包括IL_21。在一個優選實施方式中，能夠直接或間接影響Blimp-1表達的所述化合物包括信號轉導及轉錄活化蛋白3(STAT3)蛋白或其功能性部分、衍生物和/或類似物，和/或編碼它們的核酸序列。STAT3是參與B細胞發育和分化的信號轉導蛋白。STAT3能夠上調Blimp-l表達。因此，本發明還提供一種方法，其中能夠直接或間接影響Blimp-l表達的所述化合物包括STAT3或其功能性部分、衍生物和/或類似物，或編碼STAT3或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列。最優選地，通過阻抑物的外源性誘導物調節編碼STAT3或其功能性部分、衍生物和/或類似物的所述核酸序列的表達，從而隨意調節STAT3的表達程度。例如，使用誘導型啟動子系統，例如Tet-on或Tet-off系統。在一個實施方式中，將包含STAT3、衍生物或類似物和ER的融合產物引入所述細胞，以便通過羥基他莫昔芬調節STAT3表達。由于STAT3能夠影響Blimp-l表達，也可能通過給予能夠直接或間接調節STAT3的活性和/或表達的化合物間接調節Blimp-l表達。在一個實施方式中，向抗體產生細胞提供能夠增強STAT3活性的化合物，以便間接提高Blimp-l的表達。因此，本發明還提供一種方法，其中向抗體產生細胞提供能夠直接或間接增強STAT3活性的化合物。因此，在一個實施方式中，向抗體產生細胞提供能夠直接或間接激活STAT3的化合物，以便提高Blimp-l表達。以各種方式激活STAT3。優選地，通過向抗體產生細胞提供細胞因子激活STAT3。在天然情況下參與B細胞分化的細胞因子能非常有效地調節STAT蛋白。STAT3的非常有效的激活物是IL-21和IL-6，而且已知IL-2、IL-7、IL-IO、IL-15和IL-27也能激活STAT3。而且，參與先天免疫的Toll-樣受體(TLR)也能夠激活STAT3。因此，本發明的一個實施方式提供一種方法，其中能夠直接或間接影響Blimp-l表達的所述化合物包括IL-21、IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15和/或IL_27。最優選使用IL-21,因為IL-21特別適合影響抗體產生細胞的穩定性。即使在BCL6對抗Blimp-1表達時，IL-21也能夠上調Blimp-1表達。此外或或者，使用突變的詹納斯激酶(JAK)以激活STAT3。天然條件下，JAK自身被至少一種細胞因子激活后能夠磷酸化STAT3。能夠不依賴細胞因子的存在而激活STAT3的突變的詹納斯激酶特別適用于本發明方法。如前所述，在一個實施方式中能夠增強Blimp-l表達的化合物包括編碼STAT3或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列。存在編碼STAT3或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列使得即使在內源性STAT3的表達非常低或不表達時，仍然持續存在STAT3或其功能性部分、衍生物和/或類似物。也可能降低STAT5的表達和/或活性，以上調Blimp-l。如果STAT5的含量和/或活性降低，也降低BCL6表達的激活，這導致BCL6表達產物含量降低。由于BCL6和Blimp-l互相對抗表達，所以BCL6表達產物量減少導致Blimp-l表達產物量增加。因此，能夠下調STAT5活性的化合物能夠間接上調Blimp-l。例如，這類化合物包括細胞因子信號傳導抑制蛋白(SOCS)。因此，在一個實施方式中，通過向所述細胞提供SOCS蛋白，和/或在所述細胞中激活SOCS蛋白，能上調RSV特異性抗體產生細胞中Blimp-l表達產物的含量。在一個優選實施方式中，向RSV-特異性抗體產生細胞提供編碼E47或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列時，STAT5的表達和/或活性降低。在高水平表達STAT5b的B細胞內表達E47干涉了分化和增殖，即通過E47和S0CS阻斷STAT5導致BCL6水平降低，隨后Blimp-l水平上升。Blimp-l水平上調導致增殖水平下降，并導致所涉及細胞向抗體產生細胞的分化。換言之，在B細胞內表達E47增強Blimp-l表達，這導致B細胞向抗體產生表型(漿細胞)分化。至少STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6的功能性部分指與STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6相比，影響抗體產生細胞的穩定性的能力相同_種類相同、量不一定相同_的蛋白性分子。例如，STAT5蛋白或STAT3蛋白的功能性部分不含不參與或是很少參與所述能力的氨基酸。STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6的衍生物定義為經改變，所述蛋白質影響抗體產生細胞的穩定性的能力種類基本相同而量不一定相同的蛋白質。以多種方式，例如通過保守性氨基酸取代提供衍生物，其中一個氨基酸被性質(大小、疏水性等)基本相似的另一氨基酸取代，使得總體功能不大可能受到嚴重影響。例如，衍生物包括融合蛋白，如STAT5-ER或STAT3-ER融合蛋白，其活性取決于4羥基-他莫昔芬(4HT)的存在。STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6的類似物定義為影響抗體產生細胞穩定性的能力種類相同而量不一定相同的分子。所述類似物不一定衍生自所述STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6。在一個優選實施方式中，在向所述抗體產生細胞提供編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列之前，在IL-21存在下培養所述RSV特異性抗體產生細胞。優選在向所述細胞提供編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列之前，在IL-21存在下培養RSV特異性抗體產生細胞，優選B細胞，因為在這些實施方式中，穩定性、增殖和/或抗體產生得到特別改善。在優選實施方式中，本發明提供一種影響本文所述RSV特異性抗體產生細胞的穩定性的方法，該方法還包括直接或間接提高所述抗體產生細胞中Bcl-xL表達產物的含量。例如，可通過向所述抗體產生細胞提供編碼Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列或編碼其他抗凋亡基因，包括但不限于Bcl-2的核酸序列實現上述目的。在另一實施方式中，通過向所述抗體產生細胞提供能夠直接或間接提高Bcl-xL表達的化合物實現這一目的，所述化合物包括APRIL、BAFF、CD40、BCR剌激、細胞因子、生長因子或下游效應物樣JNK和AKT(PKB)。Bcl-xL是抗凋亡Bcl-2家族成員，Bcl2蛋白與所謂的僅含Bcl-2同源結構域3(BH3)的家族成員如Bax、Bak、Bim和Bad相互作用或對抗，在接受到固有死亡剌激后誘導細胞色素c釋放(Boise，L.H.，1993)。因此，通過諸如Bcl-xL等蛋白質保護線粒體膜的完整性對于細胞存活至關重要。已證明，STAT5激活能保護細胞免于發生細胞死亡。STAT5能夠調節Bcl-xL的表達，這支持了STAT5的抗凋亡作用。STAT5通過Bcl-xL啟動子內的STAT結合元件正調節Be1-xL表達。在體內，在STAT5A/B-雙缺陷小鼠的骨髓中沒有Be1-xL表達。而且，STAT5-介導的成紅血細胞存活依賴于Bcl-xL的上調。近年來，已證明Bcl-xL在小鼠B細胞中的轉基因過表達可促進B細胞存活和非惡性漿細胞灶。本發明方法特別適合產生包含能夠增殖和分泌抗體的RSV特異性抗體產生細胞的細胞培養物。在一個實施方式中，使用RSV特異性記憶B細胞，以產生離體B細胞培養物。所述記憶B細胞優選是人細胞，以便產生人抗體。所述B細胞優選來源于個體，所述個體之前接觸過呼吸道合胞病毒。在一個實施方式中，利用本領域已知方法由外周血樣品和/或扁桃體樣品分離RSV特異性B細胞。例如，通過選擇(磁珠分選)B細胞標記物CD19和/或CD22和(隨后)選擇細胞表面IgG和/或CD27和/或負選擇IgM、IgD和/或IgA，分離記憶B細胞。在生發中心B細胞中，BCL6表達水平高，而Blimp-l表達水平低。抗體分泌細胞的自然發育包括Blimp-l表達上調。由于Blimp-l抑制BCL6表達，所以在天然情況下Blimp-l上調導致BCL6下調。在本發明的一個優選實施方式中，Blimp-l表達上調，而BCL6表達至少部分維持。這導致產生共同表達BCL6和Blimp-l的RSV特異性抗體產生細胞。所述RSV特異性抗體產生細胞能夠增殖和分泌抗-RSV抗體，因此適用于離體B細胞培養。在另一優選實施方式中，通過Bcl-xL保護所述抗體產生細胞不發生凋亡。本發明RSV特異性抗體產生細胞提供長時間保持穩定并且不發生終末分化的優點。本發明所述的抗體產生細胞穩定至少一周，優選至少一個月，更優選至少三個月，最優選至少六個月。優選在CD40L存在下培養本發明B細胞，因為CD40L有利于大部分B細胞的增殖。在一個實施方式中，與生發中心B細胞相比，BCL6表達維持在基本相同或較高的水平，因為顯著的BCL6表達以及Blimp-l表達產生具有優選的增殖和抗體產生特性和/或穩定性的抗體產生細胞。在優選實施方式中，所述BCL6表達和/或Blimp-l表達伴隨著Bcl-xL表達，產生更優選的增殖和抗體產生特性和/或穩定性。因此，一個實施方式提供一種產生RSV特異性抗體產生細胞的方法，所述細胞穩定至少一周，優選至少一個月，更優選至少三個月，更優選至少六個月，所述方法包括-提供RSV特異性記憶B細胞；-提高所述細胞中Blimp-l的表達水平；禾口-提高和/或維持所述細胞中的BCL6表達水平。還提供一種產生RSV特異性抗體產生細胞的離體方法，所述方法包括提高RSV特異性記憶B細胞中Blimp-l的表達水平，以及提高和/或維持所述細胞中的BCL6表達水平。優選地，將所述BCL6和Blimp-l表達水平調節到和/或維持在與槳母細胞相比基本相同或較高的水平。在優選實施方式中，用BCL6和Bcl-xL轉導所述B細胞。因此，還提供一種產生穩定至少三個月的RSV特異性抗體產生細胞的方法，所述方法包括-向能夠產生RSV特異性抗體的B細胞提供BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物。-向所述B細胞提供Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物；禾口-培養所述B細胞。優選向所述B細胞提供編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列，以及編碼Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列。優選在能夠增加Blimp-l表達的化合物，例如IL-21、IL_2、IL_6、11-7、IL-IO、IL-15、IL-27或突變的詹納斯激酶存在下培養所述B細胞。優選使用IL-21，因為這種細胞因子特別適合用本發明方法增強Blimp-l表達和穩定抗體產生細胞。而且，為了提高轉導效率，優選在用編碼BCL6和/或Bcl-xL，或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列轉導所述B細胞之前，在IL-21存在下培養所述B細胞。在一個實施方式中，向所述B細胞提供SOCS蛋白或其功能性部分、衍生物和/或22類似物，或者編碼它們的核酸，因為S0CS蛋白或其功能性部分、衍生物和/或類似物能夠間接增強Blimp-1表達。在另一可選或額外的實施方式中，向所述B細胞提供E47或其功能性部分、衍生物和/或類似物，或者編碼它們的核酸。如前所述，作為E47或其功能性部分、衍生物和/或類似物水平提高的結果，Socs蛋白功能增強，并且間接提高Blimp-l表達。在實施例中記載了特別優選的實施方式。