專利名稱：：Prame衍生的肽以及包括該肽的免疫原組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥和免疫學領域。特別涉及到肽、疫苗以及用于制備在給藥至患者時能夠在體內引發抗腫瘤細胞的免疫應答的疫苗組合物的制備方法。
背景技術：
：腫瘤相關的抗原PRAME(黑素瘤細胞中優先表達的抗原)最初被鑒定為能夠被具有溶解黑素瘤細胞能力的細胞毒性T淋巴細胞識別的抗原(Ikeda等，Immunity.1997;6:199-208)。雖然，已知腫瘤抗原PRAME在多種人類癌癥中過表達，但目前還不了解它的分子功能。PRAME最近被鑒定為RAR(視黃酸受體)信號的顯性阻抑物。在存在RA時PRAME結合在RAR上，通過募集Polycomb蛋白阻止了配體誘導的受體激活作用以及靶基因的轉錄。PRAME存在于RAR靶的啟動子上，并抑制了RA誘導的分化、生長阻滯、以及凋亡。相反，在RA抗性的人黑素瘤中通過RNA干擾抑制PRAME的表達，恢復了的RAR信號并恢復了體內和體外對RA的抗增殖作用的敏感性(Epping等，Cell.2005;122(6):835-47)。時常在人惡性腫瘤中觀察到的PRAME的過表達可以通過拮抗RAR信號為腫瘤細胞提供生長和存活方面的優勢。事實上發現PRAME在很多種固體腫瘤中以及30%的急性白血病中具有過表達，而表達PRAME的正常組織僅限于睪丸、子宮內膜，并且在卵巢和腎上腺中的表達水平很低。PRAME為已建立的腫瘤抗原，其作為免疫療法的標靶的潛在應用在現有技術中已有證據，如US5,830，753、US6,297,050、US6,339,149、EP0783511Bl、WO01/52612和US2005/0221440Al中公開的。雖然有很多出版物指出了PRAME作為腫瘤抗原以及引發抗腫瘤細胞免疫應答和制備抗腫瘤疫苗的候選標靶的潛能，但幾乎沒有證實了PRAME衍生的肽和表位能夠天然保存的有用數據，也沒有顯示了在建立有效的抗腫瘤T細胞應答時所需的這些表位的免疫原性的有用數據。本發明著眼于這些問題并提供了改進的PRAME衍生的肽，該衍生的肽包括新鑒定的MHCI類和II類表位，本發明還提供了包括這些肽的組合物。
發明內容US6,297,050、WO01/52612和US2005/0221440A1提供了編碼表位(epitopes)的PRAME衍生的核苷酸分子，以及包括這些表位的肽。包括現有技術中公開的肽的PRAME衍生和/或PRAME表位可以用作接種組合物的活性組分。這些肽基于I類HLA呈遞的(presented)表位，該表位的確定是通過結合預定的算法和蛋白酶體剪切的檢測來進行的，而不考慮為了最佳地誘導CD8+CTL應答，所選序列需要包括由I類HLA分子和II類HLA分子呈遞的序列。此外，沒有數據證明是否這些表位和肽確實在人體內具有引發免疫應答的能力。本發明提供了能夠引發。04+T輔助淋巴細胞(Thcells)和CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的應答的肽和組合物。本發明的主要目的在于提供含有新型抗腫瘤PRAME表位的肽以及用于接種目的的包括所述肽的組合物，由于存在確定的CD4+Th和CD8+CTL表位，因此這些組合物的效果更好。含有這些肽的本發明組合物可以合成制備并因此是完全確定的，這對制造、質量控制以及確保安全的目的來說是有益的。本發明的肽最佳地被設計用作疫苗，以誘導強烈的治療性和/或保護性的免疫應答，并通過同時引發CD4+Th和CD8+CTL的應答而對抗表達PRAME的惡性腫瘤，并且本發明的肽適用于較高百分比的患者，因為這些肽中含有的HLAI類和HLAII類200880009876.5)。本發明提供了一種改進的衍生自PRAME蛋白的肽，其中，該肽包括新鑒定的表位。根據本發明的PRAME衍生的肽的序列符合許多嚴格的要求序列足夠小以能夠有效地合成同時還得足夠大以能夠被專門的抗原呈遞細胞捕獲。根據本發明的肽可以容易地被20S蛋白酶體降解，釋放出I類HLA可呈遞的片段或表位。根據本發明的肽優選包括至少一個I類HLA表位和至少一個II類HLA表位。所述II類HLA可呈遞的表位通過不依賴蛋白酶體的途徑從本發明的肽中分離出來。實質上，這些II類HLA表位被呈遞以形成最適的CD8+效應T細胞和CD8+記憶T細胞，因為CD4+Th細胞能夠為樹突狀細胞(DC)提供必要的信號從而使這些樹突狀細胞(DC)誘導最佳的強CD8+效應物以及記憶T細胞的應答。存在于本發明的肽中的表位可以被廣范圍的MHC單體型的廣范圍的I類HLA和II類HLA分子所展示，特別是涵蓋了患者體內多數HLA單體型的最主要的這些人HLA分子。本發明的肽包括HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62呈遞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位，其中，已實驗性的建立了所述CTL表位的結合I類HLA的能力和由蛋白酶體產生的C-末端。最優選含有結合HLA-A2的CTL表位的肽，因為HLA-A2為人類最主要的I類HLA分子。此外，根據本發明的肽優選具有經過健康的對照組和/或癌癥患者的體外分析證明了的CD4+Th細胞反應性，從而確保了不僅產生改進的CD8+效應物T細胞，還產生了適當的CTL記憶。此外，本發明的肽中存在的結合I類HLA分子的CTL表位優選具有經過在健康的供體和/或癌癥患者中在體外和/或體內誘生CTL的能力而確認的CD8+CTL細胞刺激活性。特別地，本發明公開了一組20個PRAME衍生的肽，該肽具有源自PRAME氨基酸序列的33-35個連續的氨基酸(aa)，這些肽滿足的上述大部分的或者全部的要求并且可以分別使用，或者2、3、4、5、10甚至所有20個肽任意結合使用，以用于治療或預防惡性腫瘤或癌癥，以及用于治療和/或預防(過)表達PRAME的惡性腫瘤(特別是腫瘤)的接種組合物。因此，本發明公開了免疫原組合物，該組合物包括選自由20個PRAME衍生的肽所組成的組中的至少一種(優選兩種或兩種以上)肽。優選情況下，所述免疫原組合物還包括免疫調節劑和佐劑(更優選合成的佐劑)，選擇所述佐劑以極大地增強并優化本發明的肽和表位的免疫原活性，從而在體內和/或體外顯示出抗腫瘤活性。抗腫瘤疫苗可以應用在多種治療領域(從抗癌癥治療至惡性腫瘤如病毒誘導的惡性腫瘤的治療或預防)，包括人乳頭狀病毒(HPV)、柯氏肉瘤皰疹病毒(Kaposisarcomaherpesvirus,KSHV)、EB(EpsteinBar)病毒誘導的淋巴瘤(EBV)、以及展示腫瘤抗原(例如，MAGE、BAGE、RAGE、GAGE、SSX-2、NY-ESO-l、CT-抗原、CEA、PSA、p53或PRAME)的偶發性的惡性腫瘤。由任意的抗腫瘤肽疫苗獲得的最優選的免疫應答為由所述肽中的T細胞表位引發的T細胞應答。成功的抗腫瘤T細胞應答應當包括I類HLA限制性CTL應答和同時發生的II類HLA限制性Th應答，并且可以伴隨有B-細胞應答。多篇出版物已經證實了CD4+T-細胞與呈遞II類表位的樹突狀細胞(DC)的相互作用使CD40配體上調。CD4+Th細胞通過其CD40配體與位于DC上CD40分子的相互作用導致了DC的激活。激活的DCs展示上調的協同刺激分子并分泌促進CTL的細胞因子。這不僅獲得了由該激活的DC(呈遞I類MHC限制性表位)誘導的更強烈的CD8+CTL應答，而且還獲得了更強烈的CTL記憶應答(Ridge等.1998,Nature393:474;Schoenberger等.1998，Nature393:480;Sun等2004,Nat.Immunol.5:927)。Zwaveling等公開了在接種長鏈的(35個氨基酸)肽以后，對于強烈的抗腫瘤CD8+CTL應答來說需要CD40在DC上的表達(2002，J.Immunol.169:350)。近來發現，當在所述長鏈的肽中含有的II類MHC表位未誘導CD4+Th應答時，誘導的CD8+CTL應答較弱且短暫，并且完全缺失008+CTL記憶。通過連續的確定的細胞內機制，從全長的PRAME蛋白分子或者從編碼有缺陷的核糖體產物的較短的PRAME，在細胞內產生呈遞由PRAME編碼的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位的I類HLA分子(DRIPS;Yewdell等，2002,Mol.Immunol39:139)。首先，能夠確定CTL表位的主要因素是所述表位(或表位前體)通過細胞溶質肽酶的酶消化作用而從它的旁側蛋白區域釋放出來。多種催化性的蛋白酶體作為初級酶復合物對于絕大多數的CTL表位的正確的C-末端的產生是需要的(Rock等，2004，Nat.Immunol.5:670)。另一方面，CTL表位的氨基末端的生成則更為靈活，因為在細胞溶質和內質網(ER)上存在多種氨基末端外肽酶(例如，ERAPl、嘌呤霉素敏感性的氨基肽酶、爭光霉素水解酶以及其他的外肽酶)，并且這些修整酶具有使延長的表位前體的N-末端縮短至表位的精確長度的能力。相反，沒有C-末端修整的報道。因此，PRAME蛋白上的蛋白酶體剪切位點的實驗性檢測鑒定了能夠結合I類HLA分子的內源產生的PRAME肽片段的C-末端。在具體的例子中，關于大部分的具有堿性C-末端殘基的CTL表位，非蛋白酶體酶活性對表位的C-末端的生成是需要的(見Tenzer等，2005;Cell.Mol.LifeSci62:1025和Seifert等，2003，Nat.Immunol.4:375)。