專利名稱：：一種人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物醫學領域，特別是一種關于避孕的多肽疫苗。
背景技術：
：計劃生育是我國的基本國策，為有效地控制人口過度增長，開發新型的安全、可逆避孕措施一直是計劃生育研究的重要課題。目前男性避孕只能在避孕套和輸精管結扎手術之間選擇。前者失敗率較高，后者具有不可逆性，且可能產生預想不到的嚴重免疫學后果，如持續高水平的抗精子抗體滴度和/或睪丸形態學的改變，故兩者均無法令人滿意。20多年來，國內外科學家一直在努力研制避孕疫苗，試圖促使男性的免疫系統破壞精子，使其暫時失去生育能力。開展的研究主要集中于針對居留于精子和男性生殖道的特異性靶抗原制備疫苗，如PH-20、受精抗原-1，頂體抗原SP-IO，受精素p等，尤其是多價疫苗的開發可明顯抑制動物的精卵結合與融合，但受孕抑制率仍停留在50%左右。鑒于此，開發創新性避孕措施是當前避孕研究的迫切需要。由于受精起源于兩性配子細胞的結合，設想以射精后精子的自我保護分子機制為立足點，靶向性破壞精子受精能力，可以在保證生活質量的前提下有效遏制精卵結合，將可能成為男性避孕的新理念。研究表明射精后的精液中，精子表面的Eppin與精囊蛋白Semenogelin(Sg)相結合。精子最初呈不動狀態，隨后前列腺分泌的絲氨酸蛋白激酶前列腺特異性抗原(PSA)水解其生理底物Sg，釋放活動的精子，精液開始液化，精子開始獲能，期間精子膜表面發生一系列的改變，其表面的粘附分子經過一系列修飾和/或脫失，以及膜外周蛋白(失能因子)被移除。Eppin-Sg復合物結合在射出的精子表面，其生理意義可能在于保護精子，Eppin含有兩個功能結構域，分別具有抗菌和抑制蛋白酶水解作用，為精子在女性生殖道中保持生育能力起到天然免疫作用，同時保護精子免遭蛋白酶水解。其中2973氨基酸殘基之間為乳清酸蛋白(wheya2cidicprotein,WAP)結構域，77127之間為牛胰蛋白酶抑制蛋白(bovinepanocreatictrypsininhibitor,BPTI)結構域，又稱Kunitz抑制蛋白結構域。抗Eppin抗體可直接破壞Eppin-Sg復合體，千擾Eppin調控PSA對Sg的水解作用，是抗Eppin抗體造成免疫性不育的分子基礎。疫苗促使機體產生高滴度抗體的前提是疫苗具有強免疫原性。現代保護性免疫理論認為，有效的保護性免疫源于一組表位的合理組合和搭配。蛋白質抗原并非通過其完整分子發揮功能，而是通過其表位體現其特異性。就某一蛋白質抗原而言，它不僅含有B細胞表位、Th細胞表位、CTL表位、NK細胞表位、MHC限制位等與免疫識別密切相關的結構，同時還含有毒性或抑制性表位、優勢非中和性表位、病理與自身抗原交叉反應性表位等，它們可引起免疫偏移、免疫顛覆等不利的免疫反應而導致免疫耐受。由于許多天然抗原引發的免疫反應不能滿足預防感染或預防發病的需要，因此，為了提高蛋白質抗原的保護性，就必須在表位水平上做出選擇，摒除后者，保留、改善前者以得到更理想的疫苗分子。我們既往提出了用模擬抗原(Mimogen)進行特異性免疫的思路和創立了"Epitope-basedVaccineDesign,EBVD(根據抗原表位設計疫苗)"技術路線，并在乙肝和腫瘤模型的mimogen設計上得到成功驗證。模擬抗原在抗原特性上與天然抗原不同，而引起的免疫反應特異性與天然抗原無異。它摒除了致病性表位、優勢非保護性表位、亞優勢保護性表位、交叉反應性表位等不利組分，具有更好的針對性。
發明內容本發明的目的就是提供一種有效的人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，它避孕效率高，而且無毒副作用。本發明的目的是通過這樣的技術方案實現的一種人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，它基本的氨基酸序列為氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGG-羧基端；以賴氨酸為接頭，將多個該基本的氨基酸序列組成多拷貝的串聯結構。本發明的基本的氨基酸序列來源于GENBANK報道的人附睪蛋白酶抑制基因的氨基酸序列(GENBANK登錄號為AF286368，公開日為2001年6月14日)，如圖1所示，采用蛋白質表位分子設計的原理和方法，對圖l所示的蛋白質序列進行二級結構、抗原性、B細胞表位、親水性質、疏水性質的分析研究，找到了具有功能的本發明所指的基本的氨基酸序列。氨基酸序列為MGSSGLLSLLVLFVLLANVQGPGLTDWLFPRRCPKIREECEFQERDVCTKDRQCQDNKKCCWSCGKKCLDLKQDVCEMPKETGPCLAYFLHWWYDKKDNTCSMFVYGGCQGNNNNFQSKANCLNTCKNKRFP本發明所指的基本的氨基酸序列的用途按80微克/只/次的劑量與福氏佐劑等量混合，注入Balb/c小鼠腹股溝皮下組織部位;7天后，按同樣的方法，以50微克/只欣的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位;4再過7天，按同樣的方法，50微克/只次的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位。末次免疫后14天，將接受免疫的小鼠尾靜脈取血，收集其血清，按酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)檢測小鼠血清中的抗體滴度，顯著高于空白對照組、PBS對照組和無關肽對照組，取得了明顯的疫苗效果，見圖l。另外，取健康人志愿者精液提取蛋白，與本發明的基本的氨基酸序列作為疫苗免疫上述小鼠的血清反應，酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)結果為陽性，可以中和精液中的抗原成分，見圖2。避孕觀察將實驗組抗原肽免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，對照組(PBS對照組、空白對照組和無關肽對照組)免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，三周后分別觀察記錄各組雌小鼠的產仔率。