專利名稱：：抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法，特別是涉及一種抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移包子與抗菌肽的生產方法。
背景技術：
：轉移因子是從外來抗原致敏的正常動物白細胞中提取出來的一種淋巴因子，或從經某種抗原刺激后的恢復期動物血細胞中提取出來的一種淋巴因子。前者稱非特異性轉移因子，后者則稱特異性轉移因子。這兩種轉移因子在體內外最重要的是可傳遞細胞免疫功能，作為過繼免疫治療的一種免疫制劑，在免疫系統中發揮多種重要作用。轉移因子目前的制備方法是將動物新鮮或冷凍的脾臟及淋巴結在25°C左右去除脂肪及結締組織，然后用純化水洗凈；將洗凈的組織切成小塊，加入適量水，用組織搗碎機破碎細胞，制成勻漿，加適量純化水，混勻，置-20°C反復凍融58次，融化溫度不得超過37'C;將凍融的勻漿離心(離心溫度4°C),去沉淀，留上清液備用；上清液裝透析袋，透析24-48小時，半成品過濾除菌；成品的配置與檢驗。抗菌肽是經誘導，由動物免疫防御系統產生的可對抗外源性病原體的防御性肽類活性物質，分子量小、活性強，具有抗細菌、真菌、病毒和原蟲作用，甚至對癌細胞也具有殺傷作用，應用十分廣泛。目前的制備方法是以新鮮雞小腸為原料，去脂肪、漿膜和內容物，稱重后冷凍剪碎，搗碎成漿。勻槳后隔水煮沸15分鐘，按照l:1的比例加入5%乙酸，并在4'C條件下攪拌過夜，次日將混合物在4'C溫度條件下以8000轉/分鐘離心30分鐘，取上清，保存在4-C環境中。將沉淀物用等體積5%乙酸混合，再置于4。C攪拌浸提過夜，重復上述離心過程，取上清，合并兩次上清液，調整pH值，.再次離心，棄沉淀，上清液冷凍干燥品即為抗菌肽。現有技術制備轉移因子及抗菌肽的主要缺點是針對疾病沒有特異性，治療效果不穩定。
發明內容本發明的目的是克服現有技術中制備的抗菌肽及轉移因子針對疾病沒有特異性，治療效果不穩定等缺點，提供一種生產工藝簡單、成本低、產出率高、效果更好的抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法。本發明的技術解決方案概述如下一種抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法，由如下步驟組成(1)用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、雞法氏囊病毒疫苗各1-5mL肌肉注射免疫40-120日齡實驗豬，首次免疫后第7-20天，再以上述疫苗各2mL肌肉注射加強免疫；(2)密切監測實驗豬體內疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無菌采取實驗豬脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養；(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養，即獲得抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽。本發明的優點本發明先用禽流感病毒、新城疫礙毒、雞法氏囊病毒免疫動物，再以較少的免疫后的豬脾臟或抗凝外周血為原料，制成淋巴細胞單層，在體外培養，誘導淋巴細胞單層生產出大量抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子和抗菌肽的混合體，本發明的方法制備的抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽無需進一步的提純，可經超聲波及凍融簡單處理后直接將混合體用在禽類體內，即可起到抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒及抗菌的作用，同時提高禽類的免疫力。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1一種抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法，步驟(1).免疫用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、雞法氏囊病毒疫苗各lmL肌肉注射免疫90日齡實驗豬，同步設立空白對照組，首次免疫第15天，再以上述疫苗各2mL肌肉注射作為加強免疫；(2)密切監測實驗豬體內疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無菌采取實驗豬脾臟，用脾臟制備淋巴細胞單層，步驟為A、處理豬脾臟取新鮮豬脾臟置于無菌玻璃容器中，加入PBS(pH為7.2)溶液浸泡半小時(或浸于質量百分濃度為1%的新潔爾滅溶液中)，取出以酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除脾臟脂肪及包膜，用PBS(pH為7.2)液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪將脾臟剪成lmm3小塊，再用PBS(pH為7.2)液洗滌3次，以去除血細胞、色素物質及剪碎過程中機械損傷的細胞；B、消化及分散組織塊將上步清洗過的PBS(pH7.2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按組織塊體積的5倍量加入0..25%胰蛋白酶液^8為7.7)，置37'C水浴中消化30分鐘。每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續消化，直到組織變成松散、表面發毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH為7.2)液洗滌3次，用O.5%水解乳蛋白——Hanks液洗，用口徑稍大的細管吹打數次，用四層紗布濾過；C、細胞計數采用標有O.lmm字樣的血球計數板進行計數，計數方法與白細胞計數相同；D、細胞懸液的分裝和培養按細胞計數結果，將細胞懸液用德DMEM營養液調整至60萬/毫升細胞懸液。將細胞懸液分裝入細胞培養瓶和細胞轉瓶，分裝量為該瓶容量的1/5，蓋上蓋，做好標識，然后將細胞培養瓶和轉瓶分別放在二氧化碳培養箱和轉瓶機上培養；E、觀察置于37'C培養的細胞，需逐日進行觀察。若細胞已生長，則要觀察細胞的形態特征并判斷其所處的生長階段(游離期、吸附期、繁殖期、維持期和衰退期)，直至形成淋巴細胞單層。(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養5在作傳代細胞培養前，首先將培養瓶置于顯微鏡下現察，以確定細胞已長成單層，即可進行細胞的傳代培養。(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養。當脾淋巴傳代細胞長成單層后，更換維持液同時加入植物血凝素誘導培養。誘導培養24小時后對產品進行檢驗將細胞培養物經超聲破碎后取樣檢測轉移因子和抗菌肽的濃度。轉移因子濃度的測定對轉移因子的定量多以多肽含量定量用Folin-酚法或分光光度法測定多肽含量，以多肽含量lmg為一個轉移因子單位。此工藝生產的轉移因子含量是常規生產的的45倍。抗菌肽濃度測定采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白為標準溶液，考馬斯亮藍G250為顯色劑，在分光光度計測定所生產的抗菌肽的濃度。本方法生產的抗菌肽的濃度是常規提取量的10倍。應用實例150只15日齡肉雞(經過健康檢査無菌)分為A、B、C、D、E共5組，每組30只，B、C、D、E組經過人工感染0.lml混合病毒雞新城疫病毒強毒攻-毒后作實驗。