專利名稱：芳基-n-甲基氨基甲酸酯類農藥殘留免疫檢測方法
技術領域：
本發明涉及芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥殘留酶聯免疫檢測(ELISA)方法，屬 于生物技術領域。專用于農產品和農業生產環境中芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥殘留 的高靈敏度快速檢測，特別適用于大批量樣品檢測和現場監測。
(二)
背景技術：
隨著農業科學技術的發展，農藥已成為防治病蟲害的主要手段，對促進農業增產起 著十分重要的作用。自20世紀70年代以來，由于有機氯農藥受到禁用或限用，同時抗有 機磷殺蟲劑的昆蟲品種日益增多，使得氨基甲酸酯類農藥的用量逐年增加。目前氨基甲 酸酯類農藥已成為我國使用量較大的農藥品種之一，被廣泛應用于糧食、蔬菜、水果及 經濟作物上的害蟲防治，主要產品有混滅威、甲萘威、涕滅威、克百威、速滅威、仲丁 威等。雖然這類農藥具有殺蟲譜廣、藥效快等優點，但隨著氨基甲酸酯類農藥的用量逐 年增加，它對人與環境的負面影響越來越大，這就使得氨基甲酸酯類農藥殘留分析檢測 倍受關注。
目前，氨基甲酸酯類農藥殘留檢測多采用薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜 法等。這些方法的檢測限低、靈敏度高，已有相關的技術標準可供參考，但由于需要昂 貴的設備、專門的操作人員，以及樣品前處理復雜、成本高、時間長，因此不能滿足快 速簡便的現場檢測要求。而免疫分析方法由于具有靈敏度高、特異性強、檢測快速、操 作簡單以及樣品純化要求低等優點，近年愈來愈受到重視。
農藥殘留免疫分析在克百威、甲萘威、甲硫威、殘殺威、速滅威等氨基甲酸酯類農 藥的殘留檢測中己得到高度重視和廣泛應用。以上這些研究主要是針對單一農藥建立其 特異性的免疫檢測方法，然而，實際上農產品中殘留的農藥往往有多種，單農藥組分免 疫分析方法己難以滿足實際檢測的需要。因而，基于免疫化學技術的農藥多殘留檢測成 為當前農產品質量安全領域的研發熱點和發展趨勢之一，并取得了較好的研究進展。農 藥多殘留分析的應用能大大提高檢測的效率和系統性，使得農藥殘留的全面監測成為可 能。但目前針對氨基甲酸酯類農藥的多殘留免疫檢測方法還未見報道。
(三)
發明內容
技術問題 本發明的目的是針對現有芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥檢測方法操 作較復雜、檢測費用較高、檢測效率低下的缺陷，提供芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥多殘留ELISA檢測方法，為芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥多殘留找到一種既快速準確 又簡單低廉的微量檢測方法。對芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥的殘留量進行檢測，準 確度高、簡單、快速、低廉。
技術方案
本發明芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥多殘留ELISA檢測方法，包括
1、 抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥單克隆抗體制備
(1) 芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥人工抗原的合成將免疫半抗原6-(苯氧基羰基)
氨基-I-己酸，簡稱HA，與牛血清白蛋白BSA偶聯，獲得通用免疫原HA-BSA;將包 被半抗原e-(間-甲基苯氧基羰基)氨基丙酸，簡稱HB，與卵清蛋白OVA偶聯，獲得包 被抗原HB-OVA;
(2) 小鼠免疫和雜交瘤細胞株的建立用HA-BSA免疫Balb/C小鼠，腹腔注射；應 用雜交瘤技術，取出抗血清效價為1.28乂106的小鼠脾細胞，將其與骨髓瘤細胞Sp2/0 融合，以HB-OVA為包被抗原，通過間接ELISA和間接競爭ELISA法篩選、有限稀釋 法亞克隆化，獲得目的雜交瘤細胞株；
(3) 獲得單克隆抗體體外培養雜交瘤細胞株獲得細胞上清液和小鼠體內制備腹水， 純化后獲得特異性抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥的單克隆抗體。
2、 芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥的多殘留免疫檢測方法，包括
(1) 包被