本發明還公開了一種新型的呈遞CTL表位的HLA-A3，該HLA隱A3經過鑒定通過N-精氨酸二元轉化酶(Nardilysin)(EC3.4.24.61)和甲拌磷寡肽酶(TOP)(EC3.4.24.15)的非蛋白酶體的二元反應生成了C-末^山頓。其次，酶法產生的長度為9-11個氨基酸的肽片段應該具有結合細胞中可用的I類HLA分子的能力，該I類HLA分子是在所述細胞中產生的。所述肽與I類HLA分子的結合限制于那些在所謂的錨定位點具有所需氨基酸殘基的肽。由于HLA分子的高度多態性，每種I類分子均具有不同的優選結合基序，該結合基序包括優選的錨定殘基。可以實驗性地檢測多數由蛋白酶體消化的酶消化現象以及I類HLA肽的結合，并且這種檢測結果的結合實現了對呈遞CTL表位的I類HLA分子進行可靠且精確的篩選(Kessler等，2001，J.Exp.Med.173:73)。此外，為了確認來自PRAME的經過鑒定的假定的I類HLA分子呈遞的CTL表位的有效性，可以對合成的表位肽進行體外誘導CTL應答的免疫原能力的檢測。一旦產生具有對抗經鑒定的表位的反應性的CTL細胞系，則該CTL細胞系(或源自該細胞系的克隆)可以用于通過功能性的CTL識別分析來確認腫瘤細胞上CTL表位在細胞表面的表達(Kessler等，2001,J.Exp.Med.173:73)。本發明提供了源自完整的PRAME蛋白抗原的仔細篩選的肽序列。這種肽在廣范圍的患有PRAME陽性癌癥的患者中給藥后，產生了改進的、增強的以及延長的CD8+CTL效應物以及記憶細胞應答。位于PRAME中的新鑒定的CD4+Th細胞和CD8+CTL細胞表位、以及PRAME衍生的合成肽和含有它們的免疫原組合物也是本發明的一部分。因為本發明的肽優選單獨或組合用作疫苗或者作為免疫原組合物的一部分，所以所述肽優選稱作疫苗肽以及疫苗組合物。在醫療目的的應用中優選使用相對短的肽，因為它們可以在體外有效地被合成，使用大于約IOO個氨基酸的天然蛋白是不可能的并且也是不經濟的。肽的化學合成可以通過常規的方法以及各種本領域技術人員公知的合適的方法進行。肽的化學合成還可以克服與完整的蛋白質的重組產生有關的問題，即，難于標準化并且需要大量的純化以及質量控制措施。長度超過I類和II類HLA表位(例如，具有下文所指定的長度)長度的肽對用作疫苗組分來說是特別有益的，因為它們足夠大從而能夠被專門的抗原呈遞細胞(特別是DC)所捕獲，如在WO02/070006中所描述的；并且它們在含有的I類和II類HLA表位發生細胞表面呈遞(presentation)之前在DC中被加工。因此，具有下文所述長度的本發明的肽的應用，防止了由非抗原呈遞細胞(見Toes等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93:7855和Toes等，1996,J.Immunol.156:3911)上的少量的I類HLA表位的系統性呈遞所產生的T細胞耐受性的不利誘導作用(參見Zwaveling等，2002，J.Immunol.169:350)。被呈遞到CTL細胞和/或Th細胞的T細胞受體處的包括表位的肽優選滿足許多要求。所述肽優選具有足夠的長度以包括I類HLA和II類HLA表位。此外，所述肽優選包括位于它們的I類HLA和II類HLA結合部分的錨定殘基，以能夠分別與I類和II類分子結合。肽與MHC呈遞分子之間的相互作用應該具有足夠的穩定性，以產生顯著有效的免疫應答。在本發明的內容中，如果所述肽具有中度到高度的親和結合力，則肽與MHC呈遞分子之間的相互作用在此方面被認為具有足夠的穩定性，其中，ICso《約5^iM被認為是高度親和結合力，約5pNKIC5()S約15^M被認為是中度親和結合力，約15nNKIC5(^100^iM被認為是低度親和結合力，IC5Q〉約100piM被認為是不結合。產生所述表位的C-末端的特定的蛋白酶體切割位點優選存在于表位的氨基酸序列之后，以使表位從更大的肽上解離下來并被呈遞給I類HLA分子。II類HLA分子呈遞的表位對序列長度的要求并不嚴格，因此對結合II類分子的肽的精確的酶法生成的要求并不絕對。這些要求在本發明中用于在全長的PRAME蛋白序列中定位和設計肽，使該肽包括優選的CTL和Th細胞表位的組合，并因此該肽可以作為極為適合于接種目的的肽。此外，優選使用體外(/"wYW)和先體外后體內(exw'w)的T細胞實驗來證實根據本發明的肽誘導基本的CD4+Th和CD8+CTL應答的能力。因此，本發明的肽在能夠化學合成的相對較短的肽的篩選中具有顯著的進步，所述相對較短的肽包括最有效且最廣泛適用的源自于PRAME腫瘤抗原的I類HLA和II類HLA分子呈遞的T細胞表位。通過它們的蛋白酶體切割來優化這些肽，所述肽優選含有I類HLA和II類HLA表位。包含在本發明的肽中的CTL表位的C-末端通過20S蛋白酶體的剪切出來，提供了具有CD8+CTL刺激能力的結合I類HLA的片段。在本發明的第一個方面，提供了一種肽，該肽包括選自人PRAME蛋白(SEQIDNo.21)的509個氨基酸序列的連續的氨基酸序列，其中，所述肽優選包括至少一個II類HLATh細胞表位，并且優選還包括至少一個I類HLA細胞毒性T細胞表位。優選情況下，所述肽的長度不多于100個氨基酸，并且包括選自人PRAME蛋白(即，SEQIDNo.21)的氨基酸序列的至少19個連續的氨基酸，其中，所述肽優選包括至少一個II類HLA表位并且優選還包括至少一個I類HLA表位，優選情況下(并不必須)，上述兩類表位都來源于人PRAME蛋白的氨基酸序列。更優選地，在所述肽中，至少一個II類HLA表位和至少一個I類HLA表位存在于來源于人PRAME蛋白的氨基酸序列的連續氨基酸序列中。為了清楚，本發明的肽優選包括至少一個I類HLA分子呈遞的表位，并優選還包括至少一個II類HLA分子呈遞的表位。這些表位中的每一種都是可呈遞的(presentable),并且在經此處所描述的加工后能夠與存在于細胞上的相應的特異性HLA分子結合。因此，每種HLA表位還可以稱為HLA結合的和/或可呈遞的表位。所述肽中含有的源自人PRAME蛋白的連續氨基酸序列的長度優選為至少19、20、21、22、25、27、30、33或35個氨基酸，且優選不多于100、80、60、50、45、40、35、33或30個氨基酸，并且所述肽中含有的源自人PRAME蛋白的連續氨基酸序列的長度更優選為19-45個氨基酸，甚至更優選為30-40個氨基酸，甚至更優選為30-35個氨基酸，和最優選為33-35個氨基酸。在另一個優選的實施方式中，本發明的肽包括本文所定義的源自人PRAME蛋白的任意的連續的氨基酸序列。本發明的肽可以容易地合成，并且足夠大以能夠被專門的抗原呈遞細胞所捕獲以及被蛋白酶體所加工，并且具有足夠的體積和長度以含有至少一個I類HLA表位和至少一個II類HLA表位。選擇性地，所述肽可以包括N-末端延伸或C-末端延伸，其可以是能夠增強生物可用性、細胞吸收、加工能力和/或溶解性的氨基酸、修飾的氨基酸、或其它功能基團。優選地，包含在本發明的肽中的II類CD4+Th細胞表位具有激活人類癌癥患者和/或健康對照組中的CD4+Th細胞的能力。優選在先體外后體內(av/vo)或體內(/w'vo)對激活作用進行評估，更優選在腫瘤細胞表達PRAME抗原的人類癌癥患者中進行評估。最優選地，II類HLA表位具有激活CD4+Th記憶應答的能力，即激活CD45RO-陽性CD4+Th細胞。由于通過DC的CD40-觸發(Lanzavecchia，1998，Nature393:413)的"殺細胞許可(licencetokill)"信號，將導致更強烈的CD8+效應物和記憶CTL應答。本發明的肽還包括I類HLA表位。所述I類HLA表位優選通過蛋白酶體切割進行了C-末端的加工。此外，所述1類111^八表位優選能夠激活008+CTL應答。最優選地，在人類健康對照個體或者甚至更優選在人類癌癥患者中，在先體外后體內和/或體內證實了所述CTL的激活能力。優選地，在人類癌癥患者中，腫瘤表達PRAME抗原。由于產生和維持有效的CTL細胞應答中的協同作用，觀察到在一個肽中同時存在I類HLA抗原和II級抗原是特別有利的(參見Zwaveling等，2002，J.Immunol.169:350)。本發明的PRAME肽中的I類HLA表位優選能夠在待治療的患者中呈顯性的HLA等位基因上被呈遞。優選本發明的PRAME衍生的肽中的I類HLA表位為能夠結合HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-A35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62的表位。最優選的I類HLACTL表位為結合HLA-A2的PRAME表位，因為HLA-A2在所有的高加索人、黑人、印地安人和東方人中呈高度顯性，如表1所示。I類HLA表位優選具有高度肽結合能力(IC5Q<約5)LiM的肽)或者中度親和力(5|^M<IC5()<約15|iM的肽)。