黃酮與黃烷衍生物的制備方法及其用途的制作方法

專利名稱：黃酮與黃烷衍生物的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥用植物南酸棗所含黃酮與黃烷衍生物的制備方法， 以及這些化合物用于制備抗缺氧藥物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。
背景技術：
氧在人的生命活動中是不可或缺的，在體內組織和細胞的能量代謝 中氧分子發揮著重要作用。多種因素可導致人體組織和細胞的供氧不 足，如某些疾病或身處特殊低氧環境(如高原)等，而缺氧又反過來可 造成細胞、組織損傷乃至各種嚴重疾病，如嚴重的呼吸系統疾病以及并 發的心腦血管疾病、免疫機能低下等。嚴重缺氧往往還成為許多相關危 重病人死亡的直接原因。因此，抗缺氧劑的研究與開發受到關注。
南酸奉C7ioems/70rt力'as "jc"/a"'es (Roxb.) Burtt. et Hill.為漆樹科 南酸棗屬植物，其樹皮和果實入藥(江蘇新醫學院編，中藥大辭典， 上冊，上海，上海人民出版社，1977年，第397-398頁和第1564頁)， 干燥果實已作為中藥"廣棗"收入我國2005年版藥典(國家藥典委員 會，中華人民共和國藥典， 一部，北京，化學工業出版社，2005年， 第29-30頁)。南酸棗的化學成分有些已有報道，其粗提物、總黃酮 或某些單體化合物的抗菌、抑制血小板聚集、抗腫瘤等活性也有報道 (李長偉等；南酸棗的研究進展解放軍藥學學報，2008年第24巻第 3期，第231-234頁)。此外，南酸棗果實總黃酮的缺氧保護作用也曾 有文獻記載(李增晞等；廣棗總黃酮對動物耐缺氧和急性心肌缺血的保 護作用中草藥，1984年第15巻第6期，第25-27頁)，但并未闡明 其中抗缺氧活性成分。本發明涉及的從南酸棗中分離制備的黃酮及黃烷 類化合物的抗缺氧活性及其用途至今未見報道。

發明內容
本發明旨在提供具有抗缺氧活性的黃酮與黃烷衍生物的制備方 法，以及這些化合物作為抗缺氧劑的用途。
本發明人發現藥用植物南酸棗的含水醇浸骨、含水醇浸骨的乙酸 乙酯萃取物、正丁醇萃取物及柱層析組分等具有很好的抗缺氧活性， 并從中首次分離得到了具有抗缺氧活性的柚皮素-4，-0-(6"-0-沒食子酰 基-Z -D-葡萄吡喃糖)苷(式I化合物，以下又稱作化合物I)、槲皮素 -7-0-ZM)-葡萄吡喃糖苷(式II化合物，以下又稱作化合物II) 、 3'-0-沒食子酰基花青素B-3 (式III化合物，以下又稱作化合物III) 、 (+)-兒茶素(6，-8) (+)-兒茶素(式IV化合物，以下又稱作化合物IV)、 dihydrodicatechin A (式V化合物，以下又稱作4匕合物V ) 、 gambiriin A3 (式VI化合物，以下又稱作化合物VI) 、 gambiriin A！(式VII化 合物，以下又稱作化合物VII)等七個黃酮與黃烷衍生物，其中化合物 I為新化合物。本發明化合物I、 H、 III、 IV、 V、 VI、 VII可通過所含酚羥基等酸性基團與堿金屬或堿土金屬形成鹽，或銨鹽，也可以與鎂、鈣、鐵等多價金屬離子形成絡合物或螯合物。
因此，本發明的第一個方面涉及二氫黃酮類化合物I(式I化合物)或其藥學上可接受的鹽、絡合物或螯合物及其用于制備抗缺氧藥物、
抗缺氧保健品等功能性食品中的用途。
本發明的第二個方面涉及上述黃酮類化合物II (式II化合物)和黃烷衍生物類化合物HI (式III化合物)、IV (式IV化合物)、V(式V化合物)、VI (式VI化合物)、VII (式VII化合物)或其藥學上可接受的鹽、絡合物或螯合物用于制備抗缺氧藥物、抗缺氧保健品等功能性食品中的用途。
本發明的第三個方面涉及上述二氫黃酮類化合物I(式I化合物)、黃酮類化合物II (式II化合物)、黃烷衍生物類化合物III (式III
化合物)、IV (式IV化合物)、V (式V化合物)、VI (式VI化合物)和VII (式VII化合物)或其藥學上可接受的鹽、絡合物或螯合
物類的制備方法，所述方法包括用醇或含水醇對植物原料如南酸棗進
行提取，再經過分離純化得到目標化合物。
本發明進一步的方面涉及化合物I (式I化合物)。本發明更進一步的方面涉及抗缺氧藥物組合物，其包含一種或多
種上述化合物I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII,或其藥學上可接受的鹽、
絡合物或螯合物，以及一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。本發明的第五個方面涉及抗缺氧保健品等功能性食品，其含有上
述一種或多種化合物I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII,或其藥學上可接
