專利名稱：一種豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白、其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌表面蛋白，具體地說涉及一種豬鏈球菌2型的表面 蛋白，還涉及該蛋白質的制備方法以及用途。
背景技術：
豬鏈球菌(6^^tococcws^^)，屬于蘭氏分類法的R群，有35個血清型， 以豬鏈球菌2型流行最廣，致病性最強。自丹麥在1968年最早報道人感染豬鏈 球菌病后，20世紀70年代以來，歐美部分國家和香港地區均報道過豬鏈球菌 病例，主要以腦膜炎為主，中毒性休克綜合征(TSS)少見，未見暴發流行。 我國于1998年和2005年兩次在江蘇和四川暴發人感染豬鏈球菌2型疫情，不同 于國外人感染病例以腦膜炎為主的特點，臨床表現為休克型和腦膜炎型。多 數病例死于中毒性休克綜合征(TSS)，病理改變主要表現為全身多器官受損， 敗血癥伴彌漫性血管內凝血(DIC)。人豬鏈球菌病已成為嚴重威脅我國人民 健康的一種新的人畜共患病，如何有效地預防和控制豬鏈球菌感染己成為科 學家們面臨的重要研究難題。
由于對毒力因子和保護性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地 區毒力也不盡相同，高致病性豬鏈球菌感染缺乏有效的診斷靶標對該類病 原的分離鑒定主要依靠傳統的分離培養和生化鑒定，然后用豬鏈球菌高免血 清進行凝集試驗分型。但家畜廣泛攜帶鏈球菌，許多菌株毒力低，因此僅僅 靠生化反應檢測豬鏈球菌是遠遠不夠的，必須建立針對特異毒力因子的檢測手段，以區分弱毒株和強毒株。以上情況都阻礙了有效的豬鏈球菌病疫苗的 研制及對感染的及時診斷與控制。
縱觀國外豬鏈球菌病疫苗的研制情況，主要經歷了全菌免疫和抗原蛋白
免疫兩個階段。上世紀90年代，有研究者以福爾馬林滅活的豬鏈球菌進行靜 脈注射能刺激被免疫豬產生調理化的抗體[HoltME, EnrightMR, Alexander TJ. (1990 ) Immunisation of pigs with killed cultures of浙eptococctwr type 2. ^J^M48:23-7]。也有研究者通過篩選無毒力的豬鏈球菌突變體，如溫度 敏感性突變體、鏈霉素依賴性突變體等來獲得具有保護性的全菌疫苗[Kebede M， Chengappa MM, Stuart JG. ( 1990 ) Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of S/re/ tococct^ efficacy trial of the mutant vaccine in mice.Mz'cn 6/o/. 22:249-57. Foster N， Staats JJ， Chengappa MM.
(1994 ) Isolation, characterization and protection studies in mice of a streptomycin-dependent mutant of 5V;^pfococcws type 1/2. F"e/ Commw". 18:155-63.]，但是滅活的全菌免疫常會引起免疫綜合征等副作用。后續有研究 者利用豬鏈球菌相關毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)結 合油包水型乳劑(WO )和氫氧化鋁佐劑(AH)作為疫苗，對其保護性和毒副作用 作了評價，發現用MRP+EF/WO免疫的豬與用全菌/WO免疫的豬具有同等有 效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫后的存活豬中，沒有觀察到明顯的 臨床表征[WisselinkHJ， VechtU， Stockhofe-Zurwieden N， Smith HE. (2001) Protection of pigs against challenge with virulent 5Vre/ tococctw serotype 2 strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine. Vet Rec. 148:473-7.]。也有人用純化的溶血素(SLY)作為疫苗免疫小鼠，發現能對小 鼠產生完全保護作用，免受毒力株的傷害[Jacobs AA， Loeffen PL, van den BergAJ， Storm PK. (1994) Identification, purification, and characterization of a thiol-activated hemolysin (suilysin) of 5^ptococcws Infect Immun.