按照一個特別優選的實施方式，首先在IL-21存在下培養RSV特異性B細胞。接著，用編碼BCL6的核酸和編碼Bcl-xL的核酸對所述B細胞進行轉導反應。優選使用離心轉導(spintransduction)。最優選地，混合包含至少一種感興趣核酸的B細胞和病毒，然后離心該混合物，以實現高轉導效率。轉導后，在不存在IL-21且存在IL-4和L-細胞的條件下培養B細胞3-5天，以便表達BCL6。接著，按照這個優選實施方式，再次用編碼BCL6的核酸和編碼Bcl-xL的核酸對所述B細胞進行轉導反應。然后，再次在不存在IL-21且存在IL-4和L-細胞的條件下培養B細胞3-5天，以便表達BCL6。接著，分離表達BCL6和Bcl-xL的細胞，再次將IL-21給予該培養物，以增強增殖和抗體產生。優選篩選培養物上清液中Bcl-6、Blimpl和Bcl-XL表達細胞分泌的抗體在體外對RSV的中和能力/活性/反應性。優選通過，例如有限稀釋培養進一步選擇產生這些抗體的抗體產生細胞。由此獲得穩定的同時表達BCL6和Blimp-l的RSV特異性B細胞。在體外培養的條件下，所述B細胞能夠在至少六個月的期間增殖和產生抗體。—個實施方式提供了一種本發明方法，該方法還包括選擇和/或分離RSV-特異性抗體或其功能等同物。在一個實施方式中，選擇和分離IgM產生細胞和IgG產生細胞。優選地，選擇和/或分離IgG產生細胞。用本發明方法產生的RSV-特異性抗體產生細胞適合產生抗RSV的抗體。然而，在一個優選實施方式中，由所述細胞中分離編碼Ig重鏈和/或輕鏈的基因并在第二種細胞，例如中華倉鼠卵巢(CH0)細胞系或293(T)細胞中表達。所述第二種細胞在本文中也稱為生產者細胞，優選適合商業抗體生產。所述生產者細胞的增殖得到能夠產生RSV-特異性抗體的生產者細胞系。優選地，所述生產者細胞系適合產生用于人的化合物。因此，所述生產者細胞系優選不含病原體，例如病原性微生物。本發明方法優選用于產生穩定至少一周、優選至少一個月、更優選至少三個月、更優選至少六個月的抗體產生細胞，以便進行商業抗體生產。最優選地，產生了能夠產生單克隆抗體的穩定細胞系。優選利用由(例如)樣品分離的記憶B細胞，通過選擇CD19和/或CD22(B細胞標記物)和細胞表面IgG和/或CD27(以標記記憶細胞)和/或通過對IgM、IgD和/或IgA進行負選擇來進行此種操作。而且，利用RSV或源白RSV的組分，例如RSVF蛋白、G蛋白和/或SH蛋白，在結合試驗中選擇RSV特異性抗體產生細胞。隨后，按照此種優選的實施方式，在所述RSV特異性抗體生產細胞中共同表達Blimp-l和BCL6，產生能夠特異性結合RSV(的組分)的細胞的培養物。在另一優選實施方式中，還向所述B細胞提供Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物。如果只使用一種記憶B細胞，則獲得產生單克隆抗體的本發明細胞系。也可能從能夠產生抗RSV抗體的B細胞得到能夠生產單克隆抗體的細胞系。用本發明方法產生穩定的B細胞培養物后，分離能夠產生抗RSV特異性抗原的抗體的B細胞，優選在第二種細胞系中表達來自所述B細胞的編碼Ig重鏈和/或輕鏈的基因的至少功能性部分。優選地，在第二種細胞系中表達來自所述B細胞的Ig重鏈編碼基因的至少功能性部分和Ig輕鏈編碼基23因的至少功能性部分。在一個實施方式中，由曾經接觸過RSV的個體獲得的抗體產生細胞，優選但不一定是記憶B細胞可用于本發明方法。以此方式，可能離體產生感興趣的人抗體。因此，還提供一種產生能夠特異性結合和/或中和呼吸道合胞病毒的抗體的方法，所述方法包括-利用本發明方法生產能夠產生RSV特異性抗體的抗體產生細胞；禾口-獲得所述抗體產生細胞產生的抗體。也提供可通過本發明方法獲得的分離或重組的抗體，以及分離或重組的抗體產生細胞，或其功能等同物。所述抗體優選包括抗體D25、AM14、AM16和/或AM23，或其功能性部分、衍生物或類似物。—旦獲得本發明的RSV特異性抗體產生細胞后，優選人工分離和/或產生編碼所述細胞的Ig輕鏈和/或重鏈的基因的至少功能性部分。在一個實施方式中，提供至少包含圖11、圖12、圖14A、圖14B和/或圖14C所示核酸序列的功能性部分的核酸序列。所述功能性部分優選包含圖11D、圖12、圖14A、圖14B和/或圖14C所示的至少一個核酸序列。所述功能性部分優選編碼圖11D、圖12、圖14A、圖14B和/或圖14C所示的至少一個CDR。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含與序列CAGGTGCAGCTGAA、ACTATATTATCAAC、TGGCTACGACAGGCCCCTGGACAAGGCCCTGAGTGGATGGGA、GGGATCATTCCTGTCTTGGGTACAGTACACTACGCACCGAAGTTCCAGGGC、AGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACAGACACAGCCCTACTACCTACCTACCACACTACTTTGACAAC、TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG和/或CAG部分至少70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的重鏈序列，所述部分具有至少15個核苷酸。所述重鏈序列優選源自抗體D25。所述重鏈序列優選包含與圖IID所示序列至少70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的序列。本文也提供包含由任何上述重鏈序列構成的重鏈序列的分離、合成或重組的核酸序列。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含與序列GACATCTCAGGACATTGTCAACTATTTAAAT、TGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAC、TCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACATATTATTGT、CAACAATATGATAATCTCCCA、CTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAAAGA和/或GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCTGT24TAATCTCCCACTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAAAGA的至少一部分至少70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的輕鏈序列，所述部分具有至少15個核苷酸。所述輕鏈序列優選源自抗體D25。所述輕鏈序列優選包含與圖11D所示序列至少70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的序列。本文也提供包含由任何上述輕鏈序列構成的重鏈序列的分離、合成或重組的核酸序列。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含與序列GAGGTGGATTCAGCTTCAGTCACTATGCC、ATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTT、AGTGGACGACTACTACTACTACGGTATGGACGTC、TGGGGCCAAGGGGCCACGGTCACCGTCTCCTCAG和/或G70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的重鏈序列，所述部分具有至少15個核苷酸。所述重鏈序列優選源自抗體AM14。本文也提供包含由任何上述重鏈序列構成的重鏈序列的分離、合成或重組的核酸序列。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含與序列GACATCCATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGGAACATATTACTGT、CAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACT、TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAC和/或GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCA少70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的輕鏈序列，所述部分具有至少15個核苷酸。所述輕鏈序列優選源自抗體AM14。本文也提供包含由任何上述輕鏈序列構成的重鏈序列的分離、合成或重組的核酸序列。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含與序列GAGGTGGATTCACATTCAGTAGTTATAAC、ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACAC、TGGTCCGGGAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCC、TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG和一部分至少70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的重鏈序列，所述部分具有至少15個核苷酸。所述重鏈序列優選源自抗體AM16。本文也提供包含由任何上述重鏈序列構成的重鏈序列的分離、合成或重組的核酸序列。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含與序列CAGTCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGAT、GTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGC、CACTCCTATGACAGAAGCCTGAGTGGT、TCAGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG和/或CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGC70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的輕鏈序列，所述部分具有至少15個核苷酸。所述輕鏈序列優選源自抗體AM16。本文也提供包含由任何上述輕鏈序列構成的重鏈序列的分離、合成或重組的核酸序列。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含與序列CAGGTGGATTCAACTTCCATAACTACGGC、ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTT、GGGACCGACTCCCTACTTTGACTCC、TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTATCCTCAG和/或GAGGTGCAGCTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT的至少一部分至少70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的重鏈序列，所述部分具有至少15個核苷酸。所述重鏈序列優選源自抗體AM23。本文也提供包含由任何上述重鏈序列構成的重鏈序列的分離、合成或重組的核酸序列。