專利名稱：單鏈抗體的基于序列的工程改造和最優化的制作方法
單鏈抗體的基于序列的工程改造和最優化
相關申請
本申請要求2007年3月12日提交的標題為"Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies" 的 美國臨時申請系列號60/906， 365的優先權。
本申請還涉及2008年3月12日提交的標題為"Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies" 的 美國臨時申請系列號XX/XXX，XXX，和2008年3月12日提交的標題為 "Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties " 的美國臨時申請系歹寸號 XX/XXX， XXX。
上述申請的全部內容通過引用合并入本文。
背景技術：
已證明抗體在癌癥、自身免疫性疾病和其他病癥的治療中是非常 有效的和成功的治療劑。雖然臨床上一般使用全長抗體，但抗體片段 的使用可提供許多有利方面，例如增加的組織滲透、與增加其他效應 子功能的能力組合的Fc-效應子功能的不存在和由更短的全身性體內 半衰期引起的更小的全身性副作用的可能性。抗體片段的藥物代謝動 力學特性表明它們可以特別適合局部治療途徑。此外，抗體片段在某 些表達系統中可以比全長抗體更容易產生。
抗體片段的 一種類型是單鏈抗體(scFv)，其由通過連接體序列綴 合至輕鏈可變結構域(VL)的重鏈可變結構域(VH)組成。因此，scFv
缺少所有抗體恒定區結構域，并且前者的可變結構域/恒定結構域界面 的氨基酸殘基(界面殘基(interfacial residue))變為暴露于溶劑。 可通過已建立的重組工程改造技術從全長抗體(例如，IgG分子)制備
8scFv。然而，全長抗體至scFv的轉化通常導致蛋白質的較差的穩定性 和溶解性、低產量和高度的聚集傾向，這產生了免疫原性的危險。
因此，已進行努力以提高scFv的性質例如溶解性和穩定性。例如， Nieba, L.等人(Prot. Eng. (1997) 10: 435-444)選擇已知為界面殘基 的3個氨基酸殘基并且突變它們。他們在細菌中觀察到突變的scFv的 增加的周質表達，以及減少的熱誘導的聚集比率，雖然熱力學穩定性 和溶解性沒有顯著改變。也已報告了其中對scFv內的特定氨基酸殘基 進行定點誘變的其他研究(參見例如，Tan， P. H.等人(1988) Biophys. J. 11:1473-1482; Worn, A.和Pluckthun， A. (1998) Biochem. 1Z: 13120-13127; Worn, A.和Pluckthun, A.(1999) Biochem.
8739-8750)。在這些不同的研究中，基于它們在scFv結構中的已 知位置(例如，根據分子建模的研究)選擇用于誘變的氨基酸殘基。
在另一個方法中，將來自表達極弱的scFv的互補決定區(CDR) 嫁接入已證明具有有利的特性的scFv的框架區(Jung, S.和 Pluckthun， A. (1997) Prot. Eng. 1^:959-966)。所得的scFv顯示
提高的可溶性表達和熱力學穩定性。
在例如Worn, A.和Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol.
305: 989-1010中綜述了對scFv進行工程改造以提高功能特性的進展。
然而，仍然需要允許進行具有優良的功能特性的scFv的合理設計的新
方法，特別地幫助本領域技術人員選擇用于工程改造的潛在的有問題
的氨基酸殘基的方法。
發明概述
本發明提供了允許使用基于序列的分析鑒定scFv序列中的潛在 有問題的氨基酸殘基的方法。此外，可選擇按照本發明的方法鑒定的 氨基酸殘基進行突變，可制備已進行突變的經工程改造的scFv并且就 提高的功能特性對其進行篩選。在特別優選的實施方案中，本發明提 供了其中將功能性選擇的(functionally-selected) scFv的數據庫
用于鑒定氨基酸殘基位點的方法，所述氨基酸殘基位點比種系和/或成熟抗體免疫球蛋白序列中相應的位點更加耐受或更不耐受變異性，從
而表明此類鑒定的殘基位點可適合用于工程改造以提高scFv功能性 例如穩定性和/或溶解性。因此，本發明提供和證明了基于功能性選擇 的scFv序列的數據庫的使用的"功能共有序列(functional consensus )，，方法的益處。
在其他優選實施方案中，本發明提供了用于鑒定免疫結合劑 (immunobinder )中目的氨基酸位點(例如，通過將具有至少一個期望 的特性的scFv序列(如使用QC測定法選擇的)的數據庫與成熟抗體 序列的數據庫例如Kabat數據庫比較而鑒定的氨基酸位點)上要置換 的優選氨基酸殘基(或備選地，要排除的氨基酸殘基)的方法。因此 本發明還提供了用于選擇特定氨基酸殘基的"富集/排除，，法。此夕卜， 本發明提供了通過突變使用本文中描述的"功能共有序列"方法鑒定 的特定框架氨基酸位點來對免疫結合劑(例如，scFv)進行工程改造的 方法。在優選實施方案中，通過用使用本文中描述的"富集/排除"分 析法發現為"富集的"殘基的殘基置換現存的氨基酸殘基來突變框架 氨基酸位點。
在一個方面，本發明提供了鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變的氨 基酸位點的方法，所述scFv具有Vh和VL氨基酸序列，該方法包括
a) 將scFv VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列輸入數據庫(所述數據庫 包含大量抗體VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列)以使scFv VH、 ^或Vh和 Vt氨基酸序列與數據庫的抗體VH、、或V^和^氨基酸序列進行比對；
b) 將scFv 、或l氨基酸序列中的氨基酸位點與數據庫的抗體VH 或V!^氨基酸序列中相應的位點相比較；
c) 確定scFv Vh或VL氨基酸序列中的氨基酸位點是否被在數據庫 的抗體Vb或VL氨基酸序列中相應位點上保守的氨基酸殘基占據；和
d) 當氨基酸位點被在數據庫的抗體L或^氨基酸序列中的相應 位點上不保守的氨基酸殘基占據時，將scFv Vh或、氨基酸序列中的
