人重組chemerin蛋白、重組載體、轉化體及其制備方法

專利名稱：人重組chemerin蛋白、重組載體、轉化體及其制備方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及人重組chemerin蛋白、重組載體和轉化體及 其制備方法。
背景資料
chemerin是一種最近被新發現的趨化功能蛋白，為ChemR23配體，最早是從卵巢癌晚 期病人腹腔積水分離純化出來(Val6rie Wittamer, Jean-Denis Franssen, Marisa Vulcano, et al.， J.Exp. Med. 198 (2003) 977—985.)。人Chemerin基因(GB: NM_002889)長度為734bp， CDS長度為492bp， CDS中前面60bp編碼一長度為20氨基酸的信號肽，最后21bp編碼 一6氨基酸的C端多肽。其前體蛋白質是由163個氨基酸殘基組成，N端的信號肽不包含 在分泌出來的Chemerin前體蛋白內，而Chemerin前體蛋白被血清中的絲氨酸蛋白酶酶切 長度為6氨基酸的C端多肽之后，成為具有生物活性的chemerin。
通過與ChemR23結合作用，chemerin對樹突狀細胞和巨噬細胞遷移具有強大的趨化作 用(Val6rie Wittamer, Jean-Denis Franssen, Marisa Vulcano, et al" J. Exp. Med. 198 (2003) 977-985.)。有研究表明chemerin對血中NK細胞具有募集作用(Silvia Parolini, Amerigo Santoro, Emanuela Marcenaro, et al" Blood 109 (2007) 3625-3632.)。因此，chemerin作為一 種重要的免疫調控生理因子，被廣泛認為是一個新藥研究開發的熱點。最近研究資料顯示， chemerin還是一個非常重要的脂肪因子，肥胖人群的chemerin血清水平明顯高于對照組人 群，參與肥胖或糖尿病的發病調控(Takahashi， M. et al" FEBS Lett. 582 (5) (2008)， 573-578)， 可作為肥胖或糖尿病的臨床檢測指標之一。
但chemerin在生物體內含量很少，且難以純化。目前尚無有具有生物活性的人重組 chemerin蛋白報道或上市。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種人重組chemerin蛋白。
為此， 一方面，本發明公開了一種人重組chemerin蛋白，為如下(a)或(b)的蛋白質
(a) 其氨基酸序列如SEQIDNO.l所述的蛋白質；
(b) 在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有淋巴細胞趨化作用活性的由(a)衍生的蛋白質。
一方面，本發明公開了一種多核苷酸分子，其特征在于該多核苷酸分子編碼本發明所述
人重組chemerin蛋白。
在一實施例里，所述多核苷酸分子的堿基序列如SEQ ID N0.2。
一方面，本發明公開了一種包含本發明所述多核苷酸分子的重組表達載體。
在實施方式中，所述重組表達載體可為原核表達載體或真核表達載體，其中優選原核
表達載體，最優選pET28a質粒。
一方面，本發明公開了一種包含本發明所述重組表達載體的轉化體。 在一實施方式中，所述轉化體為大腸桿菌。
另一方面，本發明公開了一種本發明所述人重組chemerin蛋白的制備方法，包括如下
步驟
a) 人重組Chemerin蛋白表達載體的構建；
b) 人重組Chemerin蛋白轉化體的制備；
c) 人重組Chemerin蛋白的表達；
d) 人重組Chemerin蛋白的純化。
在一實施方式中，所述人重組Chemerin蛋白表達載體為包含編碼本發明所示蛋白的 DNA的表達載體，其中所述重組表達載體可為原核表達載體或真核表達載體，優選原核表 達載體，最優選pET28a質粒。
在一實施方式中，所述人重組Chemerin蛋白轉化體是包含人重組Chemerin蛋白表達 載體的大腸桿菌。人重組Chemerin蛋白表達載體優選為包含編碼SEQ ID NO.l所述人重 組chemerin蛋白DNA的表達載體。
在一實施方式中，在步驟c)后和步驟d)前，還包括人重組Chemerin蛋白的變性及復性 步驟所述大腸桿菌破菌并收集包涵體，所述包涵體溶解至鹽酸胍變性溶液中變性，然后 采用復性液復性人重組Chemerin蛋白，其中復性液為Tris-HC1緩沖液并含有谷胱甘肽氧 化還原系統，pH值在8. 0以上，其優選配方為0. lMTris-HCl， ImM GSH， 0. ImM GSSG。
發明人發現采用此緩沖液體系可保證復性出來的人重組Chemerin蛋白在pH調整至7. 0 以下時仍然保持可溶形式，而在其它一些復性液體系下，復性之后的蛋白質在pH調整至 7.0以下時，人重組Chemerin蛋白不可逆的沉淀。
