一種以線粒體為靶點的抗腫瘤錳配合物及其制備和應用的制作方法

專利名稱：：一種以線粒體為靶點的抗腫瘤錳配合物及其制備和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及具有抗腫瘤和具有自噬功能新型小分子化合物及其制備
技術領域：
，特指一類作為新的靶向性抗腫瘤和腫瘤細胞自噬功能的小分子藥物及其制備方法。
背景技術：
：傳統的化療藥物通過破壞DNA的結構、抑制相關蛋白質的表達、干擾腫瘤組織的代謝等來殺死腫瘤細胞，但是化療藥物的選擇性差，在取得治療效果的同時，常出現不同程度的毒副作用，殺死腫瘤細胞的同時，也可以導致機體正常細胞的損傷、死亡。因此，研發新型、強效、低毒的抗腫瘤藥物是生命科學領域的重要課題。隨著順鉑在抗腫瘤方面的應用(ClarkeMJ,ZhuF,FrascaDR,Chem.Rev.,1999,99(9):2511)，引起無機藥物化學研究的熱潮，無機藥物化學已經成為一門新興交叉學科。早期無機抗腫瘤藥物多是圍繞著經典鉑類抗腫瘤藥物即以順鉑為模式的二價鉑類配合物進行的，科學工作者在鉬類抗腫瘤藥物領域進行了大量研究工作，這些研究工作大多是圍繞著經典鉑類抗腫瘤藥物即以順鈾為模式的二價鉑類配合物進行的，已有四項鉑類抗腫瘤專利報道(CN86106751抗腫瘤鉬配合物及其制備和應用；CN87104027新順鉑鉻合物，其小鼠抗腫瘤組合物及其制備過程；CN89106648.9鉑-(IV)-二胺復合物；.CN.95103058.2新的抗腫瘤鉑絡合物)，但鉑類抗腫瘤藥物具有毒副作用和交叉耐藥性等缺點(楊寧，國際泌尿系統雜志，2006，26(6)，849)。順鉑劑量依賴的腎毒性限制了其臨床治療腫瘤的效果。隨后許多非鉬族金屬的配合物，都顯示對人和實驗動物腫瘤有效，如膦基-烴基WI族金屬絡合物具有良好在抗腫瘤方面的應用(CN92104058.X制備膦基-烴基VI族金屬絡合物及含有這些絡合物的抗腫瘤組合物方法其小鼠抗腫瘤組合物及其制備過程)。已報道的抗腫瘤配合物主要包括過渡金屬鈦、釩、鈮、鉬、錸、釕、銠、銥、鉑以及銅和金等重金屬元素配合物(DreicerR.,PropertK.J"RothB.J.，etal,Cancer,1997,79(1):110.曲平，何華，化學進展，2006，18(12)，1646。李風華，吳紅星，林華寬，高等學校化學學報，2006，27(10)，1800)。這些配合物多數是以DNA為耙點，體外與小牛胸腺DNA顯示較強的插入作用，鍵合常數達104-105，多數配合物對腫瘤細胞識別功能弱，干擾正常細胞的DNA的功能。因此高效低毒性新的靶向性抗腫瘤配合物的設計和合成是一個挑戰(HambleyTW,J.Chem.Soc.DaltonTrans.2007，4929-4937)。線粒體(mitochondria)除了作為能量工廠提供ATP、還能生成活性氧(R0S)，參與細胞氧化還原信號轉導，調控細胞凋亡，甚至被譽為"細胞死亡的開關"。1999年Science發表系列論文(如ComebackMA，Science1999:1475)，集中闡述了線粒體功能及相關疾病的研究進展，強調線粒體生物醫學的研究是當代生命科學和分子醫學最活躍的新生長點和前沿之一。目前，線粒體已被證實參與多種疾病的發生、發展過程。線粒體作為"細胞死亡的開關"成為抗腫瘤藥物研究的靶點(ArmstrongJS，Brit.J.Pharm.,2007,75/，1154)。自噬(Aut叩hagy)是指隔離膜包裹細胞質和(或)細胞器形成自噬體，然后與溶酶體融合成自噬溶酶體并在其中降解的過程。自噬性細胞死亡的特征為細胞質中出現大量的自噬體和自噬溶酶體。如果自噬體中吞噬的細胞器以線粒體為主，則稱為線粒體自噬。最近發現，在線粒體膜電位下降，線粒體介導的凋亡不能順利進行時(如caspases被抑制)，通過自噬，可以誘導細胞死亡，這一點對于治療耐藥的抗凋亡腫瘤細胞有著特殊的意義(SongSW&FinkelT，NatureCellBiology2007，9,869)。總之，自噬性細胞死亡在腫瘤發生、發展中發揮重要的作用，近兩年來，通過誘導腫瘤細胞自噬的方式治療腫瘤已成為一種新的趨勢。
