專利名稱：：包含抗體替代輕鏈序列的構建體和文庫的制作方法包含抗體替代輕鏈序列的構建體和文庫發明領域本發明涉及包含抗體替代輕鏈序列的構建體和文庫。具體地，本發明涉及包含VpreB序列(任選地，與另一多肽諸如例如抗體重鏈可變域序列配偶的)的構建體及含有其的文庫。
背景技術：
：由B淋巴細胞所生成的抗體(Ig)分子是由重(H)鏈和輕(L)鏈構成的。H和L鏈的氨基端域的氨基酸序列是可變的(Vh和Vl),尤其在形成抗原結合位點的三個高變區(CDR1、CDR2、CDR3)處。H和L鏈的裝配物通過L鏈的恒定區(CO和重鏈的第一恒定區(Cm)之間的二硫鍵及通過VH和Vt域之間的非共價相互作用而穩定化。在人和許多動物(諸如小鼠)中，編碼抗體H和L鏈的基因是通過編碼V區各部分的基因片段的逐步體細胞重排而裝配的。B淋巴細胞發育的各個階段以Ig基因基因座的重排狀態表征(參見例如Melchers，R和Rolink,A.，《B-LymphocyteDevelopmentandBiology》，Paul,W.E.編,1999,Lippincott,Philadephia)。B細胞的前體(前B細胞)已經在骨髓中凈皮鑒定為這樣的淋巴細胞，它們生成p重鏈，但是不是完全形成的輕鏈，而是表達一組分別稱為VpreB(l-3)和入5的B譜系特異性基因。人VpreBl的主要同等型(CAG30495)是一種長145個氨基酸的多肽(SEQIDNO:l)。它具有IgV域樣的結構，但是缺乏典型V域的最后的(3鏈((37)，并且具有與任何其它蛋白質沒有顯示序列同源性的羧基端末端。VpreB2具有數種同等型，包括142個氨基酸的小鼠VpreB2多肽(P13373;SEQIDNO:2)、和長171個氨基酸的小鼠VpreB2序列剪接變體(CAA019641SEQIDNO:3)。VpreBl和VpreB2序列已經披露于EP0269127和美國專利No.5,182,205;Collins等，GenomeBiol.5(10):R84(2004);及Hollins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(14):5552-5556(1989)。人VpreB3的主要同等型(SEQIDNO:4)是一種7長123個氨基酸的蛋白質(CAG30496),其披露于Collins等，GenomeBiol.5(10):R84(2004)。VpreB(l-3)與另一種蛋白質人5非共價結合。人X5是一種209個氨基酸的多肽(CAA01962;SEQIDNO:5),它攜帶與抗體輕鏈具有強烈同源性的IgC域樣結構和朝向其氨基端末端的兩個功能上獨特的區域，其中之一與W或的(37鏈顯示了強烈的同源性。人X5樣蛋白具有213個氨基酸(NP—064455;SEQIDNO:6),而且與抗體人輕鏈恒定區顯示約84%的序列同一性。關于進一步的詳情，參見下列綜述文章Karasuyama等，Adv.Immunol.63:1-41(1996);Melchers等，ImmunologyToday14:60-68(1993);及Melchers,Pro"Natl.Acad.Sci.USA96:2571-2573(1999)。VpreB和X5多肽一起形成非共價結合的Ig輕鏈樣結構，其稱為替代輕鏈(surrogatelightchain)或j艮專至鏈(pseudolightchain)。在早期前B纟田月包表面上，替代輕鏈與膜結合Igp重鏈以二硫一建連接，并與信號轉導物CD79a/CD79b異二聚物結令以形成B細胞受體樣結構，所謂的前B細胞受體(preBCR)。發明概述一方面，本發明涉及包含與異質氨基酸序列偶聯的VpreB序列或X5序列的多肽，其中所述多肽能夠結合靶物。在一個優選的實施方案中，所述多肽包含VpreB序列，其中VpreB可以是任何天然VpreB,包括人VpreBl(SEQIDNO:1)、小鼠VpreB2(SEQIDNO:2和3)和人VpreB3(SEQIDNO:4),或其在另一種哺乳動物物種中的同源物，或其片段或變體，只要所述多肽保留結令靶物的能力。在一個優選的實施方案中，所述異質氨基酸序列是X5序列，其可以是任何天然X5序列，或其任何片段或變體，包括SEQIDNO:5的天然人入5序列、SEQIDNO:6的人入5樣序列、及其片段和變體。所述VpreB序列和所述異質氨基酸序列(例如人5序列)可以是彼此直接融合的，或者可以是非共價結合的。在前一種情況中，優選地，所述融合分別在VpreB和X5的CDR3類似區處或周圍發生。在另一個實施方案中，所述異質氨基酸序列是或包含抗體輕鏈可變區序列。在一個具體的實施方案中，所述抗體輕鏈可變區序列是在與抗體輕鏈CDR3區類似的位點處與所述VpreB序列融合的。在另一個實施方案中，所述融合在抗體輕鏈的CDR3區和VpreB的CDR3類似區之間。在所有的實施方案中，所述抗體輕鏈可以是X鏈或K鏈。在具體的實施方案中，本文中的多肽[包括但不限于VpreB-Ai偶聯物(包括融合物、其它共價連接、和非共價結合)和VpreB-抗體輕鏈偶聯物]可以進一步與包含抗體重鏈可變區序列(諸如抗體重鏈可變區)或完整抗體重鏈(包括可變區)的序列結合。在所述多肽包含X5序列時，X5可以是任何天然X5，包括SEQIDNO:5的人人5和SEQIDNO:6的人X5樣蛋白，或另一種哺乳動物物種中的同源物，或其任何片段或變體，只要所述多肽保留結合靶物的能力。在一個具體的實施方案中，與所述X5序列偶聯的所述異質氨基酸序列是VpreB序列。在本發明的多肽構建體中，VpreB和人5序列(若都存在的話)可以是通過任何手段得到的偶聯物，包括直接融合、通過接頭序列(例如肽接頭)實現的共價連接、和非共價結合。在一個具體的實施方案中，VpreB序列和X5序列的融合物通過非共價結合而與抗體重鏈序列偶聯，以形成二聚體復合物。在另一個實施方案中，通過VpreB序列、人5序列和抗體重鏈序列的非共價結合而形成三聚體復合物。在某些實施方案中，在這些結構(它們也被稱為"SURROBODYTM變體，，的變異型替代輕鏈結構)中，VpreB和人5部分之一或兩者的特征性尾部(附屬物)可以(但非必須)保留。有可能將別的功能性(functionality)附著于此類附屬物。另外，在多個實施方案中，可以設計并制備有益的附屬融合物，以便改善構建體的各種特性，諸如PK和/或效力。在所有的實施方案中，在存在包含可變區序列的抗體重鏈時，4^發明的多肽和抗體重鏈可變區序列可結合相同的或不同的靶物。另一方面，本發明涉及此類多肽的文庫。又一方面，本發明涉及與包含可變區序列的抗體重鏈或其片段結合的此類多肽的文庫。在一個進一步的方面，本發明涉及包含任選地與抗體重鏈可變區序列結合的替代輕鏈序列的集合的文庫。在所有的方面，所述文庫可以處于展示形式，諸如例如噬菌體展示、細菌展示、酵母展示、核糖體展示、mRNA展示、DNA^l示、哺乳動物細胞上的展示、孢子展示、病毒展示、基于蛋白質-DNA連接的展示、和微珠展示。本發明進一步涉及此類多肽和含有此類多肽的文庫的各種用途，例如用有重要的治療應用。附圖簡述圖l顯示了人VpreBl(SEQIDNO:1)和人人5與抗體人鏈可變區和恒定區的比對。VpreBl與抗體人鏈可變區共享一些序列相似性，而X5與抗體X鏈恒定區和框架區4共享一些相似性。框示的區域鑒定出分別與抗體人鏈CDR1、CDR2和CDR3區相似的VpreB1和i5序列。圖2是由VpreB和人5序列所形成的替代輕鏈、包含替代輕鏈序列的例示性融合多肽、和自V-J連接衍生的抗體輕鏈結構的示意圖。圖3是多種替代輕鏈刪除和單鏈構建體的示意圖。圖4示意性地顯示了將組合功能多樣性摻入替代輕鏈構建體中。圖5顯示了多種例示性替代輕鏈構建體的基因和蛋白質結構。圖6是VpreB1序列與抗體X5輕鏈可變區序列的比對。框示了具有最高程度序列相似性的區域。如該圖中所示，VpreBl與X5輕鏈可變區種系序列僅顯示56%-62%(氨基酸2至97)的序列同一性。圖7是VpreBl序列與抗體人5輕鏈恒定區序列的比對。如該圖中所示，所比對的VpreBl序列與相應的抗體i5輕鏈恒定區序列僅顯示62。/()(氨基酸97至209)的序列同一性。圖8是VpreBl序列與抗體K輕鏈恒定區序列的比對。如該圖中所示，所比對的VpreB1序列與相應的抗體K輕鏈恒定區序列僅顯示35%(氨基酸105至209)的序列同一性。.圖9顯示了將功能性添加至替代輕鏈(SLC)構件的多種例示性方式。圖10顯示了SEQIDNO:l的人VpreBl序列、SEQIDNO:2和3的小鼠VpreB2序列、SEQIDNO:4的人VpreB3序列、SEQDNO:5的人X5序列和SEQIDNO:6的人X5樣蛋白質序列、和實施例中所使用的多種構建體的序列。圖ll顯示了本發明的多種三聚體和二聚體替代輕鏈構建體。圖12:替代輕鏈和所偶聯的重鏈的檢測。第l道全長；第2道人5dT;第3道VpreBdt;第4道短的；第5道SCL融合物1;第6道SLC融合物2;第7道抗體。圖13:SLC融合蛋白良好地表達并分泌入大腸桿菌(五.co/Z)的周質中，而且它們與來自IgGl而不是來自IgM的重鏈CHl最好地配偶。小圖A:大腸桿菌中的SCL融合蛋白表達。小圖B:IgGly鏈比IgMp鏈更好地與SLC融合物配偶并純化。圖14:經由抗噬菌體檢測進行的噬菌體替代輕鏈構建體捕捉ELISA。圖15:哺乳動物細胞中所表達的純化的替代輕鏈構建體結合病毒靶物。圖16:哺乳動物細胞中所表達的純化的替代輕鏈構建體含有結合病毒抗原的穩定復合物。圖17:用大腸桿菌周質溶胞物進行的抗原結合。圖18:與中和性重鏈配對的替代輕鏈融合物構建體噬菌體容易結合H5HA抗原。圖19:與中和性重鏈配對的替代輕鏈構建體噬菌體結合抗原。圖20:匯總噬菌體展示實驗結果的表。圖21和圖22:第l輪和第2輪替代輕鏈融合物1和2的克隆分析結果。發明詳述A.定義除非另有定義，本文中所使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員的一般理解相同的意義。Singleton等，《DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology》，第2版,J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994)為本領域技術人員提供本申請中所使用的許多術語的一般指導。本領域技術人員會認識到與那些本文中所描述的類似或等同的許多方法和材料，這些方法和材料可以用于實施本發明。實際上，本發明絕不限于所述方法和材料。出于本發明的目的，下列術語定義如下。如本文中所使用的，術語"替代輕鏈"指通過VpreB和X5蛋白的非共價結合所形成的二聚物。術語"VpreB"在本文中以最廣義使用，指任何天然序列或變異型VpreB多肽，明確包括但不限于SEQIDNO:l的人VpreBl、SEQIDNO:2和3的小鼠VpreB2、SEQIDNO:4的人VpreB3和同等型，包括剪接變體和通過翻譯后修飾所形成的變體，它們的其它哺乳動物同源物，以及這些天然序列多肽的變體。