專利名稱：：人免疫系統毒性蛋白顆粒酶m特異性抑制劑、制備方法及用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的人免疫系統毒性蛋白顆粒酶M抑制劑、它的制備方法以及用途。
背景技術：
：自然殺傷細胞(naturalkillercells,NK)是固有免疫的主要效應細胞，在抗病毒及細胞內細菌感染、器官移植排斥反應、抗腫瘤免疫應答和自身免疫性疾病方面具有重要作用(Vivieretal.,2008)。NK細胞殺傷耙細胞的途徑有兩種直接釋放細胞毒性顆粒或結合靶細胞上的死亡受體(Fas/FasL或TNF/TNFR通路)。細胞毒性顆粒的內含物主要包括穿孔素(perforin)和絲氨酸蛋白酶家族顆粒酶(granzymes)。顆粒酶是一類高度保守的絲氨酸蛋白酶，到目前為止，在人類中發現了5種顆粒酶(A、B、K、H和M)(ChowdhuryandLieberman,2008)。顆粒酶M是其中非常特殊的一員，它在甲硫氨酸、亮氨酸或正亮氨酸后特異性地切割其底物，與一組嗜中性彈性蛋白酶共定位于人染色體19pl3.3上。與其他四種顆粒酶不同，顆粒酶M在活化的CTL細胞中沒有表達，而高表達于NK細胞和外周血大淋巴細胞(LGL)，在CD3+CD56+T細胞和丫5T細胞僅有少量表達(Krenacsetal.，2003)。顆粒酶M獨特的酶活性、基因定位及限定的表達譜表明其具有不同的殺傷作用。另外，有研究發現顆粒酶M高表于一種高細胞毒性細胞系KHYG-1中(Sucketal.,2005)。KHYG-1取自于一位侵襲性NK細胞白血病患者的外周血(Yagitaetal.,2000)，但是顆粒酶M在該細胞系中高表達的原因，以及其在侵襲性NK細胞白血病發生發展過程所起到的作用還不清楚。目前，有資料顯示KHYG-1細胞已經被開始嘗試用在癌癥的過繼性免疫治療中(http:〃www.ihepa.com/Article/ArticleShow.aspID=637)。KHYG-1體內試驗評估將進一步闡明它潛在的臨床應用價值，而該細胞中高表毒性蛋白顆粒酶M所發揮作用也必是其中要評估的重要指標。在現有技術中，還沒有任何一種絲氨酸蛋白酶的抑制劑能很好的抑制顆粒酶M的活性(Rukampetal,,2004)，所以我們致力于根據顆粒酶M的特殊結構設計顆粒酶M特異性的抑制劑。所獲得的特異性抑制劑，可在相關領域的科學研究，及臨床抑制器官移植排斥反應和自身免疫性疾病的治療中發揮重要的作用。
發明內容本發明在人顆粒酶M結構與功能的解析基礎上，設計合成了一種人顆粒酶M特異性的抑制劑，其化學結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(I)其中Lys、Val、Pro、Leu分別代指賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸、亮氨酸四種氨基酸；ACE表示乙酰基；CMK表示氯甲基酮。更具體地，本發明提供以下各項1.式(I)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(I)其中Lys、Val、Pro、Leu分別代指賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸和亮氨酸，ACE表示乙酰基，CMK表示氯甲基酮。2.以上l所述的化合物，其特征在于多肽組成以及它們的相對結構位置為Lys-Val-Pro-Leu;ACE表示乙酰基；CMK表示氯甲基酮。3.式(I)的化合物的制備方法，該方法包括以下步驟(1)根據化學式(I)的化合物的氨基酸組成及其相對位置，合成肽段；(2)對步驟(1)中合成肽段的N端進行乙酰化修飾；和(3)對步驟(2)中修飾完成的肽段進行C端CMK修飾。4.以上3所述的制備方法，進一步包括用C18疏水層析方法分離純化步驟(3)修飾完成的肽段。5.以上4所述的制備方法，進一步包括通過質譜法鑒定所得肽段。6.式(I)的化合物作為人免疫系統毒性蛋白顆粒酶M抑制劑的用途。7.式(I)的化合物在制備人免疫系統毒性蛋白顆粒酶M抑制劑中的用途。8.以上7所述的用途，其中所述抑制劑用于減少器官移植排斥、治療自身免疫病或治療腫瘤。化學結構式(I)化合物可以用于科學研究和臨床治療中。