結核分枝桿菌融合蛋白的構建及其應用的制作方法

專利名稱：結核分枝桿菌融合蛋白的構建及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及融合蛋白的構建領域。
技術背景全球約1/3人口被結核感染，90%以上處于潛伏狀態。減毒牛型結核分枝桿菌-卡介苗 (Bacille Calmette-Guerin, BCG)對預防兒童嚴重的結核感染有效，然而對成人肺結核幾 乎沒有保護作用，因此亞單位疫苗增強免疫策略對于提高成人肺結核免疫保護水平具有重要 的意義[11]。以往結核亞單位疫苗研究主要選擇生長早期和對數生長期表達的抗原，忽略了休 眠期細菌特有的抗原。然而，休眠狀態結核桿菌在人體內是普遍存在的。感染機體的結核桿 菌可能有處于休眠狀態的結核桿菌。結核桿菌被巨噬細胞吞噬后，受到天然免疫物質NO等的 攻擊，可能轉入休眠狀態。處在結核結節低氧環境中的細菌，也大多轉入休眠狀態。休眠狀 態的結核桿菌潛伏感染是成人肺結核復發的主要來源。BCG免疫機體后，由于休眠期抗原表 達量低，不能針對休眠期細菌產生免疫反應，導致對休眠狀態結核桿菌沒有免疫保護。然而 在與結核病患者密切接觸的健康人群中，發現對休眠期抗原存在很強的免疫應答。基于上述 研究，建立對休眠期細菌的免疫應答對控制成人結核病發生具有重要意義。發明內容本發明的目的在于提供一種結核分枝桿菌融合蛋白的構建及其應用方法，尤其是在結核 亞單位疫苗中的應用。隨著人們對潛伏感染的認識，休眠期結核桿菌表達的抗原物質開始受到重視。休眠期結 核桿菌為了適應缺氧等惡劣生存環境部分基因表達上調。在低氧和NO作用的環境中，休眠相 關DosR調節子(包括48個基因)禾卩HspX ( a —crystallin)基因表達上調。部分上調表達的 因子有抗原性。其中，H印X抗原可以被致敏的T細胞識別，刺激T細胞分泌IFN—y ，具有細胞 免疫和體液免疫原性。在健康的與肺結核密切接觸的家人(80%)和醫務工作者(90%)中， H印X具有明顯的T細胞刺激活性，比例明顯高于普通人群(50%),提示HspX抗原具有免疫保護 作用。Ag85B屬于結核桿菌抗原85復合體家族成員。該家族是結核桿菌短期培養物的濾過蛋白質(short-term culture filtrates, ST-CF)中的主要分泌性蛋白質，己證實是重要的結核桿菌 免疫保護性抗原。Mpt64是結核桿菌的分泌性蛋白質，也是結核桿菌ST-CF中的主要成分,可以 占到結核桿菌培養基上清濾過液中蛋白質總量的8%，其第190 19S為多肽片段H-2D(b)限制 性的CD8 + T細胞表位。為了實現上述目的，本發明提供了結核分枝桿菌融合蛋白包含保護性抗原HspX; —段為 CD8+T細胞表位Mpt64的190_ 198位的氨基酸多肽；以及結核桿菌抗原85復合體Ag85B。本發明的結核分枝桿菌融合蛋白為Ag85B-Mpt64190-198-HspX,簡稱為AMH。為了更方便的使用AMH，將AMH與佐劑混合構建亞單位疫苗。其中佐劑為二甲基三十六烷基銨(DDA)為基礎的復合佐劑(含卡介苗多糖核酸， BCG-PSBN)。該結核分枝桿菌融合蛋白以包涵體的形式存在。該結核分枝桿菌融合蛋白能在大腸桿菌中穩定表達，并能用Ni-NTA介質純化。AMM融合蛋白疫苗是我們已經構建的融合蛋白疫苗，所選抗原為結核分枝桿菌的保護性 抗原物質Ag85B、 MPT6419(M98、 Mtb8.4，并將三者串連表達。我們的研究表明AMM融合蛋白 在佐齊UDDA—BCG PSN輔助下能夠誘導較強的體液免疫和細胞免疫反應，并且誘導以Thl型 細胞免疫為主的免疫反應，是有潛力的抗結核候選疫苗。為了進一步加強對休眠期細菌的免 疫保護水平，我們用HspX替換Mtb8.4構建了新的融合蛋白AMH，并通過特異性細胞免疫和體 液免疫的檢測，比較評價AMH融合蛋白的免疫活性。