術語"人5，，在本文中以最廣義^f吏用，指任何天然序列或變異型X5多肽，明確包括但不限于SEQIDNO:5的人人5、SEQIDNO:6的人X5樣蛋白、及其同等型，包括剪接變體和通過翻譯后修飾所形成的變體，它們的其它哺乳動物同源物，以及這些天然序列多肽的變體。術語"變異型VpreB多肽"和"VpreB多肽變體"可互換使用，在本文中定義為由于氨基酸修飾而與天然序列VpreB多肽在一個或多個氨基酸位置處不同的多肽。如本文中所定義的，"變異型VpreB多肽"會不同于天然抗體X或K輕鏈序列，或其片段。優選地，"變異型VpreB多肽"會保留至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90°/0、或至少約95%、或至少約98。/。的與天然序列VpreB多肽的序列同一性。在另一個優選的實施方案中，"變異型VpreB多肽"在其氨基酸序列方面與天然抗體X或K輕鏈序列會是小于950/。、或小于90%、或小于85%、或小于80%、或小于75%、或小于70%、或小于65%、或小于60°/。相同的。變異型VpreB多肽明確包括但不限于這樣的VpreB多肽，其中VpreB序列C端的非Ig樣獨特尾部是部分或完全除去的。術語"變異型人5多肽"和"人5多肽變體"可互換使用，在本文中定義為由于氨基酸修飾而與天然序列X5多肽在一個或多個氨基酸位置處不同的多肽。如本文中所定義的，"變異型人5多肽"會不同于天然抗體X^K輕鏈序列，或其片段。優選地，"變異型X5多肽"會保留至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85°/。、或至少約90%、或至少約95°/0、或至少約98%的與天然序列人5多肽的序列同一性。在另一個優選的實施方案中，"變異型X5多肽，，在其氨基酸序列方面與天然抗體X或K輕鏈序列會是小于95%、或小于90%、或小于85%、或小于80%、或小于75%、或小于70%、或小于65%、或小于60%相同的。變異型人5多肽明確包括但不限于這樣的人5多肽，其中X5序列N端的獨特尾部是部分或完全除去的。百分比氨基酸序列同一性可以使用序列比較程序NCBI-BLAST2(Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997))來確定。NCBI畫BLAST2序列比較程序可以自http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov下載，或以其它方式從國立衛生研究院(NationalInstituteofHealth,Bethesda,MD)獲得。NCBI-BLAST2使用數項檢索參數，其中所有那些搜索參數設置成缺省值，包括例如未遮掩=是，鏈=全部，期望發生=10，最小低復雜性長度=15/5，多通過e值^0.01,多通過常數=25，最終帶缺口對比的降低(dropoff)-25和評分矩陣=BLOSUM62。術語"VpreB序列"在本文中用于指如上文中所定義的"VpreB"的序歹寸，或其片段。術語"人5序列"在本文中用于指如上文中所定義的"A5"的序列，或其片段。如本文中所定義的，術語"替代輕鏈序列"指包含如上文中所定義的"VpreB序列"和/或"X5序列'，的任何多肽序列。如本文中所定義的，"替代輕鏈序列，，明確包括但不限于SEQIDNOl的人VpreBl序列、SEQIDNO:2和3的小鼠VpreB2序列、和SEQIDNO:4的人VpreB3序列，及其多種同等型，包括剪接變體和通過翻譯后修飾所形成的變體，其在其它哺乳動物物種中的同源物，以及其片段和變體。另夕卜，術語"替代輕鏈序列，，包括但不限于SEQIDNO:5的人人5序列、SEQIDNO:6的A15樣序列、及其同等型，包括剪接變體和通過翻譯后修飾所形成的變體，其在其它哺乳動物物種中的同源物，以及其片段和變體。另外，術語"替代輕鏈序列，，包括包含如上文中所定義的VpreB和入5序列兩者的序列。關于前B細胞受體(前BCR)的三維結構，包括替代輕鏈(SCL)及其構件的結構，參見例如Lanig等，Mol.Immunol.40(17):1263-72(2004)。任選地，"替代輕鏈序列"可以與異質氨基酸序列，或任何其它異質構件偶聯以形成本文中的"替代輕鏈構建體"。如此，術語"替代輕鏈構建體，，以最廣義使用，包括任何和所有別的異質構件，包括與替代輕鏈序列偶聯的異質氨基酸序列、核酸、和其它分子，其中"偶聯"在下文定義。"替代輕鏈構建體"在本文中也稱為"SURROBODY",并且這兩個術語可互換使用。在本發明多肽的語境中，相對于第一氨基酸序列的術語"異質氨基酸序列，，用于指與第一氨基酸序列非天然相關的、至少不處于其在本文中替代輕鏈構建體中的存在形式的氨基酸序列。如此，相對于VpreB的"異質氨基酸序列"是任何在其天然環境中與天然VpreB無關的氨基酸序列，包括但不限于這樣的X5序列，其不同于那些與VpreB—起形成發育中的B細胞上的替代輕鏈的X5序列，諸如氨基酸序列變體，例如截短的和/或衍生化的A5序列。相對于VpreB的"異質氨基酸序列"還包括與VpreB共價結合(例如融合)的X5序列，包括天然序列人5，因為在它們的天然環境中，VpreB和人5序列彼此不是共價結合(例如融合)的。異質氨基酸序列還包括但不限于抗體序列，包括抗體和重鏈序列及其片段，諸如例如抗體輕鏈和重鏈可變區序列，及抗體輕鏈和重鏈恒定區序列。術語"偶聯"指任何和所有形式的共價或非共價連接，包括但不限于直接的遺傳或化學融合、經由接頭或交聯劑進行的偶聯、和非共價結合，例如經由范德華力或通過使用亮氨酸拉鏈來實現。術語"融合/融合物，，在本文中用于指不同起源的氨基酸序列在一條多肽鏈中的組合，其通過以符合讀碼框的方式組合它們的編碼核苷酸序列來實現。在與其末端之一的融合之外，術語"融合/融合物"明確涵蓋內部融合/融合物，即在多肽鏈內插入不同起源的序列。如本文中所使用的，術語"耙/耙物"指與本文中的多肽相互作用的物質。本文中所定義的靶物明確包括與本發明的含有VpreB的構建體相互作用的抗原。優選地，相互作用通過直接結合發生。如本文中所使用的，術語"肽"、"多肽"和"蛋白質"均指通過共價"肽連接"接合的氨基酸一級序列。一般而言，肽由少數氨基酸組成，通常約2個至約50個氨基酸，并且比蛋白質短。本文中所定義的術語"多肽"涵蓋肽和蛋白質。術語"氨基酸，，或"氨基酸殘基，，通常指具有其領域公認的定義的氨基酸，諸如選自下組的氨基酸丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰胺(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);組氨酸(His);異亮氨酸(Ile);亮氨酸(Leu);賴氨酸(Lys);曱硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);絲氨酸(Ser);蘇氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和纈氨酸(Val),雖然經修飾的、合成的、或罕見的氨基酸也可以根據需要使用。如此，37CFR1.822(b)(4)中所列出的經修飾的和不常見的氨基酸明確包括在該定義之內，并且通過提及而明確收入本文。氨基酸可以細分成多個亞組。如此，氨基酸可以分組為具有非極性側鏈(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val);帶負電荷的側鏈(例如Asp、Glu);帶正電荷的側鏈(例如Arg、His、Lys);或不帶電荷的極性側鏈(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、和Tyr)。氨基酸還可以分組為小氨基酸(Gly、Ala)、親核性氨基酸(Ser、His、Thr、Cys)、疏水性氨基酸(Val、Leu、Ile、Met、Pro)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp、Glu)、酰胺(Asp、Glu)、和;咸性氨基酸(Lys、Arg)。術語"多核苷酸"指核酸諸如DNA分子和RNA分子及其類似物(例如使用核苷酸類似物或使用核酸化學所生成的DNA或RNA)。根據需要，多核苷酸可以以合成方式制備，例如使用本領域公認的核酸化學來實現或者使用例如聚合酶以酶法來實現，而且若想要的話，可以進行修飾。典型的修飾包括甲基化、生物素化、和其它本領域已知的修飾。另外，核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，而且若想要的話，可以連接至可檢測的模塊。關于參照多肽的術語"變體"指與天然多肽相比擁有至少一處氨基酸突變或修飾(即改變)的多肽。通過"氨基酸修飾"所生成的變體可以例如通過替代、刪除、插入和/或化學修飾天然氨基酸序列中的至少一個氨基酸來產生。"氨基酸修飾"指預定氨基酸序列的氨基酸序列變化。例示性修飾包括氨基酸替代、插入和/或刪除。在指定位置處的"氨基酸修飾"指指定殘基的替代或刪除，或鄰近指定殘基的至少一個氨基酸殘基的插入。通過"鄰近"指定殘基的插入意指其l至2個殘基之內的插入。插入可以在指定殘基的N端或C端。"氨基酸替代"指用另一種不同的"替換"氨基酸殘基替換預定氨基酸序列中的至少一個現有氨基酸殘基。替換殘基可以是"天然存在的氨基酸殘基"(即由遺傳密碼所編碼的)，且選自下組丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰胺(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);組氨酸(His);異亮氨酸(Ile);亮氨酸(Leu);賴氨酸(Lys);曱硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);絲氨酸(Ser);蘇氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和纈氨酸(Val)。用一種或多種非天然存在的氨基酸殘基進行的替代也為本文中的氨基酸替代的定義所涵蓋。"非天然存在的氨基酸殘基"指除上文所列出的那些天然存在的氨基酸殘基以外的殘基，其能夠共價結合多肽鏈中的鄰近氨基酸殘基。非天然存在氨基酸殘基的例子包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，諸如那些記載于Ellman等，Meth.Enzvm.202:301-336(1991)的。為了生成此類非天然存在的氨基酸殘基，可以使用Noren等，Science244:182n989)和Ellman等，見上文的規程。