所述科學研究涉及有關顆粒酶腫瘤殺傷機制和單一顆粒酶在細胞或生物體作用通路的研究；臨床治療包括降低器官移植排斥、自身免疫病治療和抗腫瘤治療等。圖1.式(I)化合物合成后疏水層析純化結果；圖2.合成的式(I)化合物的質譜鑒定結果；圖3.化學結構式(I)化合物與顆粒酶M結合的結構圖，其中化學結構式(I)化合物以綠色的ball-and-stick模式呈現，并標注了其各氨基酸和修飾基團的名稱。網格圖顯示了化學結構式(O化合物確實存在的電子密度圖，不同顏色的表面圖表示了顆粒酶M底物結合口袋周圍的電勢環境。藍色區域為負電荷區；紅色區域為正電荷區；其它部分為疏水區；圖4.化學結構式(I)化合物可以高效地抑制顆粒酶M的活性(圖中[1]/[E]指化學結構式(I)化合物抑制劑(inhibitor,I)與酶(enzyme,E)的濃度比)；圖5.化學結構式(I)化合物對顆粒酶A活性的影響(圖中[I]/[E]指化學結構式(I)化合物抑制劑(inhibitory)與酶(enzyme,E)的濃度比)；圖6.化學結構式(I)化合物對顆粒酶B切割其底物Bid的影響(圖中aB指活性的顆粒酶B(activeGzmB,aB)，GST-Bid指重組的GST和Bid融合蛋白(GST-Bid)，M-I指顆粒酶M的抑制劑(GzmMinhibitor,M-I))。具體實施方式實施例l式(l)的化合物的合成、純化與鑒定式(I)的化合物中的氨基酸序列Lys-Val-Pro-Leu的合成可以按照本領域技術人員公知的固相合成技術來進行(例如參考《固相有機合成-原理及應用指南，王德心編，化學工業出版社，2004年9月》)。對肽段的N端進行乙酰化修飾和對C端進行CMK修飾也是本領域技術人員公知的技術(Belletal.，2003;Marzoetal.，1998)。式(I)的化合物的合成工作委托杭州中肽生化有限公司完成，合成純化與鑒定結果見圖1和2，其中用C18疏水層析方法分離純化修飾完成的肽段，并且用質譜法鑒定所得肽段，根據理論大小驗證主要合成成份是否為化學式(I)化合物，純度為多少。從圖1結果可知，式(I)化合物的合成純度大于98%。從圖2結果可知，所得化合物鑒定的分子量(530.8)與式(I)化合物的理論分子量(530.1)大小基本相符，因此所得化合物為式(I)的化合物。化學結構式(I)化合物與顆粒酶M結晶和結構解析實驗表明，該化合物可以在顆粒酶M上迅速地找到其靶點，并能非常恰當地粘合其耙點上(圖3)。該結構圖形象地表明，式(I)化合物能非常恰當地錨釘于顆粒酶M的催化口袋部位，化合物各組分與顆粒酶M蛋白表面氨基酸有著很強的相互作用，因此該化合物對抑制顆粒酶M的活性可能有很高的效率和特異性。化學結構式(I)化合物與顆粒酶M復合物的結晶與該復合物的結構解析方法如下用包涵體變復性的方法制備人顆粒酶M蛋白(制備方法參照Hink-Schauereta1.,2002，具體見附一)，篩選優化高質量顆粒酶M晶體后，再向晶體(晶體生長條件為50mMBicinepH8.5,0.2MLi2SO4，20%PEG3350)中加入適量化學結構式(I)化合物。16。C三個小時浸泡后，挑取化學結構式(I)化合物浸泡的顆粒酶M晶體在同步輻射線站收集其結構數據，衍射分辨率達2.30A。用結構解析相關軟件處理和分析所收集數據，確定化學結構式(I)化合物已經錨釘于其靶點后，利用高質量數據(2.70A)建立該復合物的三維結構模型(圖3)。實施例2式(I)的化合物抑制人顆粒酶M的活性化學結構式(I)化合物抑制效果及特異性檢測方法如下-(1)使用不同比例濃度的化學結構式(I)化合物，完成顆粒酶M切割其熒光底物Suc-AAPL-pNA(購于瑞士Bachem公司)的抑制效率實驗。按照化學結構式(I)化合物與顆粒酶M的濃度關系比，將實驗分成八個組在酶標板上同時進行。每組0.5nM的顆粒酶M分別與圖4所示的不同濃度關系的化學結構式(I)化合物在酶標板各孔中混合后，再向各孔加入過量的熒光底物Suc-AAPL-pNA(300|iM)，充分混勻后將酶標板放入37°C溫浴反應2小時。反應結束后，在多波長酶標儀Wallac1420Victor上測定各組405nm處的吸光度。多次重復上述實驗后，對實驗結果作統計學處理并繪制各組間數據的比較圖(圖4)。活性實驗表明(圖4)，式(I)化合物可以高效地抑制顆粒酶M的催化活性。(2)化學結構式(I)化合物抑制顆粒酶M活性特異性的檢測實驗。