受的鹽、絡合物或螯合物。
具體來說，上述化合物I、 II、 III、 IV、 V、 VI和VII的制備方法如下用含水醇浸泡提取藥用植物南酸棗材料，獲得含有上述化合物的粗浸骨，再用常規分離手段純化得到粗浸骨中的上述化合物。
所述含水醇是的含水乙醇，優選的是60% ~95% (v/v)的含水乙醇。所述的常規分離手段包括天然產物化學領域的專業人士所熟知的液-液萃取、柱層析、薄層層析、高效液相層析及重結晶等。
本發明采用大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞，用MTT法測試評價了上述化合物I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII的抗缺氧活性。經實驗證實，上述化合物對PC12細胞的缺氧損傷均具有很好保護作用。
因此，本發明的上述化合物I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII均可作為抗缺氧劑用于防治各種缺氧性疾病或改善和減輕低氧環境下與缺氧相關的各種不適癥狀。
本發明化合物可以單獨使用或組合使用，也可與藥學上可接受的各種載體、賦形劑或輔料配伍，制成抗缺氧藥物用于防治缺氧引起的各種病癥，或可以制成具有抗缺氧功能的保健品或食品添加劑，用于預防、改善或減輕缺氧條件下的各種癥狀。
本發明中的術語"藥學上可接受的鹽"是指藥用無機或有機鹽。
化合物i、 ii、 ni、 iv、 v、 vi、 vn中所含酚羥基等酸性基團可以使化合物與堿金屬或堿土金屬形成藥用鹽，也可以形成藥用銨鹽，優選但不限于銨(或胺)鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽。本發明中的術語
"藥學上可接受的絡合物或螯合物"是指藥用金屬絡合物或螯合物，優選但不限于鎂、鈣、鐵等金屬絡合物或螯合物。
本發明的化合物可以單獨或以藥物組合物的形式給藥。給藥途徑可以是口服、非腸道或局部給藥。藥物組合物可根據給藥途徑配成各種適宜的劑型。
本發明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內，腹膜內，鞘內，心室內，胸骨內和顱內注射或輸入，或借助一種外植儲器用藥。其中優選口服、腹膜內或靜脈內給藥方式。
當口服用藥時，本發明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠嚢、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤滑劑如硬脂酸鎂。膠囊制劑使用的稀釋劑 一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。任選地，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。
當皮膚局部施用時，本發明化合物可制成適當的軟骨、洗劑或霜劑制劑形式，其中將活性成分懸浮或溶解于一種或多種載體中。軟骨制劑可使用的載體包括但不限于礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蠟和水；洗劑或霜劑可使用的載體包括但不限于礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、吐溫60、十六烷酯蠟、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。
本發明化合物還可以無菌注射制劑形式用藥，包括無菌注射水或油懸浮液或無菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發油也可用作溶劑或懸浮介質，如單甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本發明化合物的使用劑量和使用方法取決于諸多
因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營養狀況、各
8種提取物或各種化合物的活性強度、服用時間、代謝速率、病癥的嚴重程度以及診治醫師的主觀判斷。
具體實施例方式
下列實施例將進一步說明本發明，但并不對本發明構成任何限制。
