專利名稱：：促紅細胞生成素融合蛋白的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及其中促紅細胞生成素(EPO)與蛋白載體尤其是與抗體或抗體片段例如Fc片段連接的重組融合蛋白，其中所述重組融合蛋白被進一步氨甲?；?。本發(fā)明還涉及所述融合蛋白的制造方法和含有所述融合蛋白的藥物組合物，以及所述融合蛋白和藥物組合物在醫(yī)療上的應用。
背景技術：
：促紅細胞生成素(EPO)是一種公知的糖蛋白，最初因其對骨髓的激素性影響和參與成熟血紅細胞的生長與發(fā)育而被鑒定。除這種造血活性之外，最近已發(fā)現(xiàn)EPO還在許多組織中作為有效的、局部生成的改善代謝應激的分子而起作用。EPO的組織保護活性通過與促紅細胞生成素受體的相互作用而介導。例如，在腦部，EPO和它的受體于局部產生，受到代謝應激物的調控，并提供神經保護和抗炎的功能(Doggrdl，SA.(2004)ExpertOpinInvestigDrugs;13(11):1517-9)。在脊髓中，EPO提供的有益效果包括抑制神經元、少突膠質細胞和內皮細胞的凋亡和壞死，減少空化，降低脂質過氧化、動員內皮祖細胞，促進血管發(fā)生和恢復血管的自我調節(jié)(Gorio，A.等(2002)ProcNatlAcadSciUSA;99(14):9450-5;LeistM.(2004)Science;305(5681):239-42)。已經證實，EPO通過核因子(NF)-kB通路的成員的調控，以及由janus激酶-2/信號轉導物和轉錄5系統(tǒng)的活化劑而進行信號轉導(GorioA.(2005)Neurosurgery;56(4):821-7;GrassoG(2005)Neurosurgery;56(4):821-7)。通過化學修飾，即，EPO的賴氨酸和/或N-末端氨基酸的至少一個伯胺基的氨甲?；?，與未經氨甲?；腅PO相比，該細胞因子的造血活性顯著降低，同時其組織保護活性，即其神經細胞再生活性保持基本不變或者甚至得到增強。WO2006/014466和WO2006/002646公開了用于各種醫(yī)學適應癥的氨甲酰化EPO的制造和應用。由于EPO的血清半衰期相對較短，并且本領域公知將免疫球蛋白恒定區(qū)與非免疫球蛋白的蛋白融合可顯著地延長所述非免疫球蛋白的蛋白的血清半衰期，因此已有數(shù)種方法被用于將免疫球蛋白片段與EPO連接。例如，WO99/02709揭示了包含EPO和免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白的生產與應用，其中EPO-Fc融合蛋白的體內半衰期與天然存在的EPO相比得到增加。從WO2005/063808可知，通過特定氨基酸的突變、缺失或插入可進一步改善EPO-Fc融合蛋白的藥代動力學，g卩，延長血清半衰期并提高體內效能。因此，對治療疾病的需求是簡化的且花費更低的EPO療法，g口，需要更低頻率的EPO施用，其中理想的是EPO的組織再生活性(即神經細胞再生活性)不變或甚至增強，而同時需要較少或甚至不需要EPO的造血活性，因此將造血活性降低。這些疾病包括但不限于中樞神經系統(tǒng)(CNS)和/或周圍神經系統(tǒng)(PNS)的功能異常或損害，特別是包括與神經損傷相關或由神經損傷引起的疾病，所述的神經損傷包括例如機械撞擊后的物理神經損壞。
發(fā)明內容因此，本發(fā)明的一個目的是通過化學修飾(即，氨甲?；甯纳婆c非融合EPO蛋白相比具有延長的血清半衰期的已知EPO-Fc融合蛋白，從而獲得經修飾的EPO-Fc融合蛋白，該經修飾的EPO-Fc融合蛋白除了具有延長的血清半衰期之外，與未修飾的EPO-Fc融合蛋白相比還具有減少的造血活性，但仍具有不變的或者增強的再生活性。本發(fā)明所述的經修飾EPO-Fc融合蛋白適用于治療中樞神經系統(tǒng)(CNS)和/或周圍神經系統(tǒng)(PNS)的疾病或功能異常，包括由例如機械撞擊、熱或輻射導致的神經物理損壞所引起的或相關的疾病。