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含與序列TCCTAATCAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGT、CAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTA、TTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTAG和/或TCCTATGTGCTGACTCAGCCCCCCTCGGTGTCACTGGCCGATAGGAGTAATTATCATCAGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTC的至少一部分至少70%、優選至少80%、更優選至少90%同源的輕鏈序列，所述部分具有至少15個核苷酸。所述輕鏈序列優選源自抗體AM23。本文也提供包含由任何上述重鏈序列構成的重鏈序列的分離、合成或重組的核酸序列。也提供編碼與至少圖11、圖14A、圖14B和/或圖14C所示氨基酸序列的功能性部分至少70%、優選至少80%、更優選至少90%相同的氨基酸序列的核酸序列，所述部分具有至少5個氨基酸殘基。所述核酸序列優選編碼與圖IID所示的重鏈CDR序列1、2和/或3和/或輕鏈CDR序列1或2至少80%相同的氨基酸序列。在另一優選實施方式中，所述核酸序列編碼與圖14A、圖14B和/或圖14C所示的至少一種CDR序列至少80X相同的氨基酸序列。在一個優選實施方式中，所述核酸序列編碼與圖11A所示重鏈序列、與圖14A所示重鏈序列、與圖11B所示重鏈序列、與圖14C所示重鏈序列、與圖11A所示輕鏈序列、與圖14A所示輕鏈序列、與圖14B所示輕鏈序列和/或與圖14C所示輕鏈序列至少70X相同的氨基酸序列。因此，還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含編碼與圖11A-D所示氨基酸序列至少70%、優選至少80%、更優選至少85%相同的氨基酸序列的序列。所述核酸序列優選編碼與圖IIA-D所示的重鏈CDR序列1、2和/或3和/或輕鏈CDR序列1或2至少80%相同的氨基酸序列。一個實施方式提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含編碼與氨基酸序列NYIIN至少70%相同、和/或與序列GIIPVLGTVHYAPKFQG至少75%相同、和/或與序列ETALVVSTTYLmYFDN至少70%相同、和/或與序列QASQDIVNYLN至少85%相同、和/或與序列VASNLET至少70%相同、和/或與序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYII麗LRQAPGQGPE麗GGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS至少70%相同、和/或與序列LQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV至少70%相同的氨基酸序列的序列。本發明核酸序列優選與任何上述序列至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%同源。還提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含編碼與圖14A-C所示氨基酸序列至少70%、優選至少80%、更優選至少85%相同的氨基酸序列的序列。所述核酸序列優選編碼與圖14A、14B和/或14C所示CDR序列至少70%相同的氨基酸序列。一個實施方式提供一種分離、合成或重組的核酸序列，所述核酸序列包含編碼以下氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列至少70%相同GFSFSHYA、ISYDGENT、ARDRIVDDYYYYGMDV、QDIKKY、DAS、QQYDNLPPLT、EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFDYYYYGMDVWGQGATVTVSS、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYL麗YHQKPGKVPELLMHDASNLEr、GFTFSSYN、ISAGSSYI、AREDYGPGNYYSP麗FDP、SSNIGAGYD、GNT、HSYDRSLSG、EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSP麗FDPWGQGTLVTVSS、VRDKVGPTPYFDS、NIGSET、DDD、QVWDRSNYHQV、EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGM麗VRQAVSS禾口LTISRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV。本發明核酸序列優選與任何上述序列至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、最優選至少95%同源。如上文所述，本發明核酸序列特別適合在核酸表達系統中表達本發明的抗體或其功能性部分、衍生物或類似物，優選D25、AM14、AM16、AM23或其功能性部分、衍生物和/或類似物。本發明核酸序列優選在細胞中表達，更優選在適合抗體生產的生產者細胞中表達。在以下實施例中進一步解釋本發明。這些實施例不限制本發明范圍，僅僅用于闡述本發明。實施例材料和方法維持和分離人B細胞使用標準方法，從源自血液庫的暗黃層分離CD19陽性人B細胞(其他來源可以是含有抗凝因子的新鮮血液，或者淋巴器官如扁桃體或脾臟)。簡要說，利用菲可(ficoll)密度分離法(英國白金漢郡的安瑪西亞公司(Amersham，Buckinghamshire,區))分離總外周血單核細胞(PBMC)。通過生產商描述的MACS細胞分選技術(荷蘭烏得勒支的密特異公司(Miltenyi，Utrecht，Netherlands))，利用CD22標記的珠正選擇B細胞。隨后利用CD19、CD27、IgD、IgM和IgA的單克隆抗體(mAb)(美國新澤西州富蘭克林湖的BD公司(BectonDickinson,BD，FranklinLakes,NJ，USA))的適當組合對細胞染色。然后，用FACSAria(BD)分選CD19和CD27陽性且IgM、IgA和IgD陰性的記憶B細胞(圖1)。除記憶B細胞外，可以用合適的標記物分離其他B細胞亞組，例如原始細胞、濾泡細胞、記憶細胞、抗體產生細胞、中心母細胞、中心細胞、生發中心細胞、漿母細胞、漿細胞、邊緣區細胞、竇狀隙周細胞或移行B細胞(這些亞組中許多亞組只在小鼠中測定過)。細胞培養洗滌分選的細胞，并在鋪有經80格雷照射的表達CD40L的L細胞(5xl04個細胞/毫升；由法國先林葆雅公司(ScheringPloughFrance,DardillyFrance)的J.Banchereau博士提供)的24孔板上，使用完全培養基(含有8%胎牛血清(FCS)和青霉素/鏈霉素的伊可夫改良的D極限必需培養基(Iscove，sModifiedDMinimalEssentialMedium))培養(1.5-2xl()5個細胞/毫升)。除非另有說明，這些表達CD40L的L細胞總是用包含8XFCS的培養基培養。為了制備用于逆轉錄病毒轉導的B細胞，在小鼠IL-21(50ng/ml，美國明尼蘇達州密得蘭明尼阿波利斯的R&D公司(R&D，Mi皿e即olis，MN，USA))存在下培養細胞36小時。轉導后，優選在IL-21存在下培養細胞，然而細胞對IL-4、IL-15和IL-10(不排除其他細胞因子)有響應。例如，IL-4誘導的B細胞擴增低于IL-21，在某些實驗中可能需要較低的細胞分裂水平。逆轉錄病毒構建物和重組逆轉錄病毒的產生以前記載過STAT5a和b的組成型活性突變體。編碼這些突變體和野生型STAT5b的DNA獲自T.Kitamura(日本東京的MSUT公司(IMSUT，Tokyo,J即an))。鼠成纖維細胞的衰老拯救篩選中，Bcl-6被鑒定為抗增殖pl9ARF-p53信號轉導的抑制劑。Bcl-XL被鑒定為抗凋亡因子，它由Korsmeyer博士(美國波士頓的HH醫學研究所(HowardHughesMedicallnstitute，Boston,US))友情提供。將這些DNA連接到以前記載的LZRS-接頭-IRES-GFP(或IRES-YFP或IRES-NGFR)載體中(Heemskerk等，1997;Heemskerk等，1999)。也可使用IRES-YFP(黃色熒光蛋白)或IRES-NGFR(神經生長因子受體)替代IRES-GFP(綠色熒光蛋白)標記物。NGFR是NGFR的信號轉導失能突變體，由C.Bonini博士友情提供。使用NGFR的單克隆抗體(美國加州芒廷維尤的克羅瑪普公司(Chrom即robe，MountainView,CA，US)或密特異公司(Miltenyi))觀察表達NGFR的細胞。為了產生重組逆轉錄病毒，使用Fugene-6(荷蘭阿爾密耳的羅氏診斷荷蘭公司(RocheDiagnosticsNetherlands,Almere，Netherlands))，按照生產商方案，將逆轉錄病毒質粒轉染到輔助性的無病毒兼嗜性生產者細胞系Phoenix-A中，該細胞系是人胚腎細胞系293的衍生物(Kinsella和Nolan，1996)(由加利福尼亞州帕洛阿爾托的斯坦福大學的G.Nolan博士(Dr.G.Nolan，StanfordUniversity,PaloAlto，CA)友情饋贈)。兩天后，通過加入2iig/ml嘌呤霉素(加利福尼亞州帕洛阿爾托的BD克隆泰克實驗室公司(BectonDickinsonClontechLaboratories))開始選擇轉染的細胞。轉染后10-14天，將6xl06細胞接種到一個10cm的皮氏培養皿中(馬薩諸塞州貝德福德的BD發現實驗室設備公司(BectonDickinsonDiscoveryLabware，Bedford,MA))，其中含有10ml不含嘌呤霉素的完全培養基。第二天，更換新鮮培養基，第三天，收獲逆轉錄病毒上清液，離心并以無細胞等份試樣形式凍存于-70°C。這種方法提供一種可重現的快速、大規模和高效價逆轉錄病毒生產方法，其產量超過3xl06個感染性病毒顆粒/毫升。逆轉錄病毒轉導如以前記載(Heemskerk等，1997;Heemskerk等，1999)進行重組人纖連蛋白片段CH-296轉導方法(RetroNectinTM;日本大津的塔卡拉公司(Takara，0tsu，J即an))。用0.3ml30iig/ml重組人纖連蛋白片段CH-296室溫處理2小時或4"處理過夜，以便包被非組織培養處理的24孔板(荷蘭Badhoevedorp的克斯塔公司(Costar，Badhoevedorp，Netherlands))。使用不同大小的肺組織培養平板時，按比例使用試劑。取出CH-296溶液，然后在室溫下與磷酸緩沖鹽水(PBS)配制的2%人血清白蛋白(HSA)—起培育30分鐘，然后用PBS洗滌一次。將為逆轉錄病毒轉導制備的5xl05個B細胞接種到不含FCS和L-細胞的0.25mlRPMI中，與0.25ml融化的逆轉錄病毒上清液混合。對于Bcl-6Bcl-XL雙轉導而言，混合125ii1Bcl-6-IRES-NGFR(或IRES-YFP)(ShvartsA.等，GenesDev.，2002)和125iilBcl-XL-IRES-GFP(美國波士頓兒童醫院的HH醫學研究所(HowardHughesMedicalInstitute,ChildrensHospital,Boston,USA)的S.Korsmeyer提供)，并力口入細胞中。然后，該培養物以1800rpm、25。C離心60分鐘，37。C培育6小時。接下來，取出0.25ml上清液，29加入0.25ml新鮮的逆轉錄病毒上清液。該培養物再次以1800rpm、25t:離心60分鐘，37。C培育過夜。第二天早晨，將細胞轉移到24孔組織培養板(克斯塔公司(Costar))中，在存在人IL-4(50ng/ml)或小鼠IL-21(50ng/ml，美國明尼蘇達州明尼阿波利斯的R&D公司(R&D，Mi皿e即olis，MN，USA))的正常條件下培養3_5天。