在以下實施例中，稱為化合物I的是二氫黃酮類化合物"柚皮素_4'-0-(6"-0-沒食子酰基-/ -0-葡萄吡喃糖)苷，即式I化合物"；稱為化合物II的是黃酮苷類化合物"槲皮素-7-0-yff-D-葡萄吡喃糖苷，即式II化合物，，；稱為化合物III的是沒食子酰基花青素類化合物"3'-0-沒食子酰基花青素B-3，即式III化合物"；稱為化合物IV的是花青素類化合物"(+)-兒茶素(6'-8)(+)-兒茶素，即式IV化合物";稱為化合物V的是二聚兒茶素類化合物"dihydrodieatechin A，即式V化合物"；稱為化合物VI的是一個查爾-兒茶素類化合物"gambiriin A3，即式VI化合物，，，稱為化合物VII的是另一個查爾-兒茶素類化合物"gambiriin An即式VII4匕合物"。
式II
9式V 式VI 式VII
實施例1.化合物I的分離制備
南酸棗C7^，/70w力."s flx/〃"Wes (Roxb.) Burtt. et Hill.的干燥樹 皮3.2 kg ( 1999年8月采自云南勐臘地區)粉碎后用市售醫用乙醇室 溫浸提，每次用95% (P7F)的含水乙醇25升浸泡7天，共提4次， 合并提取液，減壓濃縮干燥，得乙醇提取物750 g。該乙醇提取物750 g懸浮于3升水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各種溶劑每 次用3升，分別各萃取4次，合并相同萃取液，減壓濃縮干燥，得到 氯仿萃取物60g、乙酸乙酯萃取物310g、正丁醇萃取物300 g和水層 殘留物80 g。
取乙酸乙酯萃取物100 g，用適量曱醇溶解，加適量聚酰胺吸附、 干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床7.0cmx50cm)，用不同體積比的 乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，收集洗脫液并根據薄層檢測結果合并，減壓濃縮干燥，得到四個層析粗組分E-l(4g，乙酸乙酯洗脫部分)、E-2(35 g,乙酸乙酯-甲醇9:1洗脫部分)、E-3(25g，乙酸乙酯-甲醇l:l洗脫部 分)和E-4 (15g，曱醇洗脫部分)。
E-3(25g)用適量甲醇溶解，加入適量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰 胺柱(柱床3.8 c1nx50 cm)，用氯仿-甲醇(4:1)溶劑系統洗脫，收集洗 脫液并根據薄層檢測結果合并，減壓濃縮干燥，得三個組分E-3-l、 E-3-2 和E-3-3。將其中E-3-2(1.5g)用適量體積百分數卯％的乙醇水溶解后 進行S印hadex LH-20柱層析(柱床2.8 cmx27 cm),用相同體積百分數 90%的乙醇水洗脫得化合物I粗品，再經體積百分數30%的甲醇水溶液 中重結晶精制得化合物I純品(517 mg)。
化合物I為白色結晶型粉末(甲醇)，熔點為160-162。C。正離子 ES1-MS附々:587[M+H+， 609M+酬+， 625[M+K+,與其分子組成 €28112604相應分子量586—致。iH-NMR (400 MHz, MeOH-d4) 3: 7.29 (1H， d， /= 8.4 Hz， 2'，6'-H)， 7.10 (2H， s， 2""，6""-H)， 7.06 (1H， d， /= 8.4 Hz， 3',5'-H)， 5.90 (1H， d, /= 2.0 Hz， 6-H)， 5.88 (1H， d， /= 2.0 Hz， 8-H)， 5.31 (1H， dd, /= 2.8, 12.8 Hz， 2誦H)， 4.91 (1H， d， /= 7.6 Hz, l"-H)， 4.61 (1H， dd, /= 2.0， 12.0 Hz， 6"-Ha)， 4.38 (1H， dd， /= 8.4, 12.0 Hz， 6"國Hb )， 3.78 (1H， m, 5"-H)， 3.38 3.55 (3H, m， 2"-4"-H)， 3.07 (1H， dd， / = 12.8， 16.8 Hz， 3畫H國/mme)， 2.66 (1H， dd, /= 2.8， 16.8 Hz， 3-H-"s).13C-NMR (100 MHz, MeOH-d4) <5: 197.3 (C-4)， 167.9 (C-l"，)， 167.6 (C-7)， 164.9 (C-5)， 164.3 (C-8a)， 158.5 (C-4，)， 146.0 (C畫3""， 5"")， 139.4 (C國4"")， 133,5 (C國l，)， 128.4 (C國2，，6，)， 120.8 (C誦l，，，，)， 117.1 (C-3，，5')， 109.8 (C-2""，6"")， 102.9 (C-4a), 101.5 (C-l")， 96.6 (C國6)， 95.8 (C-8)， 77.5 (C-3"), 75.1 (C-5")， 74.3 (C-2")， 71.5 (C國4")， 64.4 (C-6")， 43.3 (C-3).