采用上述人工合成的包被抗原HB-OVA 0.625pg/mL在微量分析板中每孔加50pL， 37'C水浴中反應2h，或4'C冰箱過夜，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌 5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(2) 封閉
1%明膠作封閉物，微量分析板每孔10(HiL， 37'C反應1小時，倒凈，以常規洗滌緩 沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(3) 加抗體及抗體與待測樣品的混合液 用稀釋4倍的抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥單克隆抗體(細胞培養上清液)與待
測樣品和空白抗原抗體反應液磷酸鹽-吐溫緩沖液等體積充分混合，后以每孔50pL加到 微量分析板中，37'C反應1小時，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(4) 加酶標二抗
用pH7.4、 0.15mol/L的磷酸鹽緩沖液將商品化的HRP-羊抗鼠IgG稀釋3000倍，微 量分析板每孔加50pL， 37'C反應1小時，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液 洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(5) 顯色
微量分析板每孔加50pL的四甲基聯苯胺底物溶液，37'C顯色反應10 15分鐘；
(6) 終止反應并讀數
加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25pL終止顯色反應，酶標儀上450nm處讀出 吸光值，空白基質作陰性對照吸光值Bo，待測樣品吸光值B;
(7) 數據處理 計算出結合率B/Bo及Logit (B/Bo)，
Logit (B/Bo) =Ln[ (B/Bo) / (l-B/Bo)] 公式1
代入如下檢測方程(公式2可由芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥系列標準濃度的競
爭曲線進行校正)
混滅威Logit (B/Bo) =-0.9573LogC-0.3176
滅除威Logit (B/Bo) =-0.9185LogC國0.1698
滅殺威Logit (B/Bo) =-0.9647LogC+0.0305
甲萘威Logit (B/Bo) =-0.9094LogC+2.4769
其中C為微量分析板孔中測得的芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥濃度，通過公式1
和公式2可以求得；
X=nx2C， n為反應前樣品被稀釋的倍數 公式3
通過公式3求得待測樣品中以濃度X表示的芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥含量。
上述芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥多殘留ELISA檢測方法中，抗原抗體反應液磷
酸鹽-吐溫緩沖液中甲醇含量為5%、 pH值為6.0 7.0、離子強度為1.6 3.2mol/L，微
量分析板中每孔50pL。
有益效果本發明在人工化學合成抗原、免疫小鼠、細胞融合、篩選等大量前期工
作基礎上獲得了能穩定分泌特異性抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥單克隆抗體的雜交瘤細胞株。以制備的特異性抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥單克隆抗體為基礎，以偶 聯物HB-OVA作為檢測抗原，通過優化檢測體系，建立了一套更加靈敏的芳基-N-甲基 氨基甲酸酯類農藥多殘留酶聯免疫(ELISA)檢測方法，為芳基-N-甲基氨基甲酸酯類 農藥殘留檢測試劑盒的開發提供了基礎，為環境安全檢測提供了重要的工具。
與現有傳統檢測技術相比，其優點和積極效果表現在
(1) 實用性好試驗證明，該檢測方法能同時檢測2到4種不同芳基-N-甲基氨基甲 酸酯類農藥。
(2) 簡便性傳統的氨基甲酸酯類農藥分析檢測相對費力、費時、費用昂貴，需要 進行大量的樣品預處理，且樣品的檢測需在大型分析設備的室內進行，不能用于現場檢 測，且對實驗室的儀器化程度和人員素質要求較高，不能滿足農產品貿易對快速、簡便、 準確、大量檢測的需求。而我們提供的芳基-N-甲基氨基甲酸酯類多農藥ELISA檢測方 法具有操作簡單、快速(以封閉好的微量分析板做檢測只需要2 3小時即可)、分析成 本低、分析容量大、安全可靠等優點， 一般不需貴重儀器，可大量簡化甚至省去前處理 過程，對使用人員的專業技術水平要求不高，容易普及和推廣，特別適用于大批量樣本 檢測和現場監測。