發明內容本發明的目的是提供一種具有抗腫瘤和具有自噬功能新型小分子化合物及其制備方法和應用。本發明用化學方法合成了一類新的錳配合物，并運用物理手段確定了配合物的結構。體外抗腫瘤活性測試研究了配合物對腫瘤細胞的影響，發現錳配合物對腫瘤細胞A549，Hela、H印G-2，Ecal09生長均有強的抑制作用，錳配合物以自噬的方式誘導腫瘤細胞凋亡；可作為新的以線粒體為靶點抗腫瘤活性藥物和用于耐藥性腫瘤治療的腫瘤細胞自噬劑。一種錳配合物，是一氯(2-二吡啶甲胺基丙酸)合錳，分子式C15H16ClN302Mn，結構如式l，或二氯(2-二吡啶甲胺基丙酸乙酯)合錳，分子式C17H21Cl2N302Mn，結構如式2:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式l簡寫為L2MnCl,其中L2代表2-二吡淀甲胺基丙酸，結構式為式3:式2簡寫為^MnCl2,，其中L1代表2-二吡啶甲胺基丙酸乙酯，結構式為式4:o、o、式3式4制備上述所說錳配合物的方法是將配體(2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂)(L1)和MnCb按摩爾比l:l溶于乙醇溶液中，控制在30-8(TC;最佳反應溫度為50'C，反應時間2-8小時，最佳反應時間為3小時，去溶液獲得黃色錳配合物[L^MnCl2]。或者是將配體(2-二吡啶甲胺基丙酸)(L2)和MnCl2按摩爾比1:1溶于乙醇溶液中，加入NaOH0.05-0.40克，最佳用量0.25克，控制在20-65。C;最佳反應溫度為48'C，反應時間3-10小時，最佳反應時間為6小時，蒸去甲醇獲得淡黃色錳配合物[L2MnCl]。上述所說的錳配合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。特別是用于制備以線粒體為耙點抗腫瘤活性藥物和用于制備耐藥性腫瘤治療的腫瘤細胞自噬劑。本發明用化學方法合成了兩個新的二吡啶甲基胺類配體的錳配合物，并運用物理手段確定了配合物的結構。體外抗腫瘤活性測試研究了配合物對腫瘤細胞的影響，發現錳配合物對腫瘤細胞A549,Hela、H印G-2，和Ecal09生長均有強的抑制作用。兩個錳配合物均能能抑制鈣離子誘導的線粒體腫脹，說明這兩個錳配合物與線粒體有直接作用。且配合物[LMnCl]以自噬的方式誘導腫瘤細胞凋亡；可作為新的以線粒體為靶點抗腫瘤活性藥物和用于耐藥性腫瘤治療的腫瘤細胞自噬劑。圖1是錳配合物[LMnCl]對50iimolC^+誘導的小鼠肝臟線粒體腫脹的影響。.錳配合物[I^MnCl]劑量依賴性地對抗(^2+誘導的線粒體腫脹。不同濃度的錳配合物在30'C下孵育線粒體懸液3分鐘后，加入CaCl2(終濃度為50Umol/L)，在540nm處用酶標儀測定8分鐘內的吸光強度，每30秒測一次。CsA(環孢菌素A)和EGTA(Ca^鰲合劑)為陽性對照藥。圖2是錳配合物[IMnCl]增加Hela細胞中酸性泡狀細胞器的形成。錳配合物[I^MnCl]增加Hela細胞中酸性泡狀細胞器的形成。Hela細胞經過不同處理后，MDC(50卩mol/L)避光染色15分鐘，confocal拍照(X400).A:controlB:[L2MnCl]40ymol/L6hC:3-MA(10mM)預處理lh,[L2MnCl]40iimol/L6hD:Rapamycin1|mnol/L6h圖3是錳配合物[IMnCl]顯著增加MDC染色后Hela細胞內的藍色熒光強度。