專利名稱：一種抗豬瘟轉移因子的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物及其制劑領域，更具體地說，是涉及一種抗豬瘟轉移 因子的制備方法。
背景技術：
豬瘟是由豬瘟病毒感染引起的豬急性、熱性、高致死性傳染病，也是
一種毀滅性傳染病，遍及全世界。巴黎國際獸醫局(OIE)的國際衛生法規 已將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，目前有20多個國家宣布消滅豬 瘟，我國尚未消滅。
豬瘟臨床癥狀主要有一下幾種
1、 急性豬瘟。病豬體溫升高至40—42。C，精神沉郁、怕冷、嗜睡；病 初便秘，隨后出現糊狀或水樣并混有血液的腹瀉，大便惡臭；結膜炎、口 腔粘膜不潔、齒齦和唇內以及舌體上可見有潰瘍或出血斑；后期鼻端、唇、 耳、四腳、腹下及腹內側等處皮膚上有出血點或斑。常繼發細菌感染，以 肺炎或壞死性腸炎多見。
2、 慢性豬瘟。病豬體溫升高不明顯；貧血、消痩和全身衰弱， 一般病 程超過一個月；食欲時好時壞，便秘和腹瀉交替發生;耳尖、尾根和四肢 皮膚壞死或脫落。慢性豬瘟存活者嚴重發育不良，成為僵豬。
3、 非典型豬瘟。又稱亞臨床豬瘟。臨床癥狀與解剖病變不典型，發病 率與死亡率顯著降低，病程明顯延長，新生仔豬感染死亡率較高，大豬一 般能耐過；懷孕母豬感染出現流產，出現胎兒干尸，死胎及畸形胎。
4、 遲發型豬瘟。是先天感染的后遺癥，感染豬出生后一段時間內不表 現癥狀，數月后出現輕度厭食、不活潑、結膜炎、后軀麻痹，但體溫正常，可存活半年左右后死亡。懷孕母豬感染低毒力豬瘟病毒可表現群發性流產、 死產、胎兒干尸化、畸形和產出震顫的弱仔豬或外觀健康實際已感染的仔 豬。
盡管目前市場上有一些抗豬瘟的臨床用藥，但是現有藥劑的爭對性不 強，療效有限，而且，治療性制劑多是發病后采用的，不能起到預防的作 用。對于易感染豬瘟的豬群。每年定期的對豬接種豬瘟病毒疫苗是預防豬 瘟的有效方法，其次應增強營養或藥物干預，提高自身免疫力，通過藥物 提高機體抵抗力或免疫力也是一種預防豬瘟的有效方法。
轉移因子(TF， Transfer Factor)是從淋巴細胞中提取的一類低分子肽 與核苷酸復合物，具有傳遞免疫信息、激發免疫細胞活性、調節免疫功能、 增強機體非特異性細胞免疫功能等作用，被譽為T細胞活性的觸發劑，細 胞免疫的增強劑、細胞免疫調節劑及干擾素產生啟動劑。轉移因子分子量 小、無毒、無抗原性、不起過敏反應，不產生對抗抗體且可超越種系界限 應用等優點。自美國著名的免疫學專家Lawrence發現和研究轉移因子以來， 世界各國不但進行了許多理論研究，而且進行了大量的臨床應用研究，使 得轉移因子成為目前應用廣泛的增強免疫制劑。
目前已報道的提取的轉移因子大多數都是關于非特異性轉移因子的制 備方法。本發明采用特殊病毒株病毒免疫抗原的方法提取特異性的轉移因 子，提取方法在已報道的傳統方法基礎上加以改進，縮短生產時間，簡化 生產工藝。
采用特殊病毒株免疫抗原提取抗豬瘟病毒的轉移因子，具有重要的理 論和現實意義。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中存在的不足，提供一種天然高效的抗豬瘟病病毒轉移因子的制備方法。
本發明的第一個目的是提供一種簡單有效的抗豬瘟病轉移因子的制備 方法，步驟包括
(1) 先用注射用水洗凈用豬瘟病病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面 的筋膜、脂肪等組織，再用生理鹽水沖洗；
(2) 將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1 2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用 高速組織搗碎機1000 3000rpm搗碎3~5次，每次3 5min，制得豬脾勻漿 液；
(3) 豬脾勻漿液用超聲波(4KW、 3KHz)處理5 10min;
(4) 將步驟(3)中得到的勻漿液用HC1調pH5.0~6.0或者加入0.1 0.3% 擰檬酸，4"C， 3000 8000rpm離心10 30min，收集上清液；
(5) 上清液用0.2pm中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000 道爾頓的中空纖維柱超濾，收集濾出液；
(6) 將超濾得到的濾液用0.22|am濾膜進行無菌過濾，即得到抗豬瘟 病病毒轉移因子原液，4"C保存。
