一種新的植物強耐鹽基因nhxfs1及其編碼蛋白和應用的制作方法

專利名稱：一種新的植物強耐鹽基因nhxfs1及其編碼蛋白和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及到植物基因工程領域，具體的說是利用DNA家族改組技術獲得功 能顯著提高的植物Na7H+逆向轉運蛋白的基因，本發明還涉及到利用此基因培育 轉基因耐鹽植物。
背景技術：
土壤鹽漬化是影響農作物生產和生態環境的一個重要的非生物脅迫因素。目 前，世界上大約有20%的耕地和接近50%的灌溉用地受到鹽漬的嚴重危害 (Flowler T J ， Yeo A R. Breeding for salinity resistance in crop plants. Where next Aust. J.尸J朋t尸力，'o丄1995, 22:875 884)。我國大約有5億畝 鹽堿地，并且其面積有不斷增加的趨勢。培育抗鹽植物是促進鹽堿地開發利用、 改良土壤和生態治理的有效途徑。因此，利用現代生物學技術，通過對植物耐鹽 生理和分子生物學的深入研究，克隆和改造植物重要的耐鹽基因，進而將這些基 因轉化到植物中以培育轉基因耐鹽植物新品種，對于農業生產、環境保護和生態 治理等都具有重要的意義。
高濃度的鹽分對植物造成嚴重的傷害，主要表現在滲透脅迫和離子毒害兩方 面(Blumwald E， Aharon G S， Apse M P. Sodium transport in plant cells. A'oc力e歷"J'c^/ y Jcte. 2000， 1465: 140 151)。 一方面，土壤中高濃度的鹽 分使土壤水勢低于植物細胞的水勢從而引起植物細胞水分虧缺即滲透脅迫；另一 方面，過量滲入植物細胞的各種鹽離子又會對細胞造成離子毒害，主要是Na+毒 害。遭受滲透脅迫和離子毒害的植物細胞的質膜的通透性增加，導致過氧化脅迫、 營養虧缺及一系列生理代謝反應的紊亂等次生傷害作用，從而對植物正常的生長 發育造成嚴重危害。
自然界中植物為了適應高濃度的鹽，形成了一系列的防御機制(BohnertH丄Nelson D E ， Jensen R G. Adaptation to environmental stress. /7朋t Ce7丄1995，7 :1099 11U)，主要包括滲透調節和重建細胞的離子均衡兩種策 略。前者指植物細胞利用一些無機離子或者合成一些小分子有機化合物作為滲透 調節劑，以降低細胞水勢，抵御滲透脅迫。后者主要指植物細胞通過將細胞質中 過量的Na+轉運出細胞或者區隔化到液泡中，實現離子均衡、消除Na+毒害的目的。 植物細胞的一個顯著特征就是擁有體積很大的膜隔離的液泡，鹽脅迫條件下，植 物細胞保持細胞質低濃度Na+的最直接方式就是將Na+隔離到液泡中。這樣既可以 使胞質酶免受離子毒害，又能提高細胞整體的滲透壓起到促進細胞吸水的作用， 是自然界中耐鹽植物主要的耐鹽機制(Flower T J ， Troke P F ， Yeo A R. The mechanisms of salt tolerance in halophytes. j/zw/ Tl/朋t 腳w'。〗.1977 ，28 :89 121.)。
植物Na7H+逆向轉運蛋白是一種Na+的逆向轉運體，在植物質膜和液泡膜上都 有分布，其中液泡膜Na7H+逆向轉運蛋白是負責將Na+區隔化到液泡的主要蛋白。 植物Na7H+轉運蛋白最先在大麥質膜上發現，之后在多種植物質膜和液泡膜上普 遍檢測到Na+AT轉運的活性。自世界上首個植物Na7H+逆向轉運蛋白基因力^^n 被克隆后(Gaxiola R A， Rao R， Sherman A， Grisafi P， Alper S， and Fink G R. The力i^j'abjO i51 t力sh's朋proton transporters , AtNhxl and Avpl , can function in cation detoxify cation in yeast . 尸roc yVaz^Z Jcsd 5"cj' 1999,96 :1480 1485)，水稻、北濱黎、堿蓬等高等植物的液泡膜Na7H+逆向轉 運蛋白基因相繼得到克隆，分別為flaWil ( Fukuda A , Nakamura A , Tanaka Y. Molecular cloning and expression of the Na+/H+ exchanger gene in Or"s ■satira. ^'oc力i/z 5j'op力ys A ta 1999, 1446 :149 155) 、 Z^WZL (Hamada A， Shono M， Xia T, 0hta M， Hayashi Y， Tanaka A, Hayakawa T. Isolation and characterization of a Na+/H+ antiporter gene from the halophyte JtrfjO/ex ^z eh'/^'.尸J朋tyl/Wec"〗ar^z.oJogy. 2001，46:35 42) 、 (MaXL， Zhang
