專利名稱：重組家蠶抗菌肽cm4的生產和純化方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及家蠶抗菌肽CM4多拷貝表達載體的構 建、表達、純化以及最佳拷貝菌株的篩選等技術。
背景技術：
抗菌肽是所有生物天然免疫系統中重要組成部分，它們組成了高等動物防御 外來生物的第一道的防線，迄今已有1000多種具有抗菌活性的多肽被分離鑒定。 抗菌肽的抗菌譜廣，不但對常見致病細菌和原蟲有殺傷作用，而且能抑制甲型流 感病毒、水泡性口膜炎病毒和人免疫缺陷癥病毒的復制。抗菌肽通過對細菌細胞 膜的影響發揮作用，細菌不容易產生耐藥性而有望成為新一代的肽類抗生素。
抗菌肽CM4是張雙全等從中國家蠶(Bow&x ww7')(浙農1號X蘇12號) 中分離得到的。它是線性的、具有a螺旋兩親的陽離子肽，由35個氨基酸組成， 分子量約為3.8KD，有很強的殺菌能力，對細菌，真菌等都有作用。不含甲硫氨 酸。從蠶蛹中提取的抗菌肽CM4具有較廣泛的抗菌和殺傷某些腫瘤細胞的能力， 并且不破壞正常細胞。
由于抗菌肽潛在的重要臨床價值，人們對其產生了極大的興趣。但提取工藝 繁瑣和成本太高使的獲得大量天然產物面臨巨大難，因此人們對基因工程技術產
生了極大的興趣。但是到目前為止,國內外眾多實驗室已進行了各種嘗試。如 Andersons和Hellers在昆蟲桿狀病毒中表達抗菌肽A; Reichart在酵母體系中表達 防御素。雖然均有不同特點,但總的說來,所表達抗菌肽的量還不能達到實際醫藥 研發的層次.為此,很多研究者開始采用串聯表達的方式來提高產量。人們仿效 "操縱子"模型,將目的基因一個一個串聯起來,形成多個閱讀框(ORF),或者僅串聯 目標基因編碼序列,形成一個ORF,置于表達載體啟動子的控制之下,使目的基因 在宿主菌中以串聯體方式表達。這樣,一方面利用串聯體的空間結構有效屏蔽了 單體產物的毒性作用，另一方面也可有效地提高目標蛋白的表達效率。 一般的，
基因串聯體有以下幾種構建策略(1)隨機定向串聯法；(2) PCR擴增串聯法；(3)化學拼接法；(4)同尾酶法；(5)其他方法(饒賢才,胡福泉.基因串聯體的構 建策略及其表達模式[J ].醫學研究生學報，2006， 19 (6): 557-560.)
抗生素的大量應用，導致耐藥菌的產生，為了解決抗生素耐藥性的問題，研 究新的殺菌藥物就很重要。抗菌肽CM4有很強的殺菌力，對細菌，真菌，原蟲， 腫瘤細胞都有殺傷作用，可作為新藥，但天然產量低是個瓶頸。
發明內容
為了解決現有技術的上述不足，滿足大規模生產家蠶抗菌肽CM4的需要，本 發明提供一種低成本的重組家蠶抗菌肽CM4的生產和純化方法。本發明采用了同 尾酶法(S; el和AT^I),成功構建了抗菌肽CM4的多拷貝串聯表達載體，并且 也成功的從中篩選了表達量比較高的表達菌株。同單拷貝表達菌株相比，這一菌 株大大提高了CM4的表達量，在不考慮羥胺切割效率的情況下，其表達量可以達 到72.86mg/L，這是已知的抗菌肽CM4最高表達量。
本發明所采用的技術方案是 一種重組家蠶抗菌肽CM4的生產和純化方法，
包括以下步驟
(1)抗菌肽CM4多拷貝同向串聯表達載體的構建利用DNA重組技術，將 CM4基因插入pET32a(+)載體中，構建抗菌肽CM4單拷貝的克隆表達載體 pET32a-CM4;在pET32a-CM4的基礎上，利用同尾酶方法(本實驗中的同尾 酶為S/7el禾Q 構建多拷貝的表達載體，即pET32a-nCM4(n=2,3，4...8);
(2 )多拷貝抗菌肽CM4的表達和純化
將各拷貝抗菌肽CM4表達載體轉入co// BL21 (DE3)，利用終濃度為lmM 的IPTG進行誘導表達，離心收集菌體，超聲破碎后再離心收集上清，將得到的 上清過鎳柱后將融合蛋白掛于柱上，然后將其洗脫，得到粗蛋白。
可將得到的粗蛋白再經對PBS透析和反相高效液相層析(RP-HPLC)得到純 化的產物。
在上述的方案中，為了得到單體CM4，在串聯體構建時，抗菌肽CM4之間， 以及CM4與TrxA之間均引入羥胺切割位點，將得到的TrxA-3CM4融合蛋白凍 干粉于2M鹽酸羥胺，45t:切割，將切割產物于4'C中的PBS透析脫鹽。
實驗表明，重組抗菌肽CM4的活性基本類似于天然的抗菌肽CM4活性。 上述所說的多拷貝的表達載體pET32a-nCM4 (n=2,3，4...8)，優選n=3，即 pET32a-3CM4.