根據更優選的實施方式，本發明的肽的長度不多于IOO個氨基酸，包括源自人PRAME蛋白的連續的氨基酸序列，該連續的氨基酸序列選自由SEQIDNOsl-20所示的氨基酸序列所組成的組中，或者選擇由SEQIDN06、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16、18、1、2、3、4、13、17、19和SEQIDNO:20所組成的組中，人PRAME蛋白的1-33位氨基酸表示為SEQIDNO.l，19-53位氨基酸(SEQIDN0.2)，47-79位氨基酸(SEQIDNO.3),69-101位氨基酸(SEQIDN0.4)，80-114位氨基酸(SEQIDN0.5)，94-126位氨基酸(SEQIDNO.6),112-144位氨基酸(SEQIDNO.7),133-166位氨基酸(SEQIDNO.8),173-207位氨基酸(SEQIDN0.9)，190-223位氨基酸(SEQIDNO.IO)，234-268位氨基酸(SEQIDNO.il)，247-279位氨基酸(SEQIDNO.12)，262-294位氨基酸(SEQIDNO.13)，284-316位氨基酸(SEQIDNO.14)，295-327位氨基酸(SEQIDNO.15)，353-387位氨基酸(SEQIDNO.16)，399-431位氨基酸(SEQIDNO.17)，417-450位氨基酸(SEQIDNO.18)，447-480位氨基酸(SEQIDNO.19)，477-509位氨基酸(SEQIDNO.20)。人PRAME蛋白的全長氨基酸序列如SEQIDNo.21所示。這一組中更優選的肽包括SEQIDNOs.6、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16和18，這些肽包含HLA-A2或其它顯性的I類HLA表位。這一亞組中的最優選的肽包括SEQIDNOs.6、5、8、14、15、16和18，這些肽都包含結合HLA-A2的表位，當從PRAME腫瘤抗原中經過內源加工時證實了所述結合HLA-A2的表位能夠誘導識別天然存在的表位的CTL應答。本發明的PRAME衍生的肽可以通過刪除或替換一個或多個氨基酸而被修飾，通過在N-末端和/或C-末端添加氨基酸或功能性基團的延伸而被修飾，這些修飾可以改善生物可用性、對T細胞的靶向，或者包括或釋放能夠提供佐劑或共激功能的免疫調節物質。可任選的N-末端和/或C-末端的添加氨基酸優選不存在于PRAME的氨基酸序列中的相應位置上，更優選地，N-末端禾口/或C-末端的添加氨基酸不來源于PRAME的氨基酸序列(SEQIDNO.21)。本領域的技術人員應該理解的是，天然存在的人類PRAME等位基因變體的PRAME氨基酸序列也包括在本發明的范圍內。本發明的PRAME衍生的肽可以通過化學合成以及隨后的純化而獲得(例如，見實施例1)。本發明的PRAME衍生的肽優選溶于在生理上可接受的水性溶液(例如PBS)，所述水性溶液含有不超過35、20、10、5或0%的DMSO。在這種溶液中，所述肽優選以至少0.5、1、2、4或8毫克肽/毫升的濃度溶解。更優選地，多于一種的不同的本發明的PRAME衍生的肽的混合物在這種溶液中以至少0.5、1、2、4或8毫克肽/毫升的濃度溶解。根據本發明的肽的優選應用是它們用作藥物的應用，其中，更優選地，所述肽用作疫苗或疫苗的活性組分。在治療和/或預防癌癥、在制備藥物中(優選用于治療或預防人類癌癥或形成腫瘤的疾病的疫苗)，每種肽可以單獨使用或者優選將至少一種或兩種或三種或四種或多于四種的本發明的肽結合使用。這些疾病優選包括血液惡性腫瘤和固體腫瘤，其中，癌細胞表達PRAME腫瘤抗原。根據本發明的這種藥物和/或抗腫瘤疫苗可以用于治療患有以下非廣泛列表的表達PRAME的人類腫瘤性疾病或者具有發展成為這些疾病的危險的患者黑素瘤、淋巴瘤、乳頭狀瘤、乳腺癌或宮頸癌、急性和慢性白血病、成神經管細胞瘤、非小細胞肺癌、頭頸癌、腎癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、多發性骨髓瘤、肉瘤以及包括慢性髓細胞性白血病和急性髓細胞性白血病在內的血液惡性腫瘤。另一方面，本發明還涉及可以用于治療和/或接種受試者的組合物，該組合物包括至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種如上所述的根據本發明的肽，并且選擇性地含有一種或多種藥學上可接收的賦形劑，特別是佐料和免疫調節劑。優選地，所述組合物為藥物組合物和/或用作藥劑。所述藥物組合物優選用于接種。所述藥物組合物優選用于治療和/或預防癌癥，用于制備藥物(優選用于治療或預防人類腫瘤性疾病或癌癥的疫苗)。腫瘤性疾病(癌癥)的不完全列表已經在本文中給出。所述組合物優選包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15以及直到20個不同的肽。替換性地或者與前述的優選實施方式相結合，存在于本發明的組合物中的肽的長度不超過100個氨基酸，并且包括源自人類PRAME蛋白的連續的氨基酸序列，該連續的氨基酸序列選自由SEQIDNOs.1-20所示的(如表6所示)氨基酸序列所組成的組中。更優選地，所述組合物中存在的肽選自以下亞組SEQIDNOs.6、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16以及18。它們均包括HLA-A2或其它顯性的I類HLA表位。存在于本發明的組合物中的最優選的肽選自以下亞組中SEQIDNos.6、5、8、14、15、16和18。選擇性地，可以選擇兩個或兩個以上的肽來匹配受試者或者待治療的人群的HLA等位基因。藥物的劑型、給藥途徑以及所用的藥學上可接受的賦形劑是常規的為本領域所公知的，例如在Remington的"TheScienceandPracticeofPharmacy,21stEdition2005，UniversityofSciencesinPhiladelphia"中所描述的。本發明的藥物組合物和藥物優選制成適于靜脈或皮下、或者肌肉給藥的劑型，雖然其它的給藥途徑也是可以的，例如，粘膜給藥或真皮和/或皮內給藥(如通過注射)。此外，本發明還包括單次給藥本發明的至少一種肽和/或至少一種組合物。選擇性地，如果需要可以重復給藥至少一種肽和/或至少一種組合物和/或可以依次給藥本發明的不同的肽和/或組合物。根據本發明的藥學上可接受的組合物可以包括至少一種能夠刺激免疫應答的化合物或佐劑。本發明的藥物組合物還可以包括一種或多種的合成佐劑。這些佐劑可以混合在本發明的藥物組合物中或者分別地向需要治療的哺乳動物或人類給藥。特別優選那些通過Tdl樣受體起作用的佐劑。能夠激活天然免疫系統的免疫修飾化合物可以特別地通過Toll樣受體(TLR's，包括TLR，sl-lO)而被激活。能夠激活TLR受體的化合物以及它們的修飾物和衍生物在現有技術中有記載。TLR1可以通過細菌脂蛋白和它的乙酰化形式而被激活，此外，TLR2可以被革蘭氏陽性細菌的糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、源自細菌或宿主的熱休克蛋白、以及分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖而被激活。TLR3可以通過dsDNA(特別是來源于病毒的dsDNA)而被激活，或者通過化學合成的化合物多聚(I:C)而被激活。TLR4可以被革蘭氏陰性的LPS、LTA、源自宿主或細菌的熱休克蛋白、病毒包衣或外膜蛋白質、紫杉醇或它的衍生物、含有透明質院的低聚糖和纖維結合蛋白而被激活。TLR5可以被鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以通過分枝桿菌脂蛋白質以及B鏈球菌熱不穩定的可溶性因子(GBS-F)或葡萄球菌調控蛋白而被激活。TLR7可以被咪唑并喹啉激活。TLR9可以通過未甲基化的CpGDNA或染色質-IgG復合物而被激活。特別地，TLR3、TLR7和TLR9在介導抗病毒感染的天然免疫應答中起到重要的作用，在治療方法中以及根據本發明的組合物或藥物中優選使用能夠激活這些受體的化合物。特別優選的佐劑包括但不限制于合成產生的化合物，包括dsRNA、多聚(I:C)、啟動TLR3和TLR9受體的未甲基化的CpGDNA、IC31、IMSAVAC、MontanideISA-51(法國Seppic7生產的佐劑)。在另一個優選的實施方式中，合成的佐劑化合物物理連接于本發明的肽。佐劑和共激化合物或功能基團與含有I類HLA表位和II類HLA表位的肽的物理連接，通過同時刺激抗原呈遞細胞(特別是納入、代謝并展示抗原的樹突狀細胞)而提供了增強的免疫應答。此外，優選結合使用如WO99/61065和WO03/084999中記載的抗原呈遞細胞(共)刺激分子以及本發明的肽和組合物。特別地，優選使用4-l-BB和/或CD40配體、競爭性抗體(agonisticantibodies)或功能片段和它們的衍生物，以及具有相似的競爭活性的合成的化合物，向待治療的患者進行分別的給藥或者與本發明的肽結合給藥，以進一步地刺激生成患者體內最佳的免疫應答。在另一個優選實施方式中，包括使用或不使用額外的免疫刺激物(例如，TLR配體和/或抗CD40/抗-4-lBB的抗體)，在緩慢釋放的載體如礦物油中(例如，MontanideISA51)或PGLA中遞送所述月太。在本發明的說明書和權利要求中，動詞"包括"以及它的變化形式是非限制性的意思，意味著包括下列事項但并不排除未特定給出的事項。此外，由非限定性的冠詞"一個"或"一種"限定的元素(element)不排除存在多于一個元素的情況，除非文中明確地寫明是一種以及僅僅是一種元素。因此，非限定性的冠詞"一個"或"一種"通常表示"至少一種"。通過以下實施例對本發明進行更加詳細的說明，但并不限制本發明的范圍。