本發明的有益效果1、 本申請篩選休眠期保護性抗原，將休眠期抗原、對數生長期抗原聯合使用，試圖建立 針對結核桿菌不同生長狀態菌群的免疫反應，從而有效清除或監視包括潛伏感染在內的各類 結核桿菌，預防成人結核病的發生。2、 本發明選用抗原Ag85B、 Mpt6419。—198、 HspX，構建融合蛋白，以克服單一抗原免疫原不 足的缺點，同時建立對生長期和休眠期細菌全面的免疫力。3、 結核桿菌感染機體后激活CD4+、 CD8+T細胞和CD1限制的T細胞，激活的T細胞生成釋放 IFN-Y等細胞因子，激活巨噬細胞，從而清除結核桿菌。此外，CD8+T細胞被激活后，還會釋放穿孔素等淋巴毒性顆粒物質直接殺傷感染了結核桿菌的靶細胞和結核桿菌。因此，結核疫 苗的目標就是要建立Thl型為主的細胞免疫反應。此外，CD8+T細胞對抑制潛伏感染的復發具有重要作用。4、 誘導T細胞釋放IFN- y的能力常被用來做為評價候選疫苗是否誘導Thl型細胞免疫 的關鍵指標。本研究中ELISP0T檢測結果表明，針對AMH的組分HspX、 MPT6419M98以及PPD 刺激，A腿+DDA+BCG-PSN免疫小鼠脾淋巴細胞分泌IFN- y的水平最高，Ag85B +DDA + BCG-PSN 及AMM+ DDA+ BCG-PSN免疫小鼠均次之；應用AMH的另一組分Ag85B刺激時，IFN- y分泌水 平雖低于后兩組，但仍較高。說明AMH的T細胞表位可被很好地識別，誘導機體產生較強的 細胞免疫反應。尤為重要的是，融合抗原免疫小鼠脾淋巴細胞受CD8+T細胞表位MPT6419Q—198 刺激后，可以分泌IFN- y ，說明該融合蛋白疫苗較Ag85B和AMM疫苗誘導了較強的CD8+T淋 巴細胞，提示AMH疫苗具有抑制潛伏感染的作用。5、 IgG2a/IgGl常用于反映不同疫苗免疫后，所誘導的Thl/Th2反應。本研究發現，針 對Ag85B抗原，AMH+DDA十BCG — PSN免疫小鼠血清IgG2a/IgGl比值僅低于BCG免疫組，而高 于AMM和Ag85B免疫組，且IgGl及IgG2a滴度最高；HspX抗體，IgG2a/IgGl比值及抗體滴 度均高于其它各組；針對PPD的抗體水平，AMH+DDA+BCG — PSN免疫組IgG2a/IgGl比值不高， 但抗體滴度較高，僅低于AMM+DDA+BCG—PSN組，可能與PPD的復合成份引起多種免疫反應 有關。由此可見融合蛋白AMH在復合佐劑DDA和BCG—PSN的輔助下，具有較強的誘導體液免 疫的能力，且其細胞免疫反應傾向于Thl型免疫應答，免疫效應強于單一抗原Ag85B構成的 疫苗。


圖1為融合蛋白AMH氨基酸序列示意Z為在大腸桿菌BL21中表達純化蛋白質AMH，其中M:蛋白分子量Marker; 1:大腸桿菌 BL21超聲裂解液上清；2: AMH包涵體溶解液；3: AMH經Ni-NTA柱純化，洗脫緩沖液pH4.5圖3a、3b、3c、3d分別為免疫小鼠脾淋巴細胞受到Ag85B、 HspX、 Mpt64W0-198和PPD 蛋白刺激后分泌IFN- y的水平。以DDA-BCG多糖核酸(BCG-PSN)為佐劑，融合蛋白AMH(20u g/ 只/次)、AMM (20yg/只/次)和單個重組抗原Ag85B (20ug/只/次)皮下免疫C57BL/6小鼠 三次，同時設立BCG免疫組和空白組作為對照。最后一次免疫5周后，每組取4只以上小鼠， 無菌分離脾細胞，給予特異性抗原刺激(抗原刺激濃度分別為Ag85B 10Pg/ml、 PPD 10Pg/ml、MPT6419。—198 2Pg/ml、 HspX 2Pg/ml)， 共同孵育48h后采用ELISP0T方法檢測IFN-Y的分泌 水平。以每1X1()6個淋巴細胞中分泌IFN-Y的細胞個數表示。下圖為對應組小鼠脾細胞在相 應抗原PPD刺激下分泌IFN-Y的斑點成像。*與AMH+DDA+BCG-PSN組比較有顯著性差異(p <0. 05)。