在特異性檢測實驗中，我們主要檢測了化學結構式(I)化合物對CTL和NK中豐度最高并與顆粒酶M同一家族的兩個成員活性的影響，顆粒酶A(制備方法參照Fanetal.，2003，具體見附二)和顆粒酶B(制備方法同顆粒酶A，參照Fanetal.，2003，具體見附二)。我們在顆粒酶A底物篩選文獻報道數據(MahmsandCraik,2005)的基礎上，首先設計了顆粒酶A的熒光底物Suc-VANR-pNA(委托中科亞光生物科技有限公司協助合成)。然后，同上述熒光底物使用方法檢測了化學結構式(I)化合物對顆粒酶A切割其熒光底物的影響(圖5)。圖5表明式(I)的化合物對顆粒酶A的活性無抑制作用。化學結構式(I)化合物對顆粒酶B降解其底物影響的檢測采用重組蛋白的體外切割實驗來完成。我們表達純化了重組的顆粒酶B(其制備方法同附二)和其底物GST-Bid(制備方法參見附三)，然后在顆粒酶的工作緩沖液(50mMHEPES,150mMNaCl,2mMMgCl2,0.05%Tween20，pH7.3)中完成化學結構式(I)化合物對酶與底物切割抑制效果的實驗，最后跑蛋白電泳SDS-PAGE來呈現了該反應的結果(圖6)。圖6所示結果表明，式(I)的化合物對顆粒酶B的活性也無抑制作用以上功能測試的結果一致地表明，式(I)的化合物能非常高效和特異地抑制人顆粒酶M的活性(圖4，圖5，圖6)，因此該化合物可用于顆粒酶M的相關科學研究及其可能帶來的臨床反應與疾病的治療等。顆粒酶M相關的科學研究包括顆粒酶M腫瘤殺傷機制、誘導細胞死亡通路以及其與同家族顆粒酶成員協同關系等的研究。顆粒酶M可能帶來的臨床反應與疾病包括器官移植排斥和自身免疫病等。附一、顆粒酶M包涵體表達純化方案(本方案是參照文獻(Hink-Schaueretal.，2002)的基礎上改進得來)質粒pET22b-GzmM(Amp+)(參見Huaetal.,2007);表達體系E.coli:Rosetta(DE3)(Novagen);其余試劑如果沒無另外指出，都購自Sigma，Co.一、GzmM的大量表達1.從平板中挑出一個含pET22b-GzmM質粒的菌落(宿主菌為Rosetta(DE3))，接種于約50mL終濃度100嗎/mlAmp的LB培養基中，37°C、220rpm過夜培養；2.將過夜新鮮菌液按1-2%轉接于含100|ag/mlAmp的2LLB培養基中，37°C、220rpm振蕩約3hr，至OD600為0.6-0.8時，取1ml菌液做檢測誘導蛋白對照；3.加IPTG至終濃度1mM/L，37。C誘導表達5hr，再取出1ml誘導后的菌液留做全菌對照，剩余菌液4000rpm離心30分鐘(1L離心瓶)，或8000rpm離心10分鐘(250ml離心瓶)，倒掉上清(注意將殘留LB充分流盡)，將沉淀部分放置一20。C冰箱過夜保存。二、GzmM的包涵體制備1.取上述凍存細菌沉淀，于冰上加入裂解緩沖液后，在磁力攪拌器上攪拌至沉淀全部均勻懸起;裂解緩沖液終濃度Tris-HCl(pH8.0)50mMNaCl500mMMgCl2-6H205mMDNaseI5嗎/mlRNase10(ig/mlLysozyme0.25mg/mlNP400.1%2.超聲破菌，起始4秒，停9秒，共130—150次，破碎過程中應間斷性地搖晃下燒杯，避免局部受熱；3.破碎完畢，蛋白樣品4'C、17，000rpm離心30min。離心后將上清轉移到三角瓶中4t:保存，取沉淀部分制備包涵體；4.將沉淀用洗滌緩沖液I(約70ml)重懸后移入小燒杯中，在攪拌器上攪拌均勻(停止攪拌后燒杯底部基本無沉淀物)，然后再轉入離心管中4°C、16,000rpm離心30min。按上述方法用洗滌緩沖液I洗2次，再用洗滌緩沖液II反復洗3次后，便可得到較純的GzmM包涵體蛋白；<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>用HC1調洗滌緩沖液I和II至pH7.2，用雙蒸水分別定容至所需體積，0.22pm抽濾后即可使用(最好不要放置時間太長，TritonX-100長時間易產生混濁現象)。三、GzmM包涵體蛋白的變復性1.取上述包涵體蛋白，用約10ml溶解緩沖液重懸后，在漩渦混勻器上振蕩至沉淀完全溶解(長時間不溶解時，要采用超聲的方法將其完全溶解)，然后放置于搖床搖晃或綁到漩渦混勻器室溫振蕩過夜。