可以獲得高效的避孕效果，見圖6。實驗例l:本發明的基本的氨基酸序列免疫小鼠的實驗結果主要試劑及其配制包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)組成Na2C031.5gNaHC032.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至lOOOml，調至pH9.6;封閉液(5X小牛血清/PBS溶液)組成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml;磷酸鹽緩沖液(PBS):A液(0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液)組成NaH2P04，H2027.6g溶于超純水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液)組成Na2HP04'7H2053.6g(或Na2HP04'12H2071.6g或Na2HP04.2H2035.6g)溶于超純水1000ml。樣本稀釋液(PBS，0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水)成分PBA液19ml:PBB液81ml:NaG118.5;超純水lOOOml。洗滌液(PBST，pH7.4)組成PBS液lOOOml加Tween200.5ml，硫柳汞O.lg，調至pH7.4。底物液(OPD-H202)組成及其來源OPD(鄰苯二胺〈鹽酸鹽〉)(Sigma公司，USA)A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)組成檸檬酸19.2§，加蒸餾水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)組成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸餾水至lOOOml。終止液(2mol/LH2S04溶液)組成雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):原裝進口，已經過56°C，30分鐘水浴滅活補體，批號AJH10710。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京華美公司分裝)。福氏完全佐劑(CFA):RPMIgedium1640(Hyclone公司，USA);Hanks液(hyclone公司，USA);Hepes(GmbH公司，Germany)。主要儀器酶標儀(Thermolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、電子天平(AEL-160,LIBROR，日本產)、pH測定儀(~ODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶聯板(Labsystern公司，USA)、電熱恒溫水熱箱(S648，上海醫療器械七廠，中國)。實驗方法實驗動物分組健康Balb/c小鼠(北京軍事醫學科學院實驗動物中心提供)40只，雄性，6~8周齡，10~16g，隨機分為6組對照組3只，權利要求1~5的氨基酸序列作為疫苗分別分成組，按相同的方法和劑量免疫小鼠，每組10只。免疫程序按80微克/只/次的劑量與福氏佐劑等量混合，注入Balb/c小鼠腹股溝皮下組織部位；7天后，按同樣的方法，以50微克/只.次的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位；再過14天，按同樣的方法，50微克/次.只的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位。觀察28天，將接受免疫的小鼠尾靜脈放血，收集其血清。標本的采集和分離將免疫小鼠尾靜脈放血，分離血清，并凍存于一20。C冰箱保存備用。間接酶聯免疫(ELISA)方法檢測抗體采用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。包被液、稀釋液及洗滌液見前。酶標二抗為羊抗小鼠IgG,底物為OPD;用96孔酶聯板包被抗原濃度為10嗎/mL，10(^1/孔，置37°C恒溫水浴箱4小時后，棄去孔中液體；用5%BSA-PBS封閉酶標反應孔，37°(:恒溫水浴箱40分鐘后，洗漆液滿孔洗滌3遍，每遍3分鐘。按照10倍連續稀釋的血清比例加入各孔，100|al/L，37°C恒溫水浴箱1小時后洗滌3遍；加入酶標二抗，37°C恒溫水浴箱40分鐘，加入底物液OPD,100pl/L置37。C蔽光顯色反應20分鐘，終止反應，于20分鐘內，用酶標儀于492nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照OD值>2.1判定為陽性。實驗例2，免疫小鼠的抗體與人精液蛋白抽提液反應6間接酶聯免疫(ELISA)方法同實驗例1，取健康志愿者精液，蛋白抽提離心后取上清液體，與小鼠血清反應，用ELISA的方法檢測，鑒定的方法同實驗例l，結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照OD值〉2.1判定為陽性。實驗例3，多肽疫苗的合成采用標準Fmoc方案，起始選用0.0125mmo1，PSC樹脂(ABI公司產品)，分別按照權利要求1所述的序列特征、權利要求2所述的序列特征、權利要求3所述的序列特征、權利要求4所述的序列特征、權利要求5所述的序列特征，使肽鏈從C端逐個向N端延伸，各氨基酸原料(美國ABI公司生產)的用量為O.lmmol。各種氨基酸保護基團是各氨基酸的a氨基為Pmoc保護，其余側鏈保護基團，Arg(Mtr)、tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、Asp(OtBu)。每步縮合都加入HoBt/Dcc活化保護氨基酸的羧基。