A:controlB:L3Mn40ixmol/L6hC:3-MA(10mM)預處理lh,L3Mn40ymol/L6h。*p<0.05,VSA，#p<0.05，VSC.具體實施方式試劑和原料實驗中所用試劑均為分析純，除特別注明外，未經進一步處理。元素分析用Carlo-Erba-1106型元素分析儀測定，紅外光譜用Fr-IR169(固體用KBr壓片)。抗腫瘤試驗試劑如下(1)RPMI1640培養基(RPMI1640+10。/。小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/l)。(2)高糖DMEM培養基(DMEM+10%小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/l)。(3)MTT(美國Amresco公司產品)。實施例l:將配體(2-二吡啶甲胺基丙酸乙月旨)(L1)和MnCl2按摩爾比1:l溶于乙醇溶液中，控制在5(TC;反應時間3小時，蒸去溶液獲得黃色錳配合物[L^MnCl2]。Yield:80%.分子式C17H21Cl2N302Mn。元素分析實測值C，48.40%;H，4.93%;N，9.46;Mn,12.81%;計算值C，48.03;H,4.98;N，9.88;CI,16.68;Mn,12.92%。紅外光譜數據(IR，cm-l):2936，1735cm—!，1624，1575，1493，1035，841，806，506。將配體(2-二吡啶甲胺基丙酸)(L2)和MnCl2按摩爾比1:1溶于乙醇溶液中，加入NaOH0.25克，控制在48°C;反應時間6小時，蒸去甲醇獲得談黃色錳配合物[L2MnCl]。Yield:78%.80%.分子式:C15H16ClN302Mn。元素分析實測值C，55.47%;H，4.93%;N,12.86;Mn,16.61%;計算值C，55.39%;H，4.96°/。；N，12.92;Mn，16.89%。紅外光譜數據(IR，cm-1):2936，1624，1570，1493，1035，841，806，506。實施例2:將配體(2-二吡啶甲胺基丙酸乙月旨)(L1)和MnCl2按摩爾比1:2溶于乙醇溶液中，控制在8(TC;反應時間2小時，蒸去溶液獲得黃色錳配合物[1^MnCl2]。Yield:50%.分子式C17H21Cl2N302Mn。將配體(2-二吡啶甲胺基丙酸)(L2)和MnCl2按摩爾比1:2溶于甲醇溶液中，加入NaOH0.050克，控制在65°C;反應時間10小時，蒸甲醇獲得淡黃色錳配合物[L2MnCl2]。Yield:59%.C15H16ClN302Mn實施例3:將配體(2-二吡啶甲胺基丙酸乙月旨)(L1)和MnCl2按摩爾比1:l溶于水溶液中，控制在3(TC;反應時間8小時，蒸去溶液獲得黃色錳配合物[LiMnCl2]。Yield:45%.分子式C17H21Cl2N302Mn。將配體(2-二吡啶甲胺基丙酸)(L2)和MnCl2按摩爾比1:1溶于甲醇溶液中，加入NaOH0.40克，控制在20°C;反應時間3小時，蒸去甲醇獲得淡黃色錳配合物[L2MnCl]。Yield:42%.分子式C15H16ClN302Mn實施例4:抗腫瘤活性測定以實施例1得到的配合物為受試化合物篩選的細胞株有人肝癌細胞株(A549、Hepg2,Ecal09,Hela)(由江蘇大學藥學院提供)。測定采用溴化四氮唑藍(MTT)法。