溶解緩沖液終濃度10mlTris匿HCl100mM1ml(lMTris-HCl)EDTA20mM0,4ml(0.5MEDTA)還原型谷光甘肽(307.33g/mol)150mM0.46g氧化型谷光甘肽(612.6g/mol)15mM0.092g鹽酸胍6M"3gNaOH調pH至8.0后，最好馬上使用；2.取過夜溶解的上述蛋白樣品到透析帶中，在pH5.0的6M鹽酸胍中4。C透析完全(由于溶液非常粘稠透析時間可能要長些)；3.將透析好的蛋白樣品逐滴加到1Lrefoldingbuffer(按1:100的比例)中，并用攪拌器不斷攪拌使蛋白樣品迅速擴散(轉速也不能過高)，此步操作要在4。C層析柜中完成。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用鹽酸(約150ml)調節pH至8.5，用雙蒸水定容至3L，0.22pm抽濾；4.將上述蛋白樣品4"C層析柜攪拌復性8-16hr后，再按1:2的比例緩慢加入2L的refoldingbuffer中，繼續4°C復性96hrs。四、復性蛋白的濃縮與純化1.復性完畢的蛋白0.22pm抽濾后，用濃縮儀濃縮至200ml以下，濃縮過程中要不斷正反洗柱子，避免蛋白局部過濃沉淀；2.純濃縮后用bindingbuffer(50mMTris，500mMNaCl，10mMimidazole,10%Glycerol也可不加咪唑)透析樣品，透析完全后再分批上Ni-NTA基質過柱純化(避免蛋白過量堆積)；3.SDS-PAGE檢測后，離心濃縮將蛋白樣品換buffer至腸激酶的酶切buffer(20mMTrispH8,0，lmMCaC12,0.1%Tween-20)中，濃縮至約1.5ml。五、GzmM的激活及活性檢測...腸激酶處理與合成底物切割1.將樣品移至EP管中，加入適量腸激酶(腸激酶使用量根據所得蛋白量并參考其說明書決定)，4'C酶切約20hrs;2.酶切完畢SDS-PAGE檢測酶切效果后，將樣品再次過Ni-NTA基質去除腸激酶；3.所得蛋白再次濃縮換buffer(20mMTrisPH8.0或20mMTrisPH8.0,300mMNaCl,15%Glycerol),濃縮至所需濃度后可直接放置4。C保存；4.取適量樣品做GzmM合成底物切割實驗，即活性檢測。反應buffer:100mMHEPESPH7.2,200mMNaCl,0.01%Tween-20;反應體系100(il反應buffer+4^ilGzmM合成底物+10plGzmM(很濃樣品最好稀釋)；由NaOH作為陽性對照，37'C放置并記錄底物變黃時間。附二、顆粒酶A表達純化方案(Fanetal.，2003)質粒pET26b-GzmA(Kan+)(參見Fanetal.,2003);表達體系E.coli:Rosetta(DE3)(Novagen);一、誘導表達1.從長有含pET26b-GzmA質粒克隆的平板中或保存的該質粒甘油菌中挑取單克隆或少許甘油菌，接種于約200mL終濃度50ug/ml的Kan+LB培養基中，37°C、220rpm過夜培養；2.將過夜菌液按1-2%轉接于含50ug/mlKan的8LLB液體培養基中，37°C、220rpm振蕩約3hr，至OD600達到0.6-0.8;3.加IPTG至終濃度ImM/L，誘導表達3hr。表達后的菌液4000rpm離心30分鐘，取沉淀部分(注意將殘留LB充分流盡)；二、分離純化1.取出上一步收集的細菌沉淀，于冰上加160mlBindingBuffer(50mMTrispH7.9,500mMNaCl,10%甘油),160ulNP40,DNAase(終濃度為5ug/ml)，以及lmg/ml的Lysozyme;2.將重懸菌液分裝于3個燒杯中，每杯超聲start:3sec,pause9sec,超聲有效時間2min;3.超聲后樣品4°〇、20，000rpm(約40000g)離心30min，上清轉移到燒杯中,取上清的100ul待以后電泳分析.沉淀留樣；4.將上清通過(D(X45um的濾膜抽濾；5.裝Ni柱(8ml):將層析柱清洗、調節至垂直于水平面后，將出水口關閉，加入少量脫氣純水(大約l/3柱體積)。將His-TagResin攪拌均勻(注意動作要輕，不要產生氣泡)，用長玻璃膠頭滴管輕輕吸取混勻的Resin，沿柱子的管壁環形均勻加入純水中(注意將滴管盡量接近液面，以免產生氣泡)。待加入的Resin沉積出層面后，打開下方出水口，調節流速為10柱體積/小時，即大約50d/min，以后均保持此流速。繼續加入Resin，直到沉積體積達到8ml。6.