本發(fā)明的經修飾EPO-Fc融合蛋白的優(yōu)勢特征之一是與用于相同目的的傳統(tǒng)EPO或EPO-FC相比可施用更大治療劑量，并且基本上不增加對造血系統(tǒng)即血球計數(shù)的不利影響。相應地，本發(fā)明的一個目的是提供經修飾的重組EPO融合蛋白，其中EPO與蛋白載體連接，特別是與免疫球蛋白或免疫球蛋白片段如Fc片段連接，更特別是與IgG分子的Fc部分連接，并且其中所述重組融合蛋白通過氨甲?；贿M一步修飾。本發(fā)明的另一個目的是提供所述氨甲?；亟MEPO-Fc融合蛋白的制備方法。本發(fā)明的另一個目的提供包含所述氨甲?；亟MEPO-Fc融合蛋白的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面涉及所述氨甲?；亟MEPO-Fc融合蛋白對于醫(yī)療的應用。本發(fā)明的另一方面涉及包含所述氨甲酰化重組EPO-Fc融合蛋白的藥物組合物對于醫(yī)療的應用。從屬權利要求進一步描述了本發(fā)明的特征，而本發(fā)明各實施方式是獨立權利要求的主題。圖1顯示了挫傷后的大鼠在施用本發(fā)明的氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白后運動恢復的測定結果?？v座標-Beattie-Bresnahan-Basso(BBB)量表；橫坐標=在挫傷前、后選取的時間點；praeOP-挫傷前；第1組=以rhEPO蛋白處理的動物(對照)；第2組-未處理的動物(安慰劑組)；第3組=以未氨甲?；腅PO-Fc融合蛋白處理的動物(比較組)；第4組=以氨甲酰化的EPO-Fc融合蛋白處理的動物(實驗組)；第5組=以甲潑尼龍?zhí)幚淼膭游?比較組)。圖2顯示了在實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)小鼠模型中，在EAE進展的不同階段通過確定EAE評分對氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白的效果的評估結果?？v座標=實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)評分量表；橫坐標=開始施用之后的天數(shù)；圖2八=早期處理以氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白(測試組；第1組)或PBS(對照組；第2組)處理的動物，施用在EAE誘發(fā)后第18天開始；圖2B-中期處理以氨甲酰化EPO-FC融合蛋白(測試組；第3組)或PBS(對照組；第4組)處理的動物，施用在EAE誘發(fā)后第28天開始；圖2C^免期處理以氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白(測試組；第5組)或PBS(對照組；第6組)處理的動物，施用在EAE誘發(fā)后第52天開始。小鼠分組安排的詳細信息見表2。圖2A至2C顯示了各組所用動物的平均EAE評分。具體實施例方式本發(fā)明的第一實施方式提供了化學修飾(即氨甲?；?的重組EPO-Fc融合蛋白，其與未融合的EPO蛋白相比具有顯著延長的血清半衰期，同時，與未修飾的EPO-Fc融合蛋白相比具有降低的造血活性，此外，其神經細胞再生活性與未修飾的EPO或EPOFc融合蛋白的相應活性相比不變甚至得到改善。此處所用"EPO-Fc融合蛋白"是指包含EPO部分和Fc部分的蛋白。此處所用"EPO部分"包含人或其它來源的全長野生型或天然存在的促紅細胞生成素，以及促紅細胞生成素樣分子，所述促紅細胞生成素樣分子包括促紅細胞生成素生物活性片段、促紅細胞生成素的類似物、變體、突變體和衍生物。此處所用"Fc部分"包含來源于免疫球蛋白(優(yōu)選來源于人免疫球蛋白)恒定區(qū)的域，包括恒定區(qū)的片段、類似物、變體、突變體或衍生物。合適的免疫球蛋白包括IgG，艮卩，IgGl、lgG2、lgG3和lgG4等亞類，以及其它類別。