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性溴化四氮唑藍還原為難溶性的藍紫色結晶物(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的紫色結晶物，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值。操作步驟如下3.l.l接種取處于指數生長期，狀態良好的細胞一瓶，加入適量胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，用含12。/。小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培養液配成細胞懸液，計數，并將細胞密度調整稀釋至2.2*107ml.取細胞懸液接種于96孔板上，180ul/孔(含腫瘤細胞4000/孔)。3.1.2培養將培養板轉入恒溫C02培養箱中，在37'C，5%〔02及飽和濕度條件下培養24小時。3.1.3加藥受試化合物先用DMSO或超純水配制成O.1M濃度，再作4個稀釋度，濃度依次為10"M，10—5M,1(T6M，10'7M。加入受試化合物，20ul/孔，培養48小時。每組設3個平行孔，并重復3次。3.1.4染色3.1.4.1將MTT加入96孔板(貼壁細胞)中，20ul/孔，置于培養箱中孵育4小時，吸棄孔內上清液，加入DMSOIOOul/孔，置平板搖床上震蕩5分鐘。3.1.4.2將MTT加入96孔板中(懸浮細胞)，20ul/孔，置于培養箱中孵育4小時，再加入20%SDS50ul/孔，置于培養箱中過夜。3.1.5測定酶標儀設定波長為570nm，參考波長為630nm，測定96孔板每孔吸光值，記錄結果并計算細胞抑制率，以判斷受試藥物的抗腫瘤活性。3.3數據處理3.3.l細胞抑制率的計算抑制率=(對照組平均OD值-給藥組平均0D值)/對照組平均0D值X100%IC50的計算根據中國藥科大學新藥篩選中心提供的IC50軟件計算所得。MTT法測試結果示于表1。表1錳配合物對癌細胞抑制作用MTT實驗數據<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>錳配合物[L2MnCl]對四種癌細胞半數抑制率需要的化合物濃度IC50分別為小于10umol/L，錳配合物[L;MnCl2]四種癌細胞半數抑制率需要的化合物濃度為IC50為在12-21umol/L。而MnCl2在小于300umol/L對腫瘤細胞的生長沒有抑制作用。這說明本發明的錳配合物可作為抗癌藥用先導物。實施例5:錳配合物與線粒體作用實驗腫脹程度根據線粒體懸液在波長為540nm處的吸光值的變化進行測定。制備的肝臟線粒體按O.51.0mg蛋白.ml"重懸于線粒體緩沖液(125mmol-I/1sucrose,50謹ol.U1KC1,2mmol.L-1KH2PO4,5mmol'L—1succinateacid,5(jmol丄-1rotenone,10mmol.L—1Hepes,pH7.4)中，加入50nmol.L-1Ca2+(30°C)。檢測加入Ca2+后5min內吸光值的變化(AA)，AA值越大，表明線粒體腫脹度越高。在觀察化合物作用的實驗中，化合物先加入線粒體懸液中，孵育3min,加入Ca2+，每30S測一次吸光值。最后以時間為橫坐標，AA540nm為縱坐標作圖。實驗結果示于圖1:由圖1的結果可以看出對照組CsA組的吸光值下降較小(0.075)，說明線粒體懸液較穩定。50nmol.L—1C可以誘發線粒體明顯腫脹，AA,達0.32。50|amol-L—1配合物預處理可以明顯對抗50pmol丄—ta"誘發的線粒體腫脹、而100nmol丄—'配合物[i/MnCi]幾乎可以完全對抗Ca2+誘發的線粒體腫脹(AA54。