實施例2. 化合物II和III的分離制備
將實施例1中得到的南酸棗正丁醇萃取物300 g用適量甲醇溶解， 加適量大孔樹脂AB-8吸附、千燥，上大孔樹脂AB-8柱(水中柱床8.5cmx48 cm),用不同體積比的水-乙醇(100:0 — 0:100)梯度洗脫，根 據薄層檢測結果收集合并洗脫液，減壓濃縮干燥，依洗脫流出順序得兩 個水洗組分B-1 (20g) 、 B-2 (38g)和若干后續流出含水乙醇洗脫組 分B-3 (共計230 g，水-乙醇90:10 —0:100洗脫部分)。
組分B-2 (38 g)用適量甲醇溶解，加適量聚酰胺吸附、干燥，上 聚酰胺柱(水中柱床7.5cmxl8.5cm)，用不同體積比的水-丙酮梯度洗 脫，根據薄層檢測結果合并所收集的洗脫液，減壓濃縮，得八個組分 B-2-l ( 10 g，水洗脫部分)、B-2-2 ( 2 g，水洗脫部分)、B-2-3 (1.5 g,水 -丙酮9:1洗脫部分)、B-2-4 (1.7g，水-丙酮9:1洗脫部分)、B-2-5 (2 g,水-丙酮9:1洗脫部分)、B-2-6 (5g，水-丙酮7:3洗脫部分)、B-2-7 (5g，水-丙酮5:5洗脫部分)和B-2-8 (5g,丙酮洗脫部分)。B-2-2 (2 g)用適量水溶解，上SephadexLH-20層析柱(柱床2.8cmx27cm)，用 水-甲醇溶劑系統梯度洗脫，得到3個組分B-2-2-l (350 mg，水-曱醇7:3 洗脫部分)、B-2-2-2 (1.4 g，水-甲醇4:6曱醇洗脫部分)和B-2畫2-3 (200 mg，甲醇洗脫部分)。B-2-2-3 (200 mg)再次經S印hadex LH-20柱層析， 用水-甲醇2:8洗脫，收集含化合物II的洗脫部分，減壓濃縮并從甲醇 中重結晶精制，化合物Il(26mg)。
化合物II為黃色結晶型粉末(甲醇)，熔點為173-175°C。 ESI-MS 附々465 [M+Hj+， 463 [M-Hr，與其分子組成<:211120012相應分子量464 一致；1H-NMR (400 MHz, MeOH-d4) & 7.65 (1H， br s， 2，羅H)， 7.56 (1H, d, / = 8.2 Hz， 6，-H)， 6.78 (1H， d， J = 8.2 Hz， 5，-H)， 6.35 (1H， d， / = 2.0 Hz， 6國H)， 6.62 (1H, d， / = 2.0 Hz， 8-H)， 4.95 (1H， (!， /= 7.2 Hz， l"-H)， 3.84 (1H， dd, /= 12.2， 1.6 Hz, 6"-Ha)， 3.63 (1H， dd， /= 12.2， 5.6 Hz， 6"畫Hb), 3.30-3.50 (4H, m， 2"-H 5"-H). 13C-NMR (100M Hz， MeOH國^) & 177.4 (C畫4)， 164.4 (C國7)， 162.1 (C-5)， 157.6 (C-8a)， 148.9 (C誦2), 148.7 (C-3，)， 146.2 (C國4'), 137.9 (C畫3)， 123.9 (C國l'), 121.8 (C-6'), 116.2 (C-2，)， 116.1 (C畫5')， 102.3 (C國4a), 101.6 (C-l")， 100.1 (C-6)， 95.5 (C-8)， 78.3 (C-3")， 77.8 (C-5")， 74.7 (C國2")， ， 71.2 (C-4"), 62.4 (C國6")。
組分B-3 (230 g)用曱醇溶解后分批多次加入適量聚酰胺中吸附、干燥，進行聚酰胺柱層析(柱床7.0cmx50cm)，用乙醇-丙酮系統洗脫， 主要分為乙醇洗脫部分(大部分物質)和丙酮洗脫部分(少量)，其丙酮 洗脫部分繼續反復進行S印hadex LH-20柱層析，用水-乙醇4:6溶液洗 脫，得到化合物III(84mg)。
化合物III為椋色無定形粉末。正離子ESI-MS附々731[M+H+， 753[M+Naj+, 769[M+K廣，與其分子組成(:37113。016相應分子量730 —致. JH-NMR (400 MHz， MeOH-^) & 6.92 (2H， s， 2"，6"-H)， 6.61 6.86 (6H， m, 2'(u)，5'(u)， 6'(u)， 2'(t)， 5'(t)， 6'(t)-H)， 6.01 (1H， br s， 8(u)-H)， 5.84 (2H， br s， 6(u)， 6(t)-H)， 5.38 (1H， br s， 3(t)-H)， 5.29 (1H, br s， 2(t)-H)， 4.54 (1H， br s, 2(u)國H)， 3.98 (2H, br s， 3(u)， 4(u)-H)， 2.89 (1H， br s， 4(t)-Ha)， 2.52 (1H, br s， 4(t)畫Hb). 13C-NMR (100 MHz, MeOHO 3: 167.0 (C-l'), 155 157 (C畫5(u)，7(u)， 8a(u)， 5(t)， 7(t)， 8a(t))， 146.1 (C-3'(t), 4'(t))， 145.7 (C-4，(u)), 145.5 (C-3，(u))， 145.5 (C畫3，，，5")， 139.7 (C-4")， 131.8 (C-l'(u)，l'(t))， 121.3 (C-r')， 120.5 (C-6'(t))， 119.3 (C-6'(u))， 115.9 (C-5'(u))， 115.8 (C-2'(u)， 2'(t))， 114.9 (C國5，(t))， 110.1 (C-8(t)，2"，6"), 102.5 (C畫4a(t))， 101.2 (C-4a(u))， 96.8 (C-6(t))， 96.0 (C-6(u))， 95.8 (C-8(u))， 82.6 (C-2(u)), 75.9 (C畫2(t))， 74.8 (C畫3(u))， 68.5 (C-3(t))， 34.6 (C畫4(u))， 30.3 (C-4(t)).