每步縮合用含有20X六氫吡啶的NMP溶液去除Fmoc保護基，肽鏈合成后，按照ABI公司推薦的步驟，將含樹脂的肽鏈加入處于冰浴條件下的混合反應液中，反應液的成分結晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲垸(Thionaisole)0.5ml、去離子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室溫條件下持續攪拌，反應時間為4.5小時，把肽鏈從樹脂上裂解下來，同時去除多種保護基。將混合液經4G的玻璃濾器過濾，以濾掉切下的樹脂及保護基團，并用三氟乙酸沖洗反應瓶和濾器，將濾液在常溫下低壓蒸發至l~2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，經6G濾器過濾后，冷凍干燥，所得便是肽產品。以上過程都是在ABI-431A固相自動肽合成儀(美國生產)上完成。圖4為按照權利要求1所述的序列特征所合成多肽疫苗的高壓液相色譜儀(HPLC)分析結果，圖5為按照權利要求1所述的序列特征所合成多肽疫苗的質譜圖。本發明的有益效果是本發明涉及的各氨基酸原料可以室溫保存、運輸；本發明涉及的合成多肽疫苗可以室溫保存、運輸；本發明涉及的合成多肽疫苗可以自動化批量生產；本發明涉及的合成多肽疫苗均屬機體成分，無毒副作用。總之，本發明具有便于運輸保存和自動化批量生產的優點，它具有顯著免疫原性和抗原性，免疫效果明顯，而且無毒副作用。本發明的如下圖l為本發明的基本的氨基酸序列作為疫苗免疫小鼠的結果；圖2為本發明基本的氨基酸序列免疫小鼠血清與人精子液的反應結果；圖3為本發明的5項權利要求疫苗免疫小鼠的結果；圖4為本發明的基本的氨基酸序列的純度分析(HPLC測定)；HPLC純度鑒定結果，純度為^90%。圖5為本發明的基本的氨基酸序列的質譜分析；圖6為本發明的避孕效果分析。具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明實施例1:本發明基本的氨基酸序列為氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN-羧基端；以賴氨酸為接頭，將多個該基本的氨基酸序列組成多拷貝的串聯結構。本發明所指的基本的氨基酸序列的用途按80微克/只/次的劑量與福氏佐劑等量混合，注入Balb/c小鼠腹股溝皮下組織部位；7天后，按同樣的方法，以50微克/只/次的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位；再過14天，按同樣的方法，50微克/次/只的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位。觀察28天，將接受免疫的小鼠尾靜脈放血，收集其血清，按酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)檢測小鼠血清中的抗體滴度，顯著高于各個對照組，取得了明顯的疫苗效果，見圖1。另外，取健康志愿者精液抽提的上清液，與本發明的基本的氨基酸序列作為疫苗免疫上述小鼠的血清反應，酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)結果為陽性，可以中和人精液中的抗原成分，見圖2。實驗l，本發明的基本的氨基酸序列免疫小鼠的實驗結果主要試劑及其配制包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)組成Na2C031.5g，NaHC032.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000ml，調至PH9.6。封閉液(5X小牛血清/PBS溶液)組成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸鹽緩沖液(PBS):A液(0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液)組成Na2P04.H2027.6g溶于超純水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液)組成:Na2HP(V7H2053.6g(或Na2HP04-12H2071.6g或Na2HP04.2H2035.6g)溶于超純水lOOOml。樣本稀釋液(PBS，0.01mo/L磷酸鹽緩沖生理鹽水)成分PBA液19ml;PBB液81ml;Na以18.5;超純水1000ml。8洗滌液(PBST，pH7.4)組成PBS液100ml加Tween200.5ml,硫柳汞O.lg，調至pH7.4。底物液(OPD-H202)組成及其來源0PD(鄰苯二胺鹽酸鹽)(Sigma公司，USA):北京鼎國生物技術發展中心分裝，原批號P1526。A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)組成檸檬酸19.2g，加蒸餾水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)組成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸餾水至1000ml。終止液(0.2mol/LH2S04溶液)組成雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):原裝進口，已經過56°C，30分鐘水浴滅活補體，批號AJH顧O。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京華美公司分裝)。福氏完全佐劑(CFA)組成羊毛脂70g加液體石蠟30ml，充分混勻后分裝于10Qnl清潔玻璃瓶中，8磅滅菌15分鐘后4保存待用。卡介苗(批號；991106，成都生物制品研究所)。RPM工Mediuml640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hyclone公司，USA)。