在一實施方式中，所述人重組Chemerin蛋白的純化步驟，包括 (1)陰離子交換柱純化
人重組Chemerin樣品上陰離子交換柱，洗脫緩沖液A洗脫，收集蛋白洗脫液；
其中，洗脫緩沖液A為Tris-HCl緩沖液，pH6.5-8.0，優選為20mM Tris-HCl， ImM EDTA,25mMNaCl，pH7.0。
(2)陽離子交換柱純化
(1)所得的蛋白洗脫液調節pH至4.5，上陽離子交換柱，洗脫緩沖液B， 1.0ml/min洗脫， 收集電導〉60mS/cm的洗脫峰。
其中，洗脫緩沖液B為醋酸鹽緩沖液，pH3.0-5.0，優選50mMNaAc-HAc, lmMEDTA， pH4.5。
本領域技術人員均了解，真核蛋白新生的多肽鏈大多數是沒有功能的，必須加工修飾 才能轉變為有活性的蛋白質，如磷酸化、糖基化等修飾并切除新生肽鏈非功能所需片段， 為有功能的蛋白質。原核表達系統工藝成熟、成本低廉，但原核表達系統缺少這些加工修 飾功能，常導致原核表達系統中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確，或因折疊效率低下， 結果使得蛋白活性低或無活性。
本發明首次公開了人重組chemerin蛋白、重組載體和轉化體及其制備方法。本發明所 提供的人重組chemerin蛋白為直接具有活性的形式。本發明所述制備人重組chemerin蛋 白的方法，工藝簡單、成本低廉，不需要酶切等額外的步驟，所生產的重組chemerin蛋 白產品純度達到98%以上，內毒素含量低，活性高。這為chemerin蛋白在新藥研發和檢測 試劑的應用提供了豐富的、高質量的原料。


圖l.PCR電泳圖。
圖2. pET28a重組質粒的示意圖。
圖3.人重組Chemerin蛋白SDS-PAGE電泳圖。
圖4.人重組Chemerin蛋白毛細管蛋白電泳圖。
圖5.人重組Chemerin蛋白對于小鼠腹腔巨噬細胞的趨化作用。
具體實施例方式
下文將進一步詳細討論本發明的多個方面。
通過從酵母、如細菌的微生物或人或動物細胞系中分泌，可產生重組分子形式的本發 明的人重組chemerin蛋白。任選從宿主細胞中分泌多肽。
許多表達系統是已知的和可用的，包括細菌(例如大腸桿菌和枯草芽袍桿菌)，酵母(例 如釀酒酵母、乳克魯維酵母和巴斯德畢赤酵母)，絲狀真菌(例如曲霉)，植物細胞，動物細胞和昆蟲細胞。
本發明包括編碼本發明的人重組chemerin蛋白的DNA以及含有這些DNA的載體、 轉化體。
本發明中，轉化體(transformant)，即帶有異源DNA分子的受體細胞。
本發明還包括通過合成和重組技術生產本發明的人重組chemerin蛋白的方法。通過本 領域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、宿主細胞和生物體。
用于本發明的載體可以是如噬菌體、質粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉錄病毒載 體。可用于克隆和/或表達本發明的多核苷酸的載體是能在需復制和/或表達多核苷酸的 宿主細胞中復制和/或表達多核苷酸的載體。 一般說來，多核苷酸和/或載體可用于任何 真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網織紅 細胞)、大鼠、倉鼠(如CH0、 NS0和幼倉鼠腎細胞)或小鼠細胞(如L細胞))、植物細 胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞(如大腸桿菌)。有關適用于多種類型宿主細胞的適 當載體的例子可參見例如F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology . Greene Publishing Associates and Wiley_Interscience (1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。可以使用含有這些多核苷酸的宿主細胞來大量表達可用于例如藥物、診斷試 劑、疫苗和治療劑的蛋白質。
已開發出多種方法用于經由互補的粘性末端使DNA與載體可操作相連。例如，可在欲 插入載體DNA內的DNA區段添加互補的同聚體序列片段。然后通過互補同聚體尾之間的 氫鍵連接載體和DNA區段以形成重組DNA分子。
含有一或多種限制性位點的合成接頭提供了另一種連接DNA區段與載體的方法。用噬 菌體T4 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過內切核酸酶限制性消化產生的 DNA區段，所述的兩種聚合酶用其3'，5'-核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，并用 其聚合活性補平3'-凹端。因此，這些活性的聯合產生了平端DNA區段。然后在能催化 平端DNA分子連接的酶，如噬菌體T4 DNA連接酶的存在下將平端區段與大摩爾過量的 接頭分子一起保溫。因此，反應產物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區段。然后用適當 的限制性酶裂解這些DNA區段，并連接至已用酶裂解的表達載體中，所述酶能產生與所 述DNA區段相容的末端。從多個商家可以買到含有多個限制性內切核酸酶位點的合成接 頭。