圖h通過使用純化的蛋白酶體的體外消化確定的源于人PRAME蛋白的合成肽中的蛋白酶體的切割位點。通過粗箭頭和細箭頭分別指示出了主要的和少量的切割位點(分別以多于或少于5%的消化材料來表示)。圖2:通過使用細胞溶質提取物和純化的酶的體外酶消化分析確定的PRA190-198的酶切釋放的N-末端和C-末端。圖3:在"Cr-釋放細胞毒性測定中檢測的通過抗PRAME衍生的CTL表位的CTL對肽和腫瘤細胞的特定識別。圖3A，HLA-A2呈遞的表位的識別，圖3B，其它I類HLA分子呈遞的表位的識別。圖4:通過蛋白酶體消化的長鏈PRAME肽的片段中的假定的完整的表位的例子。"在競爭性結合測定中被確定結合I類HLA的肽(見表3)6用免疫-蛋白酶體消化以后獲得的片段根據它們的C-末端進行排列。列出了起始氨基酸和終止氨基酸。e強度表示為在1小時的孵育時間內消化27個氨基酸的總質量峰線(mass-peak)強度的％。具體實施方式實施例在本發明中，將誘導能夠有效的和成功的抗患者體內表達PRAME的癌細胞的疫苗誘導的T細胞應答所需要的不同方面結合起來，以設計和篩選最佳的PRAME衍生的疫苗肽。優選的PRAME疫苗肽應該包括至少一種(但優選多種)能夠在患者體內誘導CTL應答的I類HLA呈遞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位，以及至少一種證明了具有引發CD4+Th淋巴細胞應答能力的PRAME衍生的肽。實驗部分以序列以及長度/大小的形式提供了用于接種的PRAEME衍生的肽進行優化設計和篩選所需要的參數。實驗部分公開了在體外和體內I類HLA呈遞的CTL表位和誘導CD4+Th淋巴細胞反應性的肽的鑒定和確認，它們存在于全長PRAME蛋白中并且可以混合在長度優選為19-45個氨基酸的肽中。實施例h源自PRAME的肽的I類HLA呈遞的肽的鑒定肽的合成生成本研究所用的所有的肽均通過固相法在自動多肽合成儀(AbimedAMS422)上使用標準的Fmoc化學法進行合成。將用于CTL誘導的短肽溶解在20nlDMSO中，在0.9X的NaCl中稀釋至肽濃度為lmg/ml，在-20'C下儲存直至使用。I類HLA肽結合測定中使用的熒光標記的參比肽為合成的半胱氨酸衍生物。使用5-(碘代乙酰胺基)熒光素(FlukaChemieAQBuchs，Switzerland)在pH7.5(磷酸鈉水/乙腈l:1V/V溶液)下進行標記。通過葡聚糖凝膠G-10使標記的肽除去鹽分，并通過C18RP-HPLC進一步純化。通過質譜分析標記的肽。用于體外蛋白酶體消化分析和CD4+Th淋巴細胞反應性分析的27個氨基酸和22個氨基酸多肽通過如上所述的方法合成，并在乙腈-水梯度溶液中通過反相HPLC純化，并在乙腈-水中過夜進行低壓凍干。通過質譜法確定純度。用于I類HLA結合檢測的PRAME的預篩選使用肽結合預測算法BIMAS(http://bimas.cit.nih.gov/molbio/hla—bind/)(Parker,等，1994,J.Immunol.152:163)禾卩SYFPEITHI(http:〃www.syfpeithi.de/)，篩選具有潛在結合于最顯性的I類HLA分子的能力的長度為8、9、10或11個氨基酸的PRAME肽。這些計算機算法搜尋存在于全長PRAME蛋白中的與目的I類HLA分子的結合基序相匹配的肽。選擇人群中患病率較高的或至少適中的I類HLA分子，例如，HLA-Al、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA誦B7、HLA畫B8、HLA-B35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62。這些I類HLA分子的人群患病率如表1所示。使用這種算法，在全長PRAME蛋白中篩選出了對所選的I類HLA分子具有預測的(有效的)結合能力的肽。合成具有高度預測的結合能力的PRAME肽(長度為9、10或11個氨基酸)，以在基于競爭的I類HLA結合測定中在實際上實驗性地確定它們的結合能力。由于結合確定的I類HLA分子的高度預測性得分對于實際的高度親和結合力來說不存必然聯系(如Kessler等在"2003，HumImmunol.64:245"中所描述)，因此，這種結合檢測是結合能力的評估所需要的。表l:HLA抗原的頻率分布以在主要人種中的百分比來表示<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>使用Marsh等在"TheHLAFactsBook.,1999"中給出的基因頻率推導出了HLA抗原的表型頻率。I類HLA肽結合能力的檢測為了實驗性地檢測結合I類HLA的能力，使用了基于I類HLA分子競爭的細胞結合測定法，開發了HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62(Kessler等，2003,HumImmunol.64:245)。使用了經EBV轉化的人類B細胞(B-LCL)，該細胞通過弱酸處理從它們天然呈遞的I類HLA肽中"分離"。收集B-LCL并在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌，將沉淀物(2-15xl(^個細胞)置于冰上5分鐘。通過在冰冷的擰檬酸緩沖液(0.263M的檸檬酸與0.123MNa2HP04的1:1混合物，如表2所示調整pH值)中孵育細胞卯秒來進行洗脫。然后，立即將細胞在冰冷的含有2%FCS的IMDM中進行緩沖，在相同的培養基中洗滌一次以上，以4xl()S個細胞的濃度重懸于IMDM培養基中(含有2。/。FCS和2嗎/ml人(32-微球蛋白(p2M))(Sigma,St.Louis，MO,USA)。在PBS/BSA0.5X中對每種競爭的測試肽進行8組兩倍的稀釋(最高濃度600)iM，6倍的測定濃度)。在測定中，從100pM至0.8|uM的量對測試肽進行檢測。在不同的I類HLA競爭測定中使用熒光素(Fl)標記的參比肽，它們的來源如表2所示。以6倍的最終測定濃度，將通過研究建立的對I類HLA分子具有高度親和力的這些肽溶解在PBS/BSA0.5%中。在96孔的V型底培養板中將25pl的競爭(測試)肽與25^的Fl標記的參比肽混合。隨后，在100^1/孔中以4xl0V孔的量加入分離的B-LCL。在4匸下孵育24小時，細胞用含有1。/。BSA的PBS洗滌3次，用0.5%多聚甲醛固定，并通過FACScan流式細胞計數儀(BectonDickinson)進行分析以檢測平均熒光值(MF)。通過以下公式計算Fl-標記的參比肽結合的百分比抑制率(1-(MF參比+競爭肽一MF背景)/(MF參比肽-MF背景))xl00%。競爭肽的結合親和力以能夠抑制50。^的Fl-標記的參比肽的結合的濃度來表示(IC5Q)。通過非線性回歸分析來計算IC5o。IC5()S5pM被認為是高度親和結合力，5pM<IC50S約15iiM被認為是中度親和結合力，約15pM<IC5QS100iaM被認為是低度親和結合力，IC5o〉100pM被認為是未結合。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>I類HLA結合測定的結果實際的結合檢測顯示49個PRAME肽(長度為9或10個氨基酸)顯示出對HLA-A2的高度的或中度的親和力(表3a)，并且如表3b所示，93個肽(長度為8、9、10、ll個氨基酸)對于其它的I類HLA分子(HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B60、HLA-B61和HLA-B62)具有高度的或中度的結合力。使用蛋白酶體消化分析的結果，進一步分析了這些已證實了具有結合I類HLA能力的肽從它們的旁側蛋白序列中通過蛋白酶體切割的酶切釋放能力(圖1)。如表4所列出的，這種分析能夠篩選具有以下性質的肽(1)具有較高的結合I類HLA<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>462YLHARLRELL1013.3462YLHARLREL96.2466RLRELLCEL914.0470LLCELGRPSM1010.5a所述肽的N-末端氨基酸(aa)在PRAME中的位置。所述肽通過它們的起始氨基酸進行分類。b所述肽的氨基酸序列。e所述肽的長度。dIC5Q為抑制50X的FL-標記的參比肽的結合力所需要的濃度((IC5。，單位為pM)。ICMS約15|JM的肽就其結合親和力而論被認為是可能的CTL表位.