該氨基酸位點鑒定為用于突變的氨基酸位點。
該方法還可包括突變scFv Vh或VL氨基酸序列中經鑒定用于突變的氨基酸位點。例如，可用在數據庫的抗體vh或vl氨基酸序列中的相 應位點上保守的氨基酸殘基置換經鑒定用于突變的氨基酸位點。另外
或備選地，可通過隨機誘變或通過偏好性誘變(biased mutagenesis ) 突變經鑒定用于突變的氨基酸位點以產生突變的scFv的文庫，然后篩 選突變的scFv的文庫，選擇具有至少一個提高的功能特性的scFv(例 如，通過4吏用酵母質量控制系統(Quality Contro卜system) (QC-系統)篩選文庫)。
各種類型的數據庫可用于本發明的方法。例如，在一個實施方案中， 數據庫的抗體VH、、或Vh和VL氨基酸序列是種系抗體VH、 Vl或Vh和Vl 氨基酸序列。在另一個實施方案中，數據庫的抗體vh、 W或vh和vl氨基 酸序列是重排的親和力成熟的抗體VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列。在另一 個特別優選的實施方案中，數據庠的抗體Vh、 Vl或Vh和Vl氛基酸序列是 因具有至少一個期望的功能特性(例如scFv的穩定性或scFv的溶解性) 而被選擇的scFv抗體Vh、 Vl或Vh和W氨基酸序列。在另一個實施方案 中，多于一個數據庫可用于比較目的。例如，在特別優選的實施方案中， 使用因具有至少一個期望的功能特性而被選擇的scFv的數據庫以及一 個或多個種系數據庫或重排的親和力成熟的抗體數據庫，其中將來自 scFv數據庫的序列比較結果與來自其他數據庫的結果相比較。
本發明的方法可用于分析例如scFv的Vh區、scFv的Vl區或雨者。 因此，在一個實施方案中，將scFv vh氨基酸序列輸入數據庫并且使 之與數據庫的抗體Va氨基酸序列比對。在另一個實施方案中，將scFv 叭氨基酸序列輸入數據庫并且與數據庫的抗體V^氨基酸序列比對。在 另一個實施方案中，將scFv Vh和、氨基酸序列輸入數據庫并且與數 據庫的抗體VB和Vl氨基酸序列比對。
雖然本發明的方法可用于分析目的scFv內的單個目的氨基酸位 點，但更優選該方法用于分析沿著scFv序列的多個氨基酸位點。因此， 在優選實施方案中，在該方法的步驟b)中，將scFv Vh或1氨基酸序列 中的多個氨基酸位點與數據庫的抗體Vh或VL氨基酸序列中的相應位點 相比較。例如，在優選實施方案中，將scFv VH、 1或^和1氨基*列中的各框架位點(framework position)與數據庫的抗體VH、 VL或 VH和VL氨基酸序列中的各相應框架位點相比較。另外地或備選地，可分 析scFv的一個或多個CDR中的一個或多個位點。在另一個實施方案中， 將scFv VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列中的各氨基酸位點與數據庫的抗體 VH、 Vl或Vh和、氨基酸序列中的各相應的氨基酸位點相比較。
在數據庫的序列之間"保守"的氨基酸位點可被一種或多種特定 類型的氨基酸殘基占據。例如，在一個實施方案中，"保守的"位點 被在該位點以極高頻率出現的一個特定氨基酸殘基占據。即，在該方 法的步驟c)中，在數據庫的抗體Vh或l氨基酸序列中的相應位點上保 守的氨基酸殘基是在數據庫的抗體Vh或叭氨基酸序列中的該位點上出 現頻率最高的氨基酸殘基。在該情況下，為了產生經工程改造的scFv， 經鑒定用于突變的氨基酸位點可用在數據庫的抗體VH或VL氨基酸序列 中的相應位點上出現頻率最高的氨基酸殘基進行置換。
在另一個實施方案中，在數據庫的序列之間"保守的"氨基酸位 點可被例如(i)疏水氨基酸殘基，(ii)親水氨基酸殘基，(iii)能夠 形成氫鍵的氨基酸殘基或(iv)具有形成P折疊傾向的氨基酸殘基占 據。即，在該方法的步驟c)中，數據庠的抗體Vh或^氨基酸序列中的 相應位點對于(i)疏水氨基酸殘基，(ii)親水氨基酸殘基，(iii)能 夠形成氫鍵的氨基酸殘基或(iv)具有形成P折疊傾向的氨基酸殘基是 保守的。
因此，為了產生經工程改造的scFv，當數據庫的抗體Vh或Vt氨 基酸序列中的相應位點對于疏水氨基酸殘基是保守的時候，scFv中經 鑒定用于突變的氨基酸位點可用在數據庫的抗體VB或Vl氨基酸序列中 的相應位點上出現頻率最高的疏水氨基酸殘基進行置換。此外或備選 地，scFv中經鑒定用于突變的氨基酸位點可用因在scFv中的該位點 上為最適合的而被選擇的疏水氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究， 最可能保持scFv的結構和功能的疏水殘基)置換。此外或備選地，scFv 中經鑒定用于突變的氨基酸位點可通過定點誘變用一組疏水氨基酸殘 基進行置換，從而產生經工程改造的scFv的文庫，并且最優選的置換
12可通過就期望的功能特性篩選文庫來選擇(例如，在酵母QC-系統中)。 此外，為了產生經工程改造的scFv，當數據庫的抗體VH或、氨 基酸序列中的相應位點對于親水氨基酸殘基是保守的時候，scFv中經 鑒定用于突變的氨基酸位點可用在數據庫的抗體Vh或1氨基酸序列中 的相應位點上出現頻率最高的親水氨基酸殘基進行置換。另外或備選 地，scFv中經鑒定用于突變的氨基酸位點可用因在scFv中的該位點 上是最合適的而被選擇的親水氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究， 最可能保持scFv的結構和功能的親水殘基)置換。另外或備選地，scFv 中經鑒定用于突變的氨基酸位點可通過定點誘變用一組親水氨基酸殘 基來置換，從而產生經工程改造的scFv文庫，并且最優選的置換可通 過就期望的功能特性篩選文庫來選擇(例如，在酵母QC-系統中)。
此外，為產生經工程改造的scFv,當數據庫的抗體Vb或Vt氨基 酸序列中的相應位點對于能夠形成氫鍵的氨基酸殘基是保守的時候， scFv中經鑒定用于突變的氨基酸位點可用在數據庫的抗體Vh或^氨基 酸序列中的相應位點上出現頻率最高的能夠形成氫鍵的氨基酸殘基進 行置換。另外或備選地，scFv中經鑒定用于突變的氨基酸位點可用因 在scFv中的該位點上是最合適的而被選擇的能夠形成氫鍵的氨基酸 殘基(例如，基于分子建模研究，最可能保持scFv的結構和功能的殘 基)置換。另外或備選地，scFv中經鑒定用于突變的氨基酸位點可通 過定點誘變用一組能夠形成氫鍵的氨基酸殘基進行置換，從而產生經 工程改造的scFv的文庫，并且最優選的置換可通過就期望的功能特性 篩選文庫來選擇(例如，在酵母QC-系統中)。