通過截短的神經生長因子受體的信號轉導失能突變體(ANGFR，由意大利米蘭圣拉夫爾醫院(St.RaphaelHospital,Milan,Italy)的C.Bonini提供)的抗體染色或GFP和/或YFP的(共)表達確定轉導效率。選擇含有感興趣轉基因的細胞進行進一步實驗。流式細胞術將FITC、PE，PERCP，PE-Cy5，APC或APC-Cy7直接標記的人分子IgD、IgG、CD3、CD19、CD20、CD27、CD38、CD40、CD45、CD56、CD70、CD80、CD86、HLA-DR(BD)的抗體，以及用PE(DAKO)直接標記的IgM、k輕鏈、A輕鏈、CD138用于流式細胞術分析。用LSRII(BD)分析染色細胞，用Flowjo計算機軟件(TS公司(TreeStar,Inc.))加工FACS數據。增殖實驗由FACSAria上的新鮮PBMC分離原始和記憶B細胞原始B細胞CD19-Pe-Cy7pos，CD27-APCneg，IgD-PEpos記憶B細胞CD19-Pe-Cy7pos、CD27-APCpos、IgD-PEneg、IgA-FITCneg用PBS洗滌細胞，重懸于O.5ml不含FCS的RPMI(37t:)。將等量的含有2yM羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯(CFSE)的MDM加入細胞混合物中，37t:培育7分鐘。用冰冷的FCS洗滌細胞，以終止細胞的標記。將細胞重懸于500ii1IMDM-8%FCS，并在存在或不存在IL-21的情況下與L細胞一起培養。未標記細胞用作對照。36小時后(剛好在轉導前)，分析一部分細胞的CFSE含量。用Bcl-6-IRES-NGFR離心轉導其余細胞，培養3天，用LSRII分析其CFSE含量。用FlowJo軟件(TS公司)分析數據。用高速單細胞分選分離抗原特異性人B細胞除上述從MBC開始(即100個細胞/培養孔)的記憶B細胞分離法之外，也可用熒光標記的抗原培育人記憶B細胞并根據抗原識別進行分選。例子是分離結合藻紅蛋白(PE)標記的破傷風類毒素的B細胞(由德國柏林的A.Radbruch(A.Radbruch，Berlin,Germany)提供)(圖4)。以1個細胞/孔培養細胞，并檢查TT結合。然而，可使用任何其他標記的抗原。測定Bcl-6和Bcl-XL轉導細胞的長期培養導致的B細胞受體(BCR)表達改變已知在體外培養期間分化的B細胞中BCR的膜表達消失，在EBV轉化的B細胞中也觀察到這種現象。因此，對于用Bcl-6和Bcl-XL轉導并在IL-21存在下培養的B細胞進行GFP、NGFR、CD19、k和/或A或IgG染色，或用標記的破傷風類毒素染色。為了證明BCR表達的有用性，我們用FACSAria(BD)以l個細胞/孔(96孔板)分選TT-PE(Radbruch)結合細胞，然后接種于含有L細胞和IL-21的培養基。三周后，用FACSCanto(BD)檢測長出克隆的破傷風類毒素結合。至此，收獲細胞并在96孔板中用GFP、NGFR、CD19和TT-PE染色。開發分泌抗體的Bcl-6和Bcl-XL雙陽性B細胞系建立能產生單克隆抗體并且是100%Bcl-6和Bcl-XL雙陽性的B細胞系。首先，30用IL-21誘導增殖和分化來實現這一目的。同時，用Bcl-6-IRES-NGFR和Bcl-XL-IRES-GFP逆轉錄病毒轉導這些細胞。在IL-4上維持這些細胞3-4天。隨后，用其中一種或兩種逆轉錄病毒轉導的細胞表達該轉基因，因而表達NGFR或GFP蛋白。可利用LSRII(BD)觀察NGFR和/或GFP的表達。如果必要，可再次轉導細胞，以獲得更多數量的表達兩種轉基因的細胞。無論是否進行第二次轉導，均用FACSAria(BD)分選表達兩種轉基因的細胞，在存在IL-21和2500-5000L細胞/孔的條件下用96孔板進行培養，細胞密度范圍為10-500個細胞/孔。到第5天，這些小批量培養物(MBC)在培養物上清液中分泌相當多的抗體，這些抗體隨后可用于篩選目的。篩選可基于感興趣抗原的可用技術，例如ELISA/EIA/RIA、Western印跡或直接功能實驗，如中和細胞因子封閉實驗。篩選和選擇識別感興趣抗原(在我們的實驗中是TT和RSV)的MBC后，以0.5_1個細胞/孔的密度在存在IL-21的96孔板中亞克隆細胞。亞克隆通常進行2-3周，可通過有限稀釋(LD)培養物或流式細胞術(FACSAria)單細胞分選進行。RSVA-2病毒母液和HEp2細胞系大量培養RSVA-2病毒(由烏得勒支WKZ(WKZ，Utrecht)的G.vanBleek友情提供)和HEp2細胞系(阿姆斯特丹AMC的臨床實驗室(CIinicalLaboratory，AMC，Amsterdam))，并凍存于液氮。T175Falcon培養瓶中，用正常培養基培養HEp2貼壁細胞系，然后凍存等份試樣。為了獲得較高效價的RSV母液，接種HEp2細胞并培養達到50-60X鋪滿。在室溫下利用45'將原始RSV母液(1/20稀釋，總體積5ml)加到HEp2細胞上。加入15ml新鮮培養基，在打開瓶蓋的情況下將細胞放入371:、5%0)2，o/n。第二天早晨，小心去除培養物上清液，加入15ml含有1%FCS的培養基。旋緊瓶蓋，將細胞放入37°C、5%C02中孵育24-36小時。RSV誘導的合胞體清晰可見時，大部分合胞體仍然保持完成，收集培養基，過濾(0.22iim)，在室溫下1450rpm離心，然后迅速冷凍樣品并儲存于液氮中。可通過立即加入含有1%FCS的新培養基并且在4-6小時后冷凍獲得第二收集物。用于ELISA的RSV裂解物用RSVA-2感染HEp2細胞獲得的病毒母液可用于分離RSV蛋白。用PBS小心洗滌第一個孔，并用胰蛋白酶消化。洗掉胰蛋白酶(吉布科公司(Gibco))，用1%辛基葡糖苷裂解細胞沉淀(一個T175培養瓶的細胞沉淀用2ml辛基葡糖苷處理)。用注射器和針頭勻漿化懸液(上下10次)，在冰上培育1小時，然后在fC用2LTBS緩沖液pH7.4，o/n透析。離心除去細胞碎片后，獲得上清液。測定蛋白質含量為3.6mg/ml，以20iig/ml(50ia)的濃度用于ELISA。測定RSV母液的TCID5。和PFU為了測定TCID50，將104個HEp2接種于96孔板，用2或10步連續稀釋的RSV病毒以4-plo感染HEp2。2-3天后，去除培養物上清液，在室溫下用80%丙酮固定細胞10'。除去丙酮后，干燥固定的細胞層，保持4t:或凍存于-2(rC。為了對RSVHEp2細胞染色，首先用PBS0.1%吐溫20配制的5%奶粉封閉平板。然后洗滌平板3次，接著在37t:與多克隆山羊抗-RSV-HRP(l:500，美國緬因州索科的生物設計公司(Biodesign，Saco，ME，US))一起培育3-5小時，徹底洗滌。接下來，在室溫下用AEC底物孵育該孔30'。感染的灶點染成紅色，可通過光學顯微鏡肉眼觀察并計數。使用標準Excel軟件確定TCID5。。為了確定病毒的空斑形成單位(PFU)數值，在24孔板中，將lxl07mlHEp2細胞與用含1^FCS的培養液10倍連續稀釋(10—3-10—7)的RSV病毒母液一起于37t:培育45'(200iil)，然后用0.5ml手溫的0.25%海斑(se即laque)瓊脂(拜載酶公司(Biozyme))覆蓋細胞和病毒。瓊脂糖層能防止病毒通過培養基散播到未感染細胞上。由此，病毒只能感染相鄰細胞，這些細胞最終被病毒殺死，在HEp2細胞單層中形成空斑。用1%結晶紫溶液對固定的細胞(96%乙醇-100%乙酸-10%甲醛6:2:1)染色，以觀察這些空斑。對空斑進行計數(至少由兩個不同個體進行計數)，確定PFU數值。呼吸道合胞病毒(RSV)中和抗體的選擇為了獲得抗_呼吸道合胞病毒(RSV)B細胞克隆，從源自血液庫的暗黃層分離兩位捐獻者的外周血細胞(PBMC)(捐獻者B62和B63)。用FACSAria(BD)分選CDigP。sigM卿IgD卿IgA卿CD27,細胞之前(圖1)，用MACS珠和柱(密特異公司)分離CD22+細胞。細胞與L細胞一起培養，除非另有說明。在IL-21存在下培養細胞36小時，然后只用Bcl-6-IRES-NGFR轉導。12小時后收集細胞，在IL-4存在下培養3天，然后用MACS珠(密特異公司)分選NGFR表達細胞并立即用Bcl-XL-IRES-GFP轉導。洗滌不結合MACS珠的B細胞，并用Bcl-6和Bcl-XL同時轉導。12小時后收集細胞，匯集并在IL-4存在下培養3天，然后在FACSAria上根據GFP和NGFR表達進行分選。洗滌細胞，并在IL-21存在下，以100細胞/孔的密度在96孔板(克斯塔公司(Costar))中培養。利用感染RSV的HEp2細胞裂解物ELISA篩選Bcl_6和Bcl-XL雙轉導B細胞培養物的RSV結合情況，用RSV微量中和實驗進行平行檢測。簡要說，將104個HEp2細胞接種于含有完全培養基的平底96孔板(克斯塔公司)。第二天，用37t:預孵育30分鐘的RSV病毒和細胞培養物上清液的混合物在室溫下替換培養基1小時。總體積為25iU，RSV終末濃度為0.IMOI。1小時后，用PBS將病毒上清液混合物稀釋9倍，并用100iilMDM/5%FCS替換。2天后，用80X丙酮固定細胞，并用多克隆抗-RSV-HRP(生物設計公司(Biodesign))染色。使用H202和AEC，感染RSV的細胞產生紅色。使用光學顯微鏡觀察感染的細胞，如果必要進行計數。使用山羊多克隆抗-RSV(馬薩諸塞州劍橋(Cambridge,MA)的Abeam公司)作為RSV中和的對照。VH和VL區的RT-PCR和克隆用RNeasy:微量試劑盒(荷蘭芬絡的凱杰公司(Qiagen，Venlo，TheNetherlands))從約5xl05個B細胞分離總RNA。在20yl含有IX第一鏈緩沖液、500iiMdNTP、250ng隨機六聚體、5mMDTT、40URNasin(普洛麥格公司(Promega))禾P200USuperscriptIIIRT(英杰公司(Invitrogen))的體系中逆轉錄250ng總RNA。用超純水將cDNA稀釋IOX，在50ii1含有20mMTris-HCL、50mMKCL、2.5mMMgCl2、250iiMdNTP、lUAmpliTaq金標DNA聚合酶(應用生物系統公司(A卯liedBiosystemsInc.))和25pmol各引物的溶液中對2.5illcDNA進行PCR。PCR條件如下96。C進行8分鐘變性步驟，然后是35個下述循環96。C30秒，60。C30秒，72。C1分鐘；最后是72。C延伸10分鐘。按照生產商推薦方案，在瓊脂糖凝膠上電泳PCR產物，純化并克隆到pCR2.1TA克隆載體中。用BigDye終止子化學(應用生物系統公司)和Vector-NTI軟件(英杰公司)進行序列分析。為了排除逆轉錄酶和/或DNA聚合酶誘發的突變，進行若干項獨立的cDNA轉化和PCR反應，并進行單獨克隆和序列分析。用Vector-NTI毗連群快車(Vector-NTIContigExpress)軟件確定共有序列。為了在293T細胞中表達重組蛋白質抗體，用pCDNA3.1(+)Zeo(英杰公司)產生全長重鏈和輕鏈構建物。通過PCR擴增克隆D25的重鏈先導序列和VH區，引入5'-Nhel位點和3'-XhoI位點，從而構建重鏈表達載體。由同一種cDNA擴增IgGl恒定區(CHI-鉸鏈-CH2-CH3)，同時引入5'-XhoI和3，-NotI位點。通過三點連入Nhel/Notl消化的pCDNA3.1(+)Zeo獲得全長重鏈表達載體。用引物通過PCR擴增輕鏈先導序列、VL區和輕鏈恒定區，引入5'-NheI和3'-NotI位點，從而產生全長輕鏈表達構建物。將后一產物克隆到Nhel/Notl消化的pCDNA3.1(+)Zeo中獲得全長輕鏈表達載體。進行序列分析，以確認該表達構建物的正確性。用重鏈和輕鏈表達載體對293T細胞進行瞬時雙轉染(Fugene-6，德國羅氏公司(Roche，Germany)或脂質轉染試劑LTX(LipofectamineLTX)，英杰公司)，從而獲得重組單克隆抗體。用感染RSV的H印2細胞的培養物上清液進行FACS染色(48小時)，以顯示抗體與RSVF-蛋白的功能性結合。