Q， Shi H Z， Zhu J" K, Zhao Y X， Ma C Zhang H. Molecular cloning and different expression of a vacuolar Na+/H+ antiporter gene in 5"〃aeofe sa/ss under salt stress .倫J柳W /^朋tar"瓜2004， 48(2) :219—225)等。在 液泡膜質子泵提供的能量下，位于液泡膜的Na7H+逆向轉運蛋白將Na+區隔化進入液泡中從而降低細胞質中Na+的濃度，使過多的Na+離開代謝位點，減輕其對酶和 膜系統的傷害，還可降低細胞水勢，抵抗鹽分造成的滲透脅迫。所以，Na7H+逆 向轉運蛋白對植物的抗鹽性起著重要的作用。
將Na7H+逆向轉運蛋白(Na7H+antiporter)基因轉化到目標植物中進行過 量表達是培育轉基因耐鹽植物的有效方式。Apse等對轉^M好i7基因的擬南芥植 株進行了分析，過量表達Na7H+逆向轉運蛋白的轉基因擬南芥植株在200mmo1/ L NaCl中能正常生長發育。免疫印跡表明，在轉化植株葉片提純液泡中含有比 從野生型葉片提純液泡中更多的j^Wi7產物，液泡上Na7H+逆向轉運蛋白活力 顯著增強(Apse M P ， Aharon G S , Snedden W A ， Bl麗ard E. Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiporter in ylra^'c/opsis . 5We"ce. 1999,285 :1256 1258)。同樣，將擬南芥^z^Wi7基因轉入西紅柿 中，轉基因西紅柿在200 mmol/L NaCl脅迫下能夠正常生長、開花和結實。盡管 葉片中Na+濃度高，但西紅柿果實中Na+濃度很低(Zhang H X， Blumward E. Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit . 7fez^re 5i"ec力/7o7c^y . 2001, 19 : 765 768)。這些研究都表明 了 Na7H+逆向轉運蛋白基因及其蛋白在植物對于高鹽反應中的重要性，被認為 是目前最有希望利用其特性培養轉基因耐鹽品種的基因。
然而，在實際生產應用上，目前在植物中已克隆的Na7H+逆向轉運蛋白基 因仍然存在著活性不高、耐鹽性不強的問題，很大程度上限制了該基因的生產應 用和推廣。如何利用特定的現代生物學技術，克隆新的強耐鹽基因或對該基因進 行分子進化和改造，進而將這些新基因轉化到植物中以培育轉基因耐鹽植物新品 種，對于農業生產、環境保護和生態治理等都具有重要的意義。
DNA改組(DNA Shuffling)技術是目前蛋白質、酶和單克隆抗體等體外定向 進化的快速高效方法,在提高酶活性、蛋白質產量和改善蛋白質(酶)的性能等方 面具有廣泛的應用前景。其原理是將一組緊密相關的核酸序列隨機片段化，然后
利用無引物PCR將這些隨機片段進行重新組裝而得到全長的核酸序列，在這個過 程中引入突變并對不同的突變進行廣泛的重組，從而完成對目的核酸序列的迅速 進化，以提高核酸序列或其編碼的蛋白的功能(Stemmer W P. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecularevolution, ,roc yVa〃 A:at/5bi 1994, 91:10747-10751) 。 DNA改組可分
為單基因的改組和基因家族的改組，前者僅僅對單個基因進行隨即片段化，利用 無引物PCR進行重新組裝，而家族改組可對親緣關系相近或者差距很大的基因家 族進行改組。
DNA改組技術自誕生以來，已成功地對多種基因如工業用酶、抗體及一些重 要的蛋白等進行了定向進化，使酶的活性、底物特異性及抗體的特異性、蛋白功 能、熱穩定性等得到了顯著的提高(Crameri A， RaillardS， Bermudez E, Stemmer W P. DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution . #atore. 1998， 391:288 )。如Stemmer等應用該技術取得 了一系列研究成果，獲得了酶活提高了 32000倍的e-內酰胺酶(Stemmer WP. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.