專利名稱：一種應用納米磁珠純化核酸的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及核酸(包括DNA和RNA)純化產品，具體的說，涉及一種應用納米磁珠從 人體液中(如血漿或血清或尿液)純化出病毒及革蘭氏陰性菌核酸的試劑盒。
背景技術：
核酸是一類生物信息高分子化合物，自它首次被從細胞中分離出來，經歷了一百多年的 歷史，直至上個世紀中期以后科學家對核酸結構和功能的認識才取得了飛躍的發展。
核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核苷酸是核酸的基本結構單位。 DNA和RNA在動植物體中都有存在，但一種病毒只含有一種核酸，DNA或RNA。
1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結構模型，極大地推動了核酸生物化學、分子 生物學及分子遺傳學等各類生命學科的發展，這些學科的發展為現代醫學和工農業產業革命 奠定了基礎。例如，基因工程等正是在現代生物化學(核酸和蛋白質結構與功能研究)基礎 上發生和發展的。分子生物學的崛起為人類揭示生命現象的本質、健康與疾病的關系，為未 來醫學與工農業的發展提供了嶄新的技術手段，并為生物技術產業發展開辟了新的領域。
正是由于核酸在整個分子生物學中的所具有的無可代替的作用，自分子生物學創立以來， 一直是分子生物學研究的主要對象。因此核酸的提取和分離純化也是分子生物學各類實驗不 可缺少的一個環節。在臨床診斷中，常從人體組織，如血清或血漿、組織切片中分離純化核 酸，然后用于疾病的診斷和組織配型。近年來由國外傳入的血液核酸篩查技術，對核酸的分 離純化提出了更高的要求。
經典的酚-氯仿法，由于提取的核酸純度高，適用于各類分子生物學實驗，到今天仍被廣 泛采用。但酚、氯仿等對人體有害，且容易造成環境污染，同時提取過程需要反復抽提，步 驟繁瑣，易造成樣本的丟失與污染。
研究者在此基礎上做了改進，如Miller等創立的鹽析法、Loparev等創立的NaI法。后來 發現固相載體，如二氧化硅、硅藻土等在一定條件下能夠特異性的吸附核酸。目前在實驗室 中得到廣泛應用的硅膠離心柱試劑盒也是使用硅基質材料載體來吸附核酸，再通過離心方式 以去除其他生化成分如蛋白質、多糖、脂類等。
與經典的酚-氯仿方法相比，固相吸附方法操作簡便，不使用有毒有害試劑，但是固液分 離時往往需要通過離心或抽濾等手段來進行試劑體系的交換和核酸的回收，不太適用于自動 化平臺。在標本數較少時，采用這種方法能夠簡便、快速的得到高質量的核酸。但當標本較 多時，如為保障用血安全的血液病毒核酸篩查，通常需要處理大量的標本。臨床上要求可以 快速并且能夠實現自動化的進行大規模的核酸純化，盡量減小由于人為的因素帶來的誤差， 得到最為精確、可靠的結果。這種方法就在自動化的升級潛力上顯示了其瓶頸。另外， 一般 的柱提取法能檢測到的DNA核酸拷貝數為每毫升1000拷貝；檢測到的RNA核酸拷貝數為每毫升10000拷貝;檢測靈敏度不夠,造成臨床上的漏檢率提高.1) 納米氧化物的制備
2) 磁性納米氧化物/Si02復合粒子的制備
3) Si02的表面修飾
4) 懸濁液的制備
本試劑盒的工作原理
在本發明提供的快速核酸純化試劑盒中，裂解液中含有能使RNase強烈失活的chaotr叩ic 試劑GuHCl，在裂解細胞膜或病毒外殼的同時滅活RNase。裂解釋放的核酸特異性的吸附在
經羧基修飾的Si02外殼的具有超順磁性的納米顆粒——磁珠上，經過多次洗滌除雜，最后在
適當的條件下將純化的核酸從磁珠上洗脫下來。
本試劑盒可以以人類體液，優先為對如血液，尿液等為樣本，進行核酸純化。 一般的柱 提取法能檢測到的DNA核酸拷貝數為每毫升1000拷貝，本試劑盒能檢測到每毫升200拷貝； 一般的柱提取法檢測到的RNA核酸拷貝數為每毫升10000拷貝，本試劑盒能檢測到每毫升 500拷貝；故本試劑盒的靈敏度高。另外由于試劑盒由液體組成，故可以配合相應的儀器， 即可實現自動化的大規模的純化核酸。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍，下列實 施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社， 分子克隆實驗指南(第三版)；或按照制造廠商所建議的步驟和條件。所有試劑為常規的化學 分析純試劑。