在具體實施方案中，實施上述步驟之前，步驟還包括制備病毒抗原、 提取病毒抗原、病毒抗原免疫豬的步驟。這些步驟，可選用常規技術實施。 其中，所述的制備病毒抗原步驟，優選將豬瘟病病毒接種于9 11日齡雞 胚尿囊液30-40。C培養24~72h。取雞胚尿囊液，-20卩反復凍融4 8次， 3000~8000rpm離心10 30min，棄去沉淀收集上清液。其中，所述的豬瘟病 病毒株來自病毒株E2或CSFV39株或BVDV株等。在一個優選實施方案中， 豬瘟病病毒株選自本申請人保藏的CSFV 39(Genbank accession NO. J04358) 和/或BVDV (Genbank accession NO. U63479)。
所述的提取病毒抗原步驟，優選上清液用蔗糖密度梯度離心純化提 取病毒，蔗糖濃度為10% 80%， 150000 200000rpm離心2 4小時，根據豬
6瘟病病毒分子量確定豬瘟病病毒所在離心管的位置，吸出備用；
所述的病毒抗原免疫豬步驟，優選挑選健康免疫豬，將上述提取的 病毒抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫3~5次。每次免疫間隔一周，最后 一次免疫7~10天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的 特異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價后，宰殺豬，取脾臟于-2(TC保 存，備用。
本發明的第二個目的在于提供通過上述方法所制備的轉移因子。 在一個優選實施方案中，上述方法使用的豬瘟病病毒株選自本申請人
保藏的CSFV 39(Genbank accession NO. J04358)和/或BVDV (Genbank
accession NO. U63479)。
由于轉移因子是從淋巴細胞中提取的一類低分子肽與核苷酸復合物， 目前并沒有明確的組分或結構，制備方法或所用病毒株的不同，所得的轉 移因子也會差異，因此通常在生產過程中是通過限定制備方法和所用病毒 株來明確轉移因子。在本發明中，由于限定了具體的制備方法和特異的病 毒株，因此所得到的轉移因子具有組分穩定、純度高、活性好等特點，具 有很好的應用前景。
本發明的一種抗豬瘟病毒轉移因子的制備方法，具有以下優點
1、 豬脾臟屬于屠宰場的下腳料，原料來源容易；
2、 組織經組織搗碎機搗碎后，采用大功率的超聲波設備處理，縮短反 復凍融時間，而且也避免了因高壓均質機破壁處理時由于筋膜的存在而 堵塞高壓均質機；
3、 離心前用稀鹽酸調節pH，使大部分蛋白絮凝，使得離心后的上清液 的澄清度明顯好于以前的方法；而且有利用后續的微濾、超濾操作；4、 在勻漿液中加入0.1~0.3%檸檬酸也起到使蛋白絮凝的作用，簡化后 面的離心處理；
5、 本發明既可基于前期的常規病毒抗原免疫步驟，又可優選本發明的 免疫步驟，具有靈活高效的優點。
6、 所述轉移因子的提取方法，顯著地縮短了生產時間，簡化了生產工 藝。
7、 提取物經體外生物活性試驗及藥理、毒性試驗等證明，具有純度高、 免疫活性起效快而維持時間長、易吸收、無任何不良反應等特點，其療 效確切，安全可靠，既可治療又可增強抗病能力。該提取物可做成口服、 注射、噴霧等劑型，便于使用。
8、 本發明所用的病毒株，屬于申請人保藏的CSFV39(Genbank accession NO. J04358)和/或BVDV (Genbank accession NO. U63479),與常規豬瘟病 毒株相比，具有更高的免疫原性，因而采用該病毒株免疫抗原的方法所 提取的轉移因子，包含特異性好和純度高的低分子肽與核苷酸復合物， 其活性水平明顯優于常規方法和常規病毒株所制備的轉移因子。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步的描述。 實施例l:抗豬瘟轉移因子的制備
1、 將豬瘟病毒株CSFV 39(Genbank accession NO. J04358)和/或BVDV (Genbank accession NO. U63479)接種于9~11日齡雞胚尿囊液37*€培養 48h。取雞胚尿囊液，-20"反復凍融5次，5000rpm離心30min，棄去沉
淀收集上清液；
2、 取上清液，上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%, 150000rpm離心4小
時，根據豬瘟病毒分子量確定豬瘟病毒所在離心管的位置，吸出備用；