簡言之，這些規程牽涉用非天然存在的氨基酸殘基化學活化抑制型tRNA，接著是RNA的體外轉錄和翻譯。"氨基酸插入"指至少一個氨基酸摻入預定的氨基^列中。雖然插入通常會由一個或兩個氨基酸殘基的插入組成，但是本申請涵蓋更大的"肽插入"，例如約3個至約5個或者甚至多至約10個氨基酸殘基的插入。所插入的殘基可以是如上文所公開的天然存在的或非天然存在的。"氨基酸刪除"指從預定的氨基酸序列除去至少一個氨基酸殘基。除非另有說明，術語"誘變"指用于改變多核苷酸或多肽序列的任何本領域公認的技術。優選的誘變類型包括易錯PCR誘變、飽和誘變、或其它定點誘變。"定點誘變"是本領域中的標準技術，并使用如下的合成寡核普酸引物進行，所述合成寡核苷酸引物與要誘變的單鏈噬菌體DNA互補，只是有有限的錯配，其代表想要的突變。筒言之，使用合成的寡核苷酸作為引物來指導與單鏈噬菌體DNA互補的鏈的合成，并將所得的雙《連DNA轉化入支持噬菌體的宿主細菌中。將經轉化細菌的培養物鋪板于上層瓊脂中，容許自含有噬菌體的單細胞形成噬斑。理論上，50%的新噬斑會含有具有作為單鏈的突變形式的噬菌體；50%會具有最初的序列。通過在一定溫度與經激酶處理的合成引物雜交來選擇感興趣的噬斑，所述溫度容許精確匹配發生雜交，但是在此溫度與最初鏈的錯配足以阻止雜交。然后選擇與探針雜交的噬斑，測序并培養，并回收DNA。在本發明的語境中，術語"抗體"(Ab)用于指來自自V(D)J基因重組衍生的經典重組重鏈和也自VJ基因重組衍生的經典重組輕鏈的天然抗體，或其片段。"天然抗體"是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構成。每條輕鏈通過共價二硫鍵與重鏈連接，但不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵數目有所不同。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規則的鏈內二碌u4逸。每條重鏈在一端具有一個可變域(VH),隨后是許多恒定域。每條輕鏈在一端具有一個可變域(VO，在其另一端具有一個恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈可變域與重鏈的可變域排列在一起。認為特定的氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變域之間的界面，Chothia等，J.Mol.Biol.186:651(1985);Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:4592(1985)。關于抗體鏈的術語"可變的"用于指抗體鏈中在抗體間序列差異廣泛并參與每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的部分。此類變異型集中于輕鏈和重鏈可變域中稱為高變區的3個區段中。可變域中更加高度保守的部分稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各包含4個FR(分別為FR1、FR2、FR3和FR4)，框架區主要采取P-片層構型，由3個高變區連接，高變區形成連接P-片層結構的環，并在某些情況中形成P-片層結構的一部分。每條鏈中的高變區通過FR緊密相鄰地保持在一起，并與來自另一條鏈的高變區一起促進抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md,(1991),第647頁-第669頁)。恒定域不直接牽涉抗體與抗原的結合，但是展現出多種效應器功能，諸如在抗體依賴性細胞毒性中抗體的參與。術語"高變區"在用于本文時指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區包含來自"互補決定區，，或"CDR"的氨基酸殘基(即輕鏈可變域中的殘基30-36(L1)、46-55(L2)和86-96(L3)和重鏈可變域中的30-35(H1)、47-58(H2)和93-101(H3);MacCallum等，J.Mol.Biol.262(5):732-45(1996)。術語"框架區"指抗體可變區中更趨異的CDR區之間所存在的本領域公認的部分。這些框架區通常稱為框架1至4(FR1、FR2、FR3、和FR4)，并為在三維空間中保持重鏈或輕鏈抗體可變區中找到的3處CDR提供支架，使得CDR能形成抗原結合表面。根據其重鏈恒定域氨基酸序列，抗體可歸入不同的類。有五大類抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,且這些中的數種可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。與不同類的免疫球蛋白相對應的重鏈恒定域分別稱為a、5、s、y、和p。基于其恒定域的氨基酸序列，可將來自任何脊推動物物種的抗體的"輕鏈"歸入兩種截然不同的型之一，稱為卡帕(kappa，K)和拉姆達(lambda，、)。本文中對抗體輕鏈的任何提及包括K和x輕鏈兩者。"抗體片段"包括全長抗體的一部分，通常是其抗原結合或可變域。抗體片段的例子包括但不限于Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv、和(scFv)2片段。如本文中所使用的，術語"抗體結合區，，指免疫球蛋白或抗體可變區中能夠結合抗原的一個或多個部分。通常，抗體結合區是例如抗體輕鏈(VL)(或其可變區)、抗體重鏈(VH)(或其可變區)、重鏈Fd區、組合的抗體輕鏈和重鏈(或其可變區)諸如Fab、F(ab，)2、單域、或單鏈抗體(scFv)、或全長抗體，例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3、或lgG4亞型)、IgAl、IgA2、IgD、IgE、或IgM抗體。如本文中所使用的，術語"表位"指至少約3至5個，優選至少約5至10個，或至少約5至15個氨基酸，且通常不大于約500個，或約1,000個氨基酸的序列，這些氨基酸定義通過自身或作為更大序列的一部分而與應答此序列所生成的抗體結合的序列。表位不限于具有與衍生其的親本蛋白質的一部分相同的序列的多肽。實際上，病毒基因組處于不斷變化的狀態，并且在分離群之間展現出相對高度的變異性。如此，術語"表位"涵蓋與天然序列相同的序列，以及對天然序列的修飾，諸如刪除、替代和/或插入。一般而言，此類修飾本質上是保守的，但是也涵蓋非保守修飾。該術語明確包括"模擬表位"，即這樣的序列，其沒有鑒定出連續的線性天然序列或者不必在天然蛋白質中存在，但是在功能上模擬天然蛋白質上的表位。術語"表位"明確包括線性或構象性表位。術語"載體"用于指能夠在細胞中自主復制，并且DNA區段(例如基因或多核普酸)能與其可操作連接以便引起附著區段復制的rDNA分子。能夠指導編碼一種或多種多肽的基因表達的載體在本文中稱為"表達載體"。術語"控制序列"指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。適用于原核生物的控制序列包括例如啟動子、任選的操縱基因序列、及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、及增強子。.-若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關系中，則它是"可操作連才妻的"。例如，若前序列(presequence)或分泌前導(secretoryleader)的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白質(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結合位點的定位促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的"意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接來實現。若沒有此類位點，則依照常規實踐使用合成的寡核苦酸銜接頭或接頭。"噬菌體展示文庫"是蛋白質表達文庫，其將所克隆的蛋白質序列的集合表達為與噬菌體外殼蛋白的融合物。如此，短語"噬菌體展示文庫"在本文中指噬菌體(例如絲狀噬菌體)的集合，其中所述噬菌體表達外部(通常為異源)蛋白質。外部蛋白質自由地與和噬菌體接觸的其它模塊相互作用(結合)。每個展示外部蛋白質的噬菌體都是該噬菌體展示文庫的"成員"。術語"絲狀噬菌體，，指能夠在其表面上展示異質多肽的病毒顆粒，包括但不限于fl、fd、Pfl和M13。絲狀噬菌體可以包含選擇標志，諸如四環素(例如"fd-tet")。各種絲狀噬菌體展示系統是本領域技術人員公知的(參見例如Zacher等，Gene9:127-140(1980):Smith等，Science228:1315-1317(1985);及Parmley和Smith,Gene73:305-318(1988))。術語"淘選(panning)"用于指在對攜帶對靶物具有高親和力和特異性的化合物(諸如抗體)的噬菌體的鑒定和分離中的多輪篩選過程。B.詳細描述用于實施本發明方法的技術是本領域公知的，并記載于標準實驗室教科書中，包括例如Ausubel等，《CurrentProtocolsofMolecularBiology》，JohnWileyandSons(1997);《MolecularCloning:ALaboratoryManual》，第三版，J.Sambrook和D.W.Russell編，ColdSpringHarbor,NewYork,USA，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001;O，Brian等，《AnalyticalChemistryofBacillusThuringiensis》，Hickle和Fitch編,Am.Chem.Soc,，1990;《Bacillusthuringiensis:biology,ecologyandsafety》，T.R.Glare和M.O，Callaghan編，JohnWiley，2000;《AntibodyPhageDisplay,MethodsandProtocols》.，HumanaPress,2001;及《Antibodies》，G.Subramanian編,KluwerAcademic,2004。i"列^口，i秀變可以使用定點誘變來進行(Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985))。