用50ml去離子水充分沖洗沉積好的柱床，洗去Resin中殘留的乙醇。7.用50ml的ChargeBuffer(200mMNiSO4)充分平衡，掛鎳。8.用50ml的BindingBuffer充分平衡。9.層析(永遠不要讓柱子走干！！)10.上樣。注意要沿著管壁均勻上樣！控制流速10柱體積/小時，注意要保留該步樣品。11.用50mlBindingBuffer充分平衡。注意要保留該步樣品，12.用50mlWashBuffer洗去未結合的雜蛋白。注意要保留該步樣品！13.用50mlEluteBuffer(50mMTrispH7.9，500mMNaCl,250mM咪唑)(75%IXwashbuffer+25%IXelutebuffer)洗脫。收集1-25管，每管1ml(收集的管應置于冰上)。取40ul加到5ml的考馬斯亮藍G250，測其吸光值。選取蛋白含量高的管，連同上面留的樣品一起12%SDS-PAGE電泳分析表達蛋白的位置。合并目的蛋白管。14.對于使用過的柱子，應在用50ml去離子水沖洗后，用30ml鹽酸胍溶液(6Mol/L鹽酸胍，0.2Mol/L乙酸)洗，再用50ml去離子水沖洗。最后保存在20%的乙醇中。15.將親和層析得到的樣品裝于處理好的透析袋中(約3ml)，加入lulrEK酶(Sigma產品)于透析袋中。透析過夜，其中，更換三次透析buffer(即EK酶的裂解液20mMTris-HClpH7.4,50mMNaCl，2mMCaC12)。16.二次層析，去除rEK酶，純化活性GzmA17.透析的樣品3，000rpm離心5min后，用IXBindingBuffer稀釋10倍，上鎳柱純化。注意使樣品保持始終在4°C!用BLT法(1)分析所得fraction,合并有活性的管。18.將上步得到的樣品轉入超濾離心管中，2000g離心5min，將樣品濃縮至終體積為lml。控制蛋白濃度約3mg/ml，于50mMTris-HClBufferpH7.4中，于-8(TC長期保存。或lmg/ml-2(TC短期保存。附三、GST-Bid的表達純化質粒pGEX-6P-l-Bid(Amp+)(參見Zhaoetal.,2007)表達體系E.coli:Rosetta(DE3)(Novagen);一、誘導表達1.從長有含pGEX-6p-l-Bid質粒克隆的平板中或保存的該質粒甘油菌中挑取單克隆或少許甘油菌，接種于約200mL終濃度50ug/ml的Kan十LB培養基中，37°C、220rpm過夜培養；2.將過夜菌液按1-2%轉接于含50ug/mlAmp的8LLB液體培養基中,37°C、220rpm振蕩約3hr，至OD600達到0.6-0.8;3.加IPTG至終濃度lmM/L，誘導表達3hr。表達后的菌液4000rpm離心30分鐘，取沉淀部分(注意將殘留LB充分流盡)；二、分離純化1.取出上一步收集的細菌沉淀，于冰上加160mlPBS,160ulNP40,DNAase(終濃度為5ug/ml),以及lmg/ml的Lysozyme;2.將重懸菌液分裝于3個燒杯中，每杯超聲start:3sec，pause9sec,超聲有效時間2min;3.超聲后樣品4。C、20,000rpm(約40000g)離心30min，上清轉移到燒杯中，取上清的lOOul待以后電泳分析.沉淀留樣.4.將上清通過O0.45um的濾膜抽濾(所有用于層析的液體都需要通過(D0.45um的濾膜抽濾后方能使用！)5.0.8ml/min過GST預裝柱(GE產品)，上樣完畢后用10倍柱體積的PBS沖洗預裝柱；6.使用elutionbuffer(50mMTrispH8.0,10mMGSH)洗脫目的蛋白，每管lml分管接取洗脫蛋白；7.SDS-PAGE檢測所得蛋白純度與濃度，收取目的蛋白最純的管；8.將上步得到的樣品轉入超濾離心管中，2000g離心5min，將樣品濃縮至終體積為lml。控制蛋白濃度約3mg/ml，于50mMTris-HClBufferpH7.4中，于-8(TC長期保存。或lmg/ml-2(TC短期保存。參考文獻Bell，J.K.，Goetz，D.H,,Mahrus,S.，Harris,J丄.，Fletterick,R.J,andCraik,C.S.(2003)TheoligomericstructureofhumangranzymeAisadeterminantofitsextendedsubstratespecificity,7VafSfrw"Afo/腸/，10，527-534.Chowdhury，D.andLieberman,J.