4本發明的有益效果是
1. 篩選出了表達量最高的多拷貝抗菌肽表達菌株
2. 表達效率高本工藝采用原核表達系統，在未優化表達條件下能夠達到
72.86mg/L，在優化表達條件后，這一產量可以進一步提高。
3. 分離純化簡單，易操作，采用化學切割，生產成本低，可以大規模生產。
圖1是抗菌肽CM4多拷貝同向串聯表達載體的構建示意圖
圖2是抗菌肽CM4多拷貝同向串聯體的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定
圖3是SDS-PAGE鑒定多拷貝表達載體的誘導表達
圖4是western blot鑒定多抗菌肽CM4多拷貝同向串聯體表達
圖5是SDS-PAGE分析各拷貝抗菌肽CM4串聯體中目的蛋白表達形式
圖6是SDS-PAGE分析及鑒定三拷貝抗菌肽CM4融合蛋白的表達與純化
圖7是反相高效液相色譜分離純化抗菌肽CM4
圖8是Tricine/SDS-PAGE鑒定純化的抗菌肽CM4
圖9是打孔測活鑒定抗菌肽CM4的活性
圖10各拷貝抗菌肽CM4串聯體表達菌株中上清蛋白中融合蛋白的比例和CM4的
相應表達量
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
實施例
1、抗菌肽CM4多拷貝同向串聯表達載體的構建 1.1根據已知的抗菌肽CM4的序列設計如下引物
pET32a-F:5 ' GCGgg^I￡g|ACTAGIlA4CGGCCGTTGGAAGATCTTTAAG
pET32a-R:5' GAGAAGCTTTCATTAjGCTAGC|GCCG7TGATAGTGGCAGCCTG G 3'
其中pET32a-F和pET32a-R斜體部分編碼的氨基酸序列為羥胺切割位點，加下 劃線部分分別為基因克隆位點5awHI和i//"dIII。同時，加邊框的序列部分分 別為同尾酶Sw I和滿e I的識別序列。
1.2通過rPCR合成CM4基因，以pET32a-F和pET32a-R為引物，擴增CM4基因。割膠回收后，用SamH I和歷力d III對其以及pET32a(+)載體(購自Novagen公 司)進行雙酶切，用連接酶連接后構建單拷貝表達載體pET32a-CM4 1.3以載體pET32a-CM4位于目的基因之外的Kpn I酶切位點和S戸I同時對其 進行雙酶切，割膠回收大片段(含有一個CM4序列)，同樣的再以^pzI和iW^ I同時雙酶切載體，回收小片段(同樣含有一個CM4序列)，然后用連接酶連接 大小片段即得到抗菌肽CM4雙拷貝表達載體pET32a-2CM4。根據圖1反復循環 即可構建多拷貝表達載體pET32a-nCM4(1^1,2,3...8)。雙酶切鑒定,見圖2。
2. 多拷貝抗菌肽CM4的表達及最佳拷貝菌株的篩選 將構建好的各拷貝抗菌肽CM4表達載體轉入co// BL21 (DE3)，在25'C條
件下利用終濃度為lmM的IPTG進行誘導表達，5000rpm離心15min收集細胞。 2.1 SDS-PAGE及western blot鑒定
將1(^1樣品分別加入等量含P-巰基乙醇的2x上樣緩沖液，恒壓100V進行 12%SDS-PAGE，考馬斯亮藍R250染色顯帶分析(圖3)。
同樣的樣品在12%SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素薄膜，5%脫脂奶粉 封閉后，加入Anti-His Antibody孵育過夜，然后再加HRP偶聯的羊抗鼠IgG， 37°C 孵育lh, TMB顯色(具體參照Current protocol in immunology unit 8.10).結果顯 示各拷貝菌中目的蛋白均表達(圖4)。 2.2篩選抗菌肽CM4表達量最高拷貝菌株
鑒定目的蛋白表達之后，對細胞進行超聲破碎， 一方面分別取上清和沉淀以 及全菌跑SDS-PAGE電泳，然后利用Bandscan software Version 5.0掃膠軟件對 SDS-PAGE凝膠圖像進行分析。另 一方面，利用Bradford protein assay法對上清 中的蛋白濃度進行測定。結合這兩方面的數據我們選定抗菌肽CM4表達量最高 的BL21(DE3)/pET32-3CM4作為理想的表達菌株。(圖5，圖10)