PCR擴增方法記載于美國專利號4,683,192;4,683,202;4,800,159;和4,965,188,及數本教科書，包括《PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification》，H.Erlich纟扁，StocktonPress,NewYork(1989);及《PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications》，Innis等編，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)。本發明涉及包含抗體替代輕鏈序列的構建體和文庫。替代輕鏈構建體如上文所討論的，前B細胞已經在骨髓中被鑒定為這樣的淋巴細胞，它們生成p重鏈，但是不是完全形成的輕鏈，而是表達一組分別稱為VpreB(l-3)和入5的B譜系特異性基因。VpreB和X5多肽一起形成非共價結合的Ig輕鏈樣結構，其稱為替代輕鏈。替代輕鏈雖然不是抗體鏈，但是與所有抗體重鏈天然結合，而且已經顯示了替代輕鏈-抗體重鏈復合物結合自身抗原。一方面，本發明提供了包含VpreB和/或X5序列且具有結合靶物能力的多肽。所述靶物可以是任何如下的肽或多肽，其是本發明的含有VpreB和/或入5序列的多肽的結合配偶體。靶物明確包括在抗體結合的語境中通常稱為"抗原"的所有類型的靶物。如此，本發明的多肽包括但不限于VpreB序列與異質氨基酸序列的偶聯物，只要它們保留結合想要的靶物的能力。VpreB序列與異質氨基酸序列的結合可以是共價的或非共價的，并且可以直接發生，或者經由接頭(包括肽接頭)發生。本文中多肽構建體的具體例子包括這樣的多肽，其中VpreB序列(諸如VpreBl、VpreB2、或VpreB3序列，包括天然序列的片^殳和變體)是與X5序列(包括天然序列的片段和變體)偶聯的。圖2和11中顯示了這種類型的代表性融合物，并在實施例中進行描述。在直接的融合物中，VpreB序列(例如VpreB1、VpreB2或VpreB3序列)的C端通常與X5序列的N端相融合。雖然有可能融合全長的天然VpreB序列與全長、5序列(參見例如圖3中的第一示圖)，但是融合通常在兩種多肽之每一個中的CDR3類似位點處或周圍發生。圖1中顯示了VpreBl和X5的此類CDR3類似位點，并在圖2中顯示了代表性融合構建體。在這種實施方案中，融合可以在CDR3類似區內或在CDR3類似區的任一側的約IO個氨基酸殘基內的位置處發生。在一個優選的實施方案中，融合在天然人VpreBl序列(SEQIDNO:1)的約氨基酸殘基116-126之間和天然人人5序列(SEQIDNO:5)的約氨基酸殘基82和93之間發生。還有可能融合VpreB序列至抗體X輕鏈的CDR3區，如圖2中所示。圖3中顯示了別的構建體，其中VpreB和人5中僅一個是截短的。可以使用抗體K輕鏈序列來制備類似的構建體。在圖11的右側顯示了別的直接融合構建體。稱為"SLC融合物l，，的結構是四聚物，由兩個二聚物構成，其中截短的V-preBl序列(缺乏天然VpreBlC端的特征性"尾部")與類似截短的人5序列的融合物與抗體重鏈非共價結合。稱為"SLC融合物2，，的結構是四聚物，由兩個二聚物構成，其中截短的VpreBl序列(缺乏天然VpreBlC端的特征性"尾部")與抗體輕鏈恒定區的融合物與抗體重鏈非共價結合。稱為"SLC融合物3"的結構是四聚物，由兩個二聚物構成，其中抗體輕鏈可變區與截短的X5序列(缺乏天然A5N端的特征性"尾部")的融合物與抗體重鏈非共價結合。如上文所記錄，在直接的融合物之外，本發明的多肽構建體包括VpreB序列(包括天然序列的片段和變體)與異質序列諸如X5序列(包括天然序列的片段和變體，和/或抗體序列的非共價結合。如此，例如全長VpreB序列可以與截短的人5序列非共價結合。或者，截短的VpreB序列可以與全長X5序列非共價結合。在圖ll的左側顯示了與抗體重鏈非共價結合的，包含非共價結合的VpreBl和X5序列的替代輕鏈構建體。如多個圖示顯示，所述結構可以包括例如全長VpreBl和人5序列、與截短的X5序列結合的全長VpreBl序列("X5dT，，)、與全長X5序列結合的截短的V-preB1序列("VpreBdT")和與截短的X5序列結合的截短的VpreBl序列("短的")。雖然圖ll顯示了某些特定的構建體，但是普通技術人員會領會，可以以類似的方式制備和使用多種其它構建體。例如，與圖ll中所顯示的結構相反，所述結構可以是不對稱的，在每個臂中包含不同替代輕鏈序列，和/或具有三聚體或五聚體結構。還有可能在本發明的替代輕鏈構建體的各個部分中包括不同功能性，由此產生多特異性和/或多價構建體。若想要的話，本發明的構建體可以進行工程化改造，例如通過將來自抗體(包括已知的治療性抗體)CDR1、CDR2和/或CDR3區的已知序列或序列基序摻入或附加入替代輕鏈序列的CDRt、CDR2和/或CDR3類似區中來實現。這容許創建如下分子，所述分子不是抗體，但是會展現出與已知的治療性抗體的結合特異性和親和力非常類似的結合特異性和親和力。本文中的所有替代輕鏈構建體可以與抗體序列相結合。例如，如圖5中所示，VpreB-X5融合物可以通過肽接頭而與抗體重鏈可變區序列相連接。在另一個實施方案中，VpreB-入5融合物與抗體重鏈或其包括可變區序列的片段非共價結合，以形成二聚體復合物。在又一個實施方案中，VpreB和人5序列彼此及與抗體重鏈或其包括可變區序列的片段非共價結合，由此形成三聚體復合物。圖ll中顯示了包含抗體重鏈的例示性構建體。雖然通過提及某些實施方案來例示本發明的構建體，但是普通技術人員會理解，通過對替代輕鏈和抗體序列的各種變換所獲得的許多別的實施方案也是有可能的，并且在本發明的范圍之內。本發明包括所有如下構建體，所述構建體包含替代輕鏈序列，并具有結合想要的靶物的能力。在某些實施方案中，所述構建體還具有與抗體重鏈可變區序列結合的能力。可以使用本發明的構建體來建造替代輕鏈序列的文庫，與抗體文庫類似地，其可以用于多種目的，包括選擇具有想要的結合特異性和親和力的構建體。在VpreB和X5替代輕鏈序列彼此非共價結合時，這兩種構件之一或二者的游離末端(即VpreB序列的C端末端和/或X5序列的N端末端)可用于將別的多樣性摻入此類序列的文庫中。例如，可以將隨機肽文庫附加或替代至這些游離末端之一，并淘選對特定靶物的特異性結合。通過組合鑒定成具有想要的結合特異性的替代輕鏈與來自針對同一靶物的抗體的重鏈或重鏈片段，可以創建如下分子，所述分子具有在兩個不同位置上結合關聯靶物的能力。與在二聚體免疫球蛋白中所看到的親合力效應類似地，這種串聯結合或"螯合，，效應強烈地加強對單一靶物的結合。還有可能使用結合不同耙物的構件。如此，例如，可以將具有想要的結合特異性的替代輕鏈構件與結合不同耙物的抗體重鏈或重鏈片段組合。例如，替代輕鏈構件可以結合腫瘤抗原，而抗體重鏈或重鏈片^殳可以結合效應細胞。這樣，可以創建具有耙向和抗腫瘤活性的單一實體(entity)。在一個具體的實施方案中，連接VpreB和X5序列的附加物或多肽可以是抗體或抗體片段，諸如Fab或scFv片段。抗體序列的摻入不僅會創建"鰲合"效應，而且還可以在不需要第二獨立臂(諸如雙特異性抗體中找到的)的情況中在單個分子中產生雙特異性。兩種特異性可以是針對同一靶物的不同部分，或者針對不同靶物，或者針對靶物抗體復合物。類似地，可以用不同于抗體或抗體片段的任何類型的分子(包括肽、蛋白質、酶等)來制備多特異性構建體。例如，可以將具有想要的特異性的替代輕鏈構件與任何治療性肽或蛋白質組合。替代輕鏈構建體的制備可以通過本領域中已知的方法來制備本發明的替代輕鏈構建體，包括重組DNA纟支術的/>知#支術。22可以自天然來源(例如發育中的B細胞)分離和/或通過合成或半合成方法獲得編碼替代輕鏈(例如VpreB和X5多肽)的核酸。一旦鑒定并分離或以其它方式生成這種DNA，則可以將它連接入可復制的載體中以進行進一步克隆或表達。可用于表達本文中多肽編碼序列的克隆和表達載體是本領域公知的，并且是商品化的。載體構件通常包括^旦不限于以下一種或多種信號序列、復制起點、一種或多種標志基因、增強子元件、啟動子、和轉錄終止序列。適用于克隆或表達本文載體中編碼替代輕鏈構建體的DNA的宿主細胞是原核生物、酵母、或高等真核生物(哺乳動物)細胞，優選哺乳動物細胞。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括但不限于經SV40轉化的猴腎CVl系(COS-7，ATCCCRL1651);為了在懸浮培養中生長而亞克隆的人胚腎系293(293細胞)(Graham等，J.Gen.Virol.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞ADHFR(CHO,Urlaub等，Pro"Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980》;猴腎細胞(CVl,ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2,HB8065);小鼠乳房腫瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等，A廳lsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5細胞；FS4細胞；及人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。為了在哺乳動物細胞中使用，常常由病毒材料提供對表達載體的控制功能。如此，通常使用的啟動子可以衍生自多瘤病毒、腺病毒2、逆轉錄病毒、巨細胞病毒、和猿病毒40(SV40)的基因組。其它啟動子(諸如)3-肌動蛋白啟動子)源自異源來源。合適啟動子的例子包括但不限于SV40病毒的早期和晚期啟動子(Fiers等，Nature,273:113(1978))、人巨細胞病毒的立即早期啟動子(Greenaway等，Gene,1&3M-360(l兆2))、和通常與想要的基因序列有關的啟動子和/或控制序列，只要此類控制序列與宿主細胞系統相容。高等真核生物轉錄編碼想要的異源多肽的DNA可以通過將增強子序列插入載體中而得到增加。增強子是對啟動子起作用而增加其轉錄啟動活性的順式作用DNA元件，通常為約10-300bp。增強子相對與取向和位置無關，但23源自相同的來源，諸如例如來自真核細胞病毒，例如復制起點的晚期側上的SV40增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、復制起點的晚期側上的多瘤病毒增強子、和腺病毒增強子。哺乳動物宿主細胞中所使用的表達載體還含有多腺苦酸化位點，諸如那些衍生自病毒諸如例如SV40(早期和晚期)或HBV的。復制起點可以通過載體的構建來提供以包括外源起點，諸如可以是衍生自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)來源的，或者可以由宿主細胞提供。