(2008)Deathbyathousandcuts:granzymepathwaysofprogrammedcelldeath,^ww/ev/附聽恥/，26,389-420.Fan，Z.,Beresford,P丄，Oh，D.Y.,Zhang，D.andLieberman,J.(2003)TumorsuppressorNM23-H1isagranzymeA-activatedDNaseduringCTL-mediatedapoptosis,andthenucleosomeassemblyproteinSETisitsinhibitor.Ce〃，112，659-672.Hink-Schauer,C.,Estebanez-Perpina,E.，Wilharm,E.，Fuentes-Prior,P.,Klinkert，W.，Bode,W.andJenne，D.E.(2002)The2.2-Acrystalstructureofhumanpro-granzymeKrevealsarigidzymogenwithunusualfeatures.J編CT訓，277，50923-50933.Hua，G.,Zhang,Q.andFan,Z.(2007)Heatshockprotein75(TRAP1)antagonizesreactiveoxygenspeciesgenerationandprotectscellsfromgranzymeM-mediatedapoptosis,C7zem，282，20553-20560.Krenacs，L"Smyth，M丄，Bagdi，E,，Krenacs，T,，Kopper，L,，Rudiger，T,，Zettl，A.，Muller-Hermelink，RK.，Jaffe,E.S.andRaffeld,M.(2003)TheserineproteasegranzymeMispreferentiallyexpressedinNK-ceH，gammadeltaT-cell,andintestinalT-celllymphomas:evidenceoforiginfromlymphocytesinvolvedininnateimmunity.脅od，101,3590-3593.Mahrus,S.andCraik,C.S.(2005)SelectiveChemicalFunctionalProbesofGranzymesAandBRevealGranzymeBIsaMajorEffectorofNaturalKillerCell-MediatedLysisofTargetCells.C7細,W/7&5/o/og^，12,567-577.Marzo,I.,Susin，S.A.，Petit,P.X.，Ravagnan,L.，Brenner,C.,Larochette，N.,Zamzami，N.andKroemer,G.(1998)Caspasesdisruptmitochondrialmembranebarrierfunction.F^S丄e"，427，198-202.Rukamp,B丄，Kam,C.M.，Natarajan,S.，Bolton，B.W.，Smyth,M丄，Kelly,J.M.andPowers,J.C.(2004)SubsitespecificitiesofgranzymeM:astudyofinhibitorsandnewlysynthesizedthiobenzylestersubstrates.爿廠c/zS/ocAemfi/o//^^,422，9-22.Suck，G，Branch,D.R.,Smyth，M丄，M川er,R.G"Vergidis，J"Fahim，S.andKeating，A,(2005)KHYG-1,amodelforthestudyofenhancednaturalkillercellcytotoxicity.￡xp33，1160-1171.Vivier，E"Tomasello,E.,Baratin,M.,Walzer，T.andUgolini，S.(2008)Functionsofnaturalkill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