泡i""re. 1994， 370: 389 391)、熒光強度超過野生型45倍的綠色熒光蛋白(Crameri A， WhitehornE A， Tate E， Stemmer W P. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. 7fet歷'"ec力"o丄1996， 14: 315 319)。通 過DNA改組方法,Crameri等成功得到了砷酸鹽抗性提高40倍的菌株(Crameri A, Dawes G， Rodriguez E J， Silver S, Stemmer W P. Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling. ;Vat ^/otec/wo/. 1997， 15: 436 438)。但是，應用該技術在改進Na+/H+逆向轉運蛋白基因及其蛋白 質的性能方面，國內外均未見報導。

發明內容
本發明目的在于獲得一種新的植物強耐鹽基因7W 57,此基因能編碼具有
離子轉運活性的Na7H+逆向轉運蛋白。
本發明的另一個目的在于提供上述基因編碼的Na7H+逆向轉運蛋白NHXFSl，
其離子轉運活性比野生型的Na7H+逆向轉運蛋白更強。 本發明還提供了含有上述基因的重組載體。 本發明的另一方面，還提供了含有上述重組質粒的宿主細胞。 本發明的另一方面，還提供了重組載體的構建、轉基因植物等方法，以應用
上述基因和編碼蛋白培育耐鹽性更強的轉基因植物新品種。Na7H+逆向轉運蛋白(NaVH+antiporter)在植物耐鹽中起重要作用，其活 性大小影響著植物的耐鹽性。本發明通過DNA家族改組技術，對編碼Na7H+逆向 轉運蛋白的野生型耐鹽基因^M好i7、必)Wi7、 ZteA^7進行體外分子進化，以獲 得編碼離子轉運活性更高的Na7H+逆向轉運蛋白新基因7Wi^S7。這種新基因所 編碼的Na7H+逆向轉運蛋白NHXFS1能將更多的Na+從細胞質中區隔化到液泡中， 將得到的新基因轉化到目標植物中，能夠培育出耐鹽能力更強的轉基因植物新品 種。
具體來說，通過體外DNA改組技術對野生型的NaVH+逆向轉運蛋白基因進行 突變重組，通過功能互補法，在Na7H+逆向轉運蛋白基因缺失的酵母突變株中定 向篩選離子轉運活性顯著增強的Na7H+逆向轉運蛋白突變新基因。
本發明涉及到一種新的植物強耐鹽基因Aft^F67，是編碼Na7H+逆向轉運蛋 白NHXFS1，能夠提高植物抗鹽能力，是下列核苷酸序列之一
1) 序列表中的SEQ ID N0:1;
2) 與序列表中SEQ ID N0:1限定的核苷酸序列同源性在70-100%、且編碼 相同功能蛋白質的DNA序列；
3) 編碼序列表中SEQ ID N0:2所示蛋白質序列的DNA序列。
優選的植物強耐鹽基因AKT尸5V，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1，與野生型 Na7H+逆向轉運蛋白基因&7\%17之間相比，有4個核苷酸的突變，其中第185 位和1059位為腺嘌呤，1221位和1517位為鳥嘌呤。
上述基因的編碼蛋白，為具有離子轉運活性的Na7H+逆向轉運蛋白NHXFS1， 其特征在于，是下列氨基酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID NO:2;
2) 與序列表中SEQ ID N0:2限定的氨基酸序列同源性在70_100%之間的蛋 白質；
3) 在SEQIDN0:2限定的氨基酸序列中增加、減少或替換一個或幾個氨基 酸且具有相同活性的蛋白質。
優選的氨基酸序列如SEQ ID N0:2，與水稻野生型Na+/H+逆向轉運蛋白0sNHXl之間相比有2個氨基酸的改變，其中第62位為天冬氨酸，506位為甘氨 酸，也包括與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列同源性在70-100°/。之間的蛋白質，也 包括在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中增加、減少或替換一個或幾個氨基酸的蛋 白質。
本發明的技術方案如下
1、 Na7H+逆向轉運蛋白基因的克隆可以采用PCR擴增法、重組法或人工 合成法等多種方法來獲得Na+/H+逆向轉運蛋白核苷酸全長序列或其片段。比如， 基于Na7fT逆向轉運蛋白基因序列設計多核苷酸探針來從cDNA文庫或基因組文 庫中篩選目的基因，也可以用PCR擴增方法直接從cDNA或基因組中擴增出有關 序列。
2、 Na7H+逆向轉運蛋白基因的DNA改組用于DNA改組的底物可以是生 物體不同個體、株系或種類的Na7H+逆向轉運蛋白基因，也可以是通過易錯PCR、 定點突變等常規方法制取的不同突變形式的Na+/H+逆向轉運蛋白基因。