表達載體通常含有選擇標志，其編碼用該載體轉化的宿主細胞存活或生長所必需的蛋白質。適用于哺乳動物細胞的選擇標志的例子包括二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苦激酶(TK)、和新霉素。合適的哺乳動物表達載體是本領域公知的，而且是商品化的。如此，例如，可使用pCI表達載體(Promega)在哺乳動物宿主細胞中生成本發明的替代輕鏈構建體，pCI載體攜帶人巨細胞病毒(CMV)立即早期增強子/啟動子區，以促進DNA插入物的組成型表達。載體可以含有作為選擇標志的新霉素磷酸轉移酶基因。還可以在細菌宿主細胞中生成本發明的替代輕鏈構建體。在細菌系統中使用的控制元件包括啟動子(任選地含有搡縱基因序列)和核糖體結合位點。合適的啟動子包括但不限于半乳糖(gal)、乳糖(lac)、麥芽糖、色氨酸(trp)、(3-內酰胺酶啟動子、噬菌體人和T7啟動子。另外，可以^使用合成的啟動子，諸如tac啟動子。細菌系統中使用的啟動子通常還含有與編碼Fab分子可操作連接的Shine-Dalgarno(SD)序列。來自質粒pBR322的復制起點適用于大多數革蘭氏陰性細菌。包含抗體替代輕鏈序列的多鏈構建體內的各條鏈的編碼序列可以存在于同一表達載體中，在分開的調控序列控制之下，或在分開的表達載體中，用于共轉染想要的宿主細胞，包括真核的和原核的宿主。如此，可使用購自Novagen的DuetTM載體來共表達多種基因。可以在多種培養基中培養經轉化的宿主細胞。用于培養哺乳動物宿主細胞的商品化培養基包括Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)(Sigma)。此外，Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)和Bames等，Anal.Biochem.102:255(1980)中所述的任何培養基可以用作宿主細胞的培養基。培養條件(諸如溫度、pH等)就是那些先前與為表達所選擇的宿主細胞一起使用的，并且包括在制造適用于培養哺乳動物、細菌(例如大腸桿菌)或其它宿主細胞的別的培養基還記載于標準教科書中，諸如例如Sambrook等，見上文或Ausubel等，見上文。可以通過本領域中已知的方法來實施純化。在一個優選的實施方案中，使用Ni-NTA純化系統(Invitrogen)，以帶6xHis標簽的形式純化替代抗體分子。包含替代輕鏈序列的文庫本發明進一步涉及替代輕鏈序列的各種文庫和包含此類序列的構建體。如此，此類文庫可包含替代輕鏈序列(諸如本發明的含有VpreB和/或X5的構建體，包括但不限于那些上文明確描述的，圖中所顯示的和/或實施例中所描述的)的展示，基本上由其組成，或由其組成。本發明的文庫優選處于展示形式。用于展示異源蛋白質(包括抗體和其它多肽)的系統是本領域公知的。已經在編碼抗體基因的絲狀噬菌體表面上展示了抗體片段(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,222:381-388(1992);McCafferty等，Nature348(6301):552'554(1990);Griffiths等，EMBOJ.,13(14):3245-3260(1994))。關于用于選擇和篩選抗體文庫的技術的綜述，參見例如Hoogenboom,NatureBiotechnol.23(9):1105-1116(2005)。另外，有本領域中已知的用于在大腸桿菌(Agterberg等，Gene88:37-45(19卯)；Charbk等，Gene70:181-189(1988);Francisco等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2713-2717(1992))禾口酵母(i者^口酉良酒酵母(5"acc/aramyc^cereWw'ae))(Boder;^\Vittrup,Nat.Biotechnol.15:553-557(1997);Kieke等，ProteinEng.10:1303-1310(1997))表面上展示異源蛋白質及其片段的系統。其它已知的展示技術包括核糖體或mRN樣示(Mattheakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022-9026(1994);Hanes和Pluckthun,Proc.Natl,Acad.Sci.USA94:4937-4942(1997))、DN樣示(Yonezawa等，Nucl.AcidRes.3K19):e118(2003));微生物細胞展示諸如細菌展示(Georgiou等，NatureBiotech.15:29-34(1997))、哺乳動物細胞上的展示、孢子展示(Isticato等，J.Bacteriol.183:6294-6301(2001);Cheng等，Appl.Environ.Microbiol.71:3337-3341(2005)和2006年11月13日提交的共同懸而未決的臨時申請流水號60/865,574)、病毒展示諸如逆轉錄病毒展示(Urban等，NucleicAcidsRes.33:e35(2005)、基于蛋白質畫DNA連接的展示(Odegrip等,Proc.Acad.Natl.Sci.USA101:2806-2810(2004);Reiersen等，NucleicAcidsRes.33:el0(2005》和微珠(microbead)展示(Sepp等，FEBSLett.532:455-458(2002》。出于本發明的目的，可使用任何展示技術(包括噬菌體展示和孢子展示)來有利地展示含有替代輕鏈的文庫。在噬菌體展示中，將異源蛋白質(諸如替代輕鏈多肽)連接至噬菌體顆粒的外殼蛋白，而表達它的DNA^列包裝在噬菌體外殼之內。噬菌體展示方法的詳情可見于例如McCafferty等，Nature348:552-553(1990)，該文獻記載了從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)域基因全集在體外生成人抗體和抗體片段。依照此技術，以符合讀碼框的方式將抗體V域基因克隆入絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體的功能性特性的選擇也導致對編碼展現出那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式實施；關于它們的綜述，參見例如Johnson,KevinS,禾口Chiswell,DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)。可經由噬菌體展示來發現重鏈V基因區段的數種來源。Clackson等,Nature352:624-628(1991)從自經免疫小鼠的脾衍生的V基因小型隨機組合文庫分離了一批不同的抗u惡唑酮.重鏈和輕鏈。可構建來自未免疫人供體的重鏈和輕鏈V基因全集，并回收對一批不同抗原.(包括自身抗原)特異性的，基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)，或Griffith等，EMBOJ.12:725-734(1993)所記載的技術進行。可以修改這些技術及本領域中已知的其它技術來展示任何多肽，包括包含替代輕鏈序列的多肽及其它構建體。如此，例如，可以用來自天然多樣來源(諸如淋巴細胞)的重鏈集合，或者來自完全經由分子生物學技術創建的以合成方式生成的集合的重鏈集合來補足替代輕鏈。可以通過本領域中已知的方法來克隆、表達和選擇這些集合。選定的所得SURROBODYTM可以直接使用，作為多聚體分子表達，或者經由重鏈優化或替代輕鏈優化而進一步優化，例如使用隨機或非隨機位點特異性或區域性i秀變。孢子展示系統是基于將要展示的序列附著于外殼蛋白，諸如枯草芽孢桿菌(Sac!7/^swto'fc)孢子外殼蛋白。孢子原生質體(核心)環繞有細胞壁、皮層、和孢子外殼。根據物種，也可存在孢子外壁。核心壁由與營養細胞壁相同類型的肽聚糖構成。孢子展示(包括使用枯草芽孢桿菌孢子外殼成分(CorB)的表面展示系統和蘇云金芽孢桿菌08a"7/wjwZ^7&)(價)孢子展示)記載于Isticato等，J.Bacteriol.183:6294-6301(2001);Cheng等，Appl.Environ.Microbiol.71:3337-3341(2005)，在此通過提及明確收錄它們的完整公開文本。多種孢子展示技術還記載于美國專利申請公開文本號20020150594;20030165538;20040180348;20040171065;及20040254364，在此本文通過提及明確收錄它們的完整公開文本。孢子展示系統的優點在于非真核性質的同質顆粒表面和顆粒大小，預期提供理想的非反應性背景。另外，孢子的顆粒大小足以能夠通過流式細胞術進行選擇，所述流式細胞術基于相互作用而容許可選擇克隆分離。通過影響(leveraging)孢子穩定性，有可能實施多種孢子形成后的化學的、酶的和/或環境的處理和修飾。如此，有可能使用三氟乙醇(TFE)用化學處理來穩定化結構性螺旋結構，在展示此類結構時。另外，氧化壓力處理(諸如用反應性氧種類(例如過氧化物)或反應性氮種類(例如亞硝酸)進行的處理)是可能的。還有可能將孢子展示多肽的限定的或初級(crude)的群體暴露于酶促處理，諸如蛋白水解暴露、其它酶促過程、磷酸化等。其它可能的處理包括但不限于通過過氧亞硝酸鹽處理進行的亞硝基化，通過重組的、純化的或血清的蛋白酶處理進行的蛋白水解，照射，與已知的伴侶蛋白諸如熱休克蛋白(細菌的和哺乳動物的兩者)一起共溫育，用薪疊蛋白質(諸如蛋白質二硫鍵異構酶、脯氨酰異構酶等)進行的處理，凍干，和防腐劑樣處理(諸如用硫柳汞進行的處理)。這些處理可通過本領域中公知的方法進行。可以在所有的孢子展示系統中使用類似的技術，包括附著于孢子外殼蛋白的展示，包括例如所披露的孢子展示系統。替代輕鏈序列、含有其的構建體和文庫的用途本發明的文庫可用于鑒定具有想要的特性的替代輕鏈序列和替代輕鏈構建體，諸如包含替代輕鏈序列的融合物。例如，對本文中文庫的體外或體內篩選可產生包含以高結合特異性和親和力結合想要的靶物的替代輕鏈序列的多肽。如此，本文中的文庫可用于鑒定用于治療和"^斷目的的分子，諸如包含結合胂瘤標志物或治療性干預的其它分子靶物的替代輕鏈序列的多肽。另外，通過上文所描述的技術，可以對替代輕鏈多肽的高度多樣文庫進行工程化改造，包括包含結合相同靶物的多肽的集合的文庫，結合不同靶物的多肽的文庫，具有多特異性的多肽的文庫等。由于它們結合任何想要的靶物的能力，本發明的抗體替代輕鏈構建體可以在分析和診斷測定法中使用，用以檢測想要的靶分子(諸如腫瘤抗原或與疾病狀態或疾患有關的任何多肽)的存在。另外，本發明的替代輕鏈構建體可以在諸如例如癌癥療法中作為治療劑使用，以靶向已經確定與癌癥的形成和/或擴散有關的腫瘤抗原。