與EGTA組接近)。實驗結果表明配合物以劑量依賴方式對抗Ca2+誘發的線粒體腫脹功能，表明我們合成的錳配合物[L2MnCl]與線粒體有直接的作用。配合物[I^MnCl2]作用與[LMnCl]同。實施例6:[L2MnCl]自噬實驗MDC染色法檢測錳配合物處理后Hela細胞中自噬空泡的形成步驟(1)將Hela細胞接種于24孔板中，細胞密度為1.2*104個/孔。(2)在37。C，5%002的恒溫孵箱中培養24小時后，移去培養基，設三組，A,control;B，40pmol/L錳配合物;C，3-MA預處理1小時后，加40|jmol/L錳配合物，繼續培養6小時。(3)移去培養基，每孔加300|jl的PBS，洗兩遍。(4)避光配置MDC染料，濃度為50|jmol/L。每孔加入IOOjjIMDC染料，37。C孵育15分鐘。(5)移去MDC染料，每孔加300ylPBS,放脫色搖床上洗5分鐘，洗兩遍。(6)加抗熒光淬滅劑，用共聚焦顯微鏡拍熒光照片。(X400)結果示于圖2。從圖2可以看出，40umol/L的錳配合物[iAinci]處理Hela細胞后，酸性泡狀細胞器生成增加，但此作用可被3-MA(自噬阻斷劑)所阻斷，Rapamycin(雷帕霉素)做陽性對照。由此說明可以誘導Hela細胞發生自噬。40umol/L的錳配合物[IMnCl]處理Hela細胞6小時，經MDC染色，細胞內的平均熒光強度明顯地比正常組細胞強，但是經過3-MA(自噬阻斷劑)預處理后，細胞內的平均熒光強度沒有明顯的變化。由此進一步說明錳配合物[I^MnCl]誘導Hela細胞發生自噬(圖3)。權利要求1、一種錳配合物，是一氯(2-二吡啶甲胺基丙酸)合錳，分子式C15H16ClN3O2Mn，其結構如式1，或者是二氯(2-二吡啶甲胺基丙酸乙酯)合錳，分子式C17H21Cl2N3O2Mn，其結構如式2式1式22、一種制備權利要求l所說的錳配合物的方法，其特征是，將配體2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂和MnCl2按摩爾比1:1溶于乙醇溶液中，控制在30-80'C反應時間2-8小時，去溶液獲得權利要求1中式1的錳配合物；或者是將配體(-二吡啶甲胺基丙酸和MnCl2按摩爾比1:l溶于乙醇溶液中，加入NaOH0.05-0.40克，控制在20-65'C反應時間3-10小時，蒸去甲醇獲得權利要求1中式2的錳配合物。3、權利要求1所說的錳配合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。4、根據權利要求3所說的應用，其特征在于，是在制備以線粒體為靶點抗腫瘤活性藥物中的應用。5、根據權利要求3所說的應用，其特征在于，是在制備耐藥性腫瘤治療的腫瘤細胞自噬劑中的應用。全文摘要本發明涉及一種具有抗腫瘤和具有自噬功能的小分子化合物及其制備和應用。所說的小分子化合物是錳配合物L¹MnCl₂和L²MnCl，其中L¹代表2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂；L²代表2-二吡啶甲胺基丙酸。是與配體L¹或L²和MnCl₂為主要原料化學合成得到。本發明提供的二吡啶甲基胺類配體的錳配合物，對腫瘤細胞A549，Hela、HepG-2，和Eca109生長均有強的抑制作用，能抑制鈣離子誘導的線粒體腫脹能以自噬的方式誘導腫瘤細胞凋亡；可作為新的以線粒體為靶點抗腫瘤活性藥物和用于耐藥性腫瘤治療的腫瘤細胞自噬劑。文檔編號C07D213/00GK101392007SQ20081023497公開日2009年3月25日申請日期2008年11月5日優先權日2008年11月5日發明者郭文潔,陳秋云,靜高,娟黃申請人:江蘇大學