此處涉及的促紅細胞生成素的"生物活性"應理解為EPO或EPO樣分子與促紅細胞生成素受體相互作用的能力。生物活性EPO樣分子通常與野生型或天然存在的EPO的相應序列具有關鍵氨基酸序列相似性或同一性(例如從至少55°/。至約65%、75°/。、80%，甚至高達約90%95%的同一性)，并具有野生型EPO的一種或更多種功能。此處所用"生物活性片段"是指能發(fā)揮與全長蛋白相似的生物學效果的片段。這些片段可通過氨基端和羧基端缺失以及內部缺失來產生。它們還包括促紅細胞生成素的截短形式和雜合形式。"截短"形式是一個或更多個N末端和/或C末端殘基缺失的促紅細胞生成素的較短變種。本發(fā)明的EPO-Fc融合蛋白可以用不同方式連接起來?？梢詫c部分通過其C-末端與EPO部分的N-末端連接，即，EPO-Fc融合蛋白的Fc部分接近EPO-Fc融合蛋白的N-末端；或如本發(fā)明所優(yōu)選，F(xiàn)c部分通過其N-末端與EPO部分的C-末端連接。此外，EPO部分和Fc部分可末端對末端地直接融合在一起，也可以通過在EPO部分和Fc部分之間插入的接頭(例如肽接頭)間接融合在一起。相應地，本發(fā)明的第一方面涉及與EPO相比在體內具有改善的生理學半衰期和降低的造血活性、并還具有體內神經再生活性的重組EPO融合蛋白，該融合蛋白的特征在于其包含人IgG分子的Fc部分和促紅細胞生成素(EPO)部分、優(yōu)選人促紅細胞生成素部分，其中Fc部分通過其N-末端與EPO部分的C-末端直接連接，并且其中所述融合蛋白通過氨甲酰化進行修飾。一般而言，蛋白的氨甲?；ǔＷ鳛榈鞍准兓惺褂媚蛩氐母弊饔枚l(fā)生并且是高尿素血清水平導致的結果，這是由于尿素自發(fā)分解為氰酸鹽。氰酸鹽導致伯胺(包括蛋白中的伯胺)的氨甲?；⑶胰菀着c蛋白(例如EPO糖蛋白)中賴氨酸的和N-末端氨基酸的自由氨基殘基發(fā)生反應。由氰酸鹽引起的氨甲酰化過程依賴于pH，并且也可以通過包括精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸等蛋白的其它氨基酸發(fā)生，不過發(fā)生的程度較低。制備性氨甲?；ㄟ^預定量的氰酸鹽與預定量的蛋白反應進行。氨甲酰化的程度取決于氰酸鹽與蛋白之間的反應時間，以及氰酸鹽和/或目標蛋白的濃度。在另一方面本發(fā)明涉及這樣EPO-Fc融合蛋白，其中所述融合蛋白的至少一個、優(yōu)選兩個或更多個賴氨酸殘基和/或N-末端氨基被氨甲酰化。本發(fā)明的氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白可以在Fc部分包含另外的修飾，例如，氨基酸突變如氨基酸插入、氨基酸缺失或者保守或非保守氨基酸取代。特別是，現(xiàn)有技術廣泛公開了Fc部分中的氨基酸取代可通過降低或消除Fc受體結合或補體固定活性來進一步延長融合蛋白如EPO-Fc融合蛋白的血清半衰期。EPO-Fc融合蛋白還可以在促紅細胞生成素部分有附加的修飾，例如氨基酸突變如氨基酸插入、氨基酸缺失、保守或非保守氨基酸取代或氨基酸去糖基化，這降低了對EPO受體的結合親和力和/或增加了促紅細胞生成素的生物活性。一般而言，免疫球蛋白的恒定區(qū)被定義為與由木瓜蛋白酶消化產生的免疫球蛋白C-末端域同源的天然存在或合成的多肽。免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)可以包括重鏈恒定區(qū)1的域(CH1)、鉸鏈區(qū)、重鏈恒定區(qū)2的域(CH2)和重鏈恒定區(qū)3的域(CH3)。相應地，本發(fā)明的Fc部分可以包含鉸鏈區(qū)、CH2禾B/或CH3域。Fc部分可以進一步包括完整或部分的鉸鏈區(qū)、CH2和/或CH3域。在另一方面，本發(fā)明涉及這樣的EPO-Fc融合蛋白，其具有Fc部分，該Fc部分包含來自人IgG的鉸鏈區(qū)、CH2域和CH3域。在另一方面，本發(fā)明涉及這樣的EPO-Fc融合蛋白，其中EPO部分和Fc部分之間的融合在鉸鏈區(qū)完成。一般而言，可使用本領域技術人員熟知的技術通過重組表達的方法生產本發(fā)明的EPO-Fc融合蛋白。