用于PCR擴增的寡核苷酸是VHK:VHl-正向5'-AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3'VHlB-正向5'-AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGM-3'VH2A-正向5'-AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCTMCAC-3'VH2B-正向5'-AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAAC-3,VH3-正向5'-AAATCGATACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC-3'VH3B-正向5'-AAATCGATACCACCATGGARYTKKGRCT朋GC-3'VH4-正向5'-AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT-3'VH5-正向5'-AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC-3'v朋-正向5，-AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC-3'cy-反向5'-gggtctagacaggcagcccagggccgctgtgc-3'Vk區Vkl-正向5，--AAATCGATACCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3'VklB-正向5，-AAATCGATACCACCATGGACATGAGRGTCCYY-3'Vk2-正向5，-AAATCGATACCACCATGAGGCTCCCTGCTCAG-3'Vk3-正向5，-AAATCGATACCACCATGGAARCCCCAGCGCA-3'Vk4-正向5，-AAATCGATACCACCATGGTGTTGCAGACCCAG-3'Ck-反向5，-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-:V入區Vllaecb5，■-AAATCGATACCACCATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCC--3，Vllg5，.-AAATCGATACCACCATGGCCGGCTTCCCTCTCCTCC--3，V12/105，--AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCTGCTCCTCC-3'V13jpah5，■-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCGCTCTCCTGC--3，V15/75，■-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACTCCTCTCCTTC--3，33V16/95'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCCTCTCCTTC-3'V13rm5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATCCCTCTCCTCC-3'V1315'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCCCTCTCTGGC-3，V13e5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCCACACTCCTGC-3'V14c5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGTCTCCTTCTACC-3'V18a5'-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCC—3'C12/75'-GATCGCGGCCGCTTATCAWGARCATTCTGYAGGGGCCACTG-3'用于構建表達載體的寡核苷酸是重鏈表達載體VH1-L-Nhel:5'-GCGGCTAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGG_3，JH4/5-XhoI:5'-GCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3'CHfw-XhoI:5'-CGCGCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'CHrev-NotI:5'-GATCGCGGCCGCTTATCATTTACCCGGRGACAGGGAGAGGC_3，輕鏈表達載體VK1-L-Nhel:5'-GCGGCTAGCCACCATGGACATGAGGGTCCCY_3，CK-NotI:5'-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT_3，EBVRT-PCR為了檢驗強效增殖反應是否與EBV的存在相關，進行EBVRT-PCR。RT步驟如上所述。PCR條件如下94。C7分鐘變性步驟，然后是30個下述循環94°C30秒，62°C(HPRT1)、52°C(LMP-1)和58°C(EBNA1/2)30秒，72。C30秒；最后在72。C延伸7分鐘。用于RT-PCR的寡核苷酸如下HPRT1正向(5:TATGGACAGGACTGAACGTCTTGC-3—)禾PHPRT1反向(5'-GACACAAACATGATTCAAATCCCTGA-3—);LMP-1正向(5—-GCGACTCTGCTGGAAATGAT—3—)禾PLMP—1反向(5—-GACATGGTAATGCCTAGAAG-3—);EBNA1/2正向(5—-AGCAAGAAGAGGAGGTGGTAAG-3—)和EBNA1/2反向(5—-GGCTCAAAGTGGTCTCTAATGC-3—)。除RT-PCR外，我們還在用QIAmp分離試劑盒(凱杰公司)分離的細胞沉淀和上清液DNA上直接進行PCR。實施例1結果B細胞表型人記憶B細胞作為分離治療性藥物的平臺的應用依賴于在相當長的時間內培養和測試這些細胞的能力。可以在實驗室條件下培養和維持人B細胞，但維持時間不足以擴增、選擇和克隆針對感興趣抗原的單個B細胞系。我們根據對人B細胞的遺傳修飾開發永生化技術。我們研究了STAT5的下游靶點。一個靶點是Bcl-6。Bcl_6能抑制B細胞向增殖受阻的漿細胞分化。Bcl-6的過度表達保持與BLIMP1的平衡，BLIMP1是用IL-21剌激B細胞能強效增強其表達(通過STAT3起效)的轉錄因子。就誘導Ig產生細胞(CD20-CD38+)的發育而言BLMP1是必需的，而Bcl-6可阻止這一過程(細胞保持CD20表達，所謂的生發中心表型)。為了研究B細胞區域內某些細胞群可能的時滯(skewing)，剌激新鮮的記憶和原始人B細胞之前進行CFSE標記揭示出，所有細胞開始分裂，所有B細胞群被等同轉導(圖2)。顯示了用Bcl-6轉導并且在IL-21和IL-4存在下培養的記憶B細胞。在36小時時，原始B細胞的轉導水平較低，分裂速度較慢，但再培養3天后，與記憶B細胞完全相同(數據未顯示)。接下來，我們證明Bcl-6，以及Bcl-XL(STAT5的抗凋亡下游耙點)、CD40L信號傳導和IL-21存在下，能長時間(>3個月)維持人IgG記憶B細胞的CD20+CD38du11表型(圖3)。此外，Bcl-6Bcl-XLB細胞的表型對應于活化B細胞(見表l，例如3TT+B細胞克隆的FACS染色)，因為這些細胞中CD80、CD86和HLA-DR高表達。與IL-21和CD40L信號傳導一起培養的三種不同Bcl-6Bcl_XLB細胞克隆的測定染色染色CD2CD5CD7CD10CD20CD21CD22CD23CD24CD25CD27CD28CD30CD38CD40CD44CD45CD45RA結果陰性陰性陰性陽性陽性陽性陽性陰性/5%陽性陰性陽性陰性/低陰性陽性(56-74%)陽性陽性陽性陽性陽性中等CD69CD70CD71CD73CD80CD86CD95CD126CD132(共同Y)CD138CD154(CD40L)ICOSLIgMIgGHLA-DRk入結果陰性陽性陽性陰性陽性/高陽性陽性/高陰性陽性陰性/2%陽性8%陽性陽性陰性陽性陽性(高)陽性/陰性陽性/陰性陽性fIL21-R抗體膜表達經抗原結合或k和A染色測定，Bcl-6Bcl-XL轉導的EBV陰性細胞保持BCR表達陽性(圖3和4)。因此，這類細胞特別適合在長期培養后分離和/或篩選所需的特異性，例如利用標記抗原進行篩選，因為這類細胞將通過其BCR結合所述標記抗原。用FACSAria對結合PE標記的TT的Bcl_6和Bcl-XL雙轉導B細胞進行單細胞分選，從而進行驗證。三周后，在96孔板中用合適的標記物和TT-PE對單細胞分選的克隆進行染色，并用FACSCanto(BD)測定結合(圖4)。結論是，在需要B細胞上存在B細胞受體的情況下，例如篩選實驗中，優選用Bcl-6和Bcl-XL轉導B細胞，而不用EBV感染。細胞分裂和生長曲線Bcl-6Bcl-XL轉導的B細胞每天平均分裂0.6次。分裂速率因捐獻者和培養物細35胞密度而異(圖5a)。抗-RSV克隆D25的分裂速率為每天0.47次(圖5b)。可以低于1個細胞/96孔板培養細胞，用于克隆目的。Bcl-6Bcl-XLB細胞的抗體分泌Bcl-6Bcl-XL轉導的B細胞平均分泌1yg/ml抗體，這足以供應臨床前研究的需要量(圖6)。令人驚訝的是，D25抗-RSV克隆產生的抗體是其他測試細胞系的三倍。測定EBV含量對與IL-21和CD40L信號傳導一起培養的Bcl-6Bcl-XL細胞系的mRNA進行EBVRT-PCR。在用此種永生化技術獲得的細胞系中，未曾檢測到EBV基因轉錄物(數據未顯示)。選擇步驟由于生長和BCR表達的穩定性，這些細胞特別適合分離抗原特異性B細胞。它給予我們使用幾種不同的選擇和克隆方法的機會。一種是引入Bcl-6和Bcl-XL后通過標記的感興趣抗原的FACS或磁珠分選立即獲得抗原特異性細胞，從而提高產生多抗原特異性B細胞克隆的概率。另一種選擇是以低細胞密度(如100細胞/孔)批量培養純化的Bcl-6Bcl-XL轉導的記憶(或任何其他)B細胞。可收集這些100細胞/孔培養物的上清液，并檢測其特異性。發現100細胞/孔培養物能夠識別抗原，然后通過有限稀釋培養物進行亞克隆，獲得單克隆細胞系。使用這兩種方法，我們可分離到超過40個識別破傷風類毒素(TT)的B細胞克隆。因此，根據TT與BCR的結合用FACSAria選擇這些克隆，或者通過ELISA篩選一系列培養物進行選擇，直到分離到單個抗-TT單克隆細胞系(未顯示)。RSV中和抗體的選擇來自捐獻者B63的25個100細胞/孔的培養物完全阻斷RSV感染和復制。中和100細胞/孔培養物之一D10產生強效的抗-RSV抗體，我們通過有限稀釋培養進行克隆。單克隆抗體之一D25用于后續研究。經市售ELISA(阿姆斯特丹傘奎公司(Sanquin，Amsterdam)，未顯示)測定具有IgGl重鏈和k輕鏈的單克隆抗體D25(圖7)能非常有效地阻斷RSV感染，其IC5。值為0.5-1.5ng/ml(±10pM)，而臨床所用的標準抗-RSV抗體(米迪繆尼公司開發的帕麗珠單抗)的IC50為0.453iig/ml(3.02nM)(H.Wu等，2005J.Mol.Biol.和A.Mejias等，2005Antimicrob.AgentsChemother.)(圖8)。抗原識別除中和實驗外，還測定D25對感染RSV的HEp2細胞的結合。用常規病毒產生方案感染HEp2細胞。用胰蛋白酶消化感染RSV的HEp2細胞，并用25-50培養物上清液培育。洗滌細胞，用小鼠-抗-人IgG-PE(BD或杰克遜公司(Jackson))染色，以測定D25抗體與感染細胞的結合。r-BiopharmELISA對照抗體用作內標。圖9a顯示D25與感染RSV的完整HEp2細胞的結合。