此外，為產生經工程改造的scFv，當數據庫的抗體Vh或、氨基 酸序列中的相應位點對于具有形成P折疊的傾向的氨基酸殘基是保守 的時候，scFv中的經鑒定用于突變的氨基酸位點可用在數據庫的抗體 Vh或Vt氨基酸序列中的相應位點上出現頻率最高的具有形成P折疊的 傾向的氨基酸殘基進行置換。另外或備選地，scFv中經鑒定用于突變 的氨基酸位點可用因在scFv中的該位點上是最合適的而被選擇的具 有形成P折疊的傾向的氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究，最可能
13保持scFv的結構和功能的殘基)置換。另外或備選地，scFv中經鑒定 用于突變的氨基酸位點可通過定點誘變用 一組具有形成P折疊的傾向 的氨基酸殘基進行置換，從而產生經工程改造的scFv的文庫，并且最 優選的置換可通過就期望的功能特性篩選文庫來選擇(例如，在酵母 QC-系統中)。
在另一個實施方案中，可使用數據庫進行用于鑒定scFv中用于 突變的氨基酸位點的本發明的方法，所述數據庫是其中只有與scFv 抗體Vh、 Vl或VH和W氨基酸序列具有高度相似性的抗體VH、 Vl或Vh和
Vl氨基酸序列包括在該數據庫中的受限制的數據庫。
在優選實施方案中，為了定量分析的氨基酸位點(即，數據庫的 抗體VH或、氨基酸序列中的"相應位點")的保守性，使用辛普森指 數(Simpson's Index)給氨基酸位點的保守程度賦值。
本發明的方法還可用于檢查scFv序列中的成對的氨基酸位點， 以鑒定彼此共變的氨基酸位點，這樣此類共變對位點的一個或兩個位 點可被鑒定用于突變。因此，在另一個實施方案中，本發明提供了方 法，其包括
a) 對數據庫的抗體VH或Vl氨基酸序列進行協方差分析 (covariance analysis)以鑒定氨基酸位點的共變對；
b) 將氨基酸位點的共變對與scFv Vh或VL氨基酸序列中的相應位 點相比較；
c) 確定scFv Vh或VL氨基酸序列中的相應位點是否被在數據庫的 抗體VH或l氨基酸序列中的氨基酸位點的共變對上保守的氨基酸殘基 占據；和
d) 當scFv中的相應位點中的一個或兩個位點-f皮在數據庫的抗體 Vh或VL氨基酸序列中的氨基酸位點的共變對上不保守的氨基酸殘基占 據時，將scFv Vh或VL氨基酸序列中的相應位點中的一個或兩個位點 鑒定為用于突變的氨基酸位點。
該協方差分析還可與單獨的氨基酸位點的分析組合，這樣具有步 驟a) - d)的上述方法可進一步包括步驟e) 對數據庫的抗體Vh或l氨基酸序列進行協方差分析以鑒定氨基酸位點的共變對；
f) 將氨基酸位點的共變對與scFv Vh或、氨基酸序列中的相應位點相比較；
g) 確定scFv Vh或VL氨基酸序列中的相應位點是否被在數據庫的抗體VH或VL氨基酸序列中的氨基酸位點的共變對上保守的氨基酸殘基占據；和
h) 當scFv中的相應位點中的一個或兩個位點被在數據庫的抗體VH或Vl氨基酸序列中的氨基酸位點的共變對上不保守的氨基酸殘基占據時，將scFv Vh或、氨基酸序列中的相應位點中的一個或兩個位點鑒定為用于突變的氨基酸位點。
可將協方差分析法用于單個共變對或，備選地，可在數據庫的抗體VH或l氨基酸序列中鑒定多個氨基酸位點共變對并且將其與scFv VH或VL氨基酸序列中的相應位點相比較。
該方法還可包括突變scFv中的相應位點中的一個或兩個位點，所述位點被在數據庫的抗體Vh或Vl氛基酸序列中的氨基酸位點的共變對上不保守的氨基酸殘基占據。例如，在一個實施方案中，scFv中的相應位點中的一個位點(所述位點被在氨基酸位點的共變對上不保守的氨基酸殘基占據)用在共變對氨基酸位點上出現頻率最高的氨基酸殘基進行置換。在另一個實施方案中，scFv中的兩個相應位點(所述位點都被在氨基酸位點的共變對上不保守的氨基酸殘基占據)用在共變對氨基酸位點上出現頻率最高的氨基酸殘基進行置換。
可將用于鑒定scFv序列中用于突變的氨基酸位點的本發明的基于序列的方法與允許進行scFv的結構分析的其他方法組合。例如，在一個實施方案中，可將基于序列的方法與分子建模法組合來進一步分析scFv的結構。因此，在一個實施方案中，具有步驟a) -d)的上述方法還可包括例如步驟
e) 將scFv VH、 l或VH和W氨基酸序列經歷分子建模；和
f) 在scFv VH、 l或Vh和l氨基酸序列中鑒定至少一個 于突變的另外的氨基酸位點。
該方法還可包括突變scFv VH、 Vl或Vh和W氨基酸序列中的該至少一個通過分子建模鑒定用于突變的另外的氨基酸位點。
在另一個方面，本發明涉及按照本發明的方法制備的scFv組合物，其中在鑒定用于突變的一個或多個氨基酸位點上進行了一個或多個突變。還提供了藥物制劑，該制劑通常包含scFv組合物和藥學上可接受的載體。
在另 一個方面，本發明提供了在單鏈抗體(scFv)中鑒定一個或多個用于突變的框架氨基酸位點的方法，所述scFv具有Vh和1氨基酸序列，該方法包括
a) 提供Vh、 W或vh和W氨基酸序列的第一數據庫；
b) 提供因具有至少一個期望的功能特性而被選擇的scFv抗體VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列的第二數據庫；
c) 確定第一數據庫的各框架位點和第二數據庫的各框架位點上的氨基酸變異性(variability);
d) 鑒定在其上氨基酸變異性的程度在第一數據庫和第二數據庫之間不同的一個或多個框架位點，從而鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變的一個或多個框架氨基酸位點。
優選，各框架位點上的氨基酸變異性通過使用辛普森指數給保守程度賦值來測定。在一個實施方案中，基于與第一數據庫相比在第二數據庫中具有更低的辛普森指數(SI)值的一個或多個框架氨基酸位點
鑒定用于突變的一個或多個框架氨基酸位點。在另一個實施方案中，基于與第一數據庫(例如，種系數據庫)相比在第二數據庫中具有更
高的辛普森指數(SI)值的一個或多個框架氨基酸位點鑒定用于突變的一個或多個框架氨基酸位點。在一個優選實施方案中，第二數據庫(例如，QC數據庫)的氨基酸位點具有比第一數據庫(例如，Kabat數據庫)中的相應的氨基酸位點的SI值低至少0. 01，和更優選低0. 05(例如，0.06、 0.07、 0.08、 0. 09或0. l)的SI值。在更優選實施方案中，第二數據庫的氨基酸位點具有比第一數據庫中的相應的氨基酸位點的