為了獲得糖基化模式與天然存在的EPO和免疫球蛋白基本相同的糖基化重組EPO-Fc融合蛋白，優(yōu)選地使用真核細胞重組表達EPO-Fc融合蛋白。重組表達的蛋白作為單鏈多肽分泌到培養(yǎng)基中從而形成EPO-Fc融合蛋白單體，但是它們也可以以其中多肽鏈通過二硫鍵連在一起的二聚或多聚的形式分泌到培養(yǎng)基中。在另一方面，本發(fā)明的涉及這樣的EPO-Fc融合蛋白，其中兩個EPO-Fc融合蛋白單體連接在一起形成同型二聚體?？赏ㄟ^本領域公知的技術從細胞培養(yǎng)基中分離并進一步純化所分泌的重組生成的蛋白。在另一方面，本發(fā)明涉及氨甲?；亟MEPO-Fc融合蛋白的制備方法，所述融合蛋白包含人IgG分子的Fc部分和EPO部分，優(yōu)選人EPO部分，其中所述Fc部分通過其N-末端與EPO部分的C-末端直接連接，該方法包括-制備編碼EPO-Fc融合蛋白的DNA分子；-用所述DNA分子轉化宿主細胞；-表達由所述DNA分子編碼的所述EPO-Fc融合蛋白；-收獲所述EPO-Fc融合蛋白；-純化所述EPO-Fc融合蛋白；和-使所述EPO-Fc融合蛋白與氰酸鹽反應從而使EPO-Fc融合蛋白氨甲酰化，其中所述融合蛋白的至少一個、優(yōu)選兩個或更多個賴氨酸殘基和/或N-末端氨基酸被氨甲?；?。本發(fā)明的EPO-Fc融合蛋白兼有優(yōu)越的延長的血清半衰期和降低的造血活性，所述延長的血清半衰期通過EPO部分與免疫球蛋白的Fc部分的融合而獲得，同時由于該蛋白的至少一個伯胺被氨甲?；?，從而EPO-Fc融合蛋白保持不變的甚至增強的神經細胞再生活性。在另一方面，本發(fā)明涉及應用為藥物的所述EPO-Fc融合蛋白。一般地，無論何時需要以氨甲?；疎PO進行治療時，所述EPO-Fc融合蛋白可代替氨甲酰化EPO蛋白使用。特別地，所述EPO-Fc融合蛋白可用于制造治療中樞神經系統(tǒng)(CNS)和/或周圍神經系統(tǒng)疾病的藥物組合物。例如，所述EPO-Fc融合蛋白可用于制造治療下述疾病的藥物組合物，所述疾病選自由中風、除中風以外的CNS缺血事件、挫傷、脊髓損傷、外傷性腦損傷和神經退行性疾病組成的組。由于與氨甲?；姆侨诤螮PO蛋白相比本發(fā)明EPO-Fc融合蛋白的血清半衰期得以延長，因此含有所述EPO-Fc融合蛋白的藥物組合物所需的施用頻率低于含有氨甲?；姆侨诤螮PO蛋白的藥物組合物。因此，對于需要這種治療的患者而言使用本發(fā)明EPO-Fc融合蛋白的療法更加輕松。在另一方面，本發(fā)明涉及包含所述EPO-FC融合蛋白的藥物組合物，該藥物組合物可選地還含有藥用載體。在另一方面，本發(fā)明涉及但不限于適于胃腸外施用的所述藥物組合物。由于有效的EPO療法需要EPO血清水平達到治療水平，因此理想的是將所述藥物組合物作為其中本發(fā)明的EPO-Fc融合蛋白以與藥用載體物質的混合劑存在的注射溶液。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，將所述藥物組合物提供為適合靜脈注射或皮下注射的蓋倫形式(galenicform)。在另一方面，本發(fā)明涉及用于治療中樞神經系統(tǒng)(CNS)和/或周圍神經系統(tǒng)疾病的所述藥物組合物的應用。在另一方面，本發(fā)明涉及所述藥物組合物用于治療下述疾病的應用，所述疾病選自由中風、除中風的CNS缺血事件、挫傷、脊髓損傷、外傷性腦損傷、和神經退行性疾病組成的組。為了使此處描述的本發(fā)明得到更加充分地理解，闡述了以下實施例。這些實施例僅用于說明目的，而不應理解為在任何方面限制本發(fā)明。實施例實施例l:氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白的制備和表征a)構建編碼EPO-Fc融合蛋白的表達載體通過人EPO基因和人IgG1鉸鏈-CH2-CH3片段的融合PCR產生EPO-Fc融合蛋白。EPO位于構建體的N末端，并與人IgGl的鉸鏈區(qū)融合。