(3) 準確性高與我國目前市場上常用的快速檢測方法速測靈、速測卡、速測儀等檢 測方法相比，芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥ELISA檢測方法準確度較高，重復性較好
(平均變異系數低于5%)，抗體特異性識別芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥，對其他農 藥幾乎不識別。
具體實施例方式
1、芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥通用免疫原HA-BSA的合成方法為
(1)芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥通用免疫半抗原",奪基潔萄賓基-7-3麼
<formula>formula see original document page 7</formula>)的合成
稱取雙光氣22.8g，小心加入0.15g顆粒狀活性炭，36'C左右油浴加熱，用50g苯 收集光氣，苯液在室溫下攪拌，尾氣通入堿液。至雙光氣反應完，苯相增重19.2g，得 28%的光氣/苯溶液。稱取苯酚3.3g，溶于50mL2.5moI/L的NaOH水溶液，磁力攪拌1 小時，將苯酚/NaOH溶液極其緩慢的滴加入光氣/苯溶液中，并不停攪拌，加完后開始 計時，反應4小時。反應完畢后靜置分層，取有機相減壓、蒸餾得7.82g黃色油狀物。稱取3.4g 6-氨基正己酸溶于4mL 4mol/L的NaOH水溶液中，置于4'C冰箱冷卻后倒入 100mL反應瓶中，外用冰浴冷卻。然后將上述黃色油狀產物2.8g溶于4mL 1，4-二氧六 環中冷卻至4'C得A液；另取3mL4molL"的NaOH水溶液，冷卻至4'C，得B液。將 A液與B液均分成5等分，然后在有攪拌的情況下，每間隔5-10分鐘加入6-氨基正己 酸/NaOH水溶液中，加樣完成后計時，1.5h后結束反應。用濃鹽酸調節反應終液的pH 值至4左右，分層，然后分3次加入乙酸乙酯抽提，每次50mL，合并乙酸乙酯提取液， 用稀鹽酸洗滌數次，用lmol/L的NaHC03溶液抽提3次，每次50mL，收集抽提液，用 濃鹽酸調節pH值至4.0左右，再用乙酸乙酯抽提，用無水Na2S04干燥過夜，所得物減 壓蒸餾，最后用己垸乙酸乙酯=70:30進行重結晶，得白色結晶1.9g，即為芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥通用免疫半抗原6-(苯氧基羰基)氨基-l-己酸(HA)。
(2)芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥通用免疫原HA-BSA的合成反應瓶中加入芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥通用免疫半抗原6-〈^"^"^^^^"^^-3麼(HA) 0.251g和N-羥基琥珀酰亞胺0.131g，再加入N,N-二甲基甲酰胺0.3mL溶解；稱取0.313gN,N-二甲 基碳二亞胺，用0,2mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，并緩慢滴加到反應瓶中；反應在磁力攪 拌下室溫進行7小時。反應終液置4。C冰箱冷卻2小時以上，經8000rpm離心5分鐘， 取上清緩慢地加入到2mL 5.3mg mL"的牛血清白蛋白(BSA)中，反應在磁力攪拌下 室溫攪拌4小時。待反應完成后，將反應液置于透析袋內，于0.2mol/LpH6.8的磷酸緩 沖液中4'C攪拌透析，每四小時換一次透析液，共透析60小時。透析結束后透析袋中 的白色乳狀液即為芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥通用免疫原HA-BSA。將所得通用免 疫原HA-BSA取出分裝保存于-2(TC冰箱中存放備用。 2、芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥包被抗原HB-OVA的合成方法為
(l)芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥包被半抗原"-^7-伊基苯真基潔萄賓基巧麼(HB，