在下列非限制性實施例中提供了本發明的進一步詳情。實施例實施例l:作為結合域蛋白質的VpreB和含有它的融合物為了制備VpreB結合域，以重組方式創建了圖5中所示的單一蛋白質。SLC結合域蛋白質構建體由來自VpreBl的氨基酸20至121和來自人5的氨基酸87至105構成。若想要的話，為了創建新的且特異性的結合能力，依照結構或序列證據來對分子再次進行工程化改造。另外/或者，或是隨機地(通過例如易錯PCR)或是直接地(通過用氨基酸集合進行的單位點或多位點特異性的誘變)來創建變體集合。然后將所得的克隆或集合與pIII以符合讀碼框的方式克隆，供噬菌體或噬菌粒展示中使用。將這種噬菌粒構建體轉化入TG1細胞中。接著，將單集落在補充有50^ig/ml氨節青霉素和2。/。葡萄糖的LuriaBroth(LB)中增殖，直至其達到OD600約0.3，并在不進行搖動的情況中于37。C用MK307輔助噬菌體感染30分鐘。然后將細胞沉淀，然后在含有50fag/ml氨芐青霉素和75嗎/ml卡那霉素的LB中重懸，并容許在劇烈通氣的情況中于30。C生長過夜。次日，在噬菌體ELISA中使用含有噬菌粒表達的SLC-HC融合蛋白的上清液以確定靶向結合。簡言之，ELISA需要用人TNF-a包被和封閉ELISA板，接著將SLC-HC噬菌體于4。C溫育2小時，用PBS-Tween-20(0.05%)清洗和用抗ml3-HRP抗體直接檢測。或者，如下評估結合，即直接擴增或洗脫所結合的噬菌體，并使用XL-lBlue細胞來測定噬菌體滴度。本實施例描述了作為單克隆的SLC結合域融合物，但是這種SLC可以與識別共同靶物的其它異源序列以重組方式重組，并作為文庫篩選。此外，這種SLC結合蛋白可28以與先前選定的重鏈集合組合，并直接針對感興趣的相同靶物或感興趣的第二靶物進行篩選以創建雙特異性分子。或者，可以通過與未選擇的重鏈集合聯合進行的篩選來發現這種加強的結合或雙特異性結合。另外，雖然本實施例提及抗體重鏈，但是應當理解不需要整個重鏈。包含重鏈可變區序列(在沒有重鏈恒定區的情況中)或整個重鏈恒定區的單鏈融合物可以以類似的方式制備，并且在本實施例的范圍之內。實施例2:作為可變重鏈(VH)配偶體的VpreB融合物以重組方式創建圖5的第二幅圖中所顯示的功能性VpreB-X5融合蛋白(稱為"VpreB蛋白融合物——二聚體復合物")。VpreB-人5融合蛋白由m13基西III信號序列、來自VpreBl的氨基酸20至115和來自人5的氨基酸83至209構成。將此構建體與以符合讀碼框的方式與pin在一起的可變重鏈-cm融合物共表達，供噬菌體或噬菌粒展示中使用。使用來自抗TNF-a抗體D2E7的VH編碼序列作為VH編碼序列，而CHl是人IgGl的CHl區。將這種噬菌粒構建體轉化入TG1細胞中。接著，將單集落在補充有50嗎/ml氨千青霉素和20/0葡萄糖的LuriaBroth(LB)中增殖，直至其達到OD600約0.3,并在不進行搖動的情況中于37。C用MK307輔助噬菌體感染30分鐘。然后將細胞沉淀，然后在含有50^ig/ml氨千青霉素和75pg/ml卡那霉素的LB中重懸，并容許在劇烈通氣的情況中于30。C生長過夜。次日，在噬菌體ELISA中使用含有噬菌粒表達的SLC-HC融合蛋白的上清液以確定靶向結合。簡言之，ELISA需要用人TNF-a包被和封閉ELISA板，接著將SLC-HC噬菌體于4。C溫育2小時，用PBS-Tween-20(0.05。/。)清洗和用抗ml3-HRP抗體直接檢測。或者，可以如下評估結合，即直接擴增或洗脫所結合的噬菌體，并使用XL-lBlue細胞來測定噬菌體滴度。本實施例描述了作為單克隆的與重鏈可變-CHl融合物配偶的SLC融合物，但是這種SLC還可以與識別共同靶物的重鏈可變區的聚焦集合組合，并作為文庫篩選。此外，這種SLC融合物可以與未選擇的重鏈集合組合，并直接針對感興趣的靶物進行篩選。作為合理的SLC融合物備選方案，可以通過融合來自傳統抗體輕鏈的X恒定區替代人5蛋白質片段來加強VH結合。實施例3:作為所結合的可變重鏈(VH)配偶體的VpreB和X5圖5的第三幅圖中所顯示的VpreBA5共表達蛋白質(稱為"VpreB和人5——三聚體復合物")由ml3基因III信號序列和預測的成熟的、經加工的VpreBl(氨基酸20至146)和X5(氨基酸31至209)的相應氨基酸構成。將這些與以符合讀碼框的方式與piii在一起的可變重鏈-cm融合物共表達，供噬菌體或噬菌粒展示中使用。使用來自抗TNF-a抗體D2E7的VH編碼序列作為VH編碼序列，而CHl是人IgGl的CHl區。將這種噬菌粒構建體轉化入TG1細胞中。接著，將單集落在補充有50嗎/ml氨千青霉素和2。/。葡萄糖的LuriaBroth(LB)中增殖，直至其達到OD600約0.3，然后在不進行搖動的情況中于37。C用MK307輔助噬菌體感染30分鐘。然后將細胞沉淀，然后在含有50嗎/ml氨芐青霉素和75昭/ml卡那霉素的LB中重懸，并容許在劇烈通氣的情況中于30。C生"^過夜。次日，在噬菌體ELISA中使用含有噬菌粒表達的SLC-HC三聚體蛋白質復合物的上清液以確定靶向結合。簡言之，ELISA需要用人TNF-a包被和封閉ELISA板，接著將SLC-HC噬菌體于4。C溫育2小時，用PBS-Tween-20(0.05。/。)清洗和用抗ml3-HRP抗體直接檢測。或者，可以如下評估結合，即直接擴增或洗脫所結合的噬菌體，并使用XL-lBlue細胞來測定噬菌體滴度。本實施例描述了作為單克隆的與重鏈可變-CHl融合物配偶的SLC，但是這種SLC可以與識別共同靶物的重鏈可變區的聚焦集合組合，并作為文庫篩選。此外，這種SLC融合物可以與未選擇的重鏈集合組合，并直接針對感興趣的靶物進行篩選。實施例4:將多樣性工程化^Ji^VpreBlCDR3類似區中因為替代輕鏈(SLC)的CDR類似區會具有與抗體輕鏈的CDR類似的功能，所以確定VpreB和人5之間的融合點是重要的。依照一種方法，如下確定最適合于特定目的的融合點，即以含有全部VpreB氨基酸的CDR3類似位點開始，并在可克隆寡核苷酸中用來自所編碼的X5的氨基酸逐個位置地遞增地替代VpreB的氨基酸。繼續這種遞增替代，直至CDR類似位點完全由X5來源序列構成。在此過程中的一些點，可能希望添加互補重鏈，并容許/促進其抗原結合和識別。為了進一步增強或實現這種互補，可以在任何CDR類似位點中使用隨機多樣性，以及基于匹配CDR長度分析的多樣性。或者/另外，可使用抗體VX5序列來添加多樣性，因為它們的CDR長度與VpreBCDR類似位點長度良好地匹配。實施例5:將功能性添加至SLC構件因為SLC由兩條獨立的多肽構成，所以這產生了附加或嵌入第二(secondary)功能性的天然機會。在本實施例中，在第一種情況中，插入抗VEGFscFv以創建連接VpreB和X5的融合蛋白(圖9A)。將這種所得的工程化SLC約束scFv與抗TNF-a抗體的重鏈配對。將所得的構建體與以符合讀碼框的方式與pIII—起克隆的重鏈共表達，供噬菌體或噬菌粒展示中使用。將這種噬菌粒構建體轉化入TG1細胞中，并將單集落在補充有50)ig/ml氨芐青霉素和2。/。葡萄糖的LuriaBroth(LB)中增殖，直至其達到OD600約0.3，并在不進行搖動的情況中于37。C用MK307輔助噬菌體感染30分鐘。然后將細胞沉淀，然后在含有50(ig/ml氨千青霉素和75ng/ml卡那霉素的LB中重懸，并容許在劇烈通氣的情況中于30。C生長過夜。次日，在噬菌體ELISA中使用含有噬菌粒表達的SLC-HC融合蛋白的上清液以確定靶向結合。簡言之，ELISA需要用人TNF-a或人VEGF包被和封閉ELISA板，接著將SLC-HC噬菌體于4。C溫育2小時，用PBS-Tween-20(0.05%)清洗和用抗ml3-HRP抗體直接檢測。接著，創建抗VEGFscFv至VpreBC端的融合物，并與上文所述噬菌粒ELISA類似地評估所得的三元蛋白質復合物構建體。或者，將抗卵清蛋白scFv融合至人5的氨基端，并對三元蛋白質復合物測試對TNF-a和卵清蛋白兩者的結合。最后，將這兩種融合構建體(VpreB-抗VEGFscFv和人5-抗卵清蛋白)與抗TNF-a抗體的重鏈組合以創建三特異性分子，然后如上文所描述的那樣在噬菌粒ELISA中進行證實。在說明書中摻入針對不同靶物的scFv，然而可以組合針對相同靶物的功能性結合物以創建串聯的"超級結合物"。這些串聯結合物能提供加強的結合，或者甚至在一些情況中提供交聯功能。Fab交聯在整個抗體提供不想要的和持久的交聯的情況中會是有益的。例如，可能不希望充當胰島素替代物的整個免疫球蛋白胰島素受體抗體，它們的血清清除需要3-4周。因為胰島素通常具有幾分鐘的半衰期，所以Fab與這種規模的半衰期會是更協調的，而且串聯功能性能適當地解決這種應用。上文說明書僅描述了作為第二功能團的抗體，但是還可以類似地將相關肽(例如促紅細胞生成素(EPO)模擬物)、受體(例如TNF-RI)、結合蛋白(例如IL-lra)、和任何治療性蛋白(諸如干擾素)摻入附加的且約束的構建體以創建類似功能的分子。還有，可以利用兩個位點來摻入異二聚體蛋白質，諸如重鏈和輕鏈以創建第二Fab樣分子。最后，我們僅描述了單數情況，但是組合多樣性噬菌體抗體文庫和肽多樣性文庫的摻入也包括在本文中，以用針對其針對的且想要的靶物的SLC候選抗體進行篩選。實施例6:替代輕鏈構建體(SURROBODY^)在哺乳動物細胞中的表達將圖ll中稱為"三聚物，，(也稱為"SURROBODYTM變體")的結構的替代輕鏈構件的編碼序列與全長IgGl抗體重鏈共轉染入CHO-Kl細月包(ATCCCCL-61)中，以瞬時生成替代輕鏈構建體，用于生化分析。具體地，將全長人VpreBl和X5克隆入哺乳動物表達載體pCI(Promega,MadisonWI)中。這些構建體含有它們的天然的預測分泌信號。在VpreBl的情況中，預測的信號肽是SEQIDNO:1的氨基酸1-20,對于X5，預測的信號序列是SEQIDNO:5的氨基酸1-30。對于這兩種蛋白質，均刪除其預測的非結構性尾部的部分。對于VpreBl,這包括SEQIDNO:1的C端氨基酸122-146,而對于人5，這包括SEQIDNO:5的N端氨基酸30-86。圖ll中稱為"人5dT，，的"三聚物"中的截短人5序列的序列以SEQIDNO:7顯示。圖ll中稱為"VpreBdT"的"三聚物"中的截短VpreBl序列的序列以SEQIDNO:8顯示。將四種組合替代輕鏈可能性之每一種與已知的人抗流感重鏈(含有C端六組氨酸(His6)標簽)(SEQIDNO:9)共轉染，并依照制造商的建議(Invitrogen:CarlsbadCA)在低血清培養基中表達。3天后，收集上清液，過濾，并通過鎳螯合物層析(Qiagen,Germany)來純化。然后通過用抗肽家兔血清(VpreB和X5)或抗組氨酸抗體(Serotec,RaleighNC)進行的Western印跡分析來檢查純化的蛋白質。抗家兔HRP(VpreB和人5)或抗小鼠HRP(重鏈)和用TMB底物進行的比色顯色后顯現蛋白質的檢測。