Hepes(GmhH公司，Germany)。主要儀器酶標儀(Thermolabsystemsmultiskanspectrum，USA)、電子天平(AEL-160,LIBROR，日本產)、pH測定儀(MODEL450，BI0~RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶聯板(Labsystem公司，USA)、電熱恒溫水熱箱(S648，上海醫療器械七廠，中國)、微量多頭細胞收集器(衛星牌ZT—口型，紹興衛星機械公司)。實驗方法實驗動物分組健康Balb/c小鼠(第三軍醫大學實驗動物中心提供)43只，雌性，6~8周齡，1016g，隨機分為6組正常對照組3只，權利要求1~5的氨基酸序列作為疫苗分別分成組，按相同的方法和劑量免疫小鼠，每組10只。免疫程序按1加微克/只.次的劑量與福氏佐劑等量混合，注入Balb/c小鼠腹股溝皮下組織部位；14天后，按同樣的方法，以50微克/只.次的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位再過14天，按同樣的方法，50微克/次。只的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位。觀察28天，將接受免疫的小鼠眼眶放血，收集其血清。標本的采集和分離將免疫小鼠眶靜脈放血，分離血清，并凍存于-20。C冰箱保存備用。間接酶聯免疫(ELISA)方法檢測抗體采用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。包被液、稀釋液及洗滌液見前。酶標二抗為羊抗小鼠IgG，底物為OPD;用96孔酶聯板包被抗原濃度為10嗎/ml，10(Hil/L，置37^恒溫水浴箱4小時后，棄去孔中液體用5XBSA—PBS封閉酶標反應孔，37°(:恒溫水浴箱40分鐘后，洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3分鐘。按照10倍連續稀釋的血清比例加入各孔，100pl/L，37°C恒溫水浴箱1小時后洗滌3遍加入酶標二抗，37°C恒溫水浴箱40分鐘，加入底物液OPD，10(HU/L，置37。C蔽光顯色反應20分鐘，終止反應，于20分鐘內，用酶標儀于492nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照OD值>2.1判定為陽性。實驗2，免疫小鼠的抗體與人精液蛋白抽提液反應間接酶聯免疫(ELISA)方法同實驗例1，取健康志愿者精液，蛋白抽提離心后取上清液體，與小鼠血清反應，用ELISA的方法檢測，鑒定的方法同實驗例l，結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照OD值〉2.1判定為陽性。實驗3，多肽疫苗的合成采用標準Fmoc方案，起始選用0.0125mmo1，PSC樹脂(ABI公司)，分別按照權利要求1所述的序列特征、權利要求2所述的序列特征、權利要求3所述的序列特征、權利要求4所述的序列特征、權利要求5所述的序列特征，使肽鏈從C端逐個向N端延伸，各氨基酸原料(美國AB工公司生產)的用量為O.lmmol。各種氨基酸保護基團是各氨基酸的P氨基為Pmoc保護，其余側鏈保護基團，Arg(Mtr)、tyr(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(但u)、Asp(0tBu)。每步縮合都加入HoBt/Dcc活化保護氨基酸的羧基。每步縮合用含有20X六氫吡啶的NMP溶液去除Fmoc保護基，肽鏈合成后，按照ABI公司推薦的步驟，將含樹脂的肽鏈加入處于冰浴條件下的混合反應液中，反應液的成分結晶苯酸0.75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)0.5ml、去離子水0.5ml、三氟乙酸10ml。在室溫條件下持續攪拌，反應時間為4-5小時，把肽鏈從樹脂上裂解下來，同時去除多種保護基。將混合液經4G的玻璃濾器過濾,以濾掉切下的樹脂及保護基團，并用三氟乙酸沖洗反應瓶和濾器，將濾液在常溫下低壓蒸發至l2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后，經6G濾器過濾后，冷凍干燥，所得便是肽產品。以上過程都是在ABI431A固相自動肽合成儀(美國生產)上完成。圖4為按照權利要求l所述的序列特征所合成多肽疫苗的高壓液相色譜儀(HPLC)分析結果圖5為按照權利要求1所述的序列特征所合成多肽疫苗的質譜圖。10實施例2:本發明的基本氨基酸序列也可以為MFVYGGCQGNNNN\LSEIKGVIVHRLEGV<^主要試劑及其配制包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液，pU9.6)組成Na2C031.5g，NaHC032.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000ml，調至pH9.6。封閉液(5X小牛血清/PBS溶液)組成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸鹽緩沖液(PBS):A液(0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液)組成NaH2P(VH2027.6g溶于超純水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液)組成Na2HP04'7H2053.6g(或Na2HP04'12H2071.6g或Na2HP04'2H2035.6g)溶于超純水lOOOml。樣本稀釋液(PBS，0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水)成分PBA液19mhPBB液81ml;NaCl18.5;超純水lOOOml。洗滌液(PBST，pH7.4)組成PBS液lOOOml加Tween200,5ml，硫柳滎O.l，調至pH7.4。