具體實施例方式
為了更了解本發明的內容，特舉較佳實施例說明如下。
實施例l 融合蛋白AMH (Ag85B-Mpt64,剛-HspX)的構建 1、材料和方法 1. 1主要試劑材料
1.1.1主要材料結核桿菌毒力標準株H37Rv由上海市肺科醫院提供；DDA購自 Sigma-Aldrich公司；重組質粒pET28a-A麗、pET28a-Ag85B由復旦大學遺傳學研究所構建。 MPT64駅9s多肽片段由吉爾生化(上海)有限公司合成，純度90. 45%; Ni- NTAHis Bind Resins 購自Novagen (MD Chemicals Inc)公司；其余試劑均為國產或進口分析純。
質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒購買力自化舜公司，內切酶、連接酶等購買自 Biolab公司;IFNi ELISP0T kits為U-Cytech公司產品(Netherlands)。
1.1.2主要儀器設備SCR20BA型超低溫離心機(日本HITACHI公司)；超聲波細胞破碎儀(寧 波新芝科器研究所)；640型紫外吸收光譜儀(美國Beckman公司)；Vivaflow50超濾濃縮系 統(德國Sartorius公司)；DZF-6090真空丁燥箱(重慶恒達儀器廠)；Bio-Rad550型酶聯免 疫檢測儀(USA); Biosys Bioreader肖動酶聯斑點圖像分析系統(Bio-sys GrabH)。 1.1.3實驗動物C57BL6小鼠(SPF級)購自蘭州大學動物實驗中心。自由飲水進食，晝夜 節律12小時。
1. 2實驗方法
1.2.1重組蛋白Ag85B-MPT64訓—湧-HspX (AMH)的構建將&艦你t^的190-198位的基 因序列以及歷^r基因連接克隆入大腸桿菌表達載體，構建融合抗原J《55/Hf/^W，，-^ aT， 并在大腸桿菌中表達。
1.2. l.l設計引物如下:_^_
Primers SequenceAg85BFAATGGATCCTTCTCCCGGCCGGGGCTI ) Ag85BRATTGAGCTCGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG(&jc I ) HspXFl ATAGAGCTCATGGCCACCACCCTTC(Sac I )
HspXF2 ATAGAGCTCTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATT
ATGGCCACCACCCTTC(&c I ) H'spXR ACGAAGCTTTCAGTTGGTGGACCG (ffi/ din)
1. 2. 1. 2 PCR擴增Ag85B基因由于Ag85B基因后面要融合表達Mpt64190-198- HspX,所以設計 引物時把力^^皮冬止信號去掉，另外J^^術端的信號肽序列也被去掉，只擴增成熟肽部分。應 用5'-端特異性引物Ag85BF和3'-端引物六§858時廣增vfe9,55成熟肽片斷。PCR反應條件如下 96。C預變性l分鐘；98。C變性10秒，62。C復性20秒，72。C延伸l分鐘，30個循環;72。C延伸10 分鐘；4'Chold。 PCR產物經純化后，用&c I和5s州I雙酶切，克隆構建在質粒pET28a(+)中。
1.2.1.3 PCR擴增餘t似7^)-J^ -AfepJ (MH)片段以結核桿菌標準毒株(〃J祝r)DNA為模板， 先用HspXFl和HspXR擴增HspX基因片斷。PCR反應條件如下98。C預變性5分鐘；98。C變性45 秒，62。C復性45秒，72。C延伸2分30秒，30個循環；72。C延伸12分鐘。PCR產物經純化后，以 此為模板，用HspXF2和HspXR擴增l/^似/^ -76 -//邵爐合基因片斷。PCR反應條件同上。 1. 2. 1.4構建AMH表達質粒PCR產物經純化后，Ag85B片斷被5a出I和&cI酶切后，構建入 pET28相應的多克隆酶切位點，構建質粒pET28 Ag85B。 Mpt64190-198-HspX融合基因片斷用 'feci和歷"dIII雙酶切，克隆構建入質粒pET28 Ag85B中，構建質粒pET28 Ag85B-Mpt64190-198-HspX，經測序鑒定。