實施例3. 化合物IV和V的分離制備
將實施例1中經體積百分數95。/。乙醇提取后的藥渣進一步用體積 百分數60%的乙醇水室溫浸提，每次用含水乙醇25升浸泡7天，共 提3次，合并提取液，減壓濃縮干燥，得含水乙醇提取浸青90g。
取該含水乙醇提取浸骨80 g，用適量甲醇溶解，加聚酰胺150g吸 附、干燥，上聚酰胺柱(水中裝填250克聚酰胺，柱床8.5cmx22cm)， 用水-乙醇-丙酮系統洗脫，根據薄層檢測結果收集合并洗脫液，減壓濃 縮干燥，得到五個組分WE-1 (10g，水洗脫部分)、WE-2 (17 g，水 洗脫部分)、WE-3 (2g，水-乙醇體積比75:25溶劑洗脫部分)、WE-4 (15g，乙醇洗脫部分)和WE-5 (20g，丙酮洗脫部分)。
13WE-4 (15g)用適量曱醇溶解，加適量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰 胺柱(柱床4.5 cmx50 cm),用不同體積比的乙酸乙酯-曱醇溶劑梯度 洗脫，根據薄層檢測結果收集合并洗脫液，減壓濃縮干燥，得到七個組 分WE-4-l (2.2 g，乙酸乙酯洗脫部分)、WE-4-2 (300 mg,乙酸乙 酉旨-甲醇20:l洗脫部分)、WE-4-3 (520 mg，乙酸乙酯-甲醇20:1洗脫 部分)、WE-4-4 (1.5g，乙酸乙酯-曱醇20:l洗脫部分)、WE-4-5 (2.8 g，乙酸乙酯-甲醇15:1洗脫部分)、WE-4-6( 0.7 g,乙酸乙酯-曱醇15:l 洗脫部分)、WE-4-7 (4.5g，甲醇洗脫部分)。
WE-4-6 (0.7 g)用適量氯仿-甲醇(體積比1:1)溶液溶解上 Sephadex LH-20層析柱，用氯仿-甲醇(1:1)溶劑系統洗脫，主要洗脫 流份經反復聚酰胺、Sephadex LH-20柱層析得到化合物IV (105 mg)。 WE-4-7 (4.5 g)進行聚酰胺柱層析(柱床2.8 cmx30 cm)，用乙酸乙酯-甲醇(3:1)溶劑系統洗脫，#^據薄層層析結果合并流分得到4個組分 WE誦4-7國1 (1.2 g)、 WE國4-7-2 (1.4 g)、 WE-4-7-3 (1.1 g)、 WE畫4-7畫4 (0.5 g)， 其中WE-4-7-4經反復聚酰胺、Sephadex LH-20柱層析得到化合物V (37 mg)。
化合物IV為棕色無定型粉末。ESI-MS m々579[M+H+， 596 [M+NH4+， 577 [M-Hr，與其分子組成<:3。1126012相應分子量578 —致. 'H國醒R (400 MHz， MeOH-A) & 6,71 (1H， d， /= 2.0 Hz， 2'(t)-H)， 6.70 (1H， d， /= 8.0 Hz， 5'(t)畫H)， 6.82 (1H， s， 2'(u)畫H)， 6.64 (1H, s， 5'(u)畫H)， 6.59 (1H， dd， /=2.0，8.0 Hz, 6'(t)-H )， 6.08 (1H， s， 6(t)-H), 5.90(1H， d， / = 2.0 Hz， 8(u)-H)， 5.82(1H， d， /= 2.0 Hz， 6(u)國H)， 4.78 (1H， d， /= 6.0 Hz, 2(u)國H)， 4.73 (1H， d， /= 6.0 Hz， 2(t)-H)， 4.01(1H， m， 3(u)-H)， 3.97 (1H， m, 3(t)-H )， 2.73 (1H, dd, J= 5.2,16.0 Hz， 4(t)-Ha)， 2.66 (1H， dd， /= 4.8，16.0 Hz， 4(u)畫Ha)， 2.60 (1H, dd， / = 5.8,16.0 Hz， 4(t)畫Hb)， 2.42 (1H， dd， / = 5.8,16.0 Hz, 4(u)-Hb). 13C-NMR (400 MHz, MeOH國^) & 157.3 (C-7(u)， 8a(u))， 156.7 (C-5(u)), 156.4 (C誦8a(t))， 154.6 (C-5(t))， 153.0 (C-7(t))， 145.6 (C-3'(t), 4'(t))， 145.5 (C-3'(u), 4'(u))， 132.2 (C-l，(t))， 131.6 (C-l'(u))， 126.2 (C匪6'(u))， 119.6 (C畫5'(u))， 119.1 (C國6'(t))， 115.7 (C國5'(t))， 114.3(C-2'(t))， 114.0 (C-2，(u))， 108.0 (C-8(t) or 6(t))， 100.5 (C畫4a(t))， 100.1 (C-4a(u))， 96.1 (C-8(u) or 6(u))， 95.7 (C-6(t) or 8(t)), 95.2 (C-6(u) or 8(u))， 81.7 (C-2(t))， 79.9 (C-2(u))， 68.1 (C-3(t))， 67.6 (C-3(u))， 27.0 (C畫4(t))， 26.3 (C-4(u)).