底物液(0PD~~H202)組成及其來源OPD(鄰苯二胺<鹽酸鹽>)(Sigma公司，USA):北京鼎國生物技術發展中心分裝，原批號P1526。A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)組成檸檬酸19.28,加蒸餾水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)組成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸餾水至lOOOml。終止液(2mol/LH2S04溶液)組成雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):已經過56。C，30分鐘水浴滅活補體。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠lgG(Nordic公司，USA，北京華美公司分裝)。福氏完全佐劑(CFA):SigmaF5881福氏不完全佐劑(CFA)組成SigmaF009-l。RPMIMedium1640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hyclone公司，USA)。-Hepes(GmbH公司，Germany)。主要儀器酶標儀(Thermolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、電子天平(AEL-160,LIBROR，日本產)、pH測定儀(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶聯板(Labsystern公司，USA)、電熱恒溫水熱箱(S648，上海醫療器械七廠，中國)。實驗方法實驗動物分組健康Balb/c小鼠(第三軍醫大學實驗動物中心提供)，雌性，6~8周齡，1016g，隨機分組正常對照組5只，按權利要求2的氨基酸序列作為疫苗，按相同的方法和劑量免疫10只小鼠。免疫程序按80微克/只/次的劑量與福氏完全佐劑等量混合，注入Balb/c小鼠腹股溝皮下組織部位；7天后，按同樣的方法與福氏不完全佐劑等量混合，以50微克/只/次的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位；再過14天，按同樣的方法，50微克/次/只的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位。觀察28天，將接受免疫的小鼠尾靜脈放血，收集其血清。標本的采集和分離將免疫小鼠尾靜脈放血，分離血清，并凍存于-20。C冰箱保存備用o間接酶聯免疫(ELISA)方法檢測抗體采用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。包被液、稀釋液及洗滌液見前。酶標二抗為羊抗小鼠IgG，底物為OPD;用96孔酶聯板包被抗原濃度為10pg/ml，如100^1/孔，置37。C恒溫水浴箱4小時后，棄去孔中液體用5XBSA-PBS封閉酶標反應孔，37°C恒溫水浴箱40分鐘后，洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3分鐘。按照10倍連續稀釋的血清比例加入各孔，100^1/孔，37°C恒溫水浴箱1小時后洗滌3遍；加入酶標二抗，37。C恒溫水浴箱40分鐘，加入底物液OPD，10(Hil/孔，置37°C蔽光顯色反應20分鐘，終止反應，于20分鐘內，用酶標儀于492nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照0D值〉2.1判定為陽性。避孕觀察將實驗組抗原肽免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，對照組(PBS對照組、空白對照組和無關肽對照組)免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，三周后分別觀察記錄各組雌小鼠的產仔率。實施例3:本發明的基本氨基酸序列也可以為LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNN1SN^LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN主要試劑及其配制包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液，pU9.6)組成Na2C031.5g，NaHC032.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000ml，調至pH9.6。封閉液(5X小牛血清/PBS溶液)組成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸鹽緩沖液(PB):A液(0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液)組成NaH2P04'H2027.6g溶于超純水1000ml。B液(0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液)組成Na2HP04'7H2053.6g(或Na2HP04'12H2071.6g或Na2HP(V2H2035.6g)溶于超純水1000ml。樣本稀釋液(PBS，0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水)成分PBA液19ml;PBB液81ml;NaCl18.5;超純水lOOOml。洗滌液(PBST，pH7.4)組成PBS液lOOOml加Tween200，5ml，硫柳汞O.l，調至pH7.4。底物液90PD—H202)組成及其來源:OPD(鄰苯二胺〈鹽酸鹽力(Sigma公司，USA):北京鼎國生物技術發展中心分裝，原批號P1526。