16SI值低至少0. l(例如，低O. 1、 0.15、 0.2、 0.25、 0.3、 0.35、 0.4、0. 45或0. 5)的SI值。
在另一個方面，本發明提供了鑒定用于免疫結合劑中的置換的優選氨基酸殘基的方法，該方法包括
a) 提供已分類的Vh或Vt氨基酸序列(例如按照Kabat家族亞型
分類的種系和/或成熟抗體序列)的第一數據庫；
b) 提供因具有至少一個期望的功能特性而被選擇(例如，根據QC測定)的已分類的scFv抗體Vh或VL氨基酸序列的第二數據庫；
c) 測定第一數據庫的框架位點和第二數據庫的相應框架位點上
的氨基酸殘基的氨基酸頻率；
d) 當相對于第一數據庫，氨基酸殘基以更高的頻率在第二數據庫中發生(即，富集的殘基)時，將該氨基酸殘基鑒定為用于免疫結合劑的相應氨基酸位點上的置換的優選氨基酸殘基。
在某些實施方案中，如果第一和第二數據庫之間的氨基酸殘基的相對頻率的比率(在本文中，"富集因子(enrichment factor)")為至少l(例如，1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10)，那么鑒定了步驟(d)中的氨基酸殘基。在優選實施方案中，富集因子大于大約1.0 (例如l. 0、 1.1、 1.2、 1.3、 1.4或1.5)。在另一個優選實施方案中，富集因子為大約4. 0至大約6. O(例如，4. 0、 4. 1、 4. 2、 4. 3、 4. 4、 4. 5、4.6、 4.7、 4.8、 4.9、 5.0、 5.1、 5.2、 5,3、 5.4、 5.5、 5.6、 5.7、5.8、 5. 9或6.0)。在另一個實施方案中，富集因子為大約6. 0至大約8. O(例如，6.0、 6.1、 6.2、 6.3、 6.4、 6.5、 6.6、 6.7、 6.8、 6.9、7.0、 7.1、 7.3、 7.4、 7.5、 7.6、 7.7、 7.8、 7. 9或8. 0)。
在另一個方面，本發明提供了鑒定待從免疫結合劑排除的氨基酸殘基的方法，該方法包括
a) 提供已分類的Vh或l氨基酸序列(例如按照Kabat家族亞型分類的種系和/或成熟抗體序列)的第一數據庫；
b) 提供因具有至少一個期望的功能特性而被選擇(例如，根據QC測定)的已分類的scFv抗體Vh或VL氨基酸序列的第二數據庫；
17C)測定第一數據庫的框架位點和第二數據庫的相應框架位點上
的氨基酸殘基的氨基酸頻率；
d)當相對于第一數據庫，氨基酸殘基以更低的頻率在第二數據庫中發生時，將該氨基酸殘基鑒定為用于免疫結合劑的相應氨基酸位點上的置換的不利氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基的類型是不利氨基酸殘基(即，被排除的殘基)。在某些優選實施方案中，如果富集因子(EF)小于l，則鑒定了不利的氨基酸殘基。
在某些實施方案中，第一數據庫包含種系VH、 Vl或VH和^氨基酸序列。在其他實施方案中，第一數據庫由種系Vn、 Vl或Vh和Vl氛基酸
序列組成。在另一個實施方案中，第一數據庫包含成熟VH、 Vl或L和Vl氛基酸序列。在另一個實施方案中，第一數據庫由成熟VH、 W或VH和、氨基酸序列組成。在示例性實施方案中，成熟Vh、 Vl或Vh和Vl氨基酸序列來自Kabat數據庫(KDB)。
在某些實施方案中，第二數據庫包含根據QC測定選擇的scFv抗體Vh、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列。在另一個實施方案中，第二數據庫由根據QC測定選擇的scFv抗體VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列組成。
在一個實施方案中，期望的功能特性是提高的穩定性。在另一個實施方案中，期望的功能特性是提高的溶解性。在另一個實施方案中，期望的功能特性是非聚集性(non-aggregation)。在另一個實施方案中，期望的功能特性是表達(例如，在原核細胞中)的提高。在某些實施方案中，期望的功能特性不是抗原結合親和力的提高。
在另一個方面，本發明提供了工程改造免疫結合劑的方法，該方法包括
a) 選擇免疫結合劑中用于突變的一個或多個氨基酸位點；和
b) 突變一個或多個被選擇用于突變的氨基酸位點，其中一個或多個被選擇用于突變的氨基酸位點選自
(i) 使用AHo編號的VH3的氨基酸位點1、6、7、89和103(使用Kabat編號的氨基酸位點1、 6、 7、 78和89);
(ii) 使用AHo編號的VHla的氨基酸位點1、 6、 12、 13、14、 19、 21、 90、 92、 95和98 (使用Kabat編號的氨基酸位點1 、 6、
11、 12、 13、 18、 20、 79、 81、 82b和84 );
(iii) 使用AHo編號的VHlb的氨基酸位點1、 10、 12、 13、14、 20、 21、 45、 47、 50、 55、 77、 78、 82、 86、 87和107(使用Kabat編號的氨基酸位點1、 9、 11、 12、 13、 19、 20、 38、 40、 43、 48、 66、67、 71、 75、 76和93);
(iv) 使用AHo編號的Vk 1的氨基酸位點1、 3、 4、 24、 47、50、 57、 91和103 (使用Kabat編號的氨基酸位點1、 3、 4、 24、 39、42、 49、 73和85);
(v) 使用AHo編號的Vk 3的氨基酸位點2、 3、 10、 12、 18、20、 56、 74、 94、 101和103(-使用Kabat編號的氨基酸位點2、 3、 10、
12、 18、 20、 48、 58、 76、 83和85);和
(vi) 使用AHo編號的V入l的氨基酸位點1、 2、 4、 7、 11、14、 46、 53、 82、 92和103(使用Kabat編號的氨基酸位點1、 2、 4、7、 11、 14、 38、 45、 66、 74和85)。