多核苷酸插入物應該可操作地連接于同表達多核苷酸的宿主細胞相容的適當啟動子 上。啟動子可以是強啟動子和/或誘導型啟動子。列舉的一些啟動子的例子包括噬菌體久 PL啟動子、大腸桿菌lac、 trP 、 phoA、 tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉 錄病毒LTR啟動子。其它適當啟動子是本領域技術人員已知的。表達重組載體進一步含有轉錄起始、終止位點，并在轉錄區含有用于翻譯的核糖體結合位點。重組載體表達的轉 錄物的編碼部分可包括位于起點處的翻譯起始密碼子和適當地位于被翻譯多肽的末端的 終止密碼子(UAA , UGA或UAG)。
如上所述，表達載體可包括至少一個選擇標記。所述標記包括對真核細胞培養物而言 的二氫葉酸還原酶、G418 、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大腸桿菌和其它細菌 培養的四環素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。適當宿主的代表性例子包括但不限于 細菌細胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞(如釀酒 酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲細胞，如果蠅S2和夜蛾SF9細胞；動物細胞，如CH0， COS, NS0 ， 293和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。上述宿主細胞的適當培養基和培養條件 是本領域巳知的。
本發明還包括含有本發明的核苷酸序列的宿主細胞，所述核苷酸序列經本領域已知的 技術與一或多種異源控制區(如啟動子和/或增強子)可操作相連。可以選擇能調節插入 的基因序列的表達，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產物的宿主菌株。在某些誘 導物的存在下，某些啟動子啟動的表達會升高；因此，可以控制經基因改造的多肽的表達。 另外，不同宿主細胞具有特征性的和特殊的翻譯、翻譯后加工和修飾(如磷酸化、裂解) 蛋白質的機制。可以選擇適當的細胞系以確保對表達的外源蛋白質進行合乎需要的修飾和 加工。
通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、 感染或其它方法，即可將本發明的核酸和核酸重組載體導入宿主細胞。所述方法描述于多 個標準的實驗室手冊中，如Davisetal.， BasicMethods In Molecular Biology ( 1986 )。
編碼本發明的人重組chemerin蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標記的載體連接以在 宿主中增殖。 一般說來，可在沉淀物，如磷酸鈣沉淀物或其與帶電脂質的復合物中導入質 粒載體。如果載體是病毒，可使用適當的包裝細胞系在體外對其進行包裝，再轉導至宿主 細胞。
通過眾所周知的技術可以鑒定出被成功轉化的細胞，即含有本發明的DNA重組載體的 細胞。例如，可培養導入表達重組載體所得的細胞以產生所需多肽。收集并裂解細胞，使 用如Southern ( 1975 ) J. Mol. Biol. 95， 503或Berent et al (1985) Biotech. 3, 208 所述的方法，檢測其DNA內容物中DNA的存在。或者，使用抗體檢測上清液中蛋白質的存 在。
通過眾所周知的方法從重組細胞培養物中回收和純化本發明的人重組chemerin蛋白 較為有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖 維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層析。在一些實施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進行純化。 '
在一些實施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發明的人重組chemerin 蛋白。在其它實施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本發明的人重組chemerin 蛋白，所述層析柱有 Q s印harose FF柱、SP sepharose FF柱、Q s印harose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sephaxose FF或Methyl柱。