A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)組成檸檬酸19.2g，加蒸餾水至1000ml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)組成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸餾水至1000ml。終止液(2mol/LH2S04溶液)組成雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):己經過56°<:，30分鐘水浴滅活補體。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京華美公司分裝)。福氏完全佐劑(CFA):SigmaF5881福氏不完全佐劑(CFA)組成SigmaF009-l。RPMIMedium1640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hyclone公司，USA)。Hepes(GmbH公司，Germany)。，13主要儀器酶標儀(Theraiolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、電子天平(AEL隱160，LIBROR，曰本產)、pH測定儀(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶聯板(Labsystern公司，USA)、電熱恒溫水熱箱(S648,上海醫療器械七廠，中國)。實驗方法實驗動物分組健康Balb/c小鼠(第三軍醫大學實驗動物中心提供)，雌性，6~8周齡，1(M6g，隨機分組正常對照組5只，按權利要求2的氨基酸序列作為疫苗，按相同的方法和劑量免疫IO只小鼠。免疫程序按80微克/只/次的劑量與福氏完全佐劑等量混合，注入Balb/c小鼠腹股溝皮下組織部位；7天后，按同樣的方法與福氏不完全佐劑等量混合，以50微克/只/次的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位；再過14天，按同樣的方法，50微克/次/只的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位。觀察28天，將接受免疫的小鼠尾靜脈放血，收集其血清。標本的采集和分離將免疫小鼠尾靜脈放血，分離血清，并凍存于-2(fC冰箱保存備用。間接酶聯免疫(ELISA)方法檢測抗體采用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。包被液、稀釋液及洗滌液見前。酶標二抗為羊抗小鼠IgG，底物為OPD;用96孔酶聯板包被抗原濃度為10pg/ml，如100^1/孔，置37°(:恒溫水浴箱4小時后，棄去孔中液體用5XBSA-PBS封閉酶標反應孔，37°C恒溫水浴箱40分鐘后，洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3分鐘。按照10倍連續稀釋的血清比例加入各孔，100nl/L，37°<:恒溫水浴箱1小時后洗滌3遍；加入酶標二抗，37。C恒溫水浴箱40分鐘，加入底物液OPD，100nl/L，置37°C蔽光顯色反應20分鐘，終止反應，于20分鐘內，用酶標儀于492nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照0D值>2.1判定為陽性。避孕觀察將實驗組抗原肽免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，對照組(PBS對照組、空白對照組和無關肽對照組)免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，三周后分別觀察記錄各組雌小鼠的產仔率。實施例4:本發明的基本氨基酸序列也可以為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>主要試劑及其配制包被稀釋液(O.05mol/L碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液，pU9.6)組成Na2C031.5g，NaHC032.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至lOOOml，調至pH9.6。封閉液(5X小牛血清/PBS溶液)組成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸鹽緩沖液(PB):A液(0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液)組成NaH2P(VH2027.6g溶于超純水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液)組成Na2HP04'7H2053.6g(或Na2HP04'12H2071.6g或Na2HP(V2H2035.6g)溶于超純水lOOOml。樣本稀釋液(PBS，0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水)成分PBA液19ml:洗滌液(PBST，pH7.4)組成PBS液lOOOml加Tween200，5ml，硫柳汞O.l,調至pH7.4。底物液(0PD~202)組成及其來源OPD(鄰苯二胺<鹽酸鹽>)(Sigma公司，USA):北京鼎國生物技術發展中心分裝，原批號P1526。A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)組成檸檬酸19,2g，加蒸餾水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)組成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸餾水至lOOOml。終止液(2mol/LH2S04溶液)組成雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):已經過56°<:，30分鐘水浴滅活補體。