對Na7H+逆向轉運蛋白基因進行DNA改組的主要步驟為首先用DNase I 或限制酶對Na7H+逆向轉運蛋白基因進行隨機片段化，回收其中的小片段即重 疊片段。然后在不加引物的情況下，用DNA聚合酶進行Primerless PCR使小片 段互為引物和模板進行擴增，從而使不同的突變得到廣泛的重組。最后經Primer PCR擴增得到含有重組Na7H+逆向轉運蛋白基因片段的重組基因庫。
含有重組Na7H+逆向轉運蛋白基因片段的重組基因庫可以轉入到一種細胞 或生物體內如細菌、酵母或植物細胞進行篩選。例如，可以將本發明得到的重組 基因庫連接到任何酵母表達載體如pYPGE15中，利用本領域公知的方法如乙酸鋰 技術、電轉法等轉化酵母Na7H+逆向轉運蛋白突變體如W303Aenal-4Anhxl中， 構建表達重組基因庫。將酵母轉化子涂布在含高NaCl濃度的APG選擇性平板中 以高鹽為選擇壓力進行高通量篩選，得到鹽耐受性顯著提高的突變株。
從篩選到的鹽耐受性顯著提高的酵母突變株中提取質粒，通過測序來獲取改 組后的耐高鹽Na7H+逆向轉運蛋白基因的核苷酸序列，運用常規的生物軟件如 DNA Star、 Clustalx和TMpred等對耐高鹽Na+/H+逆向轉運蛋白基因和野生型 Na7H+逆向轉運蛋白基因進行核苷酸序列比對、氨基酸序列比對以及親水性疏水 性分析等生物信息學分析。結果表明，Na7H+逆向轉運蛋白NHXFS1比未改組Na7H+逆向轉運蛋白具有更強的離子轉運活性，可以將更多Na+的從胞質中區隔 化到液泡中，使導入該基因的宿主細胞具有更好的耐鹽性。
NaVH+逆向轉運蛋白基因yV^^57作為目的基因，可以構建在任何植物表達 的Ti-質粒雙元載體中比如pBISNl上，其中有LB和RB的T-DNA 25bp重復序列， 甘露氨酸合成酶啟動子(Pmas)， polyA nos終止子，還有在真核生物中作為選 擇標記使用的新霉素磷酸轉移酶II(nptII)，用于選擇的抗生素是卡那霉素。植 物表達載體中的啟動子可以是任何一種組成型啟動子、組織特異性啟動子或環境 誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，Ubiqutin啟動子。載體中 的增強子既可以是轉錄增強子，也可以是翻譯增強子。為了便于對轉基因植物細 胞或植物進行鑒定及篩選，載體中還應有植物可選擇性標記(GUS基因、熒光素 酶基因等)或具有抗生素等抗性的標記物(如卡那霉素、除草劑等)。
通過本領域公知的研究方法如凍融法、電擊法等將上述重組載體導入農桿菌 中，進行農桿菌轉化。可通過微注射、基因槍、農桿菌介導或花粉管通道方法等 常規生物技術方法將新的強耐鹽Na+/H+逆向轉運蛋白基因A^ZFS/轉入植物 中，培育出抗鹽品質優良及生物學性狀得到改善的植物新的品種。被轉化的植物 宿主既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物，如擬南芥、煙草、番茄、油菜、 水稻、小麥、玉米、大豆、蔬菜、樹木、花卉、牧草和草坪草等。本發明的基因 對于培育抗鹽植物品種，提高農作物產量、改善生態環境等具有重要的意義。
本發明的轉基因重組載體可作為商業用途的品種、品系或作為基因資源在生 產上直接使用或進行農業生物育種和轉基因植物以提高作物的抗鹽性。


圖1為改組獲得的NHXFS1基因與未改組AtNHXl、 0sNHXl、 DmNHXl基因在酵 母雙突變菌株W303-IB A enal-4 A nhxl中功能互補實驗比較，即以下細胞在 pH5. 5、含有0、 100mM、 200mM、 250mM、 300mM和350mM NaCl的APG平板上生長 情況
其中I為含有PYPGE15質粒的野生型W303-1B， II為含有PYPGE15質粒的 W303-IB Aenal-4: :HIS3 Anhxl: :TRP1， III為含有pYPGE15質粒的W303-1B △ enal—2: :HIS3， IV為含有AtNHXl-pYPGE15重組質粒的W303-1B Aenal-4: :HIS3Anhxl::TRPl， V為含有0sNHXl-pYPGE15重組質粒的W303-IB Aenal-4: :HIS3 Anhxl::TRPl， VI為含有DmNHXl-pYPGE15重組質粒的W303-1B Aenal-4: :HIS3 Anhxl::TRPl， VII ， VI為含有NHXFS1-pYPGE15重組質粒的W303-1B △ enal-4::HIS3 Anhxl::TRPl。
具體實施例方式
實施例1.擬南芥，水稻，菊花Na7H+逆向轉運蛋白基因的克隆
用TRizol試劑從擬南芥，水稻和菊花植物幼葉中抽提總RNA，以總RNA為 模版進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA為模版，參照AtNHXl、0sNHXl、 DmNHXl的cDNA序列，設計以下引物(5'端分別包含Smal和SalI酶切位點)