3、 得到的豬瘟病毒抗原免疫豬，挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒 抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫4次。每次免疫間隔一周，最后一次 免疫7天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的特異 性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價后，宰殺豬，取脾臟于-2(TC保存，
4、 從得到的豬脾臟提取抗豬瘟轉移因子
(1) 先用注射用水洗凈脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生 理鹽水沖洗；
(2) 將洗凈的豬脾臟剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用高 速組織搗碎機2000rpm搗碎3次，每次5min，制得豬脾勻漿液；
(3) 豬脾勻漿液用超聲波(4KW、 3KHz)處理5min;
(4) 將(3)中得到的勻漿液用HC1調pH5.0， 4°C， 5000rpm離心30min，
收集上清液；
(5) 上清液用0.2nm中空纖維柱微濾，收集濾出液；
(6) 濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集 濾出液；
(7) 將超濾得到的濾液用0.22pm濾膜進行無菌過濾；
(8) 分裝，4"C保存，即得到抗豬瘟病毒轉移因子原液。
實施例2:抗豬瘟轉移因子的制備
1、 將豬瘟病毒接種于9 11日齡雞胚尿囊液37'C培養72h。取雞胚尿囊 液，-20°(:反復凍融5次，5000rpm離心30min，棄去沉淀收集上清液；
2、 取上清液，上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為15%、 30%、 45%、 60%、 75%， 180000rpm離心3小時，根據豬瘟病毒 分子量確定豬瘟病毒所在離心管的位置，吸出備用； 3、 得到的豬瘟病毒抗原免疫豬，挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒 抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫4次。每次免疫間隔一周，最后一次 免疫10天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的特 異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價后，宰殺豬，取脾臟于-2(TC保 存，備用；
4 、 從得到的豬脾臟提取抗豬瘟轉移因子
(1) 先用注射用水洗凈脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生 理鹽水沖洗；
(2) 將洗凈的豬脾臟剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用高 速組織搗碎機1500rpm搗碎3次，每次5min，制得豬脾勻漿液；
(3) 豬脾勻漿液用超聲波(4KW、 3KHz)處理10min;
(4) 將(3)中得到的勻衆液用加入0.1%檸檬酸，混勻，4°C， 6000rpm 離心30min，收集上清液；
(5) 上清液用0.2nm中空纖維柱微濾，收集濾出液；
(6) 濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集 濾出液；
(7) 將超濾得到的濾液用0.22pm濾膜進行無菌過濾；
(8) 分裝，fC保存，即得到抗豬瘟病毒轉移因子原液。
實施例3:對本發明所述工藝制備的抗豬瘟轉移因子的檢測
對實施例1、 2所述工藝制備的抗豬瘟轉移因子進行以下檢測
1、紫外分光光度測定上述所得樣品在252±2nm處有一吸收峰，且
ABS260/ABS280〉2.0。2、 標準液為淡黃色，pH值在6.0-8.0之間。
3、 細菌學檢驗上述所得樣品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。
4、 20%磺基水楊酸檢測上述所得樣品無渾濁及沉淀現象，說明蛋白
反應均成陰性，其不含大分子蛋白質。
5、 核酸含量測定上述所得樣品經地衣酚法測定核酸含量分別為 578.53|Lig/mL、 521.68|ig/mL。
6、 多肽含量測定上述所得樣品經Lowry法測定多肽含量分別為-6.89mg/mL、 6.45 mg/mL。
7、 轉移因子活性測定根據轉移因子可使脫E受體后的胸腺T細胞恢 復其受體功能，從而反應轉移因子的生物活性。上述所得樣品形成E玫瑰 花結的百分率分別為28.6%、 26.9°/。，比對照組分別增加18.5%、 16.8%