A組為健康組〃不感染病毒，不給藥;B組陰性對照組，感染病毒，不給藥；C組和D組為本發明的方法制備的產品，C組為低劑量組，按0.02g/雞/天注射；D組為藥物組合物高劑量組，按0.04g/雞/天注射；E組為傳統"黃芪多糖"治療組，按0.1g/雞/天給藥。結果表明，采用本發明一種抗病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法制備的產品對雞法氏囊病有著明顯的治療作用。實驗結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結果表明，低劑量治療組、高劑量治療組與陰性對照組差異非常顯著(P<0.01=，說明本發明一種抗雞病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法制備的產品對雞新城疫病具有顯著的治療作用；特別是高劑量治療組應用明顯優于傳統"黃芪多糖"治療組療效(P<0.01)。抗菌肽抑菌實驗抑菌實驗顯示，本發明所生產的抗菌肽微克分子濃度能殺死73%以上的革蘭陽性、革蘭陰性細菌和真菌。它的抗菌譜廣，能抑制葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、產氣單胞菌、綠膿桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、放線菌、分枝桿菌等十余種近150株分離株，且實驗中抑菌圈直徑在22mm以上的細菌在71%以上。半成品和成品的檢驗半成品檢定半成品進行細菌內毒素、無菌檢査、pH值等項檢測。成品檢定成品分別作轉移因子和抗菌肽的鑒別試驗、外觀檢測、PH值、多肽含量、特異活性試驗、蛋白質反應、無菌檢查、細菌內毒素、異常毒性等項檢驗。實施例2一種抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法，步驟(1)免疫用禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒疫苗各1.2mL肌肉注射免疫50日齡實驗豬，同步設立空白對照組，首次免疫后第7天，再以上述疫苗各2.5mL肌肉注射作為二次免疫；二次免次后的第10天，再以上述疫苗3mL肌肉注射作為三次免疫；(2)密切監測實驗豬體內疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無菌采取抗凝血，用抗凝外周血制備淋巴細胞單層，步驟為無菌靜脈采取動物全血250毫升，加1.2%肝素溶液15mL抗凝，靜置90分鐘，用帶膠球吸管吸取紅細胞層以上的所有血漿，特別是緊接紅細胞層上的白細胞層要盡量吸取，分裝于消毒離心管內，用PBS(pH為7.2)液反復洗滌2次，離心速度1000轉/分，，然后用含30%犢牛血清水解乳蛋白40毫升進行白細胞培養，均勻混合后分裝于容量100毫升培養方瓶或磚瓶中塞緊瓶塞，置37-C恒溫箱中或磚瓶機中培養，經3天，白細胞均勻貼壁，即制成淋巴細胞單層。(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養；在作傳代細胞培養前，首先將培養瓶置于顯微鏡下觀察，以確定細胞已長成單層，即可進行細胞的傳代培養。(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養。當血淋巴傳代細胞長成單層后，更換維持液同時加入植物血凝素誘導培養。轉移因子濃度的測定、抗菌肽抑菌實驗的方法、半成品和成品的檢驗項目均同實施例1。實施例3一種抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法(1)用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、雞法氏囊病毒疫苗各5mL肌肉注射免疫40日齡實驗豬，首次免疫后第10天，再以上述疫苗各2mL肌肉注射加強免疫；(2)密切監測實驗豬體內疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無菌采取實驗豬脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養；(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養，即獲得抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽。實施例4一種抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法(1)用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、雞法氏囊病毒疫苗各1.5mL肌肉注射免疫120日齡實驗豬，首次免疫后第20天，再以上述疫苗各2mL肌肉注射加強免疫；(2)密切監測實驗豬體內疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無菌采取實驗豬脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養；(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養，即獲得抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽。權利要求1.一種抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法，其特征是由如下步驟組成(1)用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、雞法氏囊病毒疫苗各1-5mL肌肉注射免疫40-120日齡實驗豬，首次免疫后第7-20天，再以上述疫苗各2mL肌肉注射加強免疫；(2)密切監測實驗豬體內疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到高峰值時，無菌采取實驗豬脾臟或抗凝血，用脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養；(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養，即獲得抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽。全文摘要本發明公開了抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽的制備方法，步驟(1)用禽流感病毒疫苗、新城疫病毒疫苗、雞法氏囊病毒疫苗免疫實驗豬；(2)密切監測實驗豬體內疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達到峰值時，無菌取實驗豬脾臟或抗凝血制備淋巴細胞單層；(3)對淋巴細胞單層進行傳代培養；(4)當淋巴傳代細胞長成單層后，用植物血凝素誘導培養，即獲得抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒特異性轉移因子與抗菌肽。本發明的方法制備的產品無需進一步的提純，可經超聲波及凍融簡單處理后直接將混合體用在禽類體內，即可起到抗禽流感病毒、新城疫病毒、雞法氏囊病毒及抗菌的作用，同時提高禽類的免疫力。文檔編號C07K1/00GK101684140SQ200810151758公開日2010年3月31日申請日期2008年9月25日優先權日2008年9月25日發明者王連民,田杏芳申請人:天津生機集團股份有限公司