分子式ChHk)N04，結構式^^ch3 )的合成采用張奇等人發表在學術刊物
《分析化學》上的方法合成化合物刀-(7坊-伊^^^"^^ 萄^"^^"麼，該化合物被我們 用作芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥包被半抗原。張奇等人發表的含有上述化合物合成 方法的研究論文在《分析化學》上的具體位置為2006年第34巻第178至182頁。
(2)芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥包被抗原HB-OVA的合成反應瓶中加入芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥包被半抗原A-r/坊-伊^:^^^^^^萄^"^^"凝(HB) 0.221g和 N-羥基琥珀酰亞胺0.133g，再加入N,N-二甲基甲酰胺0.3mL溶解；稱取0.311g N,N-二甲基碳二亞胺，用0.2mLN，N-二甲基甲酰胺溶解，并緩慢滴加到反應瓶中；反應在磁力 攪拌下室溫進行7小時。反應終液置4'C冰箱冷卻2小時以上，經8000rpm離心5分鐘， 取上清緩慢地加入到4mL15mg/mL的卵清蛋白(OVA)中，反應在磁力攪拌下室溫攪 拌4小時。待反應完成后，將反應液置于透析袋內，于0.2mol/LpH6.8的磷酸緩沖液中 4'C攪拌透析，每四小時換一次透析液，共透析60小時。透析結束后透析袋中的白色乳 狀液即為芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥包被抗原HB-OVA。將所得包被抗原HB-OVA
取出分裝保存于-20 °C冰箱中存放備用。
3、 芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥單克隆抗體的制備
采用芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥通用免疫原HA-BSA，常規免疫方法免疫Balb/C
小鼠，取出抗血清效價為1.28Xl()S的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0融合，具體操作依 ClonaCell -HY Hybridoma Cloning Kit說明進行。經ELISA法篩選及有限稀釋法亞克隆化， 建立可穩定分泌抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥的雜交瘤細胞株，獲得了抗芳基-N-甲 基氨基甲酸酯類農藥單克隆抗體。
4、 ELISA反應體系主要條件0.625ng/mL的包被物HB-OVA在微量分析板中每孔加 50pL，特異性抗體稀釋8倍作為工作濃度，1%明膠作封閉物，抗原抗體反應液磷酸鹽-吐溫緩沖液中甲醇含量為5%、 pH值為6.0 7.0、離子強度為1.6 3.2mol/L，微量分析 板中每孔50pL。
實施例l上自來水樣品中檢測芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥殘留
待測樣品準備
自來水樣品取自來水1L,分別加入芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥A:混滅威標準 品l嗎、B:滅除威標準品l嗎、C:滅殺威標準品1嗎和D:甲萘威標準品1000嗎，分別 配制成lppb、 lppb、 lppb和lppm的液體樣品。 采用ELISA檢測方法對以上樣品進行檢測，操作如下
(1) 包被
HB-OVA作為包被物，0.625pg/mL在微量分析板中每孔加50pL， 37。C水浴反應2h， 或4"C冰箱過夜，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在 吸水紙上拍干；
(2) 封閉
1%明膠作封閉物，微量分析板每孔lOOpL， 37'C反應2小時，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；
(3) 加抗體及抗體與待測樣品的混合液
取待測樣品200pL加到800pL反應基質中配制成待測液，單克隆抗體(細胞上清 稀釋4倍)與待測液和空白基質液等體積充分混合，后以每孔50pL加到微量分析板中， 37'C反應1小時，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在 吸水紙上拍干；
(4) 加酶標二抗
