專利名稱：一種高效的固相萃取-hplc方法分離純化真菌產紫杉醇的制作方法
一種高效的固相萃取-HPLC方法分離純化真菌產紫杉醇
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種高效的固相萃取-HPLC方法 分離純化真菌產紫杉醇。
背景技術：
紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是一種復雜的天然的抗癌藥物，屬于二萜 生物堿。其基本結構由漿果赤霉素III (baccatinin)和連接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物構 成。
工業生產紫杉醇的早期策略，是采用從紅豆杉樹木原料中直接提取的方法，但由于紫杉 醇含量極低，水溶解性差，隨著該藥品應用范圍的擴大，所需紅豆杉數量將十分可觀，這也 給紅豆杉資源帶來嚴重威脅，可能造成生態環境的嚴重破壞。
化學法全合成紫杉醇，已于1994年在實驗室里取得了成功。但是，紫杉醇手性基團較多， 合成路線復雜，成本高、產率低，至今無法應用于工業生產。近年來，國內外學者進行了大 量紅豆杉愈傷組織培養和細胞懸浮培養研究，其中大部分已證實能產生紫杉醇，但是離體培 養生產紫杉醇實現工業化生產的關鍵問題難以突破。
國際制藥公司當前較普遍釆用的生產技術則是生化半合成法。半合成法雖然提高了紫杉 醇產量，但與直接提取紫杉醇的辦法并無本質上區別，仍然需要消耗大量紅豆杉樹木。
由于紫杉醇的市場供應受制于原料來源和制備技術兩方面的制約，使得藥價昂貴。為此， 制藥界和學術界一直在尋找新的更好的原料及方法，來代替現有的生產技術，以提高紫杉醇 的產量、滿足臨床需求。過去十余年中取得的最有意義的進展，是發現了與紅豆杉等裸子木 本植物共生的一些真菌產生紫杉醇，并且其化學結構和生物活性與紅豆杉所產紫杉醇完全相 同。據統計，國內外已報道的產生紫杉醇真菌種類已超過三十種，這些真菌絕大多數是子囊 菌或半知菌，而且大都是內共生真菌。和植物組織提取物一樣，真菌發酵液中產物眾多，而 紫杉醇的含量極低，這樣就在很大程度上增大了生產紫杉醇的成本，同時發酵液的粘度很大， 極容易堵塞色譜柱。為了解決這些問題，研究高效、經濟的提取分離方法，以提高紫杉醇的 純度和回收率，從而促進紫杉醇的工業化發酵生產。
發明內容為了克服現有技術的不足和滿足市場的需求，本發明的目的在于Mf共一種高效 的固相萃取-HPLC方法分離純化真菌產紫杉醇，以提高發酵^中紫杉醇的得斜卩纟屯度。 本發明mf共的一種固相萃取小柱的i真裝方法，其包括±真料的選擇和±真裝方法。 所述的固相 小柱的填裝方法為干柱±真充法，填料為^t性氧化鋁。 本發明提供的一種固相萃取的方法，其包括固相柱的活化、上樣和M。 戶腿的活化方法為向固相小柱中依次加入氯仿、甲醇進斤活化，上樣為處理好的發MS接 上樣，l，液為乙酸乙酯。
本發明掛共的一種高效液相色譜分析的方法，其包括樣品的前處理，色譜柱的選擇和高效液 相色譜斜牛的確立。
所述的樣品的前處理步驟為固相,后收集的淵兌液，用氮氣揮干，甲醇復溶，再經0.45nm 的濾膜過濾。
所述的色譜柱為Cl8色譜柱5 urn (250 mmx(p4.6 mm)。
戶脫的高效液相色譜剝牛為流動相為甲醇7K(v/中70: 30，進樣量20jiL，〗繊1.0mL/min， 紫外檢測波長為227nm， t主溫為3(TC。
本發明的優點和積^*:
本發明提供了一種利用堿性氧化鋁固相萃取結合高效液相色譜分離純化真菌產紫杉醇的方 法，與常規的分離純化方法相比，紫杉醇的回收率得至U了顯著的提高，超i」138%,并且紫據純 度超lj了 92%。同時該方縣用干柱i真裝法，填料和活化、^i^試劑M以不需進一歩處理，節約 了時間，節省了費用。
圖1是固相萃取小柱的結構圖。1、聚丙烯柱管2、篩板3、填料4、接頭 圖2是堿性氧化鋁固相魏前后的色譜靴匕較。 其中Taxol處為紫杉醇峰，色譜流出曲線1為萃取前的圖譜，色譜流出曲線2為M后的圖譜。
4本發明劍共的能產紫杉醇的菌株是一株腐生真菌擬盤多毛孢，已于2008年10月8日保藏于 中國微生物菌種1BI管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區大屯路，中國科學院 微生物研究所，薪中臓號CGMCCNo.2694，分類命名/^加fo^戸^。
下面將M:實施例x寸本發明作進一步的描述，這些描述并不^x寸本發明內容作進一步的限定。 本領域的技術人員應aif，對發明技術特征所作的等同替換、或相應的改進，仍屬于本發明的保 護范圍之內。
^!i例i、 固相靴小柱的±真裝