結果pET28aAMH質粒測序結果表明插入的AMH基肉序列與H37Rv基因組序列完全一致，無 突變。AMH蛋白序列如圖1示。
1.2.2 AMH蛋白表達純化活化表達A腿蛋白的E. coli BL21菌體，移入1升培養基中振蕩 培養Z-3h至0D600達到~0. 5;加入IPTG(0.8mM)37。C誘導振蕩培養4h; 4 。C離心(以下沒 有特殊說明，均為4 "C)12，000 gX10分鐘收集細菌;細菌重懸于不含尿素的BufferB (sodium phosphate buffer 0. 1 M, Tris-Cl 0. 0丄M, pH 8. 0) 5 ml/g濕菌，冰浴下超聲破碎細菌 30分鐘(200-300 W，超聲1 sec停1 sec); 12, OOOgXlO min離心收集AMM包涵體。AMH 蛋白溶于buffer B (urea 8 M， NaH2P04 0.1 M， Tris-CI 0.01 M， pH 8.0) 4 。C過夜；隨 后應用Ni-NTA His. Bind柱(Novagen)純化系統純化目的蛋白。將4 ml AMH溶液和1 ml 50%
7Ni-NTA His Bind介質混合，室溫下振蕩60min充分混合，仔細加入洗脫柱；首先加入2 X 4 ml buffer C (urea 8 M， NaH2P04 0.1 M， Tris-CI 0.01 M， pH 6. 3)洗滌；然后依次分別 加入Buffer D (urea 8 M， NaH2P04 0. 1 M， Tris-Cl 0.01 M, pH 5.9)禾tl Buffer E (urea 8 M, NaH2P04 0.1 M, Tris-CI 0.01 M, pH4. 5)洗脫。各個分離組分分別上樣于12% SDS-PAGE 電泳檢測，收集目的組分。最后，分離到的目的組分依次用尿素梯度溶液(6， 4， 2, 1， 0.5, and 0 M urea with 5 raM TrisCl, pH 7. 9)透析，4 。C下每個梯度透析12 h。 Lowry法測定 蛋白濃度。圖2示AMH蛋白包涵體及其純化產物，可見經Ni-NTA介質純化可以得到較高純度 的AMII蛋白。
實施例2亞單位疫苗的配制
將BCG-PSN用生理鹽水溶解至0. 6rag/ml，融合蛋白AMH用PBS稀釋至0. 5呢/ml。 DDA 用注射用水配制成2. 5 mg/ml ， 80 。C水浴10min，冷卻至室溫。取BCG-PSN溶液50y 1與等 量AMH蛋白溶液充分混勻，室溫放置lmin。在混合溶液中逐滴加入DDA，然后充分乳 化，使疫苗呈均一的乳油狀。 實施例3動物免疫試驗
1、 實驗動物分組(共六組)
A. AMH(20ug/次/只)+00八(250嗎/次/只)+卡介茼多糖核酸(BCG—PSN， 30ug/次/只)
B. Ag85B(20ug/次/只)+DM (M0ug/次/只)+卡介菌多糖核酸(30ug/次/只)
C. DDA (250ug/次/只)+卡介菌多糖核酸(30ug/次/只)
D. AMM(Ag85B-Mpt6419。—198-Mtb8.4， 20ug) +DDA (250118/次/只)+ BCG—PSN (30ug/次/只)
E. 生理鹽水(NS， 200iil/次/只)
F. BCG (5Xl(fCFU/只)
2、 免疫方法