實施例1:試劑盒組成與配制
1. 裂解液
本公司配制8mol/LGuHCl， 50 mmol/L Tris-HCl，體積分數為2%的Triton X-100， 25 mmol/LEDTA， 0.3 mol/L的NaCl，該裂解液pH值為6.4。
2. 磁珠緩沖液
采用液相沉積法制備內核為Fe304，外殼為經過羧基修飾的Si02的——納米的單分散相 超順磁性顆粒的水溶液。 1)納米Fe304的制備
將各50 mL的0.2mol/L的二價鐵鹽(FeSO7H20)和0.3 mol/L的三價鐵鹽(FeCl3'6H20) 溶液混合在500 mL的三口燒瓶中，劇烈攪拌(200-400 rmin力同時開啟超聲波發生器，水浴恒溫(40°C)，滴液漏斗中加入0.5 mol/L的沉淀劑氨水，在氮氣氛下將滴加到反應體系中， 使反應液pH值到ll。攪拌30min后結束反應，用蒸餾水反復洗滌直至中性，傾去上層清液， 在6(TC下真空干燥后，研磨即得納米Fe304粒子。
2) 磁性納米Fe304/Si02復合粒子的制備
稱取適量的納米Fe304粒子(TEOS與Fe304物質量比為1:5)分散于無水乙醇中，加入 幾滴油酸，然后超聲分散10分鐘；將分散后的溶液轉入250mL的三口瓶中，加入TEOS和 NH3'H20，使TEOS和NH3'H20終濃度分別為0.6 mol/L和1.2 mol/L, 40°C 800 rpm攪拌3 小時；反應完成后，在磁場吸引的條件下，將溶液用蒸餾水反復洗滌，直至清洗后的溶液不 再變渾濁；把得到的沉淀在7(TC真空干燥，最后研細得到最終的復合粒子。
3) Si02表面修飾羧基
用0.1 mol/L的HC1浸泡磁性納米Fe304/Si02復合粒子30 min,重新以去離子水洗滌至中 性，然后再用乙醇、丙酮各洗滌一遍，在7(TC真空干燥得到顆粒1。取干燥后的顆粒13.0g 分散于30mL無水甲苯中，在氮氣保護下加入環氧丙基丙氧基硅烷試劑(KH560， 1.5niL)，在 ll(TC下回流反應8h。將所得改性磁珠依次用甲苯、甲醇、甲醇/水(l:l， V:V)、甲醇洗滌并 抽干。烘干得到顆粒2。將1.0g顆粒2與0.2g亞氨基二乙酸鈉先后加于20mL甲醇中，攪拌 下反應48 h。產物以甲醇、水處理以除去過量的亞氨基二乙酸鈉后，浸泡于pH值為3的稀 HC1中。30min后，以去離子水洗滌產物至中性，再以甲醇、丙酮各洗滌一遍，過濾收集。 烘干即得到二氧化硅表面修飾羧基的磁珠。
4) 配制成200g/L， pH7.0的水懸濁液
3. 洗滌緩沖液l
本公司配制6mol/LGuHCl， 50 mmol/LTris-HCl， 0.3 mol/L的NaCl， 25 mmol/LEDTA， 該緩沖液pH值為6.4。
4. 洗滌緩沖液2
本公司配制體積分數為90%的乙醇，再加入10。/。的3mol/L的NaAc，該緩沖液pH值 為6.0。
5. 洗滌緩沖液3 無水乙醇
6. 洗脫緩沖液
本公司配制10mmol/LTris-HCl， lmmol/LEDTA，該緩沖液pH值為8.0。
7. 平衡液
本公司配制0.9。/。的NaCl。實施例2:使用試劑盒提取乙肝患者血清核酸
1. 使用前將裂解液置于室溫平衡30分鐘或用時在55。C水浴中預熱5分鐘。
2. 在2ml的離心管中依次加入900 pl裂解液，45pl磁珠緩沖液，卯0 pl血清(不足時 用平衡液補至900 pl)，振蕩混勻，每5min混勻一次，共15min。
3. 靠磁，吸棄液體。
4. 加入900 pl洗漆緩沖液1，振蕩混勻2min。靠磁，吸棄液體。
5. 加入900 pl洗滌緩沖液2，振蕩混勻2min。靠磁，吸棄液體。
6. 加入900pl洗滌緩沖液3，振蕩混勻2min。靠磁，吸棄液體。
7. 將2ml離心管開蓋置于55'C金屬浴中，10min。
8. 加入卯[il洗脫緩沖液，振蕩混勻，置于55。C金屬浴中，10min。