(圖12，第l-4道)。嵌合蛋白來創建替代輕鏈融合物(參見圖ll)。具體地，生成以重組方式融合的蛋白質，其含有來自VpreB(SEQIDNO:1)的氨基酸l-87至入5蛋白氨基32酸121-209(SEQIDNO:5)(SEQIDNO:10)。另外，制備第二種融合物，其含有來自VpreB(SEQIDNO:1)的氨基酸1-87至抗體X輕鏈恒定域(SEQIDNO:11)的C端121個氨基酸。瞬時表達每種替代輕鏈融合物，收獲，純化，并通過Westem印跡分析來檢查，基本上如上文所描述的。值得注意的是，因為這兩種融合物都含有針對抗VpreB1抗肽血清的表位，所以它被用于Westem印跡分析(圖12，第5-6道)。實施例7:替代輕鏈構建體(SURROBODY^)在大腸桿菌中的表達因為重組蛋白通常有利地在細菌中表達，所以對在原核系統中生成可溶性替代輕鏈構建體的能力進行測試。為了解決這個，將圖ll中稱為"二聚物，，的替代輕鏈融合物克隆入大腸桿菌表達/分泌系統中。使用plac阻遏型表達系統，其中表達成熟的哺乳動物蛋白質，并通過與原核前導序列的重組融合而分泌入周質中。具體地，通過將成熟蛋白質的編碼序列融合至m13gIII前導編碼序列(SEQIDNO:12和13)的C端來將替代輕鏈融合物指向周質。通過將抗流感抗體的IgGl重鏈可變區和重鏈恒定區結構域融合至pelB前導序列(SEQIDNO:14)的C端來表達重鏈。將表達這兩種蛋白質的質粒轉化入HB2151大腸桿菌細胞(Stratagene)中，并在含有100mcg/ml氨卡青霉素和200微摩爾IPTG的LB培養基中于30。C表達過夜。收獲細胞，并制備周質溶胞物，其遵循本領域已知的方法進行。直接通過Western印跡分析來測試周質溶胞物，或者如上文所述的那樣進行純化(圖13，小圖A)。因為替代輕鏈傳統上是膜結合型前B細胞受體的構件，所以通常發現它與IgM類重鏈配對。出于我們的功利目的，我們希望比較替代輕鏈融合物與基于IgM的重域恒定區l配對的能力和與基于IgG的重域恒定區l配對的能力。為了檢查這個，我們用ia重鏈恒定域l(SEQIDNO:15)替代上文所描述的抗流感抗體的Y重鏈恒定域區。我們從對周質溶胞物的Western印跡分析發現，基于IgG(力的重鏈恒定域比以基于li的重鏈恒定域為基礎的系統表達得更好，并純化至更高的水平(圖13，小圖B)。實施例8:替代輕鏈構建體(SURROBODYTM)ml3噬菌粒的表達因為重組蛋白不僅在細菌中有用地表達而且在細菌病毒顆粒表面上個別地且以多樣文庫集合表達，我們希望在ml3噬菌粒表面上生成可溶性替代輕鏈構建體。為了解決這個，將替代輕鏈融合物(圖ll中的"二聚物")克隆入大腸桿菌表達/分泌系統中。對于所有的系統都使用上文所述pLac阻遏型表達系統。然而，在這種情況中，我們將E標簽表位(GAPVPYPDPLEPR)(SEQIDNO:16)附加至替代輕鏈融合物，以及附加至輕鏈對照蛋白質。基因IIIVpreBl-X5-E標簽融合物(融合物l)和基因IIIVpreBl-CI-E標簽融合物(融合物2)的序列分別以SEQIDNO:12和13顯示。為了將重鏈構建體錨定至m13噬菌粒，以重組方式克隆重鏈構建體，可變重鏈和y恒定重域l區與ml3基因m產物以符合讀碼框的方式在一起。具體地，重組蛋白含有間插物、六組氨酸肽、抗c-myc抗體的肽表位(GEQKLISLEEDL)(SEQIDNO:17)、和琥珀終止密碼子。我們分別通過抗組氨酸和抗E捕捉ELISA檢查了蛋白質表達和復合物形成的保真性。通過本領域中公知的標準方法實現了抗體和替代體(surrobody)的噬菌粒表達。基本上，將用表達質粒轉化的TG-l細胞在補充有100mcg/ml氨爺青霉素和2。/。葡萄糖阻遏的2-YT培養基中培養至對數中期(OD600約0.3),然后用ml3K07輔助噬菌體感染，然后在補充有100mcg氨千青霉素、70mcg/ml卡那霉素、和200微摩爾IPTG的2-YT培養基中培養過夜。使用含有噬菌體的上清液或經沉淀且經PBS重懸的噬菌體進行噬菌體捕捉ELISA。如下實現謹菌體捕捉ELISA,即用抗組氨酸(Serotec)或抗E抗體(Abcam)包被微量滴定板，然后用抗ml3過氧化物酶抗體(Pharmacia)檢測結合，接著用TMB底物進行比色顯現。在這些情況中，我們通過這兩種方法都發現了對噬菌體的特異性捕捉，這支持通過重鏈和穩定的替代輕鏈結合獲得的對噬菌體的高保真性蛋白質表達融合物。圖14中顯示了結果。實施例9:哺乳動物細胞中所表達的替代輕鏈構建體的抗原結合因為看來替代輕鏈變體在鎳螯合物層析后形成可容易檢測的復合物，所以對它們結合關聯重鏈配偶體的親本抗原的能力進行測試。如上文所述的那樣實施瞬時表達和純化。通過ELISA來測試抗原結合。簡言之,用滅活的H5N1越南12-3/04病毒制備物(USFDA-CBER,抗原標準品)包被微量滴定孔，封閉，然后與量化的連續稀釋的純化蛋白質一起溫育。清洗后，用抗人Fc過氧化物酶偶聯抗體^r測復合物。最后，以比色法顯現結合，并用TMB底物顯色進行定量(參見圖15)。另外，對未稀釋的來自瞬時轉染的上清液類似地測試抗原結合，并顯示于圖16中。清洗后，或是用抗VpreBl抗肽血清和抗家兔過氧化物酶偶聯二抗或是用抗人Fc過氧化物酶偶聯抗體檢測替代輕鏈復合物，然后以比色法顯現，并用TMB底物顯色來定量。實施例10:大腸桿菌中所表達的替代輕鏈構建體的抗原結合因為替代輕鏈融合物展現出形成穩定的復合物，所以我們想要確立與來自抗流感抗體的重鏈配對的此類融合物是否會結合所述抗體的關聯病毒。為了測試結合，如上文所述的那樣制備周質溶胞物。然后將溶胞物進行ELISA抗原結合，基本上如上文所述的，只是經由多克隆親和純化的抗體用針對重鏈C端附加的六組氨酸表位的單克隆抗體或針對替代輕鏈融合物C端附加的E標簽的單克隆抗體檢測結合。通過抗小鼠或抗家兔過氧化物酶偶聯抗體實現表位檢測。最后，以比色法顯現結合，并用TMB底物顯色來定量。圖17中顯示了結果。實施例ll:噬菌體展示的替代輕鏈構建體的抗原結合因為有可能在異源系統中制備替代輕鏈變體，并且因為噬菌體展示的集合對于未來的蛋白質發現和工程化改造是想要的，所以我們想要確定替代輕鏈變體和/或融合物作為基因III結合的復合物是否容易展示在ml3噬菌體表面上。將變體(SEQIDNO:18-22)和先前所描述的融合物(SEQIDNO:12和13)與兩種抗流感抗體重鏈(SEQIDNO:19和14)之任一種進行共表達，.如上文所描述的，并且結合基本上遵循上文也進行描述的條件。簡言之，用H5N1越南1203/04病毒包被微量滴定孔，并容許噬菌粒結合，然后清洗，并直接經由抗ml3過氧化物酶偶聯抗體來檢測。用TMB進行的比色底物產物形成后，定量地測定結合。在圖18和圖19中顯示了結果。實施例12:噬菌體替代輕鏈構建體文庫的構建、選擇、克隆ELISA采用使用組合抗體文庫的迭代方法，生成和測試了結合抗原的替代輕鏈構建體。簡言之，創建自H5N1禽流感存活者的骨髓制備的組合抗體文庫。針對H5N1病毒血凝素蛋白篩選這些文庫達兩輪選擇。接著，擴增并純化噬菌粒質粒。通過來自這種質粒制備物的限制性消化來分離重鏈可變區，并與重鏈恒定域l以符合讀碼框的方式克隆，以形成與ml3基因III外殼蛋白的重組融合物，供噬菌粒展示使用。重要的是，我們使用兩種接受質粒，其中任一種共表達由VpreBl和人5構成的替代輕鏈融合物(SLC融合物1)(SEQIDNO:10)或由VpreBl和來自經典X輕鏈的X恒定域構成的替代輕鏈融合物(SEQIDNO:11)(SLC融合物2)。融合物l文庫產生3.84xl0個獨立的轉化體，而融合物2文庫產生7.8乂107個轉化體。對這兩個文庫均獨立地經過兩輪進行篩選，并且兩者都顯示超過背景的顯著富集(融合物l:5x,融合物2-20x)，這在第二4侖淘選中得到提高(融合物l-97x，融合物2:48x)。為了通過ELISA來測試克隆抗原結合，將來自這兩輪和這兩個文庫的噬菌體都轉移入HB2151大腸桿菌菌抹中以生成可溶性替代體融合蛋白。簡言之，培養HB2151克隆，并誘導以生成可溶性替代體。具體地，將菌落在補充有100mcg/ml氨節青霉素和200微摩爾IPTG的2-YT培養基中于30。C培養過夜，制備周質溶胞物，如上文所述的那樣。通過ELISA來測試所得的周質溶胞物，基本上如上文所概述的。圖20中顯示了第1輪和第2輪淘選時兩種融合物的轉化體數目和百分比陽性克隆，而圖21和圖22中顯示了融合物1和融合物2文庫克隆的第1輪和第2輪的克隆分析數據。實施例13:為了延長血清半衰期的替代輕鏈融合物抗體片段的體內半衰期在它是與完整且整個重鏈的融合物的一部分時得到相當大地延長，所述完整且整個重鏈包括所有重鏈恒定域，不僅僅是那些形成穩定抗原結合片段所必需的。在IgG的情況中，這意味著包括域CH1、CH2、和CH3。特別地，完善建立的是，CH2和CH3賦予大部分的這種體內效應。實際上，與親本分子相比，這些CH2和CH3域與異源蛋白質的融合物通常足以改善這些嵌合分子的效力和PK/PD。類似地，與VpreB和X5任一或兩者的功能性融合物受益于與重鏈恒定域的這種結合。為了治療II型糖尿病，胰高血糖素樣肽l(或GLP-1)的施用通過在胰中誘導葡萄糖依賴性胰島素分泌，由此改善那些患者中的葡萄糖管理而使個體受益。然而，長壽命的GLP-1肽是所希望的目標。因為替代輕鏈的尾部是獨特且易接近的，所以我們可以通過以重組方式將活性GLP-1才莫塊融合至VpreBl尾部(SEQIDNO:23和24)的C端或X5的N端尾部(SEQIDNO:25和26)來實現這個目標。在X5融合物的情況中，我們可以在存在或沒有VpreBl的情況中，而且甚至在存在或沒有重鏈可變域的情況中表達這個，如圖ll中所描繪的。可以在存在或沒有人5的情況中，且可能在有或沒有重鏈CH1域的情況中類似地制備與VpreBl的融合物。類似地，可以創建其它有益的生長因子、細胞因子、受體、和酶融合物。在所有的這些情況中，結合不是替代輕鏈或SURROBODYTM構件所必需的，而是可以由異源替代輕鏈融合元件完全或大部分地賦予。雖然在上述說明書中參照某些實施方案例示了本發明，但是它不限于此。實際上，在那些本文中所顯示的和描述的之外對本發明的各種修飾對于本領域技術人員根據上述說明書會變得顯而易見，并落入所附權利要求書的范圍之內。實施例14:血凝素結合替代輕鏈構建體的親和力測定為了測定融合替代輕鏈構建體(SURROBOD正STM,參見圖ll)的親和力，我們在大腸桿菌中過表達和純化多種替代體，并將它們與首先鑒定出重鏈的親本Fab進行比較。基本上如下在BioForteOctet上通過生物層干涉測量法(Bio-LayerInterferometiy)來測定親和力。首先，使用PierceNo-WeighPE04生物素(產品目錄編號21329)依照制造商的說明書以20:1摩爾過量對100嗎純化的血凝素蛋白進行生物素化，在間歇混合的情況中于室溫溫育l-3小時，然后于4。