表3B:源自PRAME的高度和中度結合I類HLA的肽(非HLA-A2)舶a序列&長度el類HLA^結合力(ic50e)136WSGNRASLY9HLA-A14.3165STEAEQPFI9HLA-A11.4247PTLAKFSPY9HLA-A18.5267LSHIHASSY9HLA陽A11,0275YISPEKEEQY10HLA-A13.0292FLSLQCLQALY11HLA-A11.0293LSLQCLQALY10HLA-A12.9294SLQCLQALY9HLA-A12.0302YVDSLFFLR9HLA-A11.4334LSEGDVMHL9HLA-A16.3361LTDVSPEPLQ10HLA-A13.8361LTDVSPEPLQA"HLA-A13.5390ITDDQLLAL9HLA-A11.0390ITDDQLLALL10HLA匿A11.5405CSQLTTLSFY10HLA-A1<1433LSNITHVLY9HLA-A1<1439VLYPVPLESY10HLA-A110.9453GTLHLERLAY10HLA-A12.0454TLHLERLAY9HLA-A110.15RLWGSIQSRY10HLA-A31.595RLWGSIQSR9HLA-A31.1316SMSVWTSPR9HLA-A3<128ELAGQSLLK9HLA-A33.1441AIAALELLPR10HLA-A310.7580CLPLGVLMK9HU\-A3<1107LLAQEVRPRR10HLA-A314.0118KLQVLDLRK9HLA-A32.15190ELFSYLIEK9HU\-A31.42194YUEKVKRK9HLA-A33.49194YUE隨RKK10HLA-A314.00198薩RKKNVLR10HLA-A37.5025204205242255261300333429432439459135260778596173215251254283287301307412447459461466494150150302113113258259260462484853170173173NVLRLCCKKVLRLCCKKLKCTWKLPTL^KYLGQMINLRRNLRRLLLSHALWDSLFFRLSEGDVMHHLIGLSNLTHGLSNLTHVLYVLYPVPLESYRLAYLHARLRRYISMSVWTSLFPPLFMAAFAFDGRHSQTLPFTCLPLGVLVLMKGQHLHLTFKAVLDGLIPVEVLVDLFIFAMPMQDIKFSPYLGQMIPYLGQMINLQYIAQFTSQFQFTSQFLSLLYVDSLFFLFFLRGRLDQLSFYGNSISISYEDIHGTLRLAYLHARLAYLHARLRELRLRELLCELTFYDPEPILEAAQPMTKKEAAQPMTKKRYVDSLFFLRRPRRWKLQVLRPRRWKLQVLQMINLRRLLLMINLRRLLINLRRLLLYLHARLRELLPRELFPPLLPRELFPPLFQPFIPVEVLIPVEVLVDLIPVEVLVDLF910101099910101010101010101091091091099109991099910910101088991099910HLA-A3HU\-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HLA-A3HUVA24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A24HLA-A*6801HLA-A*6801HUA-A*6801HLA-B7HLA-B8HLA-B8HLA-B8HLA-B8HLA-B8HLA-B*3501HLA-B*3501HLA-B*3501HLA-B*3501HLA-B*3501HLA-B*350113.501.30<14.503.50816.004.004.072.671.005.8<15.52.1158.6<11.82.5<18.21.0<11.8<1<1<1<1<1<1pred.pred.<1<1<11.67<1<1<1<11.58<12.832.24<1186GACDELFSY9HLA-B*35012.60246LPTLAKFSPY10HLA-B*3501<1253SPYLGQMINL10HLA-B*35011.98487CPHCGDRTFY10HLA-B*35011.5499EPILCPCFM9HLA-B*3501<136KDEALAIAAL10HLA-B602.9137DEALAIAAL9HLA-B601.5550RELFPPLFM9HLA-B601.48448YEDIHGTLHL10HLA-B60<137DEAWAAL9HUV-B61<150RELFPPLFM9HLA-B61<150RELFPPLFMA10HLA-B61<194LETFKAVL8HLA-B61<189GQHLHLETF9HLA-B622.39300ALYVDSLFF9HLA-B62<1316LLRHVMNPL9HLA-B622,56427LQHLIGLSNL10HLA-B622.41439VLYPVPLESY10HLA-B621.663所述肽的N-末端氨基酸在PRAME中的位置。所述肽通過HLA分子和它們的起始氨基酸位點進行分類。b所述肽的氨基酸序列。e所述肽的長度.d所述肽結合的I類HLA分子。eIC5。為抑制50。/。的FL-標記的參比肽的結合力所需要的濃度((IC5。，單位為pM)。IC5。$約15pWl的肽就其結合親和力而論被認為是可能的CTL表位。Pred表示預測的未經檢測的高度結合親和力。實施例2:全長PRAME中的蛋白酶體切割位點的檢測在體外由蛋白酶體介導的切割分析中的材料和方法通過Groettrup等(J.Biol.Chem.270:23808-23815.;1995)描述的方法，從B-LCL細胞系中純化出20S蛋白酶體。這種細胞型已知含有免疫蛋白酶體。通過2維免疫印跡確定出LMP2和LMP7的含量較高。為了評價反應動力學，以不同的孵育時間進行消化。在300)^1的如上所述的蛋白酶體酰化緩沖液中，使用lpg純化的蛋白酶體在37i:下與所述肽(27個氨基酸，20|Lig)一同孵育1小時、4小時和24小時(Eggers,等1995.J.Exp.Med.182:1865)。加入三氟乙酸以停止消化，在-20'C下儲存樣品直至進行質譜分析。在設置有流速大約為250nL/min的在線鈉米電噴射界面的串連四極桿飛行時間質譜儀(Q-TOF(Micromass))上進行電噴射離子化質譜分析。使用專用的微米/納米HPLC自動采樣器FAMOS(LCPackings)進行注入。在水-甲醇-乙酸(95:5:1，v/v/v)中將消化溶液稀釋5倍，并裝載在水-甲醇-乙酸(95:5:1，v/v/v)中的前置柱(MCA-300-05-C8;LCPackings)上。清洗前置柱3次，以去除存在于消化液中的緩沖液。隨后，以250nl/min的流速，使用70%至90%梯度的B溶液在10分鐘內對截留(trapped)的分析物進行洗脫；(A:水-甲醇-乙酸(95:5:1，v/v/v);B:水-甲醇-乙酸(10:90:1，v/v/v)。如果需要，這種較低的洗脫率允許在同樣的洗脫過程中設置額外的MS/MS實驗。每秒記錄50-2000Da的質譜。這種分辨率能夠從多種帶電離子中直接檢測出單一同位素質量。使用Biolynx/蛋白質軟件(Micromass)在消化的前體肽中搜索質譜中的峰。使用質譜中的峰的強度來確定由蛋白酶體消化產生的肽的相對量。在體外由蛋白酶介導的切割分析的結果使用純化的20S蛋白酶體，在體外對覆蓋了幾乎整個PRAME的氨基酸序列的29個有重疊的PRAME肽(最多27個氨基酸)進行消化。消化的間隔為1小時、4小時和24小時。消化片段的質譜分析顯示了經消化的PRAME肽中的大量的和少量的蛋白酶體的切割位點。圖1顯示了較多的(表示為大于5%的消化材料)和少量的切割位點(表示為小于5。^的消化材料)，這些酶切位點是在使用純化的蛋白酶體與指定的合成肽一同孵育1小時后發現的。這些時間點反應了最可靠的生理學酶活性。使用對通過體外的蛋白酶體切割產生的肽片段的鑒定，一方面來評價具有高度和中度親和結合力的I類HLA肽的C-末端的生成，另一方面來評價在經過蛋白酶體切割后作為完整片段存在的表位。圖4顯示了一種結合肽的例子，發現這種肽在蛋白酶體切割后是完整的，代表非常可能出現在體內的表位；還顯示了一種結合肽的例子，發現這種肽在蛋白酶體切割后是不完整低。在表4中列出了顯示出高度或中度結合I類HLA能力的PRAME肽，以及在體外經過蛋白酶體切割后是具有正確的C-末端的完整的片段的PRAME肽。這種對肽的篩選可能是在細胞內進行的，也是由I類HLA分子天然呈遞到腫瘤細胞表面的，因此優選使用它們在患者體內誘導CTL應答。表4:經過蛋白酶體切割后源自PRAME的結合I類HLA的肽是具有正確的C-末端完整的片段起始a終止氨基酸序列bI類HLACc-末端的生成rf片段的完整性e1624SMSVWTSPRHLA-A3見實施例3(注釋f)NT3342SLLKDEALAIHLA-A2+++3442LLKDEALAIHLA-A2+++3645KDEALAIAALHLA-B60++ND3745DEALAIAALHU\-B60++ND3745DEALAIAALHLA-B61++ND4857LPREIFPPLFHLA-B*3501+ND5058REI_FPPI_FMHLA-B60+++5058RELFPPLFMHLA-B61+++5059RELFPPLFMAHLA-B61+++5261LFPPLFMAAFHLA-A24++ND5361FPPLFMAAFHLA-B*3501++ND6069AFDGRHSQTLHLA-A24++7786PFTCLPLGVLHLA-A24+++8997GQHLHLETFHLA-B62+++94101LETFKAVLHLA-B61+++99108AVLDGLDVLLHLA-A2+++100108VLDGLDVLLHLA-A2+++113122RPRRWKLQVLHLA-B7++113122RPRRWKLQVLHLA-B8++142151SLYSFPEPEAHLA-A2+++150158EAAQPMTKKHUVA*6801見實施例3(注釋f)NT150159EAAQPMTKKRHLA-A*6801見實施例3(注釋f)NT170178QPFIPVEVLHLA-B*3501++見實施例3(注釋')ND190198ELFSYLIEKHLA-A3+248256TLAKFSPYLHLA-A2++254262PYLGQMINLHLA-A24+/見實施例3(注釋、+253262SPYLGQMINLHLA-B*3501+/見實施例3(注釋"+259266MINLRRLLHLA醫B8++258267QMINLRRLLLHLA-A2++258267QMINLRRLLLHLA-B8++260267INLRRLLLHLA-B8++283292QYIAQFTSQFHLA-A24+++284293YIAQFTSQFLHLA匿A2+++287295QFTSQFLSLHLA-A24++ND300308ALYVDSLFFHLA-A2++300308ALYVDSLFFHLA-A3++29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>a所述呈遞的表位的N-末端氨基酸在PRAME中的位置。