另外，可使用國際公開號W000/44772 (全文列入本文作為參考)中描述的方法純化本 發明的人重組chemerin蛋白。本領域技術人員可以容易地改動其中所述的方法以用于純 化本發明的人重組chemerin蛋白。可以從包括例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳 動物細胞的原核或真核宿主經重組技術產生的產物中回收本發明的人重組chemerin蛋白。
無需進一步描述，可以相信本領域技術人員可使用上文的描述和下文性的實施例來制 備和利用本發明中檢測到的改變并且實踐所要求的方法。因此，下述工作實施例具體描述 了本發明的某些實施方案，不能將其看成是對其余內容的限制。
實施例l.人重組Chemerin蛋白表達載體的構建
從人類肝臟cDNA中用引物5，-CATGCCATGGAGCTCACGGAAGCCCAGCG-3' ( SEQ IDN0.4)和反向引物5，-CCGGAATTCTTAGGAGAAGGCGAACTGTCCAG-3， ( SEQ ID N0.5)(由上海生工合成)PCR出人Chemerin基因。引物中加下劃線的部分是Ncol和 EcoRI的酶切位點。PCR條件為(95。C5分鐘94。C20秒鐘，63。C30秒鐘，72°C 30秒 鐘，30循環；72。C10分鐘)。PCR產物凝膠電泳，回收約500bp的DNA片段(見圖1)， 然后被包裝進入pTA2載體并測序(Invitrogene)。序列與SEQ ID N0.2 —致的菌落抽提質 粒，以Ncol和EcoRI雙酶切并將酶切下來的片段包裝進入Ncol和EcoRI雙酶切的pET28a 質粒。將pET28a質粒以化學轉染或電轉染的方法包裝進感受態的BL21。以卡拉霉素平板 挑選陽性克隆，并將陽性克隆抽提質粒，以Ncol和EcoRI雙酶切驗證正確包裝的質粒。
實施例2.人重組Chemerin蛋白的表達
實施例1制備的工程菌株在LB培養基(1% NaCl; 1% Tryptone; 0.5% Yeast Extract; pH7.0)中培養至OD600-0.6左右時，加入IPTG進行誘導(我們使用的是ImM濃度，然 而，更高或者更低的濃度也是適用的)。誘導在37-42。C下搖床培養進行4小時。誘導結束 后離心收集菌體，并以lxPBS (137mMNaCl; 2.7mMKCl; 4.3mMNa2HP04; 1.4mMKH2P04; pH7.4)進行洗滌。實施例3.人重組Chemerin蛋白的變性及復性
實施例2中離心收集的菌體以超聲的方式進行破菌并收集包涵體(新芝JY92-2D)， 500W，適量超聲。以3秒超聲3秒休息為一個循環，共300個循環。超聲緩沖液lxPBS; 1 mM EDTA; 0.1 mM PMSF; pH7.4。更強烈或者更溫和的超聲條件都是適用的。包涵體以 "PBS洗滌后，以10倍體積的變性緩沖液溶解(6M鹽酸胍；lmM EDTA; 50mM NaCl; 50mM Tris-HCl; pH8.0)。包涵體充分溶解后再將變性液滴加至復性液中(O.IM Tris-HCl; lmMGSH;0.1mMGSSG;pH9.5)，復性時需嚴謹控制蛋白濃度，最佳濃度為10-100ug/mL， 然而，更高或者更低的濃度也是適用的。
發明人研究表明，復性液為Tris-HCl緩沖液并含有谷胱甘肽氧化還原系統，pH值在9. 0 以上，可保證復性出來的蛋白在pH調整至8.0以下時仍然保持可溶形式，而在其它一些 復性液體系下，復性之后的蛋白質在pH調整至8. 0以下時，蛋白不可逆的沉淀。(見表1.) _表l.復性液對人重組Chemerin蛋白可溶性的影響_
先復性于(50mM NaH2PO4pH10.7，
lmM EDTA， 50mMNaCl)，然后 等體積稀釋至 (20mM Tris-HCl pH 8.0, lmM EDTA)
復性液
O.IM Tris-HCl; lmMGSH;O.lmM GSSG; pH9.5
25mM脇P(X pHlO. 7， lmMEDTA， 25mM NaCl
20mM Tris-HCl pH 8.0, lmM EDTA
pH<8.0時，人重組 Chemerin蛋白的可 溶性
+
注"+ "表示可溶；"—"表示不溶<
實施例4.人重組Chemerin蛋白的純化
實施例3所制備的人重組Chemerin蛋白復性液在15000RPM離心30分鐘后，取上清 以醋酸調節pH至7.5后，進行離子交換柱純化。步驟如下 (1)陰離子交換柱DEAE/Q柱過柱純化
a) 以Wash Buffer 1 (20mM Tris-HCl, lmM EDTA, 25mM NaCl ， pH7.5)平衡柱床將 A\B泵放入Wash Buffer 1中，流速各50%，以Wash buffer 1清洗整個管路及柱子 4-5個柱床體積，直至電導、UV值平衡。b) 上樣將A泵放入人重組Chemerin樣品內，調節進樣為A泵100。/。， B泵0%。