AtR (5' -GCGTCGACTCAAGCCTTACTAAGATCAGGAGG-3，)
AtF (5' -TCCCCCGGGATGTTGGA TTCTCTAGTG-3，)
0sR (5， -ACGCGTCGACTCATCTTCCTCCATGGC-3 ，)
0sF (5， -TCCCCCGGGATGGGGATGGAGGTGGCG-3 ，)
DmR (5' -GCGTCGACTTAGTTTCTTTCTTCATCTTC-3，)
DmF (5， -TCCCCCGGGATGGTGTTCGATTC-3，)
通過？0^擴增獲得擬南芥1^7『逆向轉運蛋白基因JMffl7、水稻^+/^+逆 向轉運蛋白基因&#"17和菊花^7『逆向轉運蛋白基因ZWWJ/,分別將其連接 到pGM-T載體中，轉入大腸桿菌DH5a，克隆得到^zW^J7、 6te7\^t7、 ZtoWJ7的序 列，并通過測序來確定。
實施例2. ^yWZ7、 flaWJ厶ZfeV^i7基因的DNA改組
1) 起始材料的制備 以pGM-T-AtNHXl、 pGM-T-0sNHXl、 pGM-T-DmNHXl 為模版，用PfuDNA聚合酶對三個基因進行PCR擴增，純化后作為DNA改組的起 始材料。
2) DNase I隨機酶切 紫外吸收法測定純化后的DNA濃度，取含量為9ug 的AtNHXl、 0sNHXl、 DmNHXl混合，使三個基因物質的量比值為1: 1: 1。取40ul 混合后的AtNHXl、0sNHXl、 DmNHXl加入到50W酶切反應體系中(10函Tris-HCl， pH7. 5， 50mM MnCl2)， 15。C下反應10min。加入 DNase I 0. 15U，混勻，15°C，lminl6s,9(TC, lOmin.產物通過2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，切下含100-200bp的片 段的凝膠并回收。
3) 無引物PCR 取1Pg回收的小片段，加入到50W反應體系中(10XTaq buffer, dNTP各0. 2mM，6U/W Taq聚合酶)。PCR程序為反應條件94。C預 變性3min， 94。C變性30s， 45°C退火lmin， 72。C延伸lmin，共50cycles， 最后72。C延伸5min。
4) 有引物PCR 取無引物PCR的產物作為模板，分別用AtR和AtF、 OsR和OsF、 DmR和DmF三對引物對重組的基因全長序列進行PCR擴增。PCR反應 體系為(10XTaq緩沖液，dNTP各0. 2mM，每種引物各30MM， 0. 6UTaq聚合酶)， PCR反應程序為94。C預變性3min， 94。C變性lmin， 58°C退火30s， 72。C延 伸1. 5min，共30cycles，最后72°C延伸5rain。
通過DNA改組，以AtF和AtR、 DmF和DmR為引物的兩組沒有擴增出條帶， 而以OsR和OsF為引物獲得了含有重組Na7H+逆向轉運蛋白基因片段的重組基 因庫。
實施例3.表達改組文庫的構建及耐高鹽^7『逆向轉運蛋白基因M/iF57的篩 選
用Sal I和Sma I對實施例2得到的重組產物進行酶切，純化后連接到同 樣酶切的酵母表達載體pYPGE15中，用乙酸鋰方法將構建的表達改組文庫導入 酵母突變株W303-lBAena1-4: :HIS3 Anhxl: :TRP1中，涂布到不含尿嘧啶的APG 選擇培養基上，3CTC，培養2d，篩選到含有1^+/『逆向轉運蛋白基因的酵母株， 通過增加NaCl濃度對所篩選到的酵母株進一步進行篩選，最終在200mM NaCl濃 度的選擇培養基上得到了一個正常生長的酵母突變子，該突變子含有新的植物強 耐鹽基因NHXFS1。
實施例4. 耐高鹽基因yV^JAW的序列分析
用酵母質粒提取試劑盒提取耐高鹽的酵母突變子中的質粒進行DNA測序。用 DNA Star、 Clustalx和TMpred等軟件對耐高鹽Na+/H+逆向轉運蛋白基因和野 生型Na7H+逆向轉運蛋白基因進行核苷酸序列比對、氨基酸序列比對以及親水性疏水性分析。
結果顯示，NHXFS1基因與野生型Na7H+逆向轉運蛋白基因6feV〃J7之間有4 個核苷酸的突變，其中第185位鳥嘌呤轉換為腺嘌呤，1059位胸腺嘧啶顛換為 腺嘌呤，1221位胸腺嘧啶顛換為鳥嘌呤，1517位腺嘌呤轉換為鳥嘌呤。NHXFS1 編碼蛋白與水稻野生型Na7PT逆向轉運蛋白之間有2個氨基酸的改變，第62位 由甘氨酸變為天冬氨酸，第506位由天冬氨酸變為甘氨酸，如序列表SEQ ID NO: 1 和SEQ ID N0:2。
實施例5. 重組載體和宿主細胞的構建 .