采用干柱填充法進行小柱的填裝。先^A下端的聚丙烯膜(篩板)，接著把稱觀的±辯斗200 mg 堿性氧化鋁沿著漏斗加入管內，最后驗戰的篩板，用力壓實，即可f頓。固相靴小柱(SPE
柱)結構圖見圖l。
^M例2、 發M的固相,
先進行固相萃取小柱的活化向固相小柱中依7効n入2mL氯仿和2mL甲醇進行活化，最后 將液面維持在篩lli:l 2mm高度。向活化好的柱中力口入處理好的發 0.1 mL，上柱后，{頓2 mL乙酸乙酯直接M， ^BIS制為0.2mUmin，反復 5次，收^fel兌液，常溫常壓下用氮氣 揮干，再用a2mL甲醇復溶。
鄉例3、高效液相色譜的純化
樣品經甲醇復溶，經0.45Mm的濾Ma濾后，進行高效液相色譜(HPLC)純化。高效液相色 譜^#:自審iJCw， 5nm， cp4.6 x 250mm，流動相為甲醇水(v/v)-70: 30，迸祥量20mL。
^11.0mL/min，紫外檢測波長為227nm，法溫為3(TC。樣品經固相魏前后的色譜圖比
5較見圖2。由圖2可以看出，發酵液直接進樣(色譜流出曲線l)，基線不穩，雜峰很多，而 且紫杉醇對應的峰有點拖尾；經過固相萃取后(色譜流出曲線2)，不僅基線水平降低，較平 穩，而且在5 min內的紫外吸收值明顯降低，其它各處的雜峰也有所下降，紫杉醇對應的峰 形得到改善。
實施例4、固相萃取后的回收率和純度測定
固相萃取后回收率的測定向已知濃度Co的樣品中添加等體積的0.025 mg/mL的紫杉醇 標準品，取6份進行SPE-HPLC (固相萃取—HPLC)，根據標準曲線計算出最終濃度d。則 回收率為(Ci-Co)/0.025xlOO%
經回收率測定，結果如表l所示
表l固相萃取后的回收率
填料樣品含量加入的標準品回收taxol回收率RSD
Co (mg/mL)(mg/mL)Ci (mg/mU
堿性氧化鋁0.00720.0250麓7138%1.44%
紫杉醇純度的檢測，按照面積百分比的方法計算純度，經過SPE-HPLC (固相萃取一 HPLC)，純化后的紫杉醇純度為92%。
實驗結果表明利用本發明的技術方法-堿性氧化鋁固相萃取結合高效液相色譜法分離純 化真菌產紫杉醇，取得了較高的的回收率，提取的紫杉醇純度達到了 92% 。'
權利要求
1、一種高效的固相萃取-高效液相色譜(HPLC)方法分離純化真菌產紫杉醇，其特征在于將固相萃取技術和HPLC結合，從產紫杉醇真菌的發酵液中分離純化紫杉醇，紫杉醇的得率和純度得到了很大的提高。
2、 根據權利要求1所述的方法，，征在于固相萃取技術包括固相萃取小柱的±真裝，固相柱的活化、上樣和m
3、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于固相萃取小柱的填裝方法為干掛真充法，填料為堿 性氧化鋁。
4、 根據權利要求2所述的方法， 征在于固相柱的活化方法為向固相小柱中依次加入氯仿和 甲醇進摘化。
5、 根據權利要求2戶皿的方法，^#征在于固相柱的上樣為處 的發 3:接上樣。
6、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于固相柱的洗脫液為乙酸乙酯。
7、 根據權利要求1戶M的方法，欺寺征在于高效液相色譜純化的方,括樣品的前處理，色譜 柱的選，鳴效液相色譜剩牛的確立。
8、 根據權利要求7戶皿的方法，其特征在于樣品的前處理步驟為固相萃取后收* 液，用 氣氣揮干，甲醇復溶，再經0.45nm的濾Ea濾。
9、 tSffi權利要求7所述的方法，賺征在于高效液相色譜柱為C18色譜柱5Mm (250mmx(p4.6 mm)。
10、 根據權利要求7艦的方法，辦征在于高效液相色譜^f牛為流動相為甲醇水(v/v"70: 30，進樣量20nL， Ml.OmL/min，紫外檢測波長為227 nm， tt^溫為30。C。
全文摘要
本發明涉及用一種高效的固相萃取-HPLC方法分離純化真菌產紫杉醇，其包括應用固相萃取原理，改良性地建立了利用堿性氧化鋁固相萃取結合高效液相色譜分離純化真菌產紫杉醇的新方法，并且取得了138％的回收率，純度達到了92％，RSD(相對標準偏差)為1.4％。該方法采用干柱填裝法填裝堿性氧化鋁小柱，而且填料和活化、洗脫試劑都可以不需進一步處理，節約了時間，節省了費用，并且紫杉醇的回收率得到了顯著的提高。
文檔編號C07D305/00GK101492432SQ20081015365
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月1日 優先權日2008年12月1日
發明者呂憲禹, 朱旭東, 畢建男, 皎 潘, 苗會娟 申請人:南開大學