3. 最佳拷貝菌株表達產物的純化
lmM IPTG，25。C誘導培養BL21(DE3)/pET32-3CM4，離心(5000 rpm， 15 min) 收集菌體，超聲破碎后再離心(12000rpm， 4°C20min)收集上清。由于融合蛋 白中帶有His.tag，將得到的上清過鎳柱后可以將融合蛋白掛于柱上。然后將其 洗脫。將收集的蛋白于4'C對PBS透析16h， 12。/。SDS-PAGE檢測。蛋白于凍干 機中凍干保存以備后續實驗。(圖6)4.融合蛋白的切割純化及生物學活性鑒定
4.1為了得到單體CM4，在串聯體構建時抗菌肽CM4之間，以及CM4與TrxA 之間均引入了羥胺切割位點。將得到的TrxA-3CM4融合蛋白凍干粉于2M鹽酸 羥胺，45'C切割4h，然后降低溫度和PH值終止反應。最后，將切割產物于4'C 中的PBS透析脫鹽。
4.2將上述透析產物用反相高效液相層析(RP-HPLC)進行純化。所用儀器為 Agilent 1100，分析柱為Kromasil C18 (10 x250mm， 5pm)，實驗所用的流動 相為A液(含有15%乙腈和0. 1%TFA)和B液(100%乙腈和0.1%TFA)。 以天然的抗菌肽CM4為標準舞，收集對應峰位的樣品，將其凍干以備用。(圖 7)
4.3將RP-HPLC純化后的蛋白進行Tricine/SDS-PAGE以及打孔測活鑒定(圖8，
圖9)。
4.4為了進一步鑒定重組抗菌肽CM4和天然抗菌肽CM4的活性大小，我們做了 以下幾種微生物的抗菌肽CM4最小抑菌濃度(MIC)測定^c/zen'c/n'a co// K12D31,
5W/mo"e〃a 5p;7.,尸e"/c/〃/"OT cAo^oge"w/w,爿s/7erg/〃ws w/ger。 4各重纟且抗菌月太CM4 樣品用含有0.01 %乙酸和0. 2%BSA的無菌水進行連續稀釋，然后將稀釋后的樣 品置于96孔板中，每一孔接種100A培養至對數期的菌，于3(TC震蕩培養24h， 然后置于酶標儀下測每孔的0D600。以上實驗重復三次，算出相應菌對抗菌肽CM4
的MIC。實驗表明，重組抗菌肽CM4的活性基本類似于天然的抗菌肽CM4。
權利要求
1、一種重組家蠶抗菌肽CM4的生產和純化方法，包括以下步驟(1)抗菌肽CM4多拷貝同向串聯表達載體的構建利用DNA重組技術，將CM4基因插入pET32a(+)載體中，構建抗菌肽CM4單拷貝的克隆表達載體pET32a-CM4；在pET32a-CM4的基礎上，利用同尾酶方法構建多拷貝的表達載體，即pET32a-nCM4，其中n＝2，3，4，5，6，7或8；(2)多拷貝抗菌肽CM4的表達和純化將各拷貝抗菌肽CM4表達載體轉入E.coli BL21(DE3)，利用終濃度為1mM的IPTG進行誘導表達，離心收集菌體，超聲破碎后再離心收集上清，將得到的上清過鎳柱后將融合蛋白掛于柱上，然后將其洗脫，得到粗蛋白。
2、如權利要求1所述的重組家蠶抗菌肽CM4的生產和純化方法，其特征在 于，步驟(2)還包括將得到的粗蛋白再經對PBS透析和反相高效液相層析得 到純化的產物。
3、如權利要求1或2所述的重組家蠶抗菌肽CM4的生產和純化方法，其特 征在于，所述的pET32a-nCM4是pET32a-3CM4。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體涉及家蠶抗菌肽CM4多拷貝表達載體的構建、表達、純化以及最佳拷貝菌株的篩選等技術。本發明的技術方案是應用重組DNA技術構建抗菌肽CM4的多拷貝同向串聯表達載體pET32a-nCM4(n＝1，2，3...8)，再利用鎳柱親和層析技術純化多拷貝抗菌肽CM4融合蛋白；利用羥胺切割TrxA-n CM4融合蛋白，獲得抗菌肽CM4單體。本發明應用基因工程技術在原核宿主細胞中高效表達了重組抗菌肽CM4，表達效率高，分離純化簡單，易放大，成本低。這為抗菌肽的大量生產、研究及應用奠定了基礎。
文檔編號C07K1/20GK101319216SQ20081012322
公開日2008年12月10日 申請日期2008年7月10日 優先權日2008年7月10日
發明者周良范, 張雙全, 李保存 申請人:南京師范大學