用pH7.4、 0.15mol/L的磷酸鹽-吐溫緩沖液將商品化的HRP-羊抗鼠IgG稀釋3000 倍，微量分析板每孔加50pL， 37'C反應1小時，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫 緩沖液洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干。
(5) 顯色
微量分析板每孔加50pL的四甲基聯苯胺底物溶液，37'C顯色反應10 15分鐘
(6) 終止反應并讀數
加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25pL終止顯色反應，酶標儀上450nm處讀 出吸光值，空白基質作陽性對照。
Bo混滅威=0.636，待測樣品吸光值B混滅威=0.415; Bo滅除威=0.524，待測樣品吸光值B滅除威=0.351; Bo滅*威=0.565，待測樣品吸光值B滅殺威=0.417。 Bo甲蔡威=0.388，待測樣品吸光值B甲蔡威=0.258。
(7) 數據處理
A. 混滅威計算出結合率Ba滅威/Bo混滅f65.3。/c)，代入公式1
Logit (B混滅威/Bo混滅威)=ln[ (B混滅威/Bo混滅威)/ (l-B混滅ag/Bo混滅威)]》《1
得到Logit (B混滅威/Bo 混滅威 )=0.632
代入如下檢測方程
Logit (B混滅^/Bo混滅威)=-0.9573LogC-0.3176 公式2
其中C為微量分析板孔中測得的混滅威濃度，求得C-0.102ppb。待測樣品中混滅 威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得
X=5x2C 公式3
求得待測樣本中混滅威殘留量濃度X^.02ppb，結果與實際濃度(lppb)相當。
B. 滅除威計算出結合率B滅除威/Bo滅除f67.0。/。，代入公式lLogit (B滅除威/Bo滅除威)=ln[ (B滅除js/Bo滅除威)/ (l-B滅除威/Bo滅除威)]&《1
f尋至lj Logit (B滅除^Bo 滅除威 )=0.708
代入如下檢測方程
Logit (B滅除威/Bo滅除威)=-0.9185LogC隱0.1698 公式2
其中C為微量分析板孔中測得的滅除威濃度，求得C-0.111ppb。待測樣品中滅除 威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得
X=5x2C 公式3
求得待測樣本中滅除威殘留量濃度X4.11ppb，結果與實際濃度(lppb)相當。
C. 滅殺威計算出結合率B滅殺^o滅殺威-73.8。/。，代入公式l Logit (B滅殺sg/Bo 滅殺威 )=ln[ (B滅殺^/Bo
滅殺威 )/ (l-B滅殺威/Bo 滅殺威 )]公式1
得到Logit (B滅殺威/Bo 滅殺威 )=1.036 代入如下檢測方程
Logit (B滅殺威/Bo滅殺威)=-0.9647LogC+0.0305 公式2
其中C為微量分析板孔中測得的滅殺威濃度，求得C二0.091ppb。待測樣品中滅殺 威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得
X=5x2C 公式3
求得待測樣本中滅殺威殘留量濃度X-0.91卯b，結果與實際濃度(lppb)相當。
D. 甲萘威計算出結合率B甲蔡^/Bo甲蔡威^66.5Q/。，代入公式1
Logit (B甲蔡se/Bo甲萘威)=ln[ (B甲萘^/Bo甲萘威)/ (l-B甲萘威/Bo甲萘威)]&《1
f尋至U Logit (B甲萘se/Bo 甲萘威 )=0.686
代入如下檢測方程
Logit (B甲萘js/Bo甲萘威)=-0.9094LogC+2.4769 公式2
其中C為微量分析板孔中測得的甲萘威濃度，求得C=0.093ppm。待測樣品中甲萘
威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得
X=5x2C 公式3
求得待測樣本中甲萘威殘留量濃度X:0.93ppm，結果與實際濃度(lppm)相當。
實施例2小青菜樣品中檢測芳基N-甲基氨基甲酸酯類農藥殘留
待測樣品準備
小青菜樣品稱取100g干燥后的小青菜，分別加入芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥A:混滅威標準品lpg、 B:滅除威標準品lpg、 C:滅殺威標準品lpg和D:甲萘威標準品 100(Hig，分別配制成10ppb、 10ppb、 10ppb和10ppm的固體樣品。
采用芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥ELISA檢測方法對以上樣品進行檢測，操作如下 步驟(1)、 (2)同實施例1。