由于RSV包膜(膜)蛋白包括兩種蛋白質，即G蛋白和F蛋白，所以檢測D25與用不具有RSVF或RSVG蛋白的假型的VSV病毒(JohnKRose友情提供)感染細胞的結合。如圖9b所示，D25強效結合于感染VSV-F蛋白的EL-4細胞。嘗試研究D25與帕麗珠單抗識別的表位時，將感染VSV-F蛋白的EL-4細胞與用量遞增的D25或帕麗珠單抗一起孵育。洗滌細胞，用3種小鼠-抗-RSV-F抗體(大科公司(Dako))的混合物染色。與小鼠-抗RSV-F抗體競爭性結合感染的VSV-F細胞的帕麗珠單抗相反，D25結合未受影響(數據未顯示)。36圖9c顯示帕麗珠單抗(Synagis)和D25以濃度依賴方式結合于感染的HEp2細胞。由于這兩種抗體均以l:l結合其靶蛋白，所以與感染的HEp2細胞的結合沒有差異。RSV抗原結合與中和克隆的頻率我們計算，對捐獻者B63而言結合RSV的抗原特異性記憶B細胞的頻率為17%，中和RSV的抗原特異性細胞的頻率為6%。D25結合的構象表位不同于帕麗珠單抗識別的表位。這點可以從圖10看出，其中D25不結合包被在ELISA平板上的裂解的RSV感染細胞裂解物遞呈的變性線性表位，而帕麗珠單抗結合于變性(F)蛋白。抗體片段的分離和純化我們能夠從若干B細胞系，包括高RSV中和克隆D25獲得高達500ml的體積。這些培養物上清液含有至少2iig/ml，因此，我們應該能夠獲得足夠的純化抗體，以進行臨床前(動物)研究。用蒙太奇(Montage)抗原純化試劑盒(美國馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司(Millipore，Billerica，MA，USA))和HiTr鄰蛋白質AHP柱(比利時代根的GE健康護理公司(GEHealthcare，Diegem，Belgium))進行純化。此外，通過LipofectamineLTX(英杰公司)，利用在pCDA3.1蛋白質表達載體中亞克隆的D25的重鏈和輕鏈轉染293T細胞。上清液中的IgG含量約為22yg/ml(總體積50ml)。克隆的D25B細胞系表達抗體的核苷酸序列產生的此種抗體也識別感染的HEp2細胞(數據未顯示)。抗體序列圖lla顯示B63D10-D25克隆的重鏈和輕鏈核苷酸和氨基酸序列。使用標準的RT-PCR和抗體特異性引物，測定重鏈(Vhl-69)和輕鏈(Vkl08/018)序列。使用T0P0載體克隆全部抗體序列，序列控制后，亞克隆到pCDNA3.1哺乳動物蛋白表達載體(英杰公司)中。圖llb和11c描述了該克隆的VH和VL4鏈，星號表示與在親和成熟和進一步B細胞選擇期間必然出現的與Vhl-69種系序列相比的突變。總之，我們顯示了利用轉基因Bcl-6和Bcl-XL對人記憶B細胞進行分離、表征和長期培養。它們是我們分離具有獨特特性的抗體，例如抗-RSV單克隆抗體B63D10-B25所必需的工具。由于B細胞來自人來源，所以它們不難被開發成治療性藥物。實施例2如前所述(p44'抗體序列')，將D25重鏈和輕鏈克隆到標準表達載體中。為了產生能夠最大程度表達蛋白質的表達構建物，由GENEART(德國雷根斯堡(Regensburg，Germany))對D25重鏈和輕鏈序列進行密碼子優化。在這種方法中，產生額外的限制性位點，以簡化將來的克隆步驟，但最重要的是，優化翻譯成氨基酸序列的核苷酸密碼子，以便最大程度翻譯成蛋白質。因此，優化了核苷酸序列但氨基酸序列保持不變。實施例4顯示了源自純化的B細胞上清液的D25、重組D25和GENEART優化的D25的中和能力。它們都能有效中和RSV。與原始D25序列相比，GENEART所作的修飾見圖12。實施例3進行了體外RSV中和實驗后，我們在體內模型中檢測了D25單克隆抗體。曾記載用于體內抗RSV測試的模型是BALB/c小鼠和棉鼠(Sigmodonhispidus)(MejiasA等，AntimicrobialAgentsandchemotherapy2004;第1811頁，JohnsonS等，JID1997;第1215頁和WuH等，JMB2007:第652頁)。很明顯，BALB/c小鼠模型是最弱的模型，但由于棉鼠難以獲得和飼養，我們首先在BALB/c小鼠中建立D25測試。方案BALB/c中的RSV特異性抗體，5天實驗設計第-1天.I.P.注射100iil抗體第0天.I.N感染lxl07pfuRSVA2(50ii1)第1-5天，檢查小鼠的總體健康狀況并稱重第5天，尸解，收集BAL、血液和肺通過靜脈穿剌抽血通過氣管收集2.0mlBAL收集肺立即對BAL材料(lml)開始TCIDs。。將lmlBAL材料(ELISA細胞因子/RT-PCR)冷凍于-80C對制備的肺材料(lml)進行TCIDs。將lml肺材料(ELISA細胞因子/RT-PCR)冷凍于-80C收集/離心血液，對血清進行hlgGELISA，儲存于-80C結果見圖13:(A)通過鼻噴霧進行RSV剌激(lx107RSV-A2顆粒)前一天，對動物IP注射不同量的Synagis(米迪繆尼公司)、純化D25或IgGl對照抗體(優萊卡公司(Eureka))(表3)。(圖13B)從第5天起測定小鼠血清中的人IgG水平，抗體血清水平在5天中下降；表4顯示半衰期概述。圖13D描述第5天治療和未治療動物的肺灌洗液(BAL)中的病毒效價，而圖13E描述治療和未治療小鼠的外周血中T和B細胞數量。圖13F顯示未治療和治療動物的肺和支氣管浸潤(通常主要是嗜曙紅細胞)的組織切片。結論/結果根據(線性)計算估計D25半衰期是5-9天在第0天注射60和30yg抗體(分別為2和lmg/kg)，在第5天檢測到33或16iig(小鼠的總體積1，5)。以第0天每只動物注射0，5mg/kg開始時，在第5天Ig水平從15iig下降到11iig，這表明半衰期為9天(表4)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>TCID5。實驗測定的病毒效價表明，在對照動物中可檢測到lxl04PFU，而在Synagis(2mg/kg)或D25(2、l和0，5mg/kg)治療的動物中檢測不到病毒。用Synagis或D25治療的動物維持較高的外周血CD4T細胞和B220B細胞百分數。Synagis(2mg/kg)治療的動物的％CD4T細胞低于D25治療的動物。雖然這可能并不顯著，但需要注意的是，與對照治療動物相比用低劑量D25(1和0，5mg/kg)治療的動物能保持高水平的B和T細胞。雖然組織學數據(圖13F)不是定量數據，但能夠看出與對照相比Synagis和D25降低了免疫細胞向肺內和支氣管周圍的內流。比較D25和Synagis時，D25治療的動物中細胞浸潤到肺內和支氣管周圍的情況較少。為了在棉鼠中檢測D25，在NVI(荷蘭比多芬(Bilthoven，Netherlands))建立實驗來比較在RSV-X病毒剌激前用Synagis和D25預治療的動物。實施例4除B63-D10-D25以外，我們由同一捐獻者(B63)分離到三種新的強效RSV中和抗體(AM14、AM16和AM23)。將最初根據RSV中和選擇并凍存于液氮的100細胞/孔批量B細胞培養物解凍，檢測培養物上清液對感染RSV的HEp2細胞的結合。我們檢測與感染的H印2細胞的結合，因為它是抗體識別天然寡聚RSV膜蛋白如F和G蛋白的標記物，并可用作中和的良好預測指標。檢測結合時，對細胞進行單細胞培養，篩選結合以獲得克隆。將所有三種抗體克隆到最初為D25構建的GENEART載體中。此外，諸如D25等抗體都能識別RSV-F蛋白(未顯示)。在293T細胞中克隆和表達后，純化重組蛋白(核苷酸和氨基酸序列見圖14A、B和C)。在Vero和HEp2細胞上檢測抗體對幾種主要RSV分離物的中和(圖15)。所有三種抗體均為IgGl同種型。AM14具有k輕鏈，而AM16和AM23具有A輕鏈。所有三種抗體如D25在其抗體可變區中均含有體細胞高度突變，這提示它們在體內的生發中心反應期間已經歷親和成熟，這是產生獨特抗體序列的過程。結果見圖15-1和15-11:用源自純化的B細胞系上清液的D25(sD25)、重組純化的D25(rD25)、重組GENEART密碼子優化的D25(rD25GA)、AM14、AM16、AM23(均為純化的重組蛋白)和Synagis進行RS病毒中和實驗。在兩種不同細胞系(圖15-1)Vero和(圖15-II)H印2細胞上，用不同抗體檢測病毒的抗體中和能力A2(A)、X(B)和2006/l(C)是RSV亞型A，而病毒Z(D)和2007-2(E)是亞型B。將100TCID5。的每種病毒加入用DMEM/1%FCS連續稀釋的抗體溶液中，37。C培育1小時，然后加入lOOulVero或HEp2細胞(lxl07ml)。不洗掉病毒抗體混合物。三天后，去除上清液，在室溫下用80%丙酮固定細胞10'。除去丙酮后，干燥固定的細胞層，保持4t:或凍存于_20°C。為了對感染RSV的HEp2細胞染色，先用PBS0.1%吐溫20配制的5%奶粉封閉平板，然后洗滌平板3次，接著在37t:與多克隆山羊抗RSV-HRP(l:500，美國緬因州索科的生物設計公司)一起培育3-5小時，充分洗滌。接下來，在室溫下用AEC底物孵育所有孔30'。感染的灶點染成紅色，可通過光學顯微鏡肉眼觀察并計數。結果/結論所有抗體都能中和RSVA和B毒株(表5)。通常，不同D25抗體能有效中和RSV病毒，但可觀察到較小的實驗間差異。AM14與D25效力相同，而AM16與Synagis效力相同。然而，AM23能非常有效地中和RSVA毒株，但它中和RSVB毒株的效力較差，但仍與Synagis相當。表5IC50值(ng/ml)39<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在Vero或HEp2細胞上每種抗體對RS病毒亞型A的IC50值計算為對三種病毒株(A2、X和2006-1)的平均50%中和值。在Vero或HEp2細胞上每種抗體對RS病毒亞型B的IC50值計算為對兩種病毒株(2007-2和Z)的平均50%中和值。一式三份地進行各中和實驗，并重復兩次(也顯示在圖15A和B中)。sD25=純化B細胞產生的培養物上清液rD25二純化的重組D25rD25GA=293T細胞上清液和GENEART密碼子優化的重組D25實施例5抗-RSV抗體的協同和阻斷作用為了分析D25、Synagis或新AM抗體組是否互相干擾對RSVF蛋白的識別，我們用濃度遞增的未標記抗體預先孵育感染RSV的HEp2細胞，直到它們達到最大結合平臺。我們為每種抗體確定平臺期，在平臺期Ig量增加時結合不再增加。(未顯示)。洗滌后，將樣品與標準劑量(3pmo1)的PE標記的D25或APC標記的Synagis—起孵育。該劑量也達到最大結合。結果如圖16所示，用未標記的Synagis或D25預孵育感染RSV的HEp2細胞時，標記的Synagis和D25與這些細胞的結合水平降低。而且，Synagis能略微降低AM16誘導的結合。D25結合被AM23強烈阻斷，但相反的是，用AM14預孵育后強烈增強D25結合。這表明D25識別的表位通常未完全暴露，但AM14與其天然表位結合后增強其暴露。這證明這兩種抗體可一起發揮作用并增強中和作用。附圖簡要說明圖1人IgG陽性記憶B細胞的分離。利用菲可密度分離法(安瑪西亞公司)從暗黃層分離的PBMC與抗-CD22磁珠一起孵育，然后用MACS柱(密特異公司)分離。然后，將CD22陽性細胞與人CD19、CD27、IgM、IgD和IgA的抗體(BD)—起孵育。用高速單細胞分選技術(FACSAria，BD)分選呈IgM、IgD、IgA陰性和CD19、CD27陽性的細胞。圖2CFSE染色。分離新鮮人記憶B細胞，用CSFE標記，用IL-21剌激36小時，然后用Bcl-6-IRES-NGFR轉導。細胞與IL-21再共同孵育3天，然后測定CFSE含量。每次細胞分裂時稀釋CFSE染料。圖3用Bcl-6和Bcl-XL或只用Bcl-XL轉導的人B細胞的例子。在經輻射的表達CD40L和細胞因子IL-21的L細胞上維持細胞。左圖顯示通過k和A染色測定的BCR表達(93的kA陽性細胞為IgG同種型，未顯示)。右圖的X軸表示CD38表達，Y軸表示CD20表達。CD38dullCD20+染色表明是記憶或生發中心B細胞；CD38+CD20—染色表明是漿母細胞。圖4永生化的抗原特異性人B細胞的分離。如圖l所示分離人記憶B細胞，隨后用Bcl-6-IRES-NGFR和Bcl-XL-IRES-GFP轉導。