化合物V黃色結晶型粉末(曱醇)，熔點為196-198°C。 ESI-MS w々: 577[M+Hf, 599M+Na+， 575[M-H]',與其分子組成<:3()1124012相應分子 量576 —致.'H-NMR (400 MHz， MeOH-^) <5: 6.84 (1H， d， /= 2.2 Hz， 2' (t)-H), 6.78 (1H， d， / = 8.0 Hz， 5' (t)-H)， 6.73 (1H， dd， / =2.2,8.0 Hz， 6'(t)-H)， 6.41 (1H, s， 5'(u)誦H)， 6.11 (1H， s， 6(t)-H)， 5.89 (1H， d， /= 2.6 Hz， 8(u)畫H)， 5.52 (1H， d， J = 2.6 Hz， 6(u)-H)， 4.90 (1H， d，被 K峰掩蓋，2 (t)-H)， 4.10 (1H， m, 3(t)-H )， 3.96 (2H， m， 2(u)， 3(u)-H)， 2.92 (1H， dd， / = 5.8,14.4 Hz， 4(u)-Ha), 2.85 (1H， dd， J = 5.2,16.4 Hz， 4(t)-Ha )， 2.67 (1H， d， ■/= 11.6 Hz， 2'(u)-Ha), 2.52 (1H， dd， /= 9.0,14.4 Hz， 4(u)-Hb)， 2.48 (1H， d， J = 11.6 Hz， 2'(u)-Hb ) 13C-NMR (400 MHz, MeOH-^) & 192.8 (C-4'(u))， 166.7 (C-7(t))， 164.9 (C鄰))，162.8 (C國6'(u))， 156.7 (C-8a(u))， 156.4 (C國7(u))， 153.8 (C-8a(t))， 155.0 (C-5(u))， 145.2 (C畫4，(t))， 145.0 (C-3'(t))， 129.9 (C-l'(t))， 118.4 (C畫6'(t))， 115.0 (C畫5'(t))， 113.5 (C-2'(t))， 川.5 (C-5'(u))， 104.3 (C-8(t))， 102.6 (C-4a(t))， 99.1 (C畫4a(u))， 95.7 (C-8(u))， 94.4 (C-6(u))， 94.0 (C-3'(u))， 89.6 (C-6(t))， 88.5 (C-l'(u))， 82.1 (C-2(t))， 78.1 (C-2(u))， 66.5 (C-3(t))， 65.5 (C-3(u))， 44.3 (C-2，(u))， 27.0 (C-4(u))， 26.5 (C國4(t))。
實施例4.化合物VI和VII的分離制備
將實施例1中得到的聚酰胺柱層析粗組分E-4(15g)用適量甲醇溶 解，加入約2倍量聚酰胺吸附、千燥，進行聚酰胺柱層析(柱床3.8cmx50 cm)，用不同體積比的氯仿-曱醇溶劑系統梯度洗脫，收集洗脫液并根 據薄層檢測結果合并，減壓濃縮干燥，得到2個組分E-4-l(2.0g，氟仿 一甲醇體積比l:l洗脫部分)和E-4-2(12g，甲醇洗脫部分)。E-4-2(12g) 用適量體積百分數90%的甲醇水溶解進行Sephadex LH-20凝膠柱層析，用相同體積百分數90%的甲醇水洗脫，收集洗脫液并根據薄層檢測 結果合并，減壓濃縮干燥，得到3個組分E隱4-2畫l (7.2g)、 E-4畫2-2 (2.3 g)和E-4-2-3 (2.5g)。取E-4-2-3 (2.5 g)，經反復的Sephadex LH-20和 聚酰胺柱層析分離，根據薄層層析檢測結果分別收集化合物VI和VII 粗品，再分別從曱醇中重結晶精制，得純品化合物VI (102 mg)和VII ("3 mg)。
化合物VI為淡棕色結晶型粉末(曱醇)，熔點為172 - 174°C。 ESl誦MS附々:58M+H]+， 603[M+Na]+， 579[M-H1-,與其分子組成 C;(,H28O,2相應分子量580—致；!H畫醒R (400 MHz, MeOH乂) 3: 6.87 (1H， d， /= 1.2 Hz, 2'(t)-H)， 6.78 (1H， d， /= 8.4 Hz， 5'(u)-H)， 6.75 (2H, dd， J= 1.6， 6.8 Hz， 6，(u)， 6，(t)畫H)， 6.67 (1H， d， /= 2.0 Hz， 2，(u)曙H)， 6.65 (1H, d， /= 8.0 Hz， 5'(t)畫H)， 6.02 (1H， s， 8(t)-H)， 5.90 (2H， s， 3(u)， 5(u)-H)， 4.83 (1H， d, /= 3.2 Hz， a畫H), 4.62 (1H， d, /= 7.6 Hz， 2(t)-H)， 4.58 (1H, br s， P國H)， 4.03 (1H， m， 3(t)誦H)， 2.90 (1H， dd， / = 4.8， 16.4 Hz， 4(t)-Ha)， 2.90 (1H， dd， /= 4.8， 14.8 Hz， y-Ha)， 2.62 (1H， dd， /= 8.4， 16.4 Hz， 4(t)誦Hb)， 2.50 (1H, dd， /= 10.0， 14.8 Hz， "Hb). 