專利名稱：針對小分子甲萘威建立的配對單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種針對小分子甲萘威建立配對單克隆抗體的方法，并將其應用于甲萘威膠體金免疫層析雙抗夾心法試紙條的制備。
背景技術：
在世界人口急劇膨脹的今天，合理的使用農藥可以提高糧食產量，但過量使用會造成嚴重的環境污染，并導致許多遺傳疾病。近年來，由于農藥在食品中殘留超標而造成的中毒事件時有發生。因此，在食品安全這個全球關注的熱點問題中，如何快速、準確地檢測農副產品中殘留的農藥問題就成為了重中之重的問題。
甲萘威是小分子物質，分子量201.13，是一種新的農業殺蟲藥。它殺蟲選擇性強，作用快，因此使用較廣。但存于植物中殘毒不易清除，接觸此類農藥就會使人中毒。發病特點是快、猛，搶救不及時會造成死亡。中毒癥狀為流涎、惡心、嘔吐、腹痛，心跳遲緩，血壓下降，大汗，尿失禁，呼吸困難，瞳孔縮小，面色蒼白等，嚴重致人死亡。
根據中華人民共和國的國家標準，并參考其他國家或地區的檢測標準，檢測甲萘威殘留的分析方法主要是液相色譜補充GC方法，其它檢測方法主要是依靠、氣相色譜法(GC)或氣相色譜與質譜(MS)聯用法(GC/MS)。這些方法普遍存在著樣品前處理過程復雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，耗時，檢測設備昂貴，并要求有專業的技術人員及較長的分析周期。
為了降低檢測成本、降低操作難度，應用免疫膠體金法檢測農藥甲萘威殘留是較好的一種技術。依據傳統定義，小分子物質只能采用膠體金免疫競爭法進行檢測，如發明專利200410071941.0農藥西維因快速檢測用試紙條及其制作方法與應用、發明專利200510013371.4膠體金標記法快速檢測西維因試紙條及其制作方法與應用、實用新型專利200520008931.2 —種快速檢測甲萘威殘留的膠體金試紙，免疫競爭法技術使小分子檢測成本明顯降低、操作也明顯簡單，但它的敏感度比雙抗夾心法低，對于檢測限低的小分子無法檢測。而雙抗夾心法雖然是常用的檢測技術，但未見報導將它應用于小分子檢測，相關文獻和方法學闡述均認為小分子物質分子量小、結構簡單，因此很難同時和兩個大分子抗體相結合。
本發明用不同方法修飾不同的間隔臂，暴露出不同的抗原位點，從而免疫經過精心篩選獲得配對的甲萘威單克隆抗體，進行雙抗夾心法膠體金免疫檢測，此方法具有特異性強，靈敏度高，批間差小等優點。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種針對小分子甲萘威建立配對單克隆抗體的方法，并將其應用于快速免疫檢測產品，使用雙抗夾心法檢測小分子甲萘威，獲得更高的敏感度、良好的特異性。
為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的
通過分析甲萘威分子結構，用活性酯法和琥珀酸酐法兩種方法形成不同的間隔臂，暴露出不同的抗原位點，再連接大分子蛋白，形成甲萘威小分子人工免疫原，利用雜交瘤技術制備針對不同抗原決定簇的單克隆抗體，之后按雙抗體夾心方式篩選出配對的兩種抗體I 、 II，配對單抗可以用于膠體金雙抗夾心法的構建，其中一株抗體稱為I用于包被試驗線，另一株
種抗體稱為II用于膠體金標記。
膠體金雙抗夾心法的原理為在硝酸纖維素膜上的檢測區包被甲萘威單克隆抗體I ，對照區包被羊抗鼠多克隆抗體。當待測物中有即甲萘威時，待測物中的抗原物質就會與標記膠體金的甲萘威單克隆抗體II形成Ag-Ab-Au復合物，由于毛細管層析作用，復合物沿膜帶移
動，可與包被在硝酸纖維素膜上的甲萘威單克隆抗體I形成雙抗夾心免疫復合物，這時檢測
線處可看到一條明顯色帶(T線)，殘余的標記膠體金的甲萘威單克隆抗體II會繼續移動，由于它來源于鼠，因此可與羊抗鼠多克隆抗體結合形成一條明顯色帶(C線)，因此當檢測試紙上可看到兩條線(C線和T線)時，證明樣品中含有甲萘威，結果為陽性，說明被檢測的樣品中農藥甲萘威超標；而當待測物質中沒有被測的甲萘威時，就不能在檢測線處(T線)形成雙抗夾心免疫復合物，僅會在C線處出現一條色帶，結果為陰性，說明被檢測的樣品中農藥甲萘威未超標。
由于采用上述技術方案，本發明所提供的采用甲萘威配對單抗制成的雙抗夾心快速免疫檢測產品具有特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，結果易讀等優點。