用Sal I和Sma I對實施例3中得到的重組質粒pGM-T-NHXFS1進行酶切， 回收之后連接到經同樣酶切的酵母表達載體pYPGE15中，用乙酸鋰方法將構建的 NHXFSl-pYPGE15重組質粒導入到酵母雙突變株W303-1B Aenal-4: :HIS3 △ nhxl::TRPl中，在不含尿嘧啶的APG選擇性培養基中進行篩選，得到陽性轉化 子。
實施例6. 酵母功能互補比較實驗
野生型酵母W303-1B是一種具有耐鹽性的酵母，其突變株W303-1B △ enal-4::HIS3 Anhxl::TRPl耐鹽性很低，將含有NHXFS1基因的重組載體導入 該酵母突變株，可進行功能互補比較實驗。
用Sal I和Sma I對重組質粒pGM-T-AtNHXl、 pGM-T-OsNHXl、 pGM_T-DmNHXl 進行酶切，回收之后連接到經同樣酶切的酵母表達載體pYPGE15中，用乙酸鋰方 法將構建的重組質粒導入到酵母雙突變株W303-1B Aenal-4::HIS3 △ nhxl::TRPl中，同時將空的酵母表達載體pYPGE15分別導入到野生型酵母 W303-1B、酵母突變株W303-1B Aenal-2: :HIS3和W303-1B Aenal-4: :HIS3 △ nhxl::TRPl中，在不含尿嘧啶的APG選擇性培養基中進行篩選。將篩選到的陽 性轉化子和篩選到的耐高鹽酵母菌株分別接種到APG液體培養基中培養，將0D6。。 都調整到1. 0，分別進行10倍、100倍和1000倍稀釋，各取點種到pH5. 5 不同鹽濃度(OmM、 100 mM、 200 mM、 250 mM、 300 mM、 350 mM NaCl)的APG 平板上，30°C，培養2d到一周，觀察生長情況。結果如圖l所示，缺失Na+AT逆向轉運蛋白基因的酵母突變株W303-1B △ enal-4::HIS3 Anhxl::TRPl (II)比野生型的酵母菌株W303-1B (III)對鹽敏 感的多，表達A髓X1、 OsNHXl、 DmNHXl的酵母突變株W303-1B Aenal-4: :HIS3 Anhxl::TRPl (IV、 V、 VI)能夠部分互補酵母的耐鹽性，而NHXFS1基因能夠 賦予酵母突變株更強的耐鹽性(vn、 VI)，這表明此改組獲得的船7『逆向轉運
蛋白麗XFS1比未改組AtNHXl、 OsNHXl、 DmNHXl Na+/H+逆向轉運蛋白具有更強 的離子轉運活性，可以將更多Na+的從胞質中區隔化到液泡中。序列表
<110>華東師范大學
〈120〉 一種新的植物強耐鹽基因NHXFS1及其編碼蛋白和應用 〈130〉 none 〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211> 1608
〈212> DNA 〈213>人工序列
〈400〉 1
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tacctttcat atatgctggc tgagttgcta g已tttgagcg gc已ttctc已c cgt已ttcttc 840
tgtggtattg taatgtcaca ttacacttgg cataacgtca cagagagttc aagagttaca 900acaaagcacg catttgcaac tctgtccttc attgctgaga cttttctctt cctgtatgtt %0
gggatggatg cattggatat tgaaaaatgg gagtttgcca gtgaca^gacc tggcaaatcc 1020
attgggataa gctcaatttt gctaggattg gttctgatsg gaagagctgc ttttgtattc 1080
ccgctgtcgt tcttgtcgaa cctaacaaag aaggcaccga atga犯犯at犯cctggaga 1140
cagcaagttg taatatggtg ggctgggctg atgagaggag ctgtgtcgat tgctcttgct 1200
tacaataagt ttacaagatc gggccatact cagctgcacg gcaatgcaat satgatcacc 1260
agcaccatca ctgtcgttct ttttagcact atggtatttg ggatgatgac aaagccattg 1320
atcaggctgc tgctaccggc ctcaggccat cctgtcacct ctgagccttc atcaccaaag 1380
tccctgcatt ctcctctcct gacaagcatg caaggttctg acctcgagag tacaaccaac 1440