c) 上樣過程中收集Flow Through,作為S柱上樣的人重組Chemerin樣品。
d) Flow Through以醋酸調節pH至4.5 。
(2) 陽離子交換柱CM/S柱過柱純化
a) 以Wash Buffer 2 (50mM NaAc-HAc， ImM EDTA, pH4.5 )平衡柱床將A\B泵放入 Wash Buffer 2中，流速各50%，以Wash buffer 2清洗整個管路及柱子4~5個柱床 體積，直至電導、UV值平衡。
b) 上樣將A泵放入樣品內，B泵放入Wash Buffer 2+1M NaCl (50mM NaAc-HAc, ImM EDTA, 1M NaCl, pH4.5)內，調節進樣為A泵100%, B泵0%。
c) 上樣結束后以Wash Buffer 2平衡柱床，沖洗并平衡柱子2~3個柱床體積，直至電 導、UV值平衡。
d) 洗脫條件B泵20。/。-100。/。， l%/min， 1.0 ml/min洗脫，出峰時收集洗脫峰。在我 們的方法中，收集電導〉60mS/cm的洗脫峰。
(3) 純化后蛋白的處理
a) 純化后的人重組Chemerin蛋白以聚乙二醇20000濃縮，再以pH7.4的1><PBS透析。
b) 透析后的蛋白濃度可達lmg/mL以上，純度可達98%以上。蛋白可直接以液氮速凍 后置于-80。C低溫冰箱保存。
實施例5. SDS-PAGE電泳和毛細管電泳檢測
按照常規SDS-PAGE電泳操作，進行SDS-PAGE電泳。
結果見圖3:第l道分子量標記。第2道經IPTG誘導后的工程菌株超聲之后的上 清。第3道經IPTG誘導后的工程菌株超聲之后的包涵體沉淀。第4道陽離子交換柱
洗脫下來的純化的人重組Chemerin蛋白。第5道純化的人重組Chemerin蛋白以聚乙二 醇20000濃縮之后再以PBS透析之后的蛋白。蛋白純度經BandScan軟件分析其純度可達 98%以上。
實施例4制備的人重組Chemerin蛋白進行毛細管電泳檢測，條件為Electrophoresis system ACS200, China裝備UV檢測212nm。毛細管長度53厘米，有效長度44厘米。電 泳緩沖液50mM甲酸緩沖液，pH3.5。電壓25kV，電流110uA。結果見圖4，表明實施 例4制備的人重組Chemerin蛋白其純度高。
實施例6.人重組Chemerin蛋白內毒素檢測
采用鱟試劑(廈門鱟試劑實驗廠有限公司)，檢測了實施例4制備的三批人重組Chemerin蛋白的內毒素含量，分別為0.641 E.U.Aig， 0.603 E.U,/ug和0.685 E.U./ug。
實施例7.人重組Chemerin蛋白活性檢測
實施例4制備的人重組Chemerin蛋白對于小鼠腹腔巨噬細胞的趨化作用，趨化作用以 最大趨化作用的百分比顯示。在Transwell (Costar 3422， 8微米孔徑，膜直徑6.5毫米) 上室加入4x105個重懸于含10%FBS的RPMI 1640培養基內的小鼠腹腔巨噬細胞，體積為 200uL。下室加入600uL含10%FBS的RPMI 1640培養基，并含不同濃度的人重組Chemerin 蛋白。趨化結束后將趨化膜取下，擦去上表面黏附的細胞，下表面黏附的細胞即為被趨化 的細胞。在顯微鏡下計數5個隨即視野。每個濃度測試了三個復孔。
結果顯示，人重組Chemerin蛋白對于小鼠腹腔巨噬細胞顯示了較強的趨化作用。ED50 經計算為l-2ng/mL。
實例8人重組Chemerin第六位氨基酸由Ala改為Gly
將實施例1中所述的PCR目的基因片段自起始密碼子ATG之后第十四位堿基以定點突 變的方法改成G，艮卩(ATGGAGCTCACGGAAGCC)改為(ATGGAGCTCACGGAAGCC)， 其它步驟同實施例1一4，表達并純化后的蛋白質序列(SEQIDNO.3)第六位由Ala變為 Gly ，艮卩(Met Glu Leu Thr Glu Ala Gin Arg Arg Gly Leu)成為(Met Glu Leu Thr Glu Gly Gin ArgArgGlyLeu)。對這一純化后的蛋白質采用了實施例7中所述方法，在變異后的人重組 Chemerin蛋白濃度為l,10,100ng/mL時，其趨化活性(按照被區劃成功穿越Transwell膜孔 的細胞來計算)分別相當于對照的2倍，3倍及3.6倍，與實施例4制備的人重組Chemerin 蛋白相比無顯著變化。
本發明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發明各個方 面的單個例子，本發明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內 容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述 改進也落入所附權利要求書的范圍之內。上文提及的參考文獻皆全文列入本文作為參考。序列表
〈110〉再生醫藥有限公司
<120>人重組chemerin蛋白、重組載體和轉化體及其制備方法 <130>序列表