為了使蛋白分泌到培養(yǎng)上清液中的，使用了與EPOcDNA共同擴增的促紅細胞生成素信號序列。這種構建使得能夠分泌同型二聚EPO-Fc分子。使用可獲得576bpDNA片段的寡核苷酸印o^d:^^/f/(被設計用于在DNA片段5'端添加唯一BamHI限制位點)和epo/n'"ge，通過PCR從質粒phEpo中擴增了人EpocDNA(epo6acA:Saw/f/:5'GGGGGATCCGCCATGGGGGTGCACGAATGTCC3'[SEQIDNO1];印o6/n"ge/or:5'AGATTTGGGCTCTCTGTCCCCTGTCCTGCAGG3'[SEQIDNO2])。用可獲得671bpDNA片段的寡核苷酸0/3/^A^/(被設計用于在DNA片段3'端添加唯一Notl限制位點)和/n'wge印o6acA:通過PCR從質粒p2G12HC擴增了人IgG1鉸鏈-CH2-CH3片段(C7G/or胸/:5'GGGGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGG3'[SEQIDNO3];W，一，6acA::5'ACAGGGGACAGAGAGCCCAAATCTTGTGAC3'[SEQIDNO4]):使用20ng質粒模板、各寡核苷酸10pmol、250pM核苷酸、lxPCR緩沖液和5單位熱穩(wěn)定Taq聚合酶，在5(^1總體積中進行擴增。兩個PCR反應都進行25個循環(huán)94°C20秒，56°C30秒和72°C1分鐘。以Qiaquick純化試劑盒(Qiagen)純化2個片段之后，使用50ng的IgGl鉸鏈-CH2-CH3cDNA、50ngEPOcDNA、250laM核苷酸、lxPCR緩沖液和5單位Taq聚合酶在體積中進行融合PCR。在第一步完成6個循環(huán)94°C20秒、60°C30秒和72°C1分鐘。在加入各10pmol的外側引物(epo^d^am/Z/和C773/orA^7)后，PCR繼續(xù)進行25個循環(huán)94t;20秒、56°C30秒和72°C1.5分鐘。然后用Qiagen的制備性凝膠提取試劑盒和凝膠提取試劑盒純化PCR產物。將得到的EPO-FccDNA插入到包含人CMV(巨細胞病毒)啟動子的經BamHI/Notl開放的真核表達載體中，并轉化到E.coli菌株TG1中。用10ng的EPO-Fc片段、5ng的pECMV載體、1單位的T4-連接酶和lx連接緩沖液(NewEnglandBiolabs)在10pl的總體積中，于37°C連接1小時。使用外側弓I物進行PCR篩選以鑒定陽性克隆。最終質粒pCMV—EpoFc中的Epo-FccDNA的正確性經過序列和限制性分析得到證實。b)EPO-Fc融合蛋白的表達和純化用來自步驟a)的大規(guī)模質粒制備物(pC]VrV^EpoFc)轉染二氫葉酸還原酶陰性CHO細胞。用比例為20:1的兩種質粒pCMV—EpoFc和p2一dhfr對細胞進行脂質體(lipofectin)轉染。轉染后24小時開始對轉染細胞進行篩選(DMEM4mML-谷胺酰胺和10。/。經透析的FCS)，并當克隆開始生長時施加MTX壓力(0.05pM和O.lpMMTX)。在篩選和分離出表現(xiàn)最好的克隆后，將培養(yǎng)轉為無蛋白條件。從細胞存活率為80%的批量投料發(fā)酵物收獲細胞上清液。對上清液進行尺寸過濾(0.2jam的孔徑)，并加入1MTris使最終pH為8.5，然后通過以pH8.5的0.025MTris緩沖鹽水平衡的蛋白A-Sepharose柱，用pH3.5的0.1M甘氨酸洗脫。對洗脫產物流分的pH進行pH測量，如有必要，用pH8.0的1MTris調至pH7.07.5。c)氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白的生產本程序的起始原料是上述的純化重組人EPO-Fc融合蛋白，通常包括培養(yǎng)上清液中存在的融合蛋白的所有同等型，這使得可以獲得高產率的所需終產物。首先通過超濾(例如10kD截流膜)將重組人EPO-Fc融合蛋白的蛋白濃度調整至4mg/mL7mg/mL。