9. 靠磁，將液體吸取到0.5ml的離心管中，立即使用或-2(TC保存。
實施例3:使用試劑盒提取丙肝患者血清核酸
1. 使用前將裂解液置于室溫平衡30分鐘或用時在55'C水浴中預熱5分鐘。
2. 在2ml的離心管中依次加入900 pl裂解液，45pl磁珠緩沖液，900 pl血清(不足時 用平衡液補至900 pl)，振蕩混勻，每5min混勻一次，共15 min。
3. 靠磁，吸棄液體。
4. 加入卯Opl洗滌緩沖液l，振蕩混勻2min。靠磁，吸棄液體。
5. 加入900 pl洗滌緩沖液2，振蕩混勻2min。靠磁，吸棄液體。
6. 加入900 pl洗滌緩沖液3，振蕩混勻2min。靠磁，吸棄液體。
7. 將2ml離心管開蓋置于55'C金屬浴中，10min。
8. 加入90pl洗脫緩沖液，振蕩混勻，置于55。C金屬浴中，10min。
9. 靠磁，將液體吸取到0.5ml的離心管中，立即使用或-20。C保存。
權利要求
1.一種應用納米磁珠純化核酸的試劑盒，其組分如下裂解液，磁珠緩沖液，洗滌緩沖液1，洗滌緩沖液2，洗滌緩沖液3，洗脫緩沖液，平衡液。
2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的裂解液含有8 mol/L GuHCl， 50 mmol/LTris-HCl，體積分數為2%的Triton X-IOO， 0.3 mol/L的NaCl， 25 mmol/LEDTA ，該裂解液的pH值為5-7。
3. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的磁珠緩沖液中的磁珠由內 核層與外殼兩個層組成。
4. 如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的內核層由核殼型磁性納米 粒子構成；所述外殼層是經過修飾的Si02。
5. 如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的內核層外殼成分Si02，進 行了羧基修飾。
6. 如權利要求3或4或5所述的試劑盒，其特征在于所述磁珠直徑如下內 核層的直徑小于10 nm，整個磁珠的直徑在30-100 nm。
7. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的洗滌緩沖液1含有6 mol/L GuHCI， 50 mmol/L Tris-HCl， 0.3 mol/L的NaC，25 mmol/L EDTA ，該洗 滌緩沖液1的pH值為5-7;所述的洗滌緩沖液3包含無水乙醇；所述的平衡 液包含0.9。/。的NaCl。
8. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的洗滌緩沖液2含有體積分數為90%的乙醇，1/10體積的3 mol/L的NaAc ;該洗滌緩沖液2的PH值 為6.0。
9. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的洗脫緩沖液含有10 mmo!/L Tris-HCl， lmmoI/LEDTA，該緩沖液pH值為8.0。
10. —種使用如權利要求1所述的試劑盒提取核酸的方法，步驟如下使用裂解液以釋放核酸；磁珠特異性吸附核酸；洗滌除去雜質；洗脫得到純化的核酸 溶液。
全文摘要
本發明提供一種應用納米磁珠提取核酸的試劑盒，尤其可以從人血漿或血清或尿液中純化出病毒及革蘭氏陰性菌的核酸，可以快速、靈敏地大規模純化核酸。該試劑盒由裂解液，磁珠緩沖液，洗滌緩沖液1，洗滌緩沖液2，洗滌緩沖液3，洗脫緩沖液，平衡液組成。本發明提取核酸速度快，靈敏度高，并且比傳統核酸純化方法具有自動化升級的潛力，使得核酸提取的大規模集成化，均一性成為可行。
文檔編號C07H1/00GK101684138SQ200810200588
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月26日 優先權日2008年9月26日
發明者汪寧梅, 穆海東, 颯 黎 申請人:上海裕隆生物科技有限公司