所述肽通過它們的起始氨基酸進行分類。6所述肽的氨基酸序列。e所述肽結合的I類HL^分子。d消化1小時后所述表位的C-末端的產生分類大量(++)代表>5%,少量(+)代表<5%e經過1小時消化后消化片段中發現的完整表位(+)表示存在；(-)表示不存在(ND)表示由于合成的輸入肽的人工末端而導致的無法確定；(NT)表示未檢測，但預測通過N-精氨酸二元轉化酶(Nardilysin)大量產生。f通過非蛋白酶體(包括在實施例3和圖2中所述的先以N-精氨酸二元轉化酶和隨后以甲拌磷寡肽酶(TOP))的切割途徑產生的PRA(190-198)的C-末端。預測通過大量的N-精氨酸二元轉化酶切割位點可以直接得到PRA(16-24)、PRA(150-158)、PRA(150-159)、PRA(253-262)和PRA(254-262)的C-末端。此外，實驗性的給出了后兩個肽(PRA(253-262),和PRA(254-262))通過蛋白酶體在它們的C-末端切割而產生。_實施例3:不依賴蛋白酶體的HLA-A3呈遞的CTL表位PRAME190-198的C-末端的產生需要非蛋白酶體切割一些不常見的CTL表位(多數在它們的C-末端具有堿性氨基酸殘基)需要使用另外的酶進行非蛋白酶體切割，以釋放它們的C-末端(Tenzer等,2005;Cell.Mol.LifeSci62:1025和Seifert等，2003，Nat.Immunol.4:375)。本發明包括一個這樣的CTL表位(位于PRAME的190-198位)，氨基酸序列為ELFSYLIEK，其中，它的C-末端是通過N-精氨酸二元轉化酶(Nardilysin;EC3.4.24.61)和甲袢磷寡肽酶(TOP;EC3.4.24.15)兩次連續的酶切但不依賴于蛋白酶體而產生的。除了涉及ELFSYLIEK表位的產生以外，可以預測N-精氨酸二元轉化酶(Nardilysin)可以通過直接切割而有效地產生下述肽的C-末端結合HLA-A3的肽PRA16-24(SMSVWTSPR)、結合HLA-A68的肽PRA'5^58和pRAi5Q-i59(EAAQPMTKK和EAAQPMTKKR)、結合HLA-A24的肽PRA254'262和結合HLA-B*3501的肽PRA253'262。后兩個肽(PRA254'262和PRA253'262)還可以通過蛋白酶體切割(如表4所示)而產生C-末端。酶法生成PRAME'9Q—198的N-末端和C-末端的檢測中的材料和方法及結果使用濃度為20nM的純化的蛋白酶體制劑、N-精氨酸二元轉化酶(Nardilysin)和甲拌磷寡肽酶(TOP),以在無細胞體系中消化合成的27個氨基酸(PRA'國)、19個氨基酸(PRA,8)、13個氨基酸(PRA扁2)、12個氨基酸(PRA19Q-2()1)和11-個氨基酸(PRA19°-2(K))的肽(濃度為20pM)，在這些肽的天然旁側區域(flankingregions)包含HLA-A3呈遞的CTL表位ELFSYL正K(PRA19(M98)。如圖2所描述的，全面的消化分析揭示了通過蛋白酶體的切割位點有效地釋放了PRA，^的N-末端。然而，與眾多主要的CTL表位相比，釋放C-末端需要先以N-精氨酸二元轉化酶(Nardilysin)切割，產生了11個氨基酸、12個氨基酸和13個氨基酸的前體表位肽PRA190—2QQ;'9Q-2Q1;19Q-2Q2，隨后以甲拌磷寡肽酶(TOP)介導的降解使所述ll個氨基酸、12個氨基酸和13個氨基酸的前體肽降解為最小9個氨基酸的ELFSYLIEK表位。此外，使用CTL克隆識別具有抑制的N-精氨酸二元轉化酶(Nardilysin)或甲拌磷寡肽酶(TOP)水平(通過RNA干擾方法)的靶細胞(PRAME和HLA-A3陽性的)中的ELFSYLIEK表位(見圖3)的功能性識別實驗，證實了這兩種酶對活體細胞中產生9個氨基酸的ELFSYLIEKPRA19(M98CTL表位來說是確切需要的(數據未示出)。由于HLA-A3的結合基序臨近HLA-All的結合基序，這種新型的表位還被認為是新型的HLA-A11呈遞的表位。表達HLA-A11和PRAME的靶細胞被CTL抗-ELFSYLIEK特異性的識別(數據未示出)。實施例4:對經鑒定的CTL表位淋巴細胞的免疫原性和內源產生的檢測對經鑒定的假定I類HLA呈遞的CTL表位的亞型進行免疫原性分析。通過在體外誘導抗合成產生的CTL表位的CTL來確定免疫原性。此外，檢測了產生的CTL(克隆)識別共表達有PRAME和正確的I類HLA分子的腫瘤的能力。對抗以下選擇到的結合I類HLA分子的PRAME衍生的CTL表位誘導CTL的大批培養。選擇肽PRA咖，(VLDGLDVLL)、PRA142'151(SLYSFPEPEA)、PRA300-309(ALYVDSLFFL)、PRA37"80(ALLERASA丁L)和PRA425-433(SLLQHLIGL)，因為這些肽是預測HLA-A2呈遞的CTL表位。此外，誘導抗以下表位的CTL:PRA19(M98(ELFSYLIEK)(—種HLA-A3呈遞的CTL表位)，PRA11"22(RPRRWKLQVL)(—種HLA-B7呈遞的表位)，PRA258-267(QMINLRRLLL)(—種預測表達HLA-B8的CTL表位)。CTL克隆的體外生成過程和功能性的CTL分析通過菲科帕克(Ficoll-Paque)法從健康的供體的血液中得到用于誘導CTL的外周血單核細胞(PBMC)。為了優化地使用存在于PBMC中的所有APC，我們開發了能夠產生激活的B細胞與成熟DC細胞的混合物的培養系統，所述混合物在最初的誘導步驟中用作APC。外周血單核細胞(PBMC)是通過綿羊紅細胞-玫瑰花結形成法(SRBC-rosetting)從T細胞部分和含有B細胞和單核細胞的部分中分離的。冷凍保藏T細胞部分。以lxl06個細胞/孔的濃度，在24孔板中在含有800U/mlGM-CSF、500U/mlIL-4(PeproTechInc.)和500ng/mlCD40mAb(克隆B-B20;Serotec)的完全培養基中培養單核細胞和B細胞的混合物6天。這種培養體系具有以下三種作用i)GM-CSF和IL-4誘導單核細胞分化為未成熟的樹突狀細胞；ii)IL-4和CD40mAb引發B細胞的激活和增殖(Schultze，等1997,JClin.Invest.100:2757)，以及iii)CD40mAb介導未成熟的樹突狀細胞的成熟(Cella,等1996.JExpMed184:747)。在第三天，補充細胞因子和CD40mAb。為了進一步促進CTL誘導能力，將APC-混合物用0.4ng/mlLPS(DifcoLabs)、500U/mlIFN(BoehringerMa皿heim)和500ng/mlCD40mAb再培養2天。在第8天，對APC-混合物與50pg/ml的肽(每種肽分別地)在室溫、輻射(30Gy)下進行脈沖處理，并進行清洗以除去游離的肽。解凍冷凍保藏的自體的T細胞部分，并使用磁性珠(Dynal)從CD4+T細胞中分離出來。在96孔U型底平板中進行初次誘導。APC以10,000個細胞/孔的濃度與50,000個CD8+T細胞/孔在含有10%的人混合血清(HPS)、5ng/ml的IL-7(PeproTech)和0.1ng/mlIL-12(Sigma)的培養基中進行共培養。在起始誘導CTL的微培養的第7天進行收集，清洗，并以40,000個應答細胞/孔的濃度在96孔的U型底平板中在含有10%HPS、5ng/ml的IL-7和0.1ng/ml的IL-12的培養基中進行再刺激(restimulated)。在弱酸洗脫以從I類MHC分子中除去天然呈遞的肽之后(見MHC結合測定的材料和方法)，通過Schultze等(1997,JClin.Invest100:2757)描述的方法在含有2。/。FCS和3略/ml的卩2-微球蛋白(Sigma)的培養基中在室溫下經過輻射(75Gy)和肽脈沖(50pg/ml)4小時產生的自體激活的B細胞，以10,000個細胞/孔的濃度用作再刺激物APC。除了IL-7被20IU/ml的IL-2(ChironCorp.)替換以外，在第14天和第21天以相同的方式重復進行再刺激。在第29天，通過標準的限制稀釋方法克隆CTL的大批培養物。每7-12天使用含有異源PBMC和B-LCL的供給混合物通過無特異性的刺激在含有10°/。FCS、1.5%白細胞凝集素(Sigma)和240IU/mlIL-2的培養基中維持CTL克隆。為了功能性的分析CTL殺死具有肽的靶細胞或腫瘤靶細胞的能力，使用了標準的鉻釋放測定法。