將60mg/mgEPO-Fc融合蛋白溶解在pH8的0.6M硼酸鈉緩沖液中制備KOCN-硼酸鹽溶液。然后將EPO-Fc融合蛋白溶液和KOCN-硼酸鹽溶液按照1:1的比例混合，將溶液在37t:孵育48小時。將氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白在PBS中用凝膠過濾(例如SephadexG25)來最終配制(endformulate)。依照用ELISA方法確定的EPO-Fc融合蛋白的標準曲線通過OD2漁m確定了氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白的濃度。接下來的氨甲?；潭葴y定證實基本上所有自由氨基都被氨甲酰化。實施例2:大鼠挫傷后運動恢復的測定在動物實驗中分析了氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白與未修飾的EPO-Fc融合蛋白相比的體內神經細胞再生活性。氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白和未修飾的EPO-Fc融合蛋白以實施例1公開的方法制備。將35只重240g260g的Sprague-Dawley大鼠分為5組，各組分別包括6只動物(第1組)、7只動物(第2、4、5組)或8只動物(第3組)。通過腹腔注射的Ketavet(110mg/kg)和Rompun(12mg/kg)的混合物將動物麻醉，之后在T-11節(jié)進行椎板切除術。在脊髓暴露后，使用IH400沖擊器(PrecisionSystems&Instrumentation,Lexington,KY，USA)對實驗云力物進行150千達因(kdyne)的脊髓挫傷。損傷1小時后，使動物接受1單位劑量的各種蛋白的注射(見表l)。在挫傷事件發(fā)生后3天、l周、2周、3周、4周、5周和6周通過Basso-Beattie-Bresnahan評定量表對運動恢復進行評估。Basso-Beattie-Bresnahan評定量表是一種21分的量表，系統(tǒng)地詳示了后肢的關節(jié)運動功能、步行能力，協(xié)調步行和軀千穩(wěn)定性的精細控制程度。表l:小鼠研究的分組安排第1組用1000單位/kg(相當于10嗎/kg)重組人EPO(rhEPO)處理；對照組第2組用腹腔注射NaCl處理；安慰劑組第3組用30(ig/kg的rhEPO-Fc處理第4組用30pg/kg的氨甲?；膔hEPO-Fc處理第5組用30mg/kg的甲潑尼龍(MPSS)處理動物暴露在開放的區(qū)域內，挫傷事件發(fā)生后3天、l周、2周、3周、4周、5周和6周進行為期5分鐘的觀察。圖1公開了該實驗所得的Basso-Beattie-Bresnahan量表的值。所發(fā)現(xiàn)的是與對照組(第1組和第2組)相比，施用氨甲?；痳hEPO-Fc(第4組)和rhEPO-Fc(第3組)顯著改善了運動的恢復。與此相反，使用甲潑尼龍?zhí)幚淼膭游?第5組)與對照動物幾乎沒有任何差異。對照動物在約4周后達到穩(wěn)定狀態(tài)，并且沒有顯示任何進一步的再生性改善，而第3組和第4組的動物(分別施用EPO-Fc融合蛋白和氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白)在6周的恢復期內都顯示出持續(xù)和顯著的改善。還發(fā)現(xiàn)與rhEPO-Fc(第3組)相比，施用氨甲酰化rhEPO-Fc(第4組)可顯著改善了運動恢復，特別是在挫傷后短時間內。第3天，用rhEPO-Fc處理的動物后肢只有1或2個關節(jié)表現(xiàn)出大范圍運動(分別為Basso-Beattie-Bresnahan評定量表的值2或3)，而用氨甲?；痳hEPO-Fc處理的動物的后肢至少有2個關節(jié)表現(xiàn)出大范圍運動并且第三個關節(jié)表現(xiàn)出輕微運動或者后肢的全部三個關節(jié)都有大范圍運動(分別為Basso-Beattie-Bresnahan評定量表的值6或7)。