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京華美公司分裝)。福氏完全佐劑(CFA):SigmaF5881福氏不完全佐劑(CFA)組成SigmaF009-l。RPMIMedium1640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hyclone公司，USA)。Hepes(GmbH公司，Germany)。主要儀器酶標儀(Thermolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、電子天平(AEL-160，LIBROR，日本產)、pH測定儀(MODEL450，BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶聯板(Labsystem公司，USA)、電熱恒溫水熱箱(S648，上海醫療器械七廠，中國)。實驗方法實驗動物分組健康Balb/c小鼠(第三軍醫大學實驗動物中心提供)，雌性，6~8周齡，10~16g，隨機分組正常對照組5只，按權利要求2的氨基酸序列作為疫苗，按相同的方法和劑量免疫10只小鼠。免疫程序按80微克/只/次的劑量與福氏完全佐劑等量混合，注入Balb/c小鼠腹股溝皮下組織部位；7天后，按同樣的方法與福氏不完全佐劑等量混合，以50微克/只/次的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位；再過14天，按同樣的方法，50微克/次/只的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位。觀察28天，將接受免疫的小鼠尾靜脈放血，收集其血清。標本的采集和分離將免疫小鼠尾靜脈放血，分離血清，并凍存于-20。C冰箱保存備用o間接酶聯免疫(ELISA)方法檢測抗體采用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。包被液、稀釋液及洗滌液見前。酶標二抗為羊抗小鼠IgG，底物為OPD;用96孔酶聯板包被抗原濃度為10ng/ml，如100nl/L置37。C恒溫水浴箱4小時后，棄去孔中液體用5XBSA-PBS封閉酶標反應孔，37°C恒溫水浴箱40分鐘后，洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3分鐘。按照10倍連續稀釋的血清比例加入各孔，10(Hil/孔，37。C恒溫水浴箱l小時后洗滌3遍；加入酶標二抗，37T恒溫水浴箱40分鐘，加入底物液OPD,100nl/孔，置37°C蔽光顯色反應20分鐘，終止反應，于20分鐘內，用酶標儀于492nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照0D值〉2.1判定為陽性。避孕觀察將實驗組抗原肽免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，對照組(PBS對照組、空白對照組和無關肽對照組)免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，三周后分別觀察記錄各組雌小鼠的產仔率。實施例5:本發明的基本氨基酸序列也可以為16K\KKLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN主要試劑及其配制包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液，pU9.6)組成Na2C031.5g,NaHC032.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000ml，調至pH9.6。封閉液(5X小牛血清/PBS溶液)組成-小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。磷酸鹽緩沖液(PB):A液(0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液)組成NaH2P04'H2027.6g溶于超純水lOOOml。B液(0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液)組成Na2HP04.7H2053.6g(或Na2HP04，12H2071.6g或Na2HP04'2H2035.6g)溶于超純水lOOOml。樣本稀釋液(PBS，0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水)成分PBA液19ml;PBB液81ml;NaC118.5;超純水lOOOml。洗滌液(PBST，pH7.4)組成PBS液lOOOml加Tween200，5ml，硫柳隸O.l，調至pH7.4。底物液(0PD~~H202)組成及其來源OPD(鄰苯二胺<鹽酸鹽>)(Sigma公司，USA):北京鼎國生物技術發展中心分裝，原批號P1526。A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)組成檸檬酸19,2g，加蒸餾水至lOOOml。B液(0.2mol/LNa2HP04溶液)組成Na2HP04'12H2071.7g，加蒸餾水至lOOOml。終止液(2mol/LH2S04溶液)組成雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。新生小牛血清(Hyclone公司，USA):己經過56。C，30分鐘水浴滅活補體。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(Nordic公司，USA，北京華美公司分裝)。福氏完全佐劑(CFA):SigmaF5881福氏不完全佐劑(CFA)組成SigmaF009-l。RPMIMedium1640(Hyclone公司，USA)。Hanks液(Hycone公司，USA)。Hepes(GmbH公司，Germany)。