標記s'Cr后(l小時)，將靶細胞(2000個細胞/孔)加入到96孔板中的終體積為100M1的完全培養基中的不同數量的效應細胞中，在37。C培養4小時后，收獲懸浮物。根據以下公式計算三個重復孔的特異性裂解的平均％:(實驗釋放一自發釋放)/(最大釋放一自發釋放)x100%.。CTL的免疫原性和功能性識別腫瘤細胞的分析結果選擇了8個肽用于體外CTL誘導，它們是PRA，，(HLA-A2)、PRA142.151(HLA-A2)、PRA脅309(HLA-A2)、PRA371，(HLA-A2)、PRA425'433(HLA-A2)、PRA190—198(HLA-A3)、PRA13-122(HLA-B7)禾卩PRA258—267(HLA-B8)，當負載于表達在B-LCL靶細胞上的正確的I類HLA分子中時，它們具有誘導大批的CTL培養物的能力，所述CTL培養物高度特異性地識別誘導肽(數據未示出)隨后，通過限制性稀釋法克隆這些CTL大批培養物，并產生CTL克隆。所述CTL克隆能夠有效地識別CTL表位，這些CTL克隆是對抗所述CTL表位而產生，所述CTL表位可以為外源負載的合成肽(圖3A和3B，圖上部)或者為存在于腫瘤細胞上的內源產生的和天然表達的CTL表位(圖3A和3B，圖下部)。因此，HLA-A2呈遞的肽(圖3A)和HLA-A3、HLA-B7和HLA-B8呈遞的肽(圖3B)都是真正的CTL表位。這些數據確認了此8個CTL表位的免疫原性，證明了它們的細胞表面表達，并且顯示了我們關于CTL表位的預測的準確性。這表明所有經鑒定的預測CTL表位(在表4中列出)均可能是腫瘤細胞表達的標靶，適合用于患有PRAME陽性并表達正確的I類HLA分子的癌癥的患者體內誘導CTL應答，。實施例5:CD4+T輔助細胞抗PRAME中結合II類HLA的肽反應性的為了優化疫苗誘導的抗腫瘤CD8+CTL細胞的應答(能夠消滅表達PRAME的腫瘤細胞)的誘導和維持，需要誘導同時發生的CD4+Th細胞的應答(例如，Bourgeois,等，2002.Eur.J.Immunol.32:2199;Kumaraguru,等，2004.J.Immunol.172:3719;Janssen,等，2003.Nature421:852;Hamilton,等,2004.Nat.Immunol.5:873)。這種現象的主要機制是CD4+輔助T細胞群通過CD40-配體和CD40的相互作用在專門的抗體呈遞細胞(主要是樹突狀細胞(DCs))的成熟過程中提供輔助作用(稱為"許可模式")(Schoenberger,等，1998.Nature393:480;Lanzavecchia.1998.Nature393:413)。多方面的證據顯示出，沒有這種CD4+Th應答，不能誘導CD8+應答或僅誘導不理想的CD8+應答，記憶細胞CD8+T細胞應答的維持和恢復是無力的(Belz,等，2002.J.Virol.76:12388)。因此，在能夠誘導CD4+Th細胞的PRAME蛋白中鑒別結合II類HLA的肽是十分重要的。使用兩種不同的篩選測定法來鑒別這些PRAME肽。使用CD4+Th細胞的增殖和由Th細胞產生的IFNY，來評價抗一組51個有重疊的PRAME肽的反應活性，所述PRAME肽具有結合II類HLA分子所需要的長度(22個氨基酸或27個氨基酸的肽)。首先，對預測具有結合這些有重疊的PRAME肽的能力的II類HLA分子進行鑒別。源自PRAME的有重疊的多肽(27個氨基酸或22個氨基酸)的II類HLA結合譜的硅檢測II類HLA與肽的結合沒有I類HLA的結合嚴格。結合在II類HLA分子中的肽至少為13個氨基酸并且可以更長，因為II類HLA分子的結合槽的開放末端允許肽結合于II類分子上并在兩個末端延伸到槽外。因此，結合II類HLA分子的肽的長度要求比結合I類HLA分子的肽的要求更靈活。此外，與此一致的是，結合在II類HLA分子上的肽比結合在I類HLA分子上的肽更雜亂。通常長度為13-25個氨基酸的多肽具有結合多種II類HLA分子的能力。這些可變的肽結合II類HLA分子的特征的優點在于，很少需要實際的實驗結合測定來確認預測的肽結合。為了預測II類HLA的結合，使用了互聯網上免費使用的一種算法。這種算法是"ProPred"(http:〃www.imtech.res.in/raghava/propred/)(見Singh等,2001，Bioinformatics17:1236)。使用這種算法，在51個有重疊的肽中篩選了用于結合不同的II類HLA分子的結合基序的存在，并對結果進行了分析。如表5A所示，用于檢測CD4+T細胞的反應性的所有有重疊的肽都具有預測的對多種II類HLA分子的有效結合能力(所用的終止點(cutoff):對于各個II類等位基因，從全長PRAME中選出5個預測的最優結合的肽)。表5A:51個有重疊的PRAME肽結合II類HLA分子的能力<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>CD4+T細胞增殖測定和CD4+T細胞IFNyELISPOT測定的步驟為了進行004+T細胞增殖測定，將獲得自健康供體或患有PRAME陽性癌癥的患者中的總PBMC(1.5xl05個細胞/孔)接種在U型底的96孔板的8個孔中的RPMI培養基中，該培養基補充有10%的自體血清和10pg/ml的51個有重疊的27個氨基酸或22個氨基酸的PRAME肽。在第6天，加入50^tl的3H-胸腺嘧啶(1mCi/50ml)，在第7天檢測3H-胸腺嘧啶的摻入狀況。為了IFNyELISPOT測定，使用購自MiltenyiBiotec的CD45RO磁性珠從PBMC中分離出CD45RO+細胞。隨后，將CD45RO+(和CD45RO-陰性)細胞與自體受輻射的PBMC以4:l的比例，接種在24孔板(2-3xlOe個細胞/孔)的10個孔的IMDM培養基中，該培養基含有10%的人混合血清并補充有5種不同的肽的10個肽的混合物，所述不同的肽中的每一種均來自于51個有重疊的長度為27個氨基酸或22個氨基酸的PRAME肽的組中。每種肽的肽濃度為5嗎/ml，并在第2天加入IL-2(150IU/ml)。在第10天，對肽刺激的CD45RO培養物進行計數，并與自體輻射的PBMC以1:1的比例，在缺少肽或者存在5pg/ml的單獨的肽(1-51號)的情況下，共同接種于IFNyELISPOT平板，每種情況進行三次重復。CD4+T細胞抗一組51個PRAME肽(27個氨基酸/22個氨基酸)的反應性的結果在8個健康受體和7個PRAME陽性癌癥患者的外周血中，CD4+Th細胞抗51個有重疊的PRAME肽的反應性分析顯示，51個肽中的28個肽通過CD4+Th細胞誘導了IFNy的生成，36個肽誘導了CD4+Th細胞的增殖(表5B)。表5B:結合II類HLA分子的51個有重疊的PRAME肽的反應性肽的編號肽的位置和長度CD4+Th細胞產生的IFNyCD4+Th細胞的增殖健康受體中的記憶細胞部分患者體內的記憶細胞部分健康供體內的天然部分起始終止長度!12727++2153622+++3194527+4315222+<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>47442463224844747327++4946048627+50473499275148350927+實施例6:篩選能夠滿足主要的疫苗要求的疫苗肽包括一種或多種PRAME衍生的肽的最優的和確定的誘導T細胞的組合物能夠誘導抗PRAME陽性腫瘤的免疫應答，且一定能夠誘導I類HLA限制性CD8+CTL應答，并同時誘導II類HLA限制性CD4+T輔助細胞應答。需要Th細胞應答，以增強誘導和維持CTL應答。此外，由于HLA分子的廣泛多態現象，需要設計一種最佳的疫苗以具有較廣的HLA單體型范圍，允許在眾多的潛在患者人群中使用這種疫苗。此外，所述疫苗應該適用于高百分比的患有PRAME陽性癌癥的個體患者。因此，根據本發明的疫苗組合物含有多種PRAMECTL表位，這些表位通過在人群中廣泛存在的不同的I類HLA分子來呈遞。由于在II類HLA分子中的雜亂結合的程度較高，這種要求對于誘導004+T輔助細胞的肽來說并不嚴格。如表4所示的CTL表位以及如上表5A和5B所列的CD4+T輔助細胞表位的鑒定，使能夠將疫苗肽設計為包含在用于PRAME陽性癌癥的確定疫苗中。所述疫苗組合物含有長度為30-35個氨基酸的PRAME衍生的肽，因為這種長度的肽具有多種優點。如上所述，原則上這種肽易于合成。此外，它們具有足夠的長度以容納I類HLA呈遞的CTL表位和II類HLA呈遞的T輔助細胞表位。最后，最重要的是所述表位(CTL表位和T輔助細胞表位)在通過抗原遞呈細胞呈遞之前，這種長度的肽需要被專門的抗原呈遞細胞(特別是樹突狀細胞)加工(Z窗eling，等，2002.J.Immunol.169:350)。結果，不會發生非專門的抗原呈遞細胞的呈遞和通過生物體的系統性擴散，因此，不會發生在以最小量的I類HLA呈遞的CTL表位接種后觀察到的耐受性的誘導(Toes,等，1996.J.Immunol.156:3911;Toes,等，1996.Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A93:7855.)。因此，這種長度的疫苗肽優于短小的I類HLA表位或全長蛋白。