attgtgaggc cttccagcct ccggatgctc ctcaccaagc cgacccacac tgtccactac 1500
tactggcgca agttcggcga cgcgctgatg cgaccgatgt ttggcgggcg cgggttcgtg 1560
cccttctccc ctggatcacc aaccgagcag agccatggag gaagatga 1608
〈210〉 2 〈211〉 536 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400〉 2
Met Gly Met Glu Val Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Leu Tyr Thr Thr 15 10 15
Ser Asp Tyr Ala Ser Val Val Ser lie Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu
Cys Ala Cys lie Val Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Val 35 40 45
Asn Glu Ser lie Thr Ala Leu lie lie Gly Leu Cys Thr Asp Val Val 50 55 60
lie Leu Leu Met Thr Lys Gly Lys Ser Ser His Leu Phe Val Phe Ser 65 70 75 80Glu Asp Leu Phe Phe lie Tyr Leu Leu Pro Pro lie lie Phe Asn Ala 85 90 95
Gly Phe Gin Val Lys Lys Lys Gin Phe Phe Arg Asn Phe Met Thr lie 100 105 110
Thr Leu Phe Gly Ala Val Gly Thr Met lie Ser Phe Phe Thr lie Ser 115 120 125
lie Ala Ala lie Ala lie Phe Ser Arg Met Asn lie Gly Thr Asp 130 135 140
Val Gly Asp Phe Leu Ala lie Gly Ala lie Phe Ser Ala Thr Asp Ser 145 150 155 160
Val Cys Thr Leu Gin Val Leu Asn Gin Asp Glu Thr Pro Phe Leu Tyr 165 170 175
Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser lie Val 180 185 190
Leu Phe Asn Ala Leu Gin Asn Phe Asp Leu Val His lie Asp Ala Ala 195 200 205
Val Val Leu Lys Phe Leu Gly Asn Phe Phe Tyr Leu Phe Leu Ser Ser 210 215 220
Thr Phe Leu Gly Val Phe Ala Gly Leu Leu Ser Ala Tyr lie lie Lys 225 230 235 240
Lys Leu Tyr lie Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met 245 250 255
Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Leu Asp Leu 260 265 270
Ser Gly lie Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly lie Val Met Ser His Tyr 275 280 285
Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys His Ala 290 295 300
Phe Ala Thr Leu Ser Phe lie Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val 305 310 315 320Gly Met Asp Ala Leu Asp lie Glu Lys Trp Glu Phe Ala Ser Asp Arg 325 330 335
Pro Gly Lys Ser lie Gly lie Ser Ser lie Leu Leu Gly Leu Val Leu 340 345 350