(PS0.01)。
8、 過敏性、毒性試驗取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品濃
縮液，相當于正常口服劑量的100倍，觀察小白鼠的生存能力的變化，結
果無任何過敏、毒性反應，也無任何死亡出現，說明本品是安全的，無 任何毒性和副作用。
9、 用豬瘟抗原做皮試檢測，有弱的陽性反應，說明本品具有良好的轉 移活性和特異性。
通過上述實施例，我們發現所提取的抗豬瘟病轉移因子可以全面抑制 豬瘟病病毒，能保護正常機體細胞免受豬瘟病病毒的感染。因此使用本發 明的轉移因子可以起到預防豬瘟病、保護正常機體細胞免受豬瘟病病毒侵 害的作用，從而降低發病率。同時對于遭受到豬瘟病病毒感染的豬使用該 轉移因子進行治療，可以有效改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。
權利要求
1、一種抗豬瘟病轉移因子的制備方法，步驟包括(1)先用注射用水洗凈用豬瘟病病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生理鹽水沖洗；(2)將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS緩沖液，用高速組織搗碎機1000～3000rpm搗碎3～5次，每次3～5min，制得豬脾勻漿液；(3)豬脾勻漿液用超聲波(4KW、3KHz)處理5～10min；(4)將步驟(3)中得到的勻漿液用HCl調pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％檸檬酸，4℃，3000～8000rpm離心10～30min，收集上清液；(5)上清液用0. 2μm中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集濾出液；(6)將超濾得到的濾液用0.22μm濾膜進行無菌過濾，即得到抗豬瘟病病毒轉移因子原液，4℃保存。
2、 權利要求1所述的方法，其中在實施上述步驟之前，還包括制備病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫豬等步驟。
3、 權利要求2所述的方法，其中所述的制備病毒抗原步驟，包括將豬瘟病病毒接種于9 11日齡雞胚尿囊液30 4(TC培養24 72h。取雞胚尿囊液，-20。C反復凍融4~8次，3000~8000rpm離心10 30min，棄去沉淀收集上清液。
4、 權利要求2所述的方法，其中所述的提取病毒抗原步驟，包括上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為10%~80%，150000 200000rpm離心2 4小時，根據豬瘟病病毒分子量確定豬瘟病病毒所在離心管的位置，吸出備用。
5、 權利要求2所述的方法，其中所述的病毒抗原免疫豬步驟，包括挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫3 5次。 每次免疫間隔一周，最后一次免疫7 10天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或 ELISA法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價后， 宰殺豬，取脾臟于-2(TC保存，備用。
6、權利要求1或2所述的方法，其中豬瘟病毒株選自本申請人保藏的CSFV 39(Genbank accession NO. J04358)和/或BVDV (Genbank accession NO. U63479)。
全文摘要
本發明公開了一種天然高效抗豬瘟病轉移因子的制備方法，包括制備病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫豬、從免疫豬的脾臟中提取抗豬瘟病轉移因子等步驟。使用本發明的轉移因子可以起到預防豬瘟病、保護正常機體細胞免受豬瘟病病毒侵害的作用，從而降低發病率。同時對于遭受到豬瘟病病毒感染的豬使用該轉移因子進行治療，可以有效改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。
文檔編號C07K1/34GK101475627SQ20081015399
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者李旭東, 管于平, 蘇建東 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司