使用經鑒別的CD8+CTL表位和CD4+T輔助細胞反應性PRAME衍生的肽的信息，設計了符合以下三個主要規則的20個PRAME疫苗肽l)含有至少一個CTL表位，優選多于一個CTL表位，最優選還含有免疫原性經過CTL誘導確認的CTL表位和更優選可被HLA-A2呈遞的CTL表位；2)含有至少一種CD4+T輔助細胞反應性肽，優選為在患有PRAME陽性的惡性腫瘤的患者體內和健康受體內都具有反應性；3)長度為19-45個氨基酸，優選為30-35個氨基酸。根據本發明設計的PRAME衍生的肽在表6中列出，并且滿足這些要求。與現有技術中描述的PRAME片段和組合物相比，表6中的PRAME衍生的肽在人類患者體內對抗表達PRAME的惡性腫瘤和腫瘤而引發有效的、增強的和延長的在體內的免疫應答的能力更為優異。表6中列出的每一個本發明的肽均被實際地合成并通過如本文上述實施例1中所描述的方法進行了純化。然而，對于最初使用與表6中的肽相同的標準設計的一種肽(SEQIDNO.22:SEQIDNO.21的222-256位氨基酸)，我們發現實際上它不能夠以能夠被接受的純度合成(小于2%的正確序列)。我們還注意到，每一種本發明的肽以0.5-8mg/ml的濃度溶解在生理上可接受的鹽溶液(包括大約35X的DMSO)中。41<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>#4PRAME69-10170-96IFNy/増殖#5PRAME80-11484-110IFNy/增殖4857l_PREIFPPl_F10HLA-B*35011.58+ND5058RELFPPLFM9HLA-B601.48+++5058RELFPPLFM9HLA-B61<1+++5059RELFPPLFMA10HLA-B61<1+++5261LFPPI_FMAAF10HLA-A24<1++ND5361FPPl_FMAAF9HLA-B*3501<1-ND6069AFDGRHSQTL10HLA-A245.5++7180AMVQAWPFTC10HLA-A210.4—_7786PFTCLPLGVL10HLA-A242.1++8088CLPLGVLMK9HLA-A3<1-8594VLMKGQHLHL10HLA-A2415-8997GQHLHLETF9HLA-B622.39+++9199HLHLETFKA9HLA-A2",1-94101LETFKAVL8HLA-B61<1+++8088CLPLGVLMK9HLA-A3<1_8594VLMKGQHLHL10HLA-A2415-一8997GQHLHLETF9HLA-B622.39++9199HLHLETFKA9HLA-A2".1-94101LETFKAVL8HLA-B61<1+++96104TFKAVLDGL9HLA-A248.6-一99108AVLDGLDVLL10HLA-A29.4++99107AVLDGLDVL9HLA-A213.4-100108VLDGLDVLL9HLA-A25.2+++100109VLDGLDVLLA10HLA-A2".9-103112GLDVLLAQEV10HLA-A215.2__<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>PRAME247-279247-273256-277IFNy/增殖IFNy/增殖#13PRAME262-294262-288#14290-316PRAME284-316增殖260267INLRRLLL8HLA-B8<1+n.t248256TLAKFSPYL9HLA-A24.6++n.t251260KFSPYLGQMI10HLA-A242.5--n.t253262SPYLGQ,L10HLA-B*35011.98+n.t254262PYLGQ,L9HLA-A24<1+n.t255264YLGQMINLRR10HLA-A34.5--n.t258267QMINLRRLLL10HLA-A24.0++n.t258267QMINLRRLLL10HLA-B81.67+++259266MINLRRLL8HLA-B8<1++n.t260267INLRRLLL8HLA-B8<1++n.t261269NLRRLLLSH9HLA-A33.5--n.t267275LSHIHASSY9HLA-A11.0--rU267275LSHIHASSY9HLA-A11.0--n.t275284YISPEKEEQY10HLA-A13.0--n.t283292QYIAQFTSQF10HLA-A248.2++n.t284293YIAQFTSQFL10HLA-A210.4+++n.t284293YIAQFTSQFL10HLA-A210.4+++n.t287295QFTSQFLSL9HLA-A241.0++NDn.t292301FLSLQCLQAL10HLA-A22.5-n.t292302FLSLQCLQALY11HLA-A11.0--n,t293302LSLQCLQALY10HUWU2.9--n.t294302SLQCLQALY9HLA-A12.0--n.t294303SLQCLQALYV10HLA-A23.2+-n.t300308ALYVDSLFF9HLA-A22.7++n,t300308ALYVDSLFF9HLA-A38+n.t300308ALYVDSLFF9HL7\-B62<1++n.t300309ALYVDSLFFL10HLA-A21.7++++200880009876.5轉溢齒被42/455t<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>權利要求1、一種長度小于100個氨基酸的肽，該肽包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少19個連續的氨基酸，其中，所述肽包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少一個II類HLA表位和至少一個I類HLA表位。2、根據權利要求l所述的肽，其中，所述至少一個II類HLA表位和至少一個I類HLA表位存在于源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的連續的氨基酸序列中。3、根據權利要求2所述的肽，其中，所述連續的氨基酸序列的長度為30-40個氨基酸，優選30-35個氨基酸，更優選33-35個氨基酸。4、根據前述任意一項權利要求所述的肽，其中，所述II類HLA表位具有激活人類癌癥患者和/或健康對照體內的CD4+Th細胞的能力。5、根據權利要求4所述的肽，其中，所述II類HLA表位具有激活CD45RO陽性CD4+Th細胞的能力。6、根據前述任意一項權利要求所述的肽，其中，所述I類HLA表位通過蛋白酶體切割進行了C-末端加工。7、根據權利要求6所述的肽，其中，所述I類HLA表位具有激活人類癌癥患者禾n/或健康對照體內的CD8+CTL的能力，優選為HLA-A2表位。8、根據前述任意一項權利要求所述的肽，其中，該肽包括源自人PRAME蛋白的連續的氨基酸序列，該連續的氨基酸序列選自由SEQIDNO:6、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16、18、1、2、3、4、13、17、19以及SEQIDNO:20所示的氨基酸序列所組成的組中，優選選自由SEQIDNO:6、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16和18所示的氨基酸序列所組成的組中，更優選選自由SEQIDNO:6、5、8、14、15、16和18所示的氨基酸序列所組成的組中。9、一種接種組合物，該組合物含有至少一種如權利要求1-8中的任意一項所述的肽，并選擇性地含有至少一種佐劑。10、根據權利要求9所述的組合物，其中，該組合物含有選自由如權利要求8中所定義的氨基酸序列組成的組中的至少3種肽。11、根據權利要求9或IO所述的組合物，其中，所述佐劑通過Toll樣受體起作用。12、根據權利要求1-8中的任意一項所述的肽或根據權利要求9-11中的任意一項所述的組合物，所述肽或組合物用作藥物，優選用作疫苗。13、根據權利要求12所述的肽或組合物，所述肽或組合物用于治療或預防癌癥。14、權利要求1-8中的任意一項所述的肽或權利要求9-11中的任意一項所述的組合物在制藥中的應用，優選在制備用于治療或預防癌癥的疫苗中的應用。15、根據權利要求14所述的應用，其中，所述癌癥選自由以下癌癥所組成的組中黑素瘤、淋巴瘤、乳頭狀瘤、乳腺癌或宮頸癌、急性和慢性白血病、成神經管細胞瘤、非小細胞肺癌、頭頸癌、腎癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、多發性骨髓瘤、肉瘤、以及包括慢性髓細胞性白血病和急性髓細胞性白血病在內的血液惡性腫瘤。全文摘要本發明涉及一種長度小于100個氨基酸的肽，該肽包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少19個連續的氨基酸，其中，所述肽包括源自人PRAME蛋白的氨基酸序列的至少一個II類HLA表位和至少一個I類HLA表位；還涉及所述肽本身以及以組合物的形式用作治療和/或預防癌癥的藥物的應用。文檔編號C07K14/435GK101687022SQ200880009876公開日2010年3月31日申請日期2008年3月26日優先權日2007年3月26日發明者C·J·M·梅里茨,J·W·德里夫霍特,J·凱斯勒,M·格里菲恩申請人:萊頓大學醫學中心附屬萊頓教學醫院