<160> 5
〈170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
〈211〉 138
〈212〉 PRT
〈213> Homo sapiens
<220>
<221> MUTAGEN <222> (l)..(l)
〈400> 1
Met Glu Leu Thr Glu Ala Gin Arg Arg Gly Leu Gin Val Ala Leu Glu 15 10 15
Glu Phe His Lys His Pro Pro Val Gin Trp Ala Phe Gin Glu Thr Ser 20 25 30
Val Glu Ser Ala Val Asp Thr Pro Phe Pro Ala Gly lie Phe Val Arg 35 40 45
Leu Glu Phe Lys Leu Gin Gin Thr Ser Cys Arg Lys Arg Asp Trp Lys 50 55 60
Lys Pro Glu Cys Lys Val Arg Pro Asn Gly Arg Lys Arg Lys Cys Leu 65 70 75 80
Ala Cys lie Lys Leu Gly Ser Glu Asp Lys Val Leu Gly Arg Leu Val 85 90 95His Cys Pro lie Glu Thr Gin Val Leu Arg Glu Ala Glu Glu His Gin 100 105 110
Glu Thr Gin Cys Leu Arg Val Gin Arg Ala Gly Glu Asp Pro His Ser 115 120 125
Phe Tyr Phe Pro Gly Gin Phe Ala Phe Ser 130 135
〈210〉 2 〈211〉 425 <212> DNA
<213> Aritfical Sequence 〈400〉 2
ccalggagct cacgg肌gcc csgcgccggg gcctgcgiggt ggccctggag gaMttcacs 60 agcacccgcc cgtgcagtgg gccttccagg agaccagtgt ggagagcgcc gtggacacgc 120 ccttcccagc tgg組3ttt gtgaggctgg組tt iagct gcagcagaca兆ctgccgga 180 agagggactg gaagaaaccc gagtgcaaag tcaggcccaa tgggaggaaa cggaaatgcc 240 tggcctgcat caaactgggc tctgaggaca aagttctggg ccggttggtc cactgcccca 300 tagagaccca agttctgcgg gaggctgagg agcaccagga gacccagtgc ctcagggtgc 360 agcgggctgg tgaggacccc cacagcttct acttccctgg acagttcgcc ttctcctaag 420 aattc 425
〈210> 3
<211〉 138
<212> PRT
<213〉 Homo sapiens
<220>
〈221〉 MUTAGEN <222〉 (1). . (1)<220>
<221> MUTAGEN <222> (6),. (6)
<400〉 3
Met Glu Leu Thr Glu Gly Gin Arg Arg Gly Leu Gin Val Ala Leu Glu 15 10 15
Glu Phe His Lys His Pro Pro Val Gin Trp Ala Phe Gin Glu Thr Ser 20 25 30
Val Glu Ser Ala Val Asp Thr Pro Phe Pro Ala Gly lie Phe Val Arg 35 40 45
Leu Glu Phe Lys Leu Gin Gin Thr Ser Cys Arg Lys Arg Asp Trp Lys
50 55 60
Lys Pro Glu Cys Lys Val Arg Pro Asn Gly Arg Lys Arg Lys Cys Leu 65 70 75 80
Ala Cys lie Lys Leu Gly Ser Glu Asp Lys Val Leu Gly Arg Leu Val 85 90 95
His Cys Pro lie Glu Thr Gin Val Leu Arg Glu Ala Glu Glu His Gin 100 105 110
Glu Thr Gin Cys Leu Arg Val Gin Arg Ala Gly Glu Asp Pro His Ser 115 120 125
Phe Tyr Phe Pro Gly Gin Phe Ala Phe Ser 130 135
〈210〉 4 〈211〉 29 <212> DNA<213〉 Aritfical Sequence 〈400〉 4