13C-NMR (400 MHz, MeOH-</4) A 158.2 (C-2(u), 6(u)), 158.0 (C-4(u))， 156.8 (C曙7(t))， 156.2 (C鄰))，155.4 (C-8a(t))， 146.5 (C畫4'(u)， 4'(t))， 146.0 (C-3，(t))， 144.3 (C畫3'(u))， 135.5 (C-l'(u))， 132.6 (C-l'(t))， 120.8 (C-6'(u))， 120.4 (C-6'(t))， 117.0 (C畫2'(u))， 116.4 (C-5，(t))， 116.2 (C誦5，(u))， 115.6 (C-2，(t))， 108.5 (C-6(t))， 106.6 (C-l(u))， 102.1 (C-4a(t))， 96.2 (C-3(u)，5(u))， 95.6 (C-8(t))， 83.0 (C畫2(t))， 78.1 (C-yff)， 69.4 (C誦3(t))， 46.6 (C-a)， 30.6 (C國4(t))， 29.5 (C國力.
化合物VII為淡棕色結晶型粉末(甲醇)，熔點為167-169°C。 ESI-MS柳々581[M+Hl+, 603[M+Na廣，579[M-H卩，與其分子組成 <^(^28012相應分子量580 —致；ifl-NMR (400 MHz, MeOH-</4) & 6.78 (1H， d, /= 1.6 Hz， 2'(t)畫H )， 6.75 (1H， br s， 2'(u)-H), 6.68 (1H， d， /= 8.0 Hz， 5'(t)-H)， 6.63 (3H, br s， 5'(u),6，(u),6'(t)國H)， 6.04 (1H， s, 6(t)-H), 5.84 (2H， s， 3(u)， 5(u)-H)， 4.70 (1H， br s， 《， 2(t)-H)， 4.59 (1H， br s， / -H)， 3.93 (1H， m, 3(t)-H)， 2.90 (2H， m， y， 4(t)畫H)， 2.56 (1H， m， 4(t)畫H)， 2.49 (1H， m，
16y-H). 'H-NMR (400 MHz, MeOH-^) <5: 158.5 (C-2(u)， 6(u))， 158.0 (C-4(u))， 156.3 (C-7(t))， 156.2 (C鄰))，155.5 (C誦8a(t))， 146.5 (C-3'(t))， 146.4 (C國4'(t))， 146.0 (C-3'(u))， 144.5 (C-4'(u))， 136.2 (C畫l'(u))， 132.8 (C-r(t))， 121.4 (C畫6'(u))， 120.8 (C-6'(t))， 117.4 (C-2'(u))， 116.5 (C-5'(t))， 116.3 (C-5'(u)), 115.6 (C-2,(t))， 107.9 (C畫8(t)), 106.6 (C-l(u))， 101.4 (C-4a(t))， 97.9 (C誦6(t)), 96.4 (C-3(u)， 5(u)), 83.2 (C-2(t))， 77.6 (C-灼，69.3 (C-3(t)), 46.9 (C-a)， 30.8 (C國力，29.6 (C-4(t))。
實施例5. 抗缺氧活性測試
細胞系與細胞培養活性測試釆用大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞株， 細胞用含10%新生小牛血清和青霉素、鏈霉素各100//g/mL的DMEM 培養基，于37°C通入5%C02和95%空氣的培養箱中常規培養和繼代 維護。
被測樣品與樣品溶液配制實施例1 實施例4中化合物I、 II、 III、 IV、 V、 VI和VII。精密稱量被測樣品適量，用含10%新生小牛血清 和青霉素與鏈霉素各100 〃g/mL的DMEM培養基溶解，配制成50 "g/mL、 100//g/mL和200 〃g/mL的才羊品溶液，供測活性。