在某些優選實施方案中，將一個或多個被選擇用于突變的氨基酸位點突變成在因具有至少一個期望的功能特性而被選擇(例如，在酵母QC-系統中)的抗體序列中的相應氨基酸位點上發現的氨基酸殘基。在另 一個實施方案中，將被選擇用于突變的一個或多個氨基酸位點突變成按照本發明的富集/排除分析法鑒定的氨基酸殘基(例如，"富集的氨基酸殘基")。
優選，免疫結合劑是scFv，但其他免疫結合劑例如全長免疫球蛋白和其他抗體片段(例如，Fab或Dab)也可按照該方法進行工程改造。
結合劑和藥學上可接受的栽體的組合物。 '
附圖概述
圖1是概述按照本發明的方法進行的scFv的一般基于序列的分析的流程圖。圖2是用于scFv的基于序列的分析的示例性多步驟方法的流程圖。 圖3是用于在酵母中選擇穩定和可溶的scFv的示例性質量控制 (QC)系統的示意圖。通過該系統，可因誘導型報告基因構建體的存 在而選擇能夠在還原性環境中表達穩定和可溶的scFv的宿主細胞，所 述報告基因構建體的表達依賴于穩定和可溶的scFv-AD-Gal llp融合 蛋白的存在。融合蛋白與Ga14 (l-100)的相互作用形成了激活選擇標 記的表達的功能轉錄因子(參見圖3A)。不穩定的和/或不溶性的scFv 不能夠形成功能轉錄因子和誘導選擇標記的表達，從而被排除在選擇 之外(圖3B)。
圖4是另一個示例性質量控制(QC)系統的示意圖。選擇可溶性scFv 的總體概念與圖3中描述的相同，然而在該形式中，將scFv直接融合至 包含激活結構域(AD)和DNA結合結構域(DBD)的功能轉錄周子。圖4A描 述了示例性可溶的和穩定的scFv，當融合至功能轉錄因子時，其能夠觸 發選擇標記的轉錄。相反，圖4B描述了其中不穩定的scFv阻礙待激活 的選擇標記的轉錄(甚至當其融合至轉錄因子時亦如此)的情景。
圖5是在體細胞突變前天然種系序列中的特定框架(FW)殘基(圖 5A)上和在體細胞突變后于QC系統中選擇的成熟抗體序列中的相應的 FW殘基(圖5B)上變異性的分析的示意圖。可將不同的變異性值賦予種 系和QC序列中的各自FW位點(例如，高度可變的框架殘基 ("hvFR"))(即，分別地"G"和"Q"值)。如果對于特定的位點G>Q， 則在該位點存在有限數目的適當的穩定的FW殘基。如果對于特定位點 G<Q，則這可表示殘基已被天然選擇用于最佳的溶解性和穩定性。
圖6描述了在25至95'C的溫度范圍內進行熱誘導的脅迫后對于 ESBA105變體觀察到的變性特征。具有至種系共有序列殘基 (consensus residues )的回復突變(V3Q、 R47K或V103T)的ESBA-105 變體用虛線標示。包含通過本發明的方法鑒定的優選置換的變體 (QC11.2、 QC15. 2和QC23. 2)用實線標示。
圖7描述了一組包含共有序列回復突變(S-2、 D-2、 D-3)、至丙 氨酸(D-1)或QC殘基(QC7. 1、 QC11.2、 QC15.2、 QC23. 2)的回復突變的ESBA 105變體的熱穩定性的比較。在圖7A中提供了在選擇的框架 位點上的框架殘基的同一性。與親本ESBA 105抗體不同的殘基以粗斜 體標示。以Kabat編號提供氨基酸位點。在圖7B中提供了各變體的熱 穩定性(以任意解折疊單位(arbitrary unfolding unit)表示)。
圖8描述了在25至95'C的溫度范圍內進行熱誘導的脅迫后對于 ESBA212變體觀察到的變性特征。具有至種系共有序列殘基的回復突 變(V3Q或R47K)的ESBA-212變體用虛線標示。親本ESBA212分子用實 線標示。
發明詳述
本發明涉及用于免疫結合劑特性，特別地scFv特性(包括但不 限于穩定性、溶解性和親和力)的基于序列的工程改造和最優化的方 法。更具體地，本發明公開了使用抗體序列分析鑒定scFv中待突變的 氨基酸位點來最優化scFv抗體，從而提高scFv的一個或多個物理特 性的方法。本發明還涉及按照本發明的方法產生的經工程改造的免疫 結合劑例:^ scFv。
本發明至少部分基于抗體序列的多個數據庫中的各重鏈和輕鏈 框架位點上的氨基酸頻率的分析。特別地，已將種系和/或成熟抗體數 據庫的頻率分析與因具有期望的功能特性而被選擇的scFv序列的數 據庫的頻率分析相比較。通過給各框架位點的變異性程度賦值(例如， 通過使用辛普森指數)和通過比較不同類型的抗體序列數據庫中的各 框架位點上的變異性程度，現已可能鑒定對于scFv的功能特性(例如， 穩定性、溶解性)是重要的框架位點。這現允許對框架氨基酸位點定 義"功能共有序列"，其中已鑒定了比種系和/或成熟抗體免疫球蛋白 序列中的相應位點更耐受變異性或更不耐受變異性的框架位點。因此， 本發明提供和證明了基于功能性選擇的scFv序列的數據庫的使用的 "功能共有序列"方法的益處。此外，本發明提供了通過突變使用本 文中描述的"功能共有序列"方法鑒定的特定框架氨基酸位點來對免 疫結合劑(例如，scFv)進行工程改造的方法。
21首先定義某些術語，這樣可使本發明更容易被理解。隨非另外指 出，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域內的技 術人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料 相似或等同的方法和材料可用于本發明的實踐或試驗中，但下面描述 了適當的方法和材料。本文中提及的所有公開物、專利申請、專利和 其他參考資料以它們的全文通過引用合并入本文。在矛盾的情況下， 以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實施例只是舉例 說明性的而非限定性的。
本文中使用的術語"抗體"是免疫球蛋白的同義詞。根據本發明 的抗體可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少
一個可變結構域，例如單個可變結構域Fv (Skerra A.和Pluckthun， A. (1988) Science證1038-41) 、 scFv (Bird, R. E.等人(1988) Science 242: 423-26; Huston, J. S.等人(1988) Pro" Natl. Acad. Sci. USA ^1:5879-83)、 Fab、 (Fab') 2或本領域技術人員熟知的其他片段。