lie Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu 355 360 365
Thr Lys Lys Ala Pro Asn Glu Lys lie Thr Trp Arg Gin Gin Val Val 370 375 380
lie Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser lie Ala Leu Ala 385 390 395 400
Tyr Asn Lys Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gin Leu His Gly Asn Ala 405 410 415
lie Met lie Thr Ser Thr lie Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val 420 425 430
Phe Gly Met Met Thr Lys Pro Leu lie Arg Leu Leu Leu Pro Ala Ser 435 440 445
Gly His Pro Val Thr Ser Glu Pro Ser Ser Pro Lys Ser Leu His Ser 450 455 柳
Pro Leu Leu Thr Ser Met Gin Gly Ser Asp Leu Glu Ser Thr Thr Asn 465 470 475 480
lie Val Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Thr Lys Pro Thr His 485 490 495
Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Gly Asp Ala Leu Met Arg Pro 500 505 510
Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Ser Pro Gly Ser Pro Thr 515 520 525
Glu Gin Ser His Gly Gly Arg Glx 530 53權利要求
1、一種新的植物強耐鹽基因NHXFS1，其特征在于，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)與序列表中SEQ ID NO1限定的核苷酸序列同源性在70-100％、且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；3)編碼序列表中SEQID NO2所示蛋白質序列的DNA序列。
2、 一種新的植物強耐鹽基因y^tF57的編碼蛋白，為具有離子轉運活性的Na7H+ 逆向轉運蛋白NHXFS1，其特征在于，是下列氨基酸序列之一1) 序列表中SEQ ID N0:2;2) 與序列表中SEQ ID N0:2限定的氨基酸序列同源性在70-100%之間的蛋 白質；3) 在SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列中增加、減少或替換一個或幾個氨基 酸且具有相同活性的蛋白質。
3、 含有權利要求l所述基因的重組載體。
4、 含有權利要求l所述基因的宿主細胞。
5、 權利要求1所述一種新的植物強耐鹽基因NHXFS1在培育抗鹽植物方面的應 用，其特征在于，所述植物強耐鹽基因NHXFS1通過微注射、基因槍、農桿菌介 導或花粉管通道的方法轉入植物中，培育出耐鹽性及生物學性狀得到改善的植物 新品種。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程領域，提供了通過DNA改組技術獲得的新的植物強耐鹽基因NHXS1。其核苷酸序列為SEQ ID NO1或者是與SEQ ID NO1核苷酸序列同源性在70～100％之間的DNA序列，或編碼SEQ ID NO2蛋白質序列的DNA序列。此基因編碼的Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白NHXS1比野生型Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白AtNHX1具有更強的離子轉運活性的。本發明還提供了重組載體的構建、轉基因植物等方法以應用上述基因和蛋白質，可培育耐鹽性更強或其他生物學性狀得到改善的轉基因植物新品種。
文檔編號C07K14/415GK101413004SQ20081020331
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月25日 優先權日2008年11月25日
發明者濤 夏, 輝 張, 凱 徐 申請人:華東師范大學