實施例3:氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白在多發(fā)性硬化癥小鼠模型中的效果的評估。在動物實驗中對氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白在實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)發(fā)展的早期、中期、晚期的體內效果進行了分析?？稍趪X類動物如小鼠中誘發(fā)的EAE是廣為接受的類似于多發(fā)性硬化癥(MS)的脫髓鞘紊亂的動物模型。EAE小鼠模型模擬了MS的典型復發(fā)和恢復過程。該實驗中所用的氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白按實施例1所述制備。通過以髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白(MOG35-55)進行免疫，在11只C57BL/6雌性小鼠中誘發(fā)EAE(Savino，C.等.(2006)JNeuroimmimol172(l-2):27-37)。簡要地說，在PBS中配制4mg/ml的MOG35.55溶液。將熱滅活的結核分枝桿菌(DifcoH37RA)以8mg/ml的濃度懸浮在弗氏不完全佐劑(IFA)中。將懸浮液用MOG35.55溶液乳化。然后對每只小鼠皮下注射100i^l所述乳化液，每側肋各注射5(^1。最后，對每只動物靜脈注射溶于PBS的250ng百日咳毒素兩次，一次在免疫后立即進行，另一次在免疫后48小時后進行。為分析氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白在EAE發(fā)展不同階段的效果，將誘發(fā)出EAE的動物分為測試組(5只動物)和對照組(6只動物)。測試組的動物用50|ig/kg體重劑量的氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白進行處理，而對照組只用PBS處理。從免疫后的18天(早期處理)、28天(中期處理)或52天(晚期處理)開始通過氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白或PBS的腹腔注射進行施用。此外，每個測試組和對照組都進一步被分為3個小組(見表2)。處理進行30天，動物每隔一天接受給藥。表2:小鼠研究的分組安排<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>監(jiān)控動物的臨床狀況和疾病發(fā)展。此外，在治療過程中每天通過根據(jù)表3(Buddeberg，B.S.等(2004)JNeuroimmimol153(1-2):158-70)所示的分級體系的EAE評分對動物顯現(xiàn)的神經功能缺損進行定量評估。表3:EAE評分<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>圖2A至2C顯示了通過這些動物實驗獲得的EAE評分，其中各圖顯示了各組所用動物的平均評分。與對照組(第2、4和6組)相比發(fā)現(xiàn)，施用氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白(第1、3和5組)可減少EAE發(fā)展的早期(圖2A)、中期(圖2B)和后期階段(圖2C)復發(fā)率。對照動物的EAE評分上下波動，對于以氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白處理的動物觀測到，EAE評分即疾病的嚴重程度與處理開始時相比不再增高。還發(fā)現(xiàn)與各自的對照相比，早期施用氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白(圖2A)比晚期施用氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白(圖2C)對EAE進展有更好的效果。