用FACSAria分離表達NGFR、GFP并能結合PE-標記的破傷風毒素的細胞。在96孔平底培養板中，在經輻射的L細胞和IL-21存在下對細胞進行單細胞培養，然后利用FACSCanto(BD)根據TT-PE結合進行選擇。圖56XLB細胞克隆的累積細胞生長和分裂速率。在IL_21和經輻射的L細胞的存在下培養來自(A)兩個抗-TT克隆和(B)—個抗-RSV克隆(B63D10-D25)的B細胞。圖6用1，Oml含有8%FCS和青/鏈霉素的MDM，以200，000細胞/24孔板開始培養新鮮培養物。所用FCS為正常(海克隆公司(HyClone))或超低牛IgGFCS(吉布科公司(Gibco))。3天后，更換培養物上清液，將細胞數量調整到200，000細胞/毫升。顯示了在3個連續時間點上測量的3天內的平均IgG產量，沒有顯著性差異(p值為0.2)。圖7為了確定D25抗-RSV克隆的輕鏈表型，用k-藻紅蛋白或A-藻紅蛋白(BD)抗體對D25B細胞系染色。只有k-藻紅蛋白抗體結合該細胞系，表明該抗體具有k輕鏈。圖8用Bcl-6Bcl-XL陽性人記憶B細胞培養來自捐獻者B63的100細胞/孔培養物。其中一個培養物D10顯示出強烈的中和作用。制備源自LD的單克隆細胞系，一個D25有效中和RSVA-2病毒。這里顯示了D25與帕麗珠單抗(synagis)和多克隆山羊抗-RSV的比較。未顯示用IL-21和CD40L信號傳導培養的Bcl6Bcl-XL轉導的B細胞克隆的無關培養物上清液，它能產生高水平抗體，但不阻斷RSV感染。將D25克隆用于進一步表征。圖9在圖9a中以10-12e6細胞/T175培養瓶(Nunc)的密度，用MDM/5XFCS接種HEp2細胞。第二天，用5ml含RSV病毒(1.OMOI)的培養基替換培養基，室溫培育45'，然后加入20ml新鮮培養基，37°Co/n培養細胞。第三天，用MDM/1%FCS替換培養基，蓋緊蓋子37。Co/n培養。第四天，用PBS洗滌細胞并用胰蛋白酶處理。為了染色感染的細胞，用培養物上清液進行初步孵育。用抗人IgG-PE(BD)進行第二次孵育。用LSRII(BD)分析細胞。作為陽性對照，使用市售ELISA試劑盒(r-Biopharm)的陽性對照。在圖9b中用具有RSVF或G蛋白假型的VSV病毒(JohnRose友情提供)感染EL-4細胞，并用D25培養物上清液培育。洗滌細胞，用抗-人IgG-PE(杰克遜公司)培育，以測定D25與感染細胞的結合。只檢測到D25與具有RSVF蛋白假型的VSV病毒感染細胞的結合。圖9c顯示帕麗珠單抗(Synagis)和D25以濃度依賴方式結合于感染的HEp2細胞。顯示的是平均熒光強度(MFI)。圖10多克隆山羊抗-RSV(陽性對照)、帕麗珠單抗(synagis)和D25與包被的HEp2感41染細胞裂解物的結合。[O386]圖11D25克隆的序列分析。lla顯示重鏈和輕鏈可變區的核苷酸和預測的氨基酸序列。llb/c顯示與預測種系相比D25重鏈和輕鏈序列。星號表示可能在選擇和B細胞克隆的體內親和成熟過程中發生的突變。[O388]圖12由BCL6BCL-xL轉導的B細胞系克隆和表達重組人抗體。已經在D25抗體有關內容中記載過這一過程(圖11)。這里顯示了與原始D25序列相比的GENEART核苷酸修飾，需要注意這些突變不改變D25抗體的氨基酸組成。圖13用源自純化的B細胞上清液的D25和Synagis剌激BALB/c小鼠。(A)通過鼻噴霧進行RSV剌激(lxl07RSV-A2顆粒)前一天，對動物IP注射不同量的Synagis(米迪繆尼公司)、純化D25或IgGl對照抗體(優萊卡公司(Eureka))(表3)。(B)從第5天起測定小鼠血清中的人IgG水平，抗體血清水平在5天中下降(C);表4顯示半衰期概述。圖13D描述第5天治療和未治療動物的肺灌洗液(BAL)中的病毒效價，而圖13E描述治療和未治療小鼠的外周血中T和B細胞數量。(F)顯示未治療和治療動物的肺和支氣管浸潤(通常主要是嗜曙紅細胞)的組織切片。圖14三種新的強效RSV中和抗體(A)AM14、(B)AM16和(C)AM23的核苷酸和氨基酸序列。圖15用源自純化的B細胞系上清液的D25(sD25)、重組純化的D25(rD25)、重組GENEART密碼子優化的D25(rD25GA)、AM14、AM16、AM23(均為純化的重組蛋白)和Synagis進行RS病毒中和實驗。在兩種不同細胞系(圖15-I)Vero和(圖15-11)H印2細胞上，用不同抗體檢測病毒的抗體中和能力:A2(A)、X(B)和2006/1(C)是RSV亞型A，而病毒Z(D)和2007-2(E)是亞型B。將100TCID5。的每種病毒加入用DMEM/1%FCS連續稀釋的抗體溶液中，37t:培育1小時，然后加入100ulVero或HEp2細胞(lxl07ml)。圖16固定量(3pmo1)的APC標記的Synagis和PE標記的rD25與感染RSV的HEp2細胞的相對結合，HEp2細胞用濃度遞增的所示未標記抗體預孵育。參考文獻Banchereau，J.，dePaoli，P.，Valle，A.，Garcia,E.，Rousset，F.，(1991)."依賴白介素4和CD40抗體的長期人B細胞系"(LongtermhumanBcelllinesd印endentoninterleukin-4andantibodytoCD40)，Science251，70_2。Boise，LH.，M.Gonzalez-Garcia，C.E.Postema，LDing，T.Lindsten，LA.Turka，X.Mao，G.Nunez和C.B.Thompson.(1993)."Bcl-x，用作凋亡性細胞死亡的主要調節物的bcl_2相關基因，，(Bcl-x，abcl_2_relatedgenethatfunctionsasadominantregulatorof即optoticcelldeath).Cell74:597。Dadgostar，H.，Zarnegar，B.，Hoffmann,A.，Qin，X.F.，Truong，U.，Rao，G.，42Baltimore,D.和Cheng，G.(2002)."在B淋巴細胞中多種信號途徑在CD40調節的基因表達中的合作，，(CooperationofmultiplesignalingpathwaysinCD40_regulatedgeneexpressioninBlymphocytes).Proc.Natl.Acad.SciUSA99,1497-1502。Heemskerk等，1997:J.Exp.Med.第186巻，第1597-1602頁。Heemskerk等，1999:CellImmunol.第195巻，第10-17頁。Kinsella和Nolan，1996:Hum.GeneTher.第7巻，第1405-1413頁。Malisan，F.，Briere，F.，Bridon，J.M.，Harindranath，N.，Mills,F.C.，Max,E.E.，Banchereau，J.，Martinez-Valdez，H.(1996)."在CD40活化的天然人B細胞中白介素10誘導免疫球蛋白G同種型轉換重組"(Interleukin-10inducesimmunoglobulinGisotypeswitchrecombinationinhumanCD40-activatednaiveBlymphocytes)，J.Exp.Med.183,937-47。MathasS，JanzM，HummelF，HummelM，Wollert-WulfB，LusatisS，AnagnostopoulosI，LietzA，SigvardssonM，JundtF，JohrensK，BommertK，SteinH，DorkenB(2006)."HLH蛋白ABF-1和Id2固有地抑制轉錄因子E2A介導霍奇金淋巴瘤中月中瘤B細胞的重編程，，(IntrinsicinhibitionoftranscriptionfactorE2AbyHLHproteinsABF—landId2mediatesreprogrammingofneoplasticBcellsinHodgkinlymphoma).NatImmunol.7，207-215。MejiasA等，《抗微生物劑禾口化療》(AntimicrobialAgentsandchemother即y)2004;1811頁，JohnsonS等，JID1997;1215頁。WuH等，JMB2007:652頁。ShvartsA.等，2002:GenesDev.第16巻，第681-686頁。Traggiai，E.，Becker,S.，Subbarao，K.，Kolesnikova，，Uematsu，Y.，Gismondo，M.R.，Murphy，B.R.，Rappuoli，R.，Lanzavecchia，A.(2004)."從記憶B細胞制備人單克隆抗體的有效方法有效中和SARS冠狀病毒"(AnefficientmethodtomakehumanmonoclonalantibodiesfrommemoryBcells:potentneutralizationofSARScoronavirus).NatureMedicine第10巻，第8其月，871-875。Ye，B.H.，Cattoretti，G.，Shen，Q.，Zhang，J.，Hawe，N.，deWaard，R.，Le皿g，C.，Nouri-Shirazi，M.，Orazi，A.，Chaganti，R.S.等(1997)."BCL-6原癌基因控制生發中心形成禾口Th2型炎癥，，(TheB(X_6proto-oncogenecontrolsgerminal-centreformationandTh2_typeinflammation).NatGenet16，161—170。權利要求一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能性部分、衍生物和/或類似物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含與序列NYIIN至少70％相同的序列，和/或-重鏈CDR2序列，其包含與序列GIIPVLGTVHYAPKFQG至少75％相同的序列，和/或-重鏈CDR3序列，其包含與序列ETALVVSTTYLPHYFDN至少70％相同的序列，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含與序列QASQDIVNYLN至少85％相同的序列，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含與序列VASNLET至少70％相同的序列。2.如權利要求1所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物，其特征在于，其重鏈序列包含與序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYII麗LRQAPGQGPE麗GGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS至少70%相同的序列，和/或其輕鏈序列與序列DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYL麗YQQKPGKAPKLLIYVAS3.—種抗體，或所述抗體的功能性部分、衍生物和/或類似物，其在感染°1￥:勺HEp-2細胞的體外中和實驗中的ICs。值小于10ng/ml，優選小于2ng/ml。4.一種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能性部分、衍生物和/或類似物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含與序列GFSFSHYA至少80%相同的序列，和/或-重鏈CDR2序列，其包含與序列ISYDGENT至少80%相同的序列，和/或-重鏈CDR3序列，其包含與序列ARDRIVDDYYYYGMDV至少80%相同的序列，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含與序列QDIKKY至少80%相同的序列，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含與序列DAS至少80%相同的序列，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含與序列QQYDNLPPLT至少80%相同的序列。