分別在第1、 4、 7周用制備好的蛋白疫苗腹股溝皮下免疫動物(200ul/只)，卡介苗5 X106CFU在第一周腹股溝皮下免疫動物一次。蛋白疫苗最后一次免疫后5周采血檢測體液免 疫指標，動物處死無菌分離脾臟淋巴細胞檢測細胞免疫指標。 3 、 ELISA法檢測抗體水平
用Ag85B蛋白(5Pg/ml)， PPD蛋白(2(^g/m] ) , HspX (5化/ml)包被96孔板(10(M/Vell) 4'C過夜。用PBST溶液300ri/well洗板5次X5min/次。從l : 200開始至l : 12800，加入對倍稀釋的血清樣品，37"放置1 h。洗板后，加入200W/well的l : 20000稀釋的兔抗鼠IgGl、 IgG2a， 37。C放置lh。洗板后，加入100W/we11 TMB顯色液，室溫避光反應15分鐘顯色后，加 入5(mi/well終l卜液(2N的Il2S04)終止反應；在450nm檢測0D值。
結果重組AMH蛋白在佐劑DDA-卡介菌多糖核酸輔助下，可以刺激小鼠產生較高水平的 IgGl、 IgG2a，如表1示。針對Ag85B抗原，AMH+DDA+BCG—PSN免疫小鼠血清IgG2a/IgGl比值僅 低于BCG免疫組，而高于A醒和Ag85B免疫組，且lgGl及IgG2a滴度最高；HspX抗體，IgG2a/IgGl 比值及抗體滴度均高于其它各組；針對PPD的抗體水平，AMH+DDA+13CG—PSN免疫組IgG2a/IgGl 比值不高，但抗體滴度較高，僅低于AMM+DDA+BCG—PSN組。
__表l.疫苗免疫小鼠抗體水平檢測_
分組 抗Ag85B 抗HspX 抗PPD
IgGl IgG2a igG2a/IgGl IgGl IgG2a IgG2a/IgGl IgGl IgG2a
IgG2a/IgGl
AMH+DDA+BCG-PSN 12800 40320.322540 64002.52 6400 3200
0.50
Ag85B+DDA+BCG-PSN 5080 10080.20 800 8001.00 400 1131
2. 83
AMM+ DDA+BCG-PSN 12800 32000.251600 16001.00 12800 6400
0. 50
DDA+BCG—PSN 3200 400 0. 13 1008 635 0.63 566 1131
2. 00
BCG 800 10081.26 504 6351.26 800
1131 1."
NS 8040 - 4040 - 40
40 _
以DDA-BCG多糖核酸(BCG-PSN)為佐劑，融合蛋白AMH (20ug/只/次)、AMM (20ug/ 只/次)和單個抗原Ag85B (20ii g/只/次)皮下免疫C57BL/6小鼠三次，同時設立BCG免疫 組和空白組作為對照。最后一次免疫5周后，每組取4只小鼠，摘除眼球取外周血，分離血 清，采用ELISA方法檢測血清抗Ag85B、 PPD和HspX IgG,、 IgG2a抗體水平。抗原包被濃度分別為Ag85B 5^/ml、 PPD 20Pg/tnl、 HspX 5Pg/ml。
4、 ELISPOT法檢測免疫小鼠脾細胞分泌IFN- Y細胞數
IFN- y的水平與結核病的保護性免疫反應相關。應用ELISPOT方法檢測了免疫小鼠脾臟淋
巴細胞分別針對特異性抗原分泌IFN-y的水平。小鼠最后一次免疫五周后無菌分離脾臟，應
用ELISP0T技術檢測脾細胞受到Ag85B蛋白、HspX蛋白、Mpt64柳，多肽，PPD蛋白刺激后IFN-
y的表達ELISPOT板預先用IFN-y抗體包被過夜，無菌摘除脾臟，研磨后經200目尼龍網過
濾，經淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。加終濃度為5X107mL的淋巴細胞100W/well入96孔
ELISPOT板中，分別給予Ag85B蛋白(脅g/ml)' HspX蛋白(2l^g/ml), Mpt64蛋白(2Pg/ml)，