更具體地說，從圖2A中可以看出，在開始施用后第30天，氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白處理的動物(測試組)的平均評分減少65.2%，而對照動物的平均評分只減少46.1%。這些實驗的結果表明氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白對EAE發(fā)展的積極效果。權利要求1.一種重組EPO融合蛋白，所述蛋白與EPO相比在體內具有改善的生理學半衰期和降低的造血活性，并進一步具有體內神經再生活性，所述蛋白的特征在于它包含人IgG分子的Fc部分和促紅細胞生成素(EPO)部分、優(yōu)選人促紅細胞生成素部分，其中所述Fc部分通過其N-末端與所述EPO部分的C-末端直接連接，并且其中所述融合蛋白通過氨甲?；恍揎?。2.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的至少一個、優(yōu)選兩個或更多個賴氨酸殘基和/或N-末端氨基酸被氨甲?；?。3.如權利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述Fc部分包含來自人IgG的鉸鏈區(qū)、CH2域和CH3域。4.如權利要求1至3中任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合位于所述鉸鏈區(qū)。5.如權利要求1至4中任一項所述的融合蛋白，其中，兩個EPO-Fc融合蛋白單體結合在一起形成同型二聚體。6.—種包含人IgG分子的Fc部分和EPO部分、優(yōu)選人EPO部分的氨甲?；闹亟MEPO-Fc融合蛋白的制備方法，其中，所述Fc部分通過其N-末端與所述EPO部分的C-末端直接連接，所述方法包括制備編碼EPO-Fc融合蛋白的DNA分子；用所述DNA分子轉化宿主細胞；表達由所述DNA分子編碼的所述EPO-Fc融合蛋白；收獲所述EPO-Fc融合蛋白；純化所述EPO-Fc融合蛋白；禾口使一定量的氰酸鹽與一定量的所述EPO-Fc融合蛋白反應從而將所述EPO-Fc融合蛋白氨甲?；?，其中所述融合蛋白的至少一個、優(yōu)選兩個或更多個賴氨酸殘基和/或N-末端氨基酸被氨甲?；?。7.應用為藥物的如權利要求1至5中任一項所述的融合蛋白。8.如權利要求1至5中任一項所述的融合蛋白在治療中樞神經系統(tǒng)(CNS)和/或周圍神經系統(tǒng)疾病的藥物組合物的制造中的應用。9.如權利要求8所述的應用，其中所述疾病選自由中風、除中風的CNS缺血事件、挫傷、脊髓損傷、外傷性腦損傷和神經退行性疾病組成的組。10.—種包含如權利要求1至5中任一項所述的融合蛋白以及藥用載體的藥物組合物，所述組合物優(yōu)選用于胃腸外施用。11.如權利要求IO所述的藥物組合物，所述組合物被配制為注射溶液。全文摘要本發(fā)明涉及重組融合蛋白，其中促紅細胞生成素(EPO)通過其C-末端與Fc片段連接，并且其中所述重組融合蛋白在該融合蛋白的伯胺處被進一步氨甲?；?。更具體而言，本發(fā)明涉及氨甲酰化EPO-Fc融合蛋白，其中所述融合蛋白的至少一個、優(yōu)選兩個或更多個賴氨酸胺殘基和/或N-末端氨基酸被氨甲?；?。與未修飾的EPO-Fc融合蛋白相比，本發(fā)明的氨甲?；疎PO-Fc融合蛋白具有降低的造血活性，而其組織再生活性，即神經細胞再生活性保持不變或甚至得到增強。本發(fā)明還涉及制造這樣的融合蛋白的方法以及包含所述融合蛋白的藥物組合物，并且涉及這些融合蛋白及藥物組合物在醫(yī)療上的應用。文檔編號C07K14/435GK101688210SQ200880005733公開日2010年3月31日申請日期2008年2月20日優(yōu)先權日2007年2月22日發(fā)明者托馬斯·赫梅特斯貝格,海因茨·雷德爾,羅伯特·維克申請人:波利門科學生物免疫研究有限公司