主要儀器酶標儀(Thermolabsystemsmultiskanspectrum,USA)、電子天平(AEL-160,LIBROR，曰本產)、pH測定儀(MODEL450,BIO-RAD，USA)、96孔聚苯乙烯酶聯板(Labsystem公司，USA)、電熱恒溫水熱箱(S648,上海醫療器械七廠，中國)。實驗方法實驗動物分組健康Balb/c小鼠(第三軍醫大學實驗動物中心提供)，雌性，6~8周齡，10~16g，隨機分組正常對照組5只，按權利要求2的氨基酸序列作為疫苗，按相同的方法和劑量免疫10只小鼠。免疫程序按80微克/只/次的劑量與福氏完全佐劑等量混合，注入BaJb/c小鼠腹股溝皮下組織部位；7天后，按同樣的方法與福氏不完全佐劑等量混合，以50微克/只/次的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位；再過14天，按同樣的方法，50微克/次/只的劑量注射Balb/c小鼠腹股溝的皮下組織部位。觀察28天，將接受免疫的小鼠尾靜脈放血，收集其血清。標本的采集和分離將免疫小鼠尾靜脈放血，分離血清，并凍存于-20。c冰箱保存備用o間接酶聯免疫(ELISA)方法檢測抗體采用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。包被液、稀釋液及洗滌液見前。酶標二抗為羊抗小鼠IgG，底物為OPD;用96孔酶聯板包被抗原濃度為10ng/ml,如100^1/孔，置37。C恒溫水浴箱4小時后，棄去孔中液體用5XBSA-PBS封閉酶標反應孔，37°C恒溫水浴箱40分鐘后，洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3分鐘。按照10倍連續稀釋的血清比例加入各孔，100pl/孑L，37°(:恒溫水浴箱1小時后洗滌3遍；加入酶標二抗，37。C恒溫水浴箱40分鐘，加入底物液opd，100h1/孔，置37°c蔽光顯色反應20分鐘，終止反應，于20分鐘內，用酶標儀于492nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照0D值>2.1判定為陽性。避孕觀察將實驗組抗原肽免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，對照組(PBS對照組、空白對照組和無關肽對照組)免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，三周后分別觀察記錄各組雌小鼠的產仔率，見圖6。、實驗4:對上述實施例l-5所述產品進行生殖力回復實驗，結果如下生殖力回復實驗初次免疫后18—20周后抗體滴度下降明顯，從40萬下降到2—8萬，26周后抗體滴度低于5000，按雄雌比例l:2進行雌雄小鼠合籠，將實驗組抗原肽免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，對照組(PBS對照組、空白對照組和無關肽對照組)免疫雄小鼠與健康雌小鼠合籠，三周后分別觀察記錄各組雌小鼠的產仔率。實驗結果表明免疫雄性小鼠其生殖力回復，肽免疫組的雌小鼠與對照組雌小鼠的產仔率和受孕率差異不顯著，參見表l。表l、免疫雄鼠抗體滴度下降后合籠情況<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權利要求1、一種人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列為氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN-羧基端；以賴氨酸為接頭，將多個該基本的氨基酸序列組成多拷貝的串聯結構。2、如權利要求l所述的人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列為MFVYGGCQGNNNN\LSEIKGVIVHRLEGVK3、如權利要求l所述的人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列為LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNN1S^LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN4、如權利要求l所述的人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列為LSEIKGVIVHRLEGVMFVYGGCQGNNNN^KLSEIKGVIVHRLEGV、MFVYGGCQGNNNN二K^5、如權利要求l所述的人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氮基酸序列為LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN\LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNKLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN\KLSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNNK全文摘要一種人附睪蛋白酶抑制蛋白免疫避孕多肽，其特征在于它基本的氨基酸序列為氨基端-LSEIKGVIVHRLEGVGGGMFVYGGCQGNNNN-羧基端；并可以以賴氨酸為接頭，將多個該基本的氨基酸序列組成多拷貝的串聯結構。本發明具有產品便于運輸保存和進行自動化生產的優點，它具有顯著的免疫原性和抗原性，免疫效果明顯，具有高效、可逆的避孕效果，而且安全無副作用。文檔編號C07K14/81GK101638438SQ20081017095公開日2010年2月3日申請日期2008年10月15日優先權日2008年5月14日發明者畏何,吳玉章,李晉濤,梁志清,萍閻,陳正瓊申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學