PPD蛋白(10化/ml)刺激。共同孵育48小時后，按ELISPOT操作說明依次加入檢測抗體等試
劑，洗板、顯色，計數斑點數。數據應用One-Way ANOVA (spss10. 0)進行統計學處理。
結果重組AMH蛋白在佐劑卡介菌多糖核酸-DDA輔助下，免疫小鼠脾淋巴細胞受到 Ag85B、 HspX、 Mpt6419。 —19S和PPD蛋白刺激后，能分泌較高水平的IFN-y ，如表2和圖3示。其 中，A腿亞單位疫苗免疫小鼠脾細胞受到特定抗原(HspX、 Mpt6419。—剛和PPD)刺激后，產生分 泌IFN-y的淋巴細胞數 (108±48、 159±55、 220±43)明顯高于單個抗原Ag85B免疫組(44 ±5、 28±8、 131±52， t值分別為3. 63、 5.77、 3.45， p<0. 05)和另一個融合蛋白A麗組(10 ±2、 33±2、 114±43， t值分別為3.89、 4.74、 3.86， p<0.05)。
表2.分泌工FN- y的淋巴細胞數/1 x 106個淋巴細胞
分組 Ag85b+ HspX+ MPT64削—198+ PPD十
X土SDtX士SDtX土SDtX士SDt
AMH+DDA+BCG-PSN169 ±35108±48159±55220 ±43
Ag85B+DM+BCG-PSN206 ±2144 ±5*3.6328 ±8*5.77131±52*3. 45
_1. 89
DDA十BCG-PSN54 土25±5*4. 995.3640 ±18*6.47
5. 30
扁+DM+BCG-PSN280 ±50*-4. 4910±2*3. 8933±2*4.74114 ±43*3. 86
NS19 ±4*8.2212±2*3.822±1*4.7210±5*9. 56
BCG30 ±6*7. 353±2*4. 9337±9*5.0520 ±12*9. 04
N》4
t與AMH+DDA+BCG-PSN組比較*與AMH+DDA+BCG-PSN組比較有顯著性差異(p<0. 05)。
權利要求
1、結核分枝桿菌融合蛋白，含結核分枝桿菌融合蛋白包含保護性抗原HspX、一段為CD8+T細胞表位Mpt64的190-198位的氨基酸多肽、以及結核桿菌抗原85復合體Ag85B。
2、 根據權利要求l所述的結核分枝桿菌融合蛋白，其特征為所述的結核分枝桿菌融合蛋 白與佐劑混合構建亞單位疫苗。
3、 根據權利要求2所述的結核分枝桿菌融合蛋白，其特征為佐劑為二甲基三十六烷基銨 為基礎構成的復合佐劑，抗原為融合蛋白AMH。
4、 根據權利要求l所述的結核分枝桿菌融合蛋白，其特征為所述的結核分枝桿菌融合蛋 白以包涵體的形式存在。
5、 根據權利要求l所述的結核分枝桿菌融合蛋白，其特征為所述的結核分枝桿菌融合蛋 白能在大腸桿菌中穩定表達。
6、 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌融合蛋白，其特征為利用Ni-NTA介質純化。
全文摘要
本發明為結核分枝桿菌融合蛋白的構建及其應用，涉及融合蛋白的構建。現有的結核分枝桿菌融合蛋白忽略了休眠期細菌的特有的抗原，本申請提供結核分枝桿菌融合蛋白包含保護性抗原HspX、一段為CD8⁺T細胞表位Mpt64的190-198位的氨基酸多肽、以及結核桿菌抗原85復合體Ag85B。篩選休眠期保護性抗原，將休眠期抗原、對數生長期抗原聯合使用構建疫苗，試圖建立針對結核桿菌不同生長狀態菌群的免疫反應，從而有效清除或監視包括潛伏感染在內的各類結核桿菌，預防成人結核病的發生。
文檔編號C07K14/35GK101654477SQ20081014714
公開日2010年2月24日 申請日期2008年8月21日 優先權日2008年8月21日
發明者于紅娟, 傅林鋒, 姜雯雯, 宋楠楠, 青 李, 王洪海, 王秉翔, 祝秉東, 郄亞卿, 彧 雒 申請人:蘭州大學