(3)加抗體及抗體與待測樣品的混合液
稱取待測樣品0.2g，用0.4mL甲醇浸泡2小時左右，取lOO(iL加到900pL反應基 質中配制成待測液，單克隆抗體(細胞上清稀釋4倍)與待測液和空白基質液等體積充 分混合，后以每孔50nL加到微量分析板中，37t:反應l小時，倒凈，以常規洗滌緩沖 液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干； 步驟(4)、 (5)、 (6)同實施例1; (7)數據處理
A. 混滅威計算出結合率B濯滅gE/Bo混滅威-50.3。/。，代入公式l
Logit (B混滅威/Bo混滅威)=ln[ (B溜滅gj/Bo混滅威)/ (l-B混滅威/Bo混滅威)] 》《1
得到Logit (B混滅"Bo混滅威)=0.012
代入如下檢測方程
Logit (B混滅威/Bo混滅威)=-0.9573LogC-0.3176 公式2
其中C為微量分析板孔中測得的混滅威濃度，求得C=0.453ppb。待測樣品中混滅 威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得
X=10x2C 公式3
求得待測樣本中混滅威殘留量濃度X-9.05卯b，結果與實際濃度(10ppb)基本接近。
B. 滅除威計算出結合率8滅除^0滅除威=53.8%，代入公式l
Logit (B滅除ss/Bo滅除威)=ln[ (B滅除威/Bo滅除威)/ (l-B滅除"Bo滅除威)] 》《1
得到Logit (B滅除gs/Bo滅除威)=0.152
代入如下檢測方程
Logit (B滅除威/Bo滅除威)二0.9185LogC隱0.1698 公式2
其中C為微量分析板孔中測得的滅除威濃度，求得C=0.446ppb。待測樣品中滅除 威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得
X=10x2C 公式3
求得待測樣本中滅除威殘留量濃度X-8.92卯b，結果與實際濃度(10ppb)基本接近。C. 滅殺威計算出結合率B滅殺^/Bo滅殺f58.6。/。，代入公式l
Logit (B滅殺威/Bo滅殺威)(B滅殺^/Bo滅殺威)/ (l-B滅殺jj/Bo滅殺威)]》《1
得到Logit (B滅殺^/Bo滅殺威)=0.347
代入如下檢測方程
Logit (B滅殺威/Bo滅殺威)=-0.9647LogC+0.0305 公式2
其中C為微量分析板孔中測得的滅殺威濃度，求得C^.470ppb。待測樣品中滅殺 威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得
X=10x2C 公式3
求得待測樣本中滅殺威殘留量濃度X=9.40ppb，結果與實際濃度(10ppb)基本接近。
D. 甲萘威計算出結合率B甲蔡^o甲蔡f51.2。/。，代入公式l
Logit (B甲蔡je/Bo甲萘威)=ln[ (B甲萘^/Bo甲萘威)/ (l-B甲萘ss/Bo甲萘威)]》《1
矛導至lj Logit (B甲萘^/Bo 甲萘威 )=0.048
代入如下檢測方程
Logit (B甲萘威/Bo甲萘威)=-0.9094LogC+2.4769 公式2
其中C為微量分析板孔中測得的甲萘威濃度，求得C二0.469ppm。待測樣品中甲萘 威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得
X=10x2C 公式3 求得待測樣本中甲萘威殘留量濃度X=9.38ppm，結果與實際濃度(10卯m)基本接近。
權利要求
1、抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥單克隆抗體的制備方法(1)芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥人工抗原的合成將免疫半抗原6-(苯氧基羰基)氨基-1-己酸，簡稱HA，與牛血清白蛋白BSA偶聯，獲得通用免疫原HA-BSA；將包被半抗原β-(間-甲基苯氧基羰基)氨基丙酸，簡稱HB，與卵清蛋白OVA偶聯，獲得包被抗原HB-OVA；(2)小鼠免疫和雜交瘤細胞株的建立用HA-BSA免疫Balb/C小鼠，腹腔注射；應用雜交瘤技術，取出抗血清效價為1.28×106的小鼠脾細胞，將其與骨髓瘤細胞Sp2/0融合，以HB-OVA為包被抗原，通過間接ELISA和間接競爭ELISA法篩選、有限稀釋法亞克隆化，獲得目的雜交瘤細胞株；(3)獲得單克隆抗體體外培養雜交瘤細胞株獲得細胞上清液和小鼠體內制備腹水，純化后獲得特異性抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥的單克隆抗體。