本文中使用的術語"抗體框架(antibody framework)"是指可 變結構域VL或Vh的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環的支架 (Kabat， E. A.等人，(1991) Sequences of proteins of immunological interest.證Publication 91-3242)。
本文中使用的"抗體CDR"是指抗體的互補決定區，其如Kabat E. A. 等人，(1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publ icat ion 91-3242)定義的由抗原結合環組成。抗體Fv片段的 兩個可變結構域中的每一個包含例如3個CDR。
術語"單鏈抗體"或"scFv"意指包含通過連接體連接的抗體重 鏈可變區(VH)和抗體輕鏈可變區(VJ的分子。此類scFv分子可具 有一般結構冊2-Vl-連接體-Vh-C00H或NH2-Vh-連接體-Vl-C00H。
如本文中所使用的，"同一性"是指兩個多肽、分子之間或兩個 核酸之間匹配的序列。當兩個進行比較的序列中的位點都被相同的堿 基或氨基酸單體亞單元占據(例如，如果兩個DNA分子的每一個中的位 點都被腺噤呤占據，或兩個多肽的每一個中的位點都被賴氨酸占據)
22時，各個分子在該位點上是同一的。兩個序列之間的"百分數同一性" 是由這兩個序列共有的匹配位點數目除以進行比較的位點數目再乘以
IOO的函數。例如，如果兩個序列的10個位點中有6個匹配，那么這 兩個序列具有60%的同一性。例如，DM序列CTGACT和CAGGTT共有 50%的同一性(總共6個位點中有3個位點匹配)。通常，在將兩個序列 比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如， 通過計算機程序例如Align程序(DNAstar， Inc.)方便地進行的 Needleman等人(1970) J. Mol. Biol. H: 443-453的方法來提供。 "相似的"序列是當比對時共有相同和相似氨基酸殘基的序列， 其中相似的殘基是進行比對的參照序列中的相應氨基酸殘基的保守置 換。在這點上，參照序列中的殘基的"保守置換"是用在物理或功能 上與相應的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性 質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。因此，"經 保守置換修飾的"序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個 或多個保守置換的序列。兩個序列之間的"百分數相似性"是包含由 兩個序列共有的匹配殘基或保守置換的位點數目除以進行比較的位點 數目再乘以100的函數。例如，如果兩個序列的10個位點中有6個匹 配以及10個位點中有2個包含保守置換，那么這兩個序列具有80%的 正相似性。
本文中使用的"氨基酸共有序列"是指可使用至少兩個，優選更 多的進行比對的氨基酸序列的矩陣產生的氨基酸序列(允許在比對中 出現缺口 )，其使得可能確定各位點上出現頻率最高的氨基酸殘基。 共有序列是包含在各位點上出現頻率最高的氨基酸的序列。如果兩個 或更多個氨基酸等同地出現在單個位點上，那么共有序列包括兩個或 所有此類氨基酸。
可在不同水平上分析蛋白質的氨基酸序列。例如，可在單個殘基 水平、多個殘基水平、具有缺口的多個殘基水平等上展示保守性或變 異性。殘基可展示相同殘基的保守性或可在種類水平上保守。氨基酸 種類的實例包 極性但不帶電荷的R組(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；帶正電荷的R組(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負電荷 的R組(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R組(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、 甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸(半 胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他種類對于本領域技術人員來說是已知 的并且可使用結構測定法或其他數據來定義以估量可置換性。在該意 義上，可置換的氨基酸可以指可在該位點上進行置換并且保持功能保 守性的任何氨基酸。
如本文中所使用的，當一個氨基酸序列(例如，第一Vh或W序列) 與一個或多個另外的氨基酸序列(例如，數據庫中的一個或多個Vh或 、序列)比對時，可將一個序列(例如，第一Vh或叭序列)中的氨基 酸位點與一個或多個另外的氨基酸序列中的"相應位點"相比較。如 本文中所使用的，"相應位點"表示當對序列進行最優比對時，即當 序列進行比對以獲得最高百分數同 一 性或百分數相似性時進行比較的 序列中的等同位點。
如本文中所使用的，術語"抗體數據庫"是指兩個或更多個抗體 氨基酸序列("多個"序列)的集合，通常是指數十個、數百個或甚 至數千個抗體氨基酸序列的集合。抗體數據庫可存儲例如抗體VH區、 抗體Vl區或兩者的集合的氨基酸序列，或可存儲由VH和1區域組成的 scFv序列的集合。優選，可將數據庫存儲在可檢索的、固定的介質中， 例如計算機上可檢索的計算機程序中。在一個實施方案中，抗體數據 庫是包含或由種系抗體序列組成的數據庫。在另一個實施方案中，抗 體數據庫是包含或由成熟(即，表達的)抗體序列組成的數據庫(例如， 成熟抗體序列的Kabat數據庫，例如KBD數據庫)。在另一個實施方案 中，抗體數據庫包含或由功能性選擇的序列(例如，根據QC測定選擇 的序列)組成。