活性測試方法取對數生長期的PC12細胞，用含10%新生小牛 血清和青霉素、鏈霉素各100//g/mL的新鮮DMEM培養基配成細胞 密度為每毫升lxi()S個的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔150戸L， 于37。C通入5% C02和95%空氣的培養箱中培養18 ~ 24 h，吸引棄去 培養液，分成正常對照組、缺氧對照組和缺氧給藥組，各組每個樣品 均設三孔。正常對照組和缺氧對照組每孔加含10%新生小牛血清、青 霉素和鏈霉素各100//g/mL的新鮮DMEM培養基各150;/L,缺氧給 藥組每孔加樣品溶液各150vL。對照組和給藥組于培養箱中培養1 h， 缺氧對照組和缺氧給藥組以31.25 ^/M CoCl2處理2 h造成對細胞的缺氧 損傷，然后于培養箱中正常培養24h。培養結束后，每孔加入5mg/mL 的MTT溶液(用0.01 M的PBS液配制)各15 ^L,混勻，37。C孵育 4 h,翻板法棄去孔內培養液，每孔加DMSO各150 //L,振蕩10 min使MTT紫色產物充分溶解，用酶標儀測量每孔于4卯nm處的OD值。 數據以正常對照組為100%，取各組OD平均值按下式計算缺氧對照組 和缺氧給藥組的細胞存活率細胞存活率(％)=缺氧對照組或缺氧給 藥組OD平均值/正常對照組OD平均值x1000/()。取8次獨立實驗數據， 計算相應細胞存活率(％)，并用StudenW檢驗法，統計檢驗缺氧對照 組和缺氧給藥組兩組間細胞存活率的顯著性差異。
實驗結果詳見表1。表1所示測試結果表明，本發明化合物I~VII 在所試濃度范圍內對PC12細胞的缺氧損傷具有顯著保護作用。
表1 .化合物I-VII對PC12細胞缺氧損傷的保護作用
細胞存活率％ (平均值士SD， n=8)
化合物缺氧對照組50 (ag/ml)100 (ag/ml)200 (/ig/ml)
I90.0±6.1131.4±15.3*172.6±14.6*180.6±22.3*
II82.8±5.3108.1± 6.5*115.8± 6，132.3±17.5*
III82.8±5.3144.0±14.0*144.6±15.9*127.3±16.『
IV90.0±6.1120.8± 9.8*132.5±11.9*138.2±10.5*
V90.0±6.1122.7± 7.1*132.5±11.8*112.8± 6.7*
VI85.9±4.0174.0± 8.7*201.7士16.()a215.5±10.4*
VII85.9±4.0155.6±14.4*175.9±12.3*181.8±12.6*
*星號表明與相應缺氧對照組相比有顯著性差異，P<0.01
結論
本發明的化合物i、 n、 in、 iv、 v、 vi、 vii對pci2細胞的缺
氧損傷具有顯著的保護作用。因此，本發明的上述化合物可作為抗缺 氧活性成分用于制備抗缺氧藥物以及抗缺氧保健品等功能性食品。
權利要求
1.式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII化合物，或其藥學上可接受的鹽、絡合物或螯合物用于制備抗缺氧藥物以及抗缺氧保健品等功能性食品的用途，式I式II式III 式IV式V 式VI 式VII。
2.式I化合物或其藥學上可接受的鹽、絡合物或螯合物:
3. 藥物組合物，其包含權利要求2所述的式I化合物，或其藥學 上可接受的鹽、絡合物或螯合物，以及一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。
4. 保健食品，其包含權利要求2所述的式I化合物，或其藥學上 可接受的鹽、絡合物或螯合物。
5. 斥又利要求1所述式1 式VII化合物的制備方法，該方法包括以 南酸棗為原料，經含水醇浸泡提取，獲得含有上述化合物的粗浸骨， 再用常規分離手段，分離純化得到粗浸骨中的上述化合物。
6. 權利要求5所述的制備方法，其中所述含水醇是60%~95% (v/v) 的含水乙醇。
7. 權利要求5所述的制備方法，所述常規分離手段包括液-液萃 取、柱層析、薄層層析、高效液相層析及重結晶等。
全文摘要
本發明涉及藥用植物南酸棗所含黃酮與黃烷衍生物，其制備方法，以及這些化合物用于制備抗缺氧藥物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。
文檔編號C07H15/00GK101683353SQ20081021176
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月24日 優先權日2008年9月24日
發明者崔承彬, 李明明, 李長偉, 明 范, 兵 蔡, 冰 韓 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所