2、 權利要求l所述單克隆抗體用于免疫檢測芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥的方法，包 括(1) 包被采用權利要求1所述人工合成的包被抗原HB-OVA 0.625pg mL—1在微量分析板中每 孔加50pL, 37。C水浴中反應2h，或4。C冰箱過夜，倒凈，以常規洗漆緩沖液磷酸鹽-吐 溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；(2) 封閉1%明膠作封閉物，微量分析板每孔100pL， 37'C反應1小時，倒凈，以常規洗滌緩 沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；(4) 加抗體及抗體與待測樣品的混合液用稀釋8倍的抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥單克隆抗體與待測樣品和空白抗原 抗體反應液磷酸鹽-吐溫緩沖液等體積充分混合，后以每孔5(HiL加到微量分析板中，37 'C反應1小時，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖液洗滌5 7次并倒置、在吸 水紙上拍干；(5) 加酶標二抗用pH7.4、 0.15mol U1的磷酸鹽緩沖液將商品化的HRP-羊抗鼠IgG稀釋30000倍， 微量分析板每孔加50pL， 37。C反應l小時，倒凈，以常規洗滌緩沖液磷酸鹽-吐溫緩沖 液洗漆5 7次并倒置、在吸水紙上拍干；(6) 顯色微量分析板每孔加5(^L的四甲基聯苯胺底物溶液，37'C顯色反應10 15分鐘；(7) 終止反應并讀數加2moll/的硫酸，微量分析板每孔加25pL終止顯色反應，酶標儀上450nm處讀 出吸光值，空白基質作陽性對照吸光值Bo，待測樣品吸光值B;(8) 數據處理 計算出結合率B/Bo及Logit (B/Bo)，Logit (B/Bo) =Ln[ (B/Bo) / (l-B/Bo)] 公式1代入如下檢測方程(公式2可由芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥標準系列濃度的競爭曲線進行校正。)混滅威Logit (B/Bo) =-0.9573LogC-0.3176 滅除威Logit (B/Bo) =-0.9185LogC-0.1698 滅殺威Logit (B/Bo) =-0.9647LogC+0.0305 甲萘威Logit (B/Bo) =-0.9094LogC+2.4769其中C為微量分析板孔中測得的芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥濃度，通過公式1 和公式2可以求得；X=nx2C， n為反應前樣品被稀釋的倍數 公式3 通過公式3求得待測樣品中以濃度X表示的芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥含量。
3、根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，抗原抗體反應液磷酸鹽-吐溫緩沖液 中甲醇含量體積比為5%、 pH值為6.0 7.0、離子強度為1.6 3.2molL'1，微量分析板中 每孔5CHil。
全文摘要
本發明涉及芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥殘留免疫的檢測方法，屬于生物技術領域。以載體蛋白與芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥通用半抗原(HA)偶聯，獲得完全抗原，以該抗原免疫Balb/C小鼠，應用雜交瘤技術，經ELISA法篩選及有限稀釋法亞克隆化，獲得可穩定分泌抗芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥的雜交瘤細胞株，制備獲得單克隆抗體。以單克隆抗體為基礎，建立四種芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥殘留ELISA檢測方法，該方法具較強的特異性、靈敏性及穩定性，為芳基-N-甲基氨基甲酸酯類農藥微量檢測提供了快速、靈敏、特異的技術方法。
文檔編號C07K16/44GK101314618SQ20081012276
公開日2008年12月3日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者劉鳳權, 覃 孫, 奇 張, 胡白石 申請人:南京農業大學