術語"免疫結合劑"是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分 抗原結合位點，例如重鏈和/或輕鏈可變結構域的全部或一部分，這樣 免疫結合劑能夠特異性識別靶抗原。免疫結合劑的非限定性實例包括 全長免疫球蛋白分子和scFv，以及抗體片段，包括但不限于(i) Fab片段，由Vl、 Vh、 Cl和CJ結構域組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段， 包含通過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii) FaV片段，其基本上是具有鉸鏈區的一部分的Fab(參見，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed. , 3. sup. rd ed. 1993); (iv)由Vh和ChI結枸 域組成的Fd片段；(v)由抗體的單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段； (vi) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature里544-546)，其由VH 結構域組成；和(vii)納米抗體(Nanobody)，包含單個可變結構域和兩 個恒定結構域的重鏈可變區。如本文中所使用的，術語"功能特性"是例如為了提高多肽的生 產特性或治療功效，其提高(例如相對于常規多肽)對于本領域技術 人員來說是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫結合劑)的特性。在 一個實施方案中，功能特性是提高的穩定性(例如，熱穩定性)。在 另一個實施方案中，功能特性是提高的溶解性(例如，在細胞條件下)。 在另一個實施方案中，功能特性是非聚集性。在另一個實施方案中， 功能特性是表達(例如，在原核細胞中)的提高。在另一個實施方案 中，功能特性是在內含體純化方法后重折疊產量的提高。在某些實施 方案中，功能特性不是抗原結合親和力的提高。scFv的基于序列的分析本發明提供了用于分析scFv序列的方法，其允許鑒定scFv序列 中選擇用于突變的氨基酸位點。被選擇用于突變的氨基酸位點是經預 測影響scFv的功能特性例如溶解性、穩定性和/或抗原結合的氨基酸 位點，其中預測該位點上的突變提高scFv的性能。因此，本發明允許 對scFv進行比簡單隨機突變scFv序列中的氨基酸位點更集中的工程 改造以最優化性能。在圖1的流程圖中示意性地圖解了 scFv序列的基于序列的分析 的某些方面。如該圖中所示的，將要最優化的scFv序列與一個或多個 抗體數據庫(包括由因穩定和可溶而被選擇的scFv序列組成的抗體數 據庫)中的序列相比較。這可允許鑒定特別地scFv形式中對于穩定性和/或溶解性是至關重要的殘基，以及鑒定特別地在scFv形式(例如， l和VH的組合)中顯示穩定性、溶解性和/或不依賴于各自CDR的結合 的提高的模式。在鑒定了至關重要的殘基后，它們就可用例如在各自 數據庫中鑒定的出現頻率最高的適當的氨基酸進行置換，和/或通過隨 機或偏好性誘變進行置換。因此，在一個方面，本發明涉及鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變 的氨基酸位點的方法，所述scFv具有Vh和vl氨基酸序列，該方法包 括a) 將scFvVh、 Vl或vh和W氨基酸序列輸入包含許多抗體vh、、 或Vh和Vt氨基酸序列的數據庫，以使scFv VH、 l或Vh和Vt氨基酸序 列與數據庫的抗體VH、 Vl或VB和Vl氨基酸序列比對；b) 將scFv Vh或、氨基酸序列中的氨基酸位點與數據庫的抗體 Vh或W氨基酸序列中的相應位點相比較；c) 確定scFv Vh或t氨基酸序列中的氨基酸位點是否被在數據 庫的抗體VH或l氨基酸序列中的相應位點上保守的氨基酸殘基占據； 和d) 當氨基酸位點被在數據庫的抗體vh或Vt氨基酸序列中的相應 位點上不保守的氨基酸殘基占據時，將scFv Vh或l氨基酸序列中的 氨基酸位點鑒定為用于突變的氨基酸位點。因此，在本發明的方法中，將目的scFv的序列(即，VH、 Vl或丙 者的序列)與抗體數據庫的序列相比較，然后確定目的scFv中的氨基 酸位點是否被在數據庫中的序列的相應位點上"保守的"氨基酸殘基 占據。如果scFv序列的氨基酸位點被在數據庫的序列中的相應位點上 不"保守的"氨基酸殘基占據，則scFv的該氨基酸位點選擇用于突變。 優選，被分析的氨基酸位點是目的scFv中的框架氨基酸位點。更優選， 可分析目的scFv中的每一個框架氨基酸位點。在備選的實施方案中， 可分析目的scFv的一個或多個CDR中的一個或多個氨基酸位點。在另 外的實施方案中，可分析目的scFv中的各氨基酸位點。為了確定氨基酸殘基在抗體數據庫的序列中的特定氨基酸位點26(例如，框架位點)上是否"保守"，可計算在特定位點上的保守程 度。存在許多不同的本領域內已知的可定量給定的位點上的氨基酸多 樣性的方法，其全都可用于本發明的方法。優選，使用辛普森多樣性 指數計算保守程度，該指數是多樣性的量度。其考慮到存在于各位點上的氨基酸的數目，以及各氨基酸的相對豐度(abundance)。辛普森 指數(S. I.)代表兩個隨機選擇的抗體序列在某些位點包含相同的氨基 酸的概率。當測量保守性、豐富度(richness )和均勻度(evenness ) 時，辛普森指數考慮了兩個主要因素。如本文中所使用的，"豐富度"是存在于特定位點上的氨基酸的不同種類的數目的量度(即，數據庫 中在該位點上顯示的不同氨基酸殘基的數目是豐富度的量度)。如本文中所使用的，"均勻度"是存在于特定位點上的氨基酸中的每一個 的豐度的量度(即，數據庫的序列中氨基酸殘基在該位點上發生的頻 率是均勻度的量度)。雖然殘基豐富度獨自可用作檢查特定位點上的保守程度的量度， 但其沒有考慮存在于某些位點上的各氨基酸殘基的相對頻率。其對在 數據庫的序列中的特定位點上極少發生的氨基酸殘基與對在相同位點以極高的頻率發生的殘基給予同樣的權重。均勻度是組成位點的豐富 度的不同氨基酸的相對豐度的量度。辛普森指數將兩者(豐富度和均 勻度)都考慮到了，從而是按照本發明定量保守程度的優選方法。特 別地，在非常保守的位點上的低頻率殘基被認為是潛在有問題的，從 而其可選擇用于突變。辛普森指數的公式為D -Snjni-D/IUN-I),其中N是調查的序 列(例如，在數據庫中)的總數，n是各氨基酸殘基在被分析的位點 上的頻率。氨基酸事件(i)在數據庫中的頻率是氨基酸在數據庫中發生 的次數(iii)。計數rii本身以相對頻率給出，其表示它們按照事件的總 數進行了標準化。當最大多樣性發生時，S. I.值是0，當最小多樣性 發生時，S. I.值是l。因此S. I.的范圍是0至1，多樣性和指數值呈 負相關。在圖2中更詳細地描述了概述用于分析數據庫的序列中的框架氨27基酸位點的多個步驟的流程圖。