C溫育過夜。通過大小排阻旋轉柱除去過量的生物素，并交換入PBS中。接著，通過使用N產親和層析的FPLC來純化HA結合替代輕鏈構建體和Fab，脫鹽以除去過量的咪唑，濃縮，并通過定量輕鏈ELISA(BethelLabs，產品目錄編號E80-115-ic，和E80-116-;g來定量，其依照制造商的說明書進行。最后，通過分析一系列樣品濃度來測定親和力，所述樣品濃度通常是以連續2倍稀釋的15nM-500nM。將所述樣品與用HA蛋白包被的生物傳感器一起溫育達長至15分鐘，然后在樣品稀釋劑中溫育達長至l小時。在以1500RPM旋轉樣品平板的情況中完成所有的這些步驟。在Fab與經HA包被的生物傳感器一起溫育期間測量結合，并在結合后在樣品稀釋劑溫育中測量解離。下表中顯示了親和力。克隆融合物1融合物lFab37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>在此通過提及明確而完整收錄貫穿說明書所引用的所有參考文獻，及其中所引用的參考文獻。權利要求1.一種多肽，其包含與異質氨基酸序列偶聯的VpreB序列和/或λ5序列，其中所述多肽能夠結合靶物。2.權利要求l的多肽，其包含VpreB序列。3.權利要求2的多肽，其中所述VpreB序列選自下組天然VpreBl序列、天然VpreB2序列、天然VpreB3序列及其片段和變體。4.權利要求3的多肽，其中所述天然VpreB序列選自下組SEQIDNO:1的人VpreBl、SEQIDNO:2和3的小鼠VpreB2、SEQIDNO:4的人VpreB3、及其片段和變體。5.權利要求2的多肽，其中所述異質氨基酸序列包含人5序列。6.權利要求5的多肽，其中所述異質氨基酸序列包含SEQIDNO:5的人X5的或SEQIDNO:6的人X5樣多肽的整個或部分。7.權利要求5的多肽，其中所述入5序列是與所述VpreB序列融合的。8.權利要求2的多肽，其包含VpreB序列與異質氨基酸序列的融合物。9.權利要求8的多肽，其中所述異質氨基酸序列是X5序列。10.權利要求9的多肽，其中所述VpreB序列選自下組SEQIDNO:l的人VpreBl、SEQIDNO:2和3的小鼠VpreB2、和SEQIDNO:4的人VpreB3、及其片段和變體。11.權利要求10的多肽，其中所述X5序列是SEQIDNO:5的人X5、SEQIDNO:6的人X5樣多肽、或其片段或變體的序列。12.權利要求9的多肽，其中所述融合分別在所述VpreB序列和人5的CDR3類似區處或周圍發生。13.權利要求8的多肽，其中所述異質氨基酸序列包含抗體輕鏈可變區序列。14.權利要求13的多肽，其中所述抗體輕鏈可變區序列是在與抗體輕鏈CDR3區類似的位點處與所述VpreB序列融合的。15.權利要求13的多肽，其中所述抗體輕鏈可變區序列的CDR3區是在與所述CDR3區類似的位點處與所述VpreB序列融合的。16.權利要求15的多肽，其中所述抗體輕鏈是人鏈。17.權利要求15的多肽，其中所述抗體輕鏈是K鏈。18.權利要求13的多肽，其中所述異質氨基酸序列進一步包含抗體輕鏈恒定區序列。19.權利要求18的多肽，其中所述恒定區序列是抗體輕鏈的整個恒定區。20.權利要求l的多肽，其包含X5序列。21.權利要求20的多肽，其中所述人5序列是SEQIDNO:5的人入5、SEQIDNO:6的人15樣多肽、或其片段或變體的序列。22.權利要求21的多肽，其中所述異質氨基酸序列是與所述人5序列偶聯的VpreB序列。23.權利要求22的多肽，其中所述偶聯是所述X5與VpreB序列的融合。24.權利要求22的多肽，其中所述偶聯是所述X5和VpreB序列之間的共價連接。25.權利要求24的多肽，其中所述共價連接是由連接肽或多肽序列形成的。26.權利要求l的多肽，其包含VpreB序列和X5序列，其中所述偶聯是非共價結合，且其中所述VpreB和X5序列至少其一分別不同于全長天然VpreB和入5序列。27.權利要求26的多肽，其中所述VpreB和X5序列至少其一分別是天然VpreB和X5序列的片段或變體。28.權利要求l的多肽，其中所述多肽是與第二異質氨基酸序列進一步偶聯的。29.權利要求28的多肽，其包含與所述第二異質氨基酸序列共價結合的，VpreB序列與X5序列的融合物。30.權利要求29的多肽，其中所述第二異質多肽序列是包含可變區的抗體重鏈序列。31.權利要求30的多肽，其中所述抗體重鏈序列是通過肽接頭而與所述VpreB序列和所述X5序列的融合物偶聯的。32.權利要求30的多肽，其中所述抗體重鏈序列是通過非共價結合而與所述VpreB序列和所述X5序列的融合物偶聯的，以形成二聚體復合物。33.權利要求32的多肽，其中所述抗體重鏈可變區序列與所述多肽結合相同的革巴物。34.權利要求32的多肽，其中所述抗體重鏈可變區序列結合與所述多肽結合的耙物不同的耙物。35.權利要求34的多肽，其中所述多肽結合腫瘤抗原，而所述抗體可變區序列結合效應細月包。36.權利要求26的多肽，其進一步包含抗體重鏈序列，所述抗體重鏈序列包含可變區，與非共價結合的VpreB序列和人5序列非共價結合，以形成三聚體復合物。37.權利要求36的多肽，其中所述抗體重鏈包含與所述多肽結合相同靶物的可變區序列。38.權利要求36的多肽，其中所述抗體重鏈包含結合與所述多肽結合的靶物不同的靶物的可變區序列。39.權利要求38的多肽，其中所述多肽結合腫瘤抗原，而所述可變區序列結合爻丈應細力包。40.權利要求l的多肽，其中所述VpreB序列和/或所述X5序列的CDR類似區是通過嫁接來自治療性抗體的相應CDR序列而得到工程化改造的。41.權利要求l的多肽，其中所述靶物是抗原。42.權利要求l的多肽，其中所述靶物是病毒抗原。43.權利要求42的多肽，其中所述靶物是流感A病毒。44.權利要求43的多肽，其中所述多肽中和所述流感A病毒。45.—種文庫，其包含依照權利要求l-44任一項的多肽。46.—種文庫，其包含與抗體重纟連結合的、VpreB序列和X5序列的偶聯物。47.權利要求46的文庫，其中所述偶聯物是所述VpreB與、5序列的融合物。48.權利要求46的文庫，其中所述偶聯物是所述VpreB與人5序列的非共價結合。49.權利要求46的文庫，其中所述偶聯物是經由肽接頭的所述VpreB和X5序列的共價連接。50.權利要求46的文庫，其中所述抗體重鏈可變區序列是與所述偶聯物非共價結合的。51.權利要求46的文庫，其中所述抗體重鏈可變區序列是與所述偶聯物共價結合的。52.權利要求46的文庫，其中所述抗體重鏈包含與所述偶聯物結合相同靶物的可變區序列。53.權利要求46的文庫，其中所述抗體重鏈包含結合與所述偶聯物結合的靶物不同的耙物的可變區序列。54.權利要求53的文庫，其中所述偶聯物結合腫瘤抗原，而所述可變區序列結合效應細月包。55.處于展示形式的權利要求45的文庫。56.權利要求55的文庫，其中所述展示選自下組噬菌體展示、細菌展示、酵母展示、核糖體展示、mRNA^示、DNA^示、哺乳動物細胞上的展示、孢子展示、病毒展示、基于蛋白質-DNA連接的展示、和微珠展示。57.處于展示形式的權利要求46的文庫。58.權利要求57的文庫，其中所述展示選自下組噬菌體展示、細菌展示、酵母展示、核糖體展示、mRNA^示、DNM示、哺乳動物細胞上的展示、孢子展示、病毒展示、基于蛋白質-DNA連接的展示、和微珠展示。59.—種文庫，其包含替代輕鏈序列。60.處于展示形式的權利要求59的文庫。61.權利要求59的文庫，其中所述展示選自下組噬菌體^L示、細菌展示、酵母展示、核糖體展示、mRNA^示、DNM示、哺乳動物細胞上的展示、孢子展示、病毒展示、基于蛋白質-DNA連接的展示、和微珠展示。62.權利要求45、46或59的文庫，其進一步包含附加至所述文庫成員或嵌入所述文庫成員中的至少一種別的功能性。63.權利要求62的文庫，其中所述別的功能性是由抗體、肽、或多肽序列提供的。64.權利要求63的文庫，其中所述多肽序列是受體或配體序列。65.權利要求63的文庫，其中所述抗體、肽、或多肽序列是抗體、肽、或多肽文庫的成員。66.權利要求65的文庫，其中所述肽文庫是隨機肽序列的文庫。67.權利要求66的文庫，其中至少一些所述肽序列具有對靶抗原的結合特異性。68.處于展示形式的權利要求62的文庫。69.權利要求68的文庫，其中所述展示選自下組噬菌體展示、細菌展示、酵母展示、核糖體展示、mRNA^示、DNAJl示、哺乳動物細胞上的展示、孢子展示、病毒展示、基于蛋白質-DNA連接的展示、和微珠展示。70.—種文庫，其包含與抗體重鏈可變區序列結合的替代輕鏈序列的集合。71.權利要求70的文庫，其中所述替代輕鏈序列具有對一種或多種靶物的結合特異性。72.權利要求71的文庫，其中所述替代輕鏈序列具有對同一靶物的結合特異性。73.權利要求71的文庫，其中所述替代輕鏈序列具有對至少兩種不同靶物的結合特異性。74.權利要求71的文庫，其中所述替代輕鏈序列具有對多種靶物的結合特異性。75.權利要求70的文庫，其中所述替代輕鏈序列包含VpreB序列和/或X5序列。76.權利要求75的文庫，其中所述VpreB序列選自下組人VpreBl(SEQIDNO:1)、小鼠VpreB2(SEQIDNO:2和3)、和人VpreB3(SEQIDNO:4)序列及其片段和變體。77.權利要求75的文庫，其中所述X5序列選自下組SEQIDNO:5的人X5、SEQIDNO:6的人人5樣多肽、及其片段和變體。78.權利要求75的文庫，其中所述VpreB和X5序列是彼此非共價結合的。79.權利要求75的文庫，其中所述VpreB和X5序列是彼此共價連接的。80.權利要求79的文庫，其中所述VpreB和X5序列是彼此直接融合的。81.權利要求75的文庫，其進一步包含附加至所述文庫成員或嵌入所述文庫成員中的至少一種別的功能性。82.權利要求81的文庫，其中所述別的功能性是由抗體、肽、或多肽序列提供的。83.權利要求82的文庫，其中所述多肽序列是受體或配體序列。84.權利要求82的文庫，其中所述抗體、肽、或多肽序列是抗體、肽、或多肽文庫的成員。85.權利要求84的文庫，其中所述肽文庫是隨4幾肽序列的文庫。86.權利要求85的文庫，其中至少一些所述肽序列具有對靶抗原的結合特異性。87.處于展示形式的權利要求70的文庫。88.權利要求87的文庫，其中所述展示選自下組噬菌體展示、細菌展示、酵母展示、核糖體展示、mRNA^i示、DNA^示、哺乳動物細胞上的展示、孢子展示、病毒展示、基于蛋白質-DNA連接的展示、和微珠展示。全文摘要本發明涉及包含抗體替代輕鏈序列的構建體和文庫。具體地，本發明涉及包含VpreB序列(任選地，與另一多肽諸如例如抗體重鏈可變域序列配偶的)的構建體及含有其的文庫。文檔編號C07K16/28GK101679974SQ200880010164公開日2010年3月24日申請日期2008年3月26日優先權日2007年3月27日發明者勞倫斯·霍羅威茨,麗徐,拉梅什·巴特申請人:航道生物技術有限責任公司