catgccatgg agctcacgga agcccagcg 29
<210> 5 <211> 32 <212〉 DNA
<213〉 Aritfical Sequence <400> 5
ccggaattct taggagaagg cgaactgtcc ag 3權利要求
1.一種人重組chemerin蛋白，為如下(a)或(b)的蛋白(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有淋巴細胞趨化作用活性的由(a)衍生的蛋白。
2. —種編碼權利要求1所述的人重組chemerin蛋白的多核苷酸分子。
3. —種包含權利要求2所述多核苷酸分子的重組表達載體。
4. 一種包含權利要求3所述重組表達載體的轉化體。
5. —種權利要求l所述人重組chemerin蛋白的制備方法，包括如下步驟a) 人重組Chemerin蛋白表達載體的構建；b) 人重組Chemerin蛋白的表達；c) 人重組Chemerin蛋白的純化。
6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述人重組Chemerin蛋白表達載體為包 含編碼權利要求1所述人重組chemerin蛋白DNA的表達載體。
7. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述表達載體可為原核表達載體或真核 表達載體。
8. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述表達載體可為pET28a質粒。
9. 如權利要求10所述的制備方法，其特征在于所述人重組Chemerin蛋白轉化體是包 含編碼權利要求1所述的人重組chemerin蛋白表達載體的大腸桿菌。
10. 如權利要求9所述的制備方法，其特征在于所述人重組Chemerin蛋白表達載體為 包含編碼SEQ IDNO.l所述人重組chemerin蛋白DNA的表達載體。
11. 如權利要求9所述的制備方法，其特征在于在步驟c)后和步驟d)前，還包括人重 組Chemerin蛋白的變性及復性步驟所述大腸桿菌破菌并收集包涵體，所述包涵體溶解至 鹽酸胍變性溶液中變性，然后采用復性液復性人重組Chemerin蛋白，其中復性液為 Tris-HCl緩沖液并含有谷胱甘肽氧化還原系統，pH 〉8.0。
12. 如權利要求11所述的制備方法，其特征在于所述復性液配方為0. lMTris-HCl， ImM GSH， 0. ImM GSSG， pH9.5。
13. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述人重組Chemerin蛋白的純化步驟， 包括a.).陰離子交換柱純化人重組Chemerin樣品上陰離子交換柱，洗脫緩沖液A洗脫，收集蛋白洗脫液，其中，洗脫緩沖液A為Tris-HCl緩沖液，pH6.5-8.0; b).陽離子交換柱純化蛋白洗脫液調節pH至4.5，上陽離子交換柱，洗脫緩沖液B1.0ml/min洗脫，收集 電導〉60mS/cm的洗脫峰，其中，洗脫緩沖液B為醋酸鹽緩沖液，pH3.0-5.0。
14. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于所述陰離子交換柱為DEAE/Q柱。
15. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于所述洗脫緩沖液A為20mM Tris-HCl, lmM EDTA, 25mM NaCl, pH7.0。
16. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于所述陽離子交換柱為CM/S柱。
17. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于所述洗脫緩沖液B為50mM NaAc-HAc， ImMEDTA, pH4.5。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及人重組chemerin蛋白、重組載體和轉化體及其制備方法。本發明首次公開了人重組chemerin蛋白、重組載體和轉化體及其制備方法。本發明所提供的人重組chemerin蛋白為直接具有淋巴細胞趨化活性的形式。本發明所述制備人重組chemerin蛋白的方法，工藝簡單、成本低廉，不需要酶切等額外的步驟，所生產的重組chemerin蛋白產品純度達到98％以上，內毒素含量低，活性高。這為chemerin蛋白在新藥研發和檢測試劑的應用提供了豐富的、高質量的原料。
文檔編號C07K14/435GK101619100SQ200810130458
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月4日 優先權日2008年7月4日
發明者砥 向, 偉 韓 申請人:再生醫藥有限公司