因此，在上述方法的優選實施方案中，使用辛普森指數給數據庫 的抗體Vh或Vl氛基酸序列中的相應位點的保守程度賦值。該相應位點的S. I.值可用作該位點的保守性的指標。在其他實施方案中，將密切相關的抗體序列的可信比對(trusted alignment )用于本發明以產生氨基酸的相對豐度和確定的位點的保守 程度的矩陣。這些矩陣經設計用于抗體-抗體數據庫比較。計算各殘基 的觀察到的頻率，并且將其與預期的頻率(其基本上是數據集中各殘 基對于各位點的頻率)相比較。使用所述方法對給定的scFv抗體進行的分析提供了關于給定的 scFv抗體中的某些位點上的生物學上允許的突變和罕見殘基的信息， 以及允許預測其框架中的潛在弱點。可將常規技術用于對"最，，符合 一組氨基酸-頻率數據的氨基酸置換進行工程設計(使用S. I.值和相 對頻率作為標準)。上述基于序列的分析可用于scFv的Vh區域，scFv的l區域或兩者。因此，在一個實施方案中，將scFv VH氨基酸序列輸入數據庫并 且與數據庫的抗體^氨基酸序列比對。在另一個實施方案中，將scFv VL氨基酸序列輸入數據庫并且與數據庫的抗體VL氨基酸序列比對。在 另一個實施方案中，將scFv Vh和VL氨基酸序列輸入數據庫并且與數 據庫的抗體VH和l氨基酸序列比對。用于將一個序列與數據庫中的其 他序列的集合進行比對的算法在本領域內已良好地建立。將序列進行 比對以獲得序列之間的最高百分數同 一性或相似性。本發明的方法可用于分析scFv序列中的一個目的氨基酸位點或 更優選，可用于分析多個目的氨基酸位點。因此，在上述方法的步驟 b)中，可將scFv L或W氨基酸序列中的多個氨基酸位點與數據庫的 抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應位點相比較。要分析的優選位點是 scFv的Vh和/或Vl序列中的框架位點(例如，可分析各Vh和Vj醫架位 點)。另外或備選地，可分析scFv的一個或多個CDR中的一個或多個 位點(雖然突變CDR中的氨基酸位點可能不是優選的，因為CDR中的突28變比框架區中的突變更可能影響抗原結合活性)。此外，本發明的方法允許分析scFv VH、 Vl或Vh和W氨基酸序列中的各氨基酸位點。在本發明的方法中，可將目的scFv的序列與多種不同類型的抗 體序列數據庫的一種或多種中的序列相比較。例如，在一個實施方案 中，數據庫的抗體VH、 Vl或VH和Vt氨基酸序列是種系抗體VH、 Vl或Vh 和l氨基酸序列。在另一個實施方案中，數據庠的抗體Vh、 Vl或Vh和 VL氨基酸序列是重排的親和力成熟的抗體H或Vh和VL氨基酸序列。 在另一個優選實施方案中，數據庠的抗體Vh、 W或Vh和^氨基酸序列 是因具有至少一種期望的功能特性例如scFv穩定性或scFv溶解性而 被選擇(下面進一步論述的)的scFv抗體Vh、 W或Vh和、氨基酸序列。得、匯編和/或產生抗體序列信息。序列的來源可包括但不限于一種或 多種下列數據庫。* Kabat數據庫(.immuno. bme. nwu. edu; Johnson & Wu (2001) Nucleic Acids Res.旦205-206; Johnson & Wu (2000) Nucleic Acids Res. 214-218)。來自2000的原始數據可通過在美國的FTP和在英國的鏡像獲得。
Kabatman包含允許用戶就序列的罕見特征檢索Kabat序列和使 用戶能夠發現對于特定抗體序列中的CDR的正則分配(canonical assignment)的數據庫。
AAAAA網站(www, bioc. unizh. ch/ant ibody/)， 由 Annemarie Honegger制作的提供關于抗體的序列信息和結構數據的抗體網頁。* ABG:抗體的3D結構的目錄(directory) -由Antibody Group (ABG)產生的目錄允許用戶訪問匯編在Protein Data Bank (PDB)中的抗體結構。在該目錄中，各PDB條目(entry)具有至原始來源的超 鏈接，從而使重新獲得全部信息變得容易。
ABG:小鼠VH和VK種系區段的種系基因目錄，在Institutode Biotecnologia, UNAM (National University of Mexico)的Antibody Group的網頁的一部分。
IMGT ,國際免疫遺傳學信息系統 ( international ImMunoGeneTics information system ) -由Marie-Paule Lefranc (University Montpellier II， CNRS)于1989年創建,IMGT是專門于 人和其他脊推動物物種的免疫系統的免疫球蛋白、T細胞受體和相關蛋白質的集成知識資源。IMGT由序列數據庫(IMGT/LIGM-DB，來自人 和其他脊推動物的IG和TR的綜合數據庫，具有完全注釋的序列的翻 譯，IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMER-DB)、基因組數據庫(IMGT/GENE-DB)、 結構數據庫(IMGT/3Dstructure-DB)、網絡資源(IMGT Repertoire)組 成 (IMGT， the internationalImMunoGeneTics informationsystem扭； imgt. cines. fr; Lefranc等人(1999) Nucleic Acids Res. ^2: 209-212; Ruiz等人(2000) Nucleic Acids Res.旦219-221; Lefranc 等人(200D Nucleic Acids Res. li: 207-209; Lefranc等人(2003) Nucleic Acids Res. H.: 307-310)。
VBASE-從一千多個/>開的序列(包括目前從Genbank和EMBL 數據庫釋放的序列)匯編的所有人種系可變區序列的綜合目錄。在優選實施方案中，從scFv文庫獲得抗體序列信息，所述scFv 文庫具有已在還原性環境中就增強的穩定性和溶解性進行選擇的確定 的框架。更特別地，已描述了允許選擇在還原性環境中具有增強的穩 定性和溶解性的scFv框架的酵母質量控制(QC)-系統(參見例如，PCT
發明者D·厄馳, L·博拉斯 申請人:艾斯巴技術股份公司