5.如權利要求4所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物，其特征在于，其重鏈序列和/或其輕鏈序列與序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYL麗YHQKPGKVPELLMHDASNLE6.—種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或°其1:能性部分、衍生物和/或類似物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含與序列GFTFSSYN至少80%相同的序列，和/或-重鏈CDR2序列，其包含與序列ISAGSSYI至少80%相同的序列，和/或-重鏈CDR3序列，其包含與序列AREDYGPGNYYSPNWFDP至少80%相同的序歹1」，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含與序列SSNIGAGYD至少80%相同的序歹1」，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含與序列GNT至少80%相同的序列，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含與序列HSYDRSLSG至少80%相同的序列。7.如權利要求6所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物，其特征在于，其重鏈序列包含與序列EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNM麗VRQAPGKGLEWVSHISAGSSYIYYSDSVKG列，和/或其輕鏈序列與序列QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYG8.—種分離、合成或重組的能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體或其功能性部分、衍生物和/或類似物，其包括-重鏈CDR1序列，其包含與序列GFNFHNYG至少80%相同的序列，和/或-重鏈CDR2序列，其包含與序列VWYDGSKK至少80%相同的序列，和/或-重鏈CDR3序列，其包含與序列VRDKVGPTPYFDS至少80%相同的序列，和/或-輕鏈CDR1序列，其包含與序列NIGSET至少80%相同的序列，和/或-輕鏈CDR2序列，其包含與序列DDD至少80%相同的序列，和/或-輕鏈CDR3序列，其包含與序列QVWDRSNYHQV至少80%相同的序列。9.如權利要求6所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物，其特征在于，其重鏈序列FAISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS至少70%相同的序列，和/RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV至少70%相同。10.如權利要求1-9中任一項所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物，其特征在于，它們是人抗體和/或嵌合抗體。11.一種分離、合成或重組的核酸序列，或其功能性部分、衍生物或類似物，其編碼權利要求1-10中任一項所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物。12.如權利要求1-10中任一項所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物，其特征在于，用作藥物和/或預防劑。13.如權利要求1-10中任一項所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物在制備用于至少部分治療和/或預防RSV相關疾病的藥物和/或預防劑中的應用。14.如權利要求ll所述的核酸序列、功能性部分、衍生物和/或類似物，其特征在于，用作藥物和/或預防劑。15.如權利要求ll所述的核酸序列、功能性部分、衍生物和/或類似物在制備用于至少部分治療和/或預防RSV相關疾病的藥物和/或預防劑中的應用。16.—種分離的抗體產生細胞，其能夠產生權利要求1-10中任一項所述的抗體、功能性部分、衍生物或類似物。17.如權利要求16所述的抗體產生細胞，其特征在于，能穩定至少9周、優選至少3個月、更優選至少6個月。18.如權利要求16或17所述的抗體產生細胞，其特征在于，BCL6和Blimp-l共同表達。19.如權利要求16-18中任一項所述的抗體產生細胞，其包含-編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列，和/或-編碼Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物的外源性核酸序列。20.如權利要求16-19中任一項所述的抗體產生細胞，其特征在于，編碼BCL6、Bcl-xL或者BCL6或Bcl-xL的功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列的表達受外源性化合物誘導的激活物和/或阻抑物的調節。21.—種產生抗體產生細胞的方法，所述細胞穩定至少三個月并且能夠產生RSV-特異性抗體，所述方法包括_提高能夠產生RSV-特異性抗體的B細胞中的Blimp-1表達水平；禾口_提高和/或維持所述B細胞中的BCL6表達水平。22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述B細胞中的BCL6表達水平被調整到和/或維持在與漿母細胞相比基本相同或更高的水平。23.如權利要求21或22所述的方法，其包括向所述B細胞提供編碼BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸序列。24.如權利要求21-23中任一項所述的方法，還包括提高所述細胞中Bcl-xL的表達水平。25.如權利要求24所述的方法，其包括向所述細胞提供編碼Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸。26.如權利要求21-25中任一項所述的方法，其包括_向能夠產生RSV特異性抗體的B細胞提供BCL6或其功能性部分、衍生物和/或類似物；_向所述B細胞提供Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或類似物；禾口-培養所述B細胞。27.如權利要求21-26中任一項所述的方法，其特征在于，在IL-21存在下培養所述B細胞。28.如權利要求21-27中任一項所述的方法，其特征在于，所述B細胞獲自曾經接觸過呼吸道合胞病毒的個體。29.如權利要求21-28中任一項所述的方法，還包括在第二種細胞中表達編碼Ig重鏈和/或Ig輕鏈的所述B細胞的基因。30.—種產生能夠特異性結合呼吸道合胞病毒的抗體的方法，所述方法包括_利用權利要求21-29中任一項所述的方法得到能夠產生RSV特異性抗體的抗體產生細胞；和_獲得所述抗體產生細胞產生的抗體。31.—種可通過權利要求30所述方法獲得的分離抗體，或所述抗體的功能性部分、衍生物和/或類似物。32.—種分離、合成或重組的核酸序列，其包含與圖11、圖12、圖14A、圖14B或圖14C所示核苷酸序列的至少一部分至少70%同源的序列，所述部分具有至少15個核苷酸。33.如權利要求32所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含與序列CTCTGGTTGTATCTACTACCTACCTACCACACTACTTTGACAAC、CAGGCGAGTCAGGACATTGTCAACTATTTAAAT、GTTGCATCCAATTTGGAGACA、CAACAATATGATAATCTCCCA、GGATTCAGCTTCAGTCACTATGCC、GACGTC、CAGGACATTAAGAAGTAT、GATGCATCC、CAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACT、GGATTCACATTCAGTAGTTATAAC、ATTAGTGCGGGTAGTAGTTACATA、GCGAGAGAGGATTATGGTCCGGGAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCC、AGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGAT、GGCAACACT、CACTCCTATGACAGAAGCCTGAGTGGT、GGATTCAACTTCCATAACTACGGC、GTTTGGTATGATGGAAGTAAGAAA、AACATTGGAAGTGAAACT、GATGATGAC和/或CAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTA至少70%同源的序列。34.—種分離、合成或重組的核酸序列，其包含的某一序列編碼與序列NYIIN至少70X相同、和/或與序列GIIPVLGTVHYAPKFQG至少75%相同、和/或與序列ETALVVSTTYLmYFDN至少70%相同、和/或與序列QASQDIVNYLN至少85%相同、和/或與序列VASNLET至少70%相同、和/或與序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYII麗LRQAPGQGPE麗GGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIfflJSLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS至少70%相同、和/或與序列DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYL麗YQQKPGKAPKLLIYVA氨基酸序列，和或與選自下組的序列至少70%相同的氨基酸序列gfsfshya、，sydg:nt、ARDRIVDDYYYYGMDV、QDIKKY、DAS、,D亂PPLT、E亂VESGGGVVQPGRSHSCAASGFSFSHYAYGMDVWGQGATVTVSS、AREDYGPGNYYSP麗FDP、SSNIGAGYD、GNT、HSYDRSLSG、EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSy腸YSP麗FDPWGQGTLVTVSS、VRDKVGPTPYFDS、NIGSET、DDD、QVWDRSNYHQV、EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGM麗VRQAvss禾口LTISRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV。35.—種至少部分治療或預防rsv相關疾病的方法，所述方法包括給予需要的個體治療有效量的權利要求1-10或31中任一項所述的抗體或其功能性部分、衍生物或類似物。全文摘要本發明提供能夠特異性結合RSV的抗體和其功能等同物，以及產生它們的方式和方法。文檔編號C07K16/10GK101778866SQ200880023301公開日2010年7月14日申請日期2008年5月30日優先權日2007年6月1日發明者H·斯皮茨,T·博蒙特申請人:米迪繆尼有限公司