具體實施例方式
實施例一小分子農藥甲萘威免疫原的合成
通過兩種不同的反應可合成不同臂長的半抗原
反應l:萘酸與過量的酰氯在溶劑存在條件下回流反應2—10小時，冷卻逐滴加入過量的氨基酸溶液(該溶液為由堿和氨基酸配成水溶液)，攪拌反應2—10小時，可得到產物，經
純化可得到半抗原I。
反應2:萘酚與稍過量的酸酐在溶劑存在的條件下避光回流反應5—20小時，得到產物，經純化可得到半抗原II。將半抗原i、 n分別與大分子蛋白相連接，得到合成免疫原i、 n。
實施例二甲萘威單克隆抗體的制備
用合成的免疫原I、 n免疫BALB/c小鼠，用SP2/0細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。提取小鼠腹水純化篩選，獲得針對甲萘威不同抗原決定簇的單克隆抗體I、 II 。
實施例三甲萘威膠體金免疫層析雙抗夾心法檢測試紙條的制備
1. 膠體金溶液的制備取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到90 95°C，加入適量枸櫞酸三納繼續加熱攪拌至沸騰5分鐘，冷卻后避光保存備用。
2. 金溶液與甲萘威單克隆抗體II的結合將甲萘威單克隆抗體II標記的膠體金液吸附纖維材料上，干燥后備用。
3. 膜的制備制膜機制膜，利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的甲萘威單克隆抗
體I溶液量相等。
4. 試紙條的制作
試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸
水層和單克隆抗體金標墊相互交疊連接(交疊連接部分在1—2毫米范圍)，在單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。用切條機切成3mm的膜條，即為膠體金檢測試紙條。
5. 使用方法把試紙的樣品吸液層端放入蔬菜浸汁中，l分鐘后取出試紙平放，由于毛細管
和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，5分鐘時觀察結果。
6. 結果判斷根據國家頒布的蔬菜農藥殘留檢測標準制定界限值，樣品中甲萘威濃度超過界
限值，反應線顏色為紅色，即顯色區為兩條紅色線時為陽性，反之只有一條紅色控制線時為陰性。
權利要求
1.針對小分子甲萘威建立的配對單克隆抗體及其應用，其特征在于針對小分子甲萘威，采用活性酯法和琥珀酸酐法兩種方法形成不同的間隔臂，暴露出不同的抗原位點，再連接大分子蛋白，形成甲萘威小分子人工免疫原I、II，利用雜交瘤技術制備針對不同抗原決定簇的單克隆抗體，之后按雙抗體夾心方式篩選出配對的兩種抗體I、II，配對單抗可以用于膠體金雙抗夾心法的構建，其中一株抗體稱為I用于包被試驗線，另一株種抗體稱為II用于膠體金標記。
2. 根據權利要求i所述的針對小分子甲萘威建立的配對單克隆抗體及其應用，其特征在于連接的大分子包括任何可以和小分子的全部或部分結構結合產生免疫原性的分子。
3. 根據權利要求i所述的針對小分子甲萘威建立的配對單克隆抗體及其應用，其特征在于采用甲萘威小分子人工免疫原i、 n分別免疫小鼠，獲得能同時與小分子甲萘威結合的，即針對小分子甲萘威不同抗原決定簇的兩種甲萘威單克隆抗體i、 n。
4. 根據權利要求i所述的針對小分子甲萘威建立的配對單克隆抗體及其應用，其特征在于獲得配對的甲萘威單克隆抗體可用于甲萘威雙抗夾心免疫層析試紙條的制備。
全文摘要
針對小分子甲萘威建立的配對單克隆抗體及其應用，通過分析甲萘威分子結構，用活性酯法和琥珀酸酐法兩種方法形成不同的間隔臂，暴露出不同的抗原位點，再連接大分子蛋白，形成甲萘威小分子人工免疫原，利用雜交瘤技術制備針對不同抗原決定簇的單克隆抗體，之后按雙抗體夾心方式篩選出配對的兩種抗體I、II，配對單抗可以用于膠體金免疫層析雙抗夾心法的構建，其中一株抗體稱為I用于包被試驗線，另一株種抗體稱為II用于膠體金標記。本發明所提供的采用甲萘威配對單抗制成的快速免疫檢測產品具有特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，結果易讀等優點。
文檔編號C07K16/44GK101633697SQ20081011718
公開日2010年1月27日 申請日期2008年7月25日 優先權日2008年7月25日
發明者萬積成 申請人:萬積成