62:1742-8.]。但豬鏈球菌的毒力因子較常時間以來就呈現出時空上的相對多樣 性，雖然MRP、 EF與毒力高度相關，但與歐洲致病株不同的是多數加拿大 致病株不表達MRP和EF，且MRP和EF的2-型豬鏈球菌缺失突變體與野生 型一樣同樣具備毒力[Gottshalk M, Lebrun A, Wisselink HJ, Dubreuil JD, Smith HE， Vecht U. (1998) Production of virulence-related proteins by Canadian strains of 5^印tococcw raz's capsular type 2. Can J Vet Res 62:75-79.]。我國、流行株禾口非 流行株都表達MRP，且動物實驗顯示流行株培養分泌的上清并不引起病變， 單靠現了解的MRP、 EF、 SLY等毒力因子不足以解釋我國2-型豬鏈球菌的致 病機理，使用MRP作為人免疫疫苗產生抗體中和MRP可能難以達到理想的 效果。而在國內，豬鏈球菌疫苗的研制還處于起步狀態，即滅活的全菌疫苗[王 卓，舒秀偉，王文成.豬鏈球菌病二價滅活疫苗候選株培養條件的優化及其安 全性試驗.(2004)中國藥獸雜志.38: 34-36.]。因此有必要根據我國實際情況， 研制適合我國的2-型豬鏈球菌的新型疫苗，發掘新的具有免疫原性的毒力因 子是尋找新型疫苗的重要途徑。
一般來說，表面暴露蛋白和細胞壁附著蛋白常被作為疫苗的候選耙標和 血清學診斷試劑。近10年來，也有研究者試圖尋找有免疫原性的豬鏈球菌表 面細胞壁蛋白作為疫苗的候選分子，1996年Haataja S等分離并鑒定出一種半 乳糖抑制型黏附素，在23種血清型的豬鏈球菌中，用免疫印跡的方法均能檢 測到這種黏附素的存在，發現具有很強的免疫原性和調理功能，適合作為疫 苗候選分子[HaatajaS， TikkanenK， HytonenJ， Finne J.( 1996)The Gal alpha 1-4Gal-bindingadhesinof 浙e/ tococcws a gram-positivemeningitis-associated bacterium. Adv Exp Med Biol. 408:25-34.] 。 2005 年 Okwumabua O等人通過對2-型豬鏈球菌的全基因組進行篩選，發現一種分子 量為38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保護性,認為這種蛋白是較好的疫苗 候選分子并且適合用作診斷試劑的開發，這種蛋白的生物學功能以及與致病 機理的關系正在進一步研究中[OkwumabuaO， Chinnapapakkagari S. (2005) Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic and protective antigen of 5^reptococcws纖S. Clin Diagn Lab Immunol. 12:484-90]。
發明內容
為了尋找具有免疫原性的毒力因子，研發豬鏈球菌新型疫苗，本發明提 供了一種豬鏈球菌2型新型核酸酶表面蛋白，還公開了該核酸酶表面蛋白的 制備方法及其用途。本發明所公開的豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白具有序列 表中序列1所示的氨基酸序列，編碼該核酸酶表面蛋白的基因具有序列表中 序列2所示的核苷酸序列，編碼該蛋白的基因在豬鏈球菌2型菌株中廣泛存 在。該蛋白命名為SSU98_1549， genebank編號為gi|146321396。
本發明還公開了表達上述豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白的重組表達質 粒，其含有序列表中序列2的核苷酸序列。上述表達質粒可以為大腸桿菌表 達質粒，具體質粒可以是pET32a等。
本發明還公開了含有上述表達豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白的重組表達 質粒的菌株，該菌株為大腸桿菌，可以為BL21菌株。
本發明還公開了上述核酸酶表面蛋白的制備方法，該方法包括如下步驟:
首先克隆該核酸酶表面蛋白基因可通過PCR方法進行，首先設計合成 引物，在引物兩端可添加酶切位點和保護性堿基，然后按照PCR方法，用豬鏈球菌制備的模板，在一定條件下進行擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電 泳，并回收產物并進行酶切，確定核酸酶表面蛋白基因。然后是表達該核酸 酶表面蛋白基因的重組質粒制備將制備的核酸酶表面蛋白基因與大腸桿菌 表達載體相連接，表達載體可以為原核表達載體，可采用商業的原核表達載
體，如大腸桿菌表達載體pET32a，制備表達載體，并轉化大腸桿菌，制備重 組菌，利用菌落PCR和限制性內切酶進行重組菌的篩選和鑒定；對重組菌進 行IPTG誘導表達；超聲波破碎重組菌，收集上清，以GE鎳親和層析柱進行 純化。
本發明還公開了上述核酸酶表面蛋白的用途。本發明的核酸酶表面蛋白 是通過免疫蛋白質組鑒定的2型豬鏈球菌新的免疫原性抗原分子，目前根據 豬鏈球菌基因組注釋的結果，僅有該基因開放閱讀框架的預測，尚未有該蛋 白在豬鏈球菌中表達的報道，也未有該基因功能的線索。
本發明通過實驗證明，該蛋白可用作診斷靶標，在豬鏈球菌感染的動物 和人血清中針對該蛋白的抗體明顯上升，因而可用于開發豬鏈球菌感染的診 斷試劑。本發明還公開了核酸酶表面蛋白在制備豬鏈球菌2型疫苗中的應用。
通過該蛋白制備的免疫血清調理的全血殺傷實驗發現該蛋白具有一定的保護 性，是新的高效保護性抗原，可用于制備疫苗，作為重點疫苗候選和診斷分 子。
本發明首次將該核酸酶表面蛋白鑒定為豬鏈球菌2型新的免疫原性抗原 分子，并通過基因工程方法制備了該核酸酶表面蛋白并制備了相應抗體。并 公開了該核酸酶表面蛋白可以用于制備豬鏈球菌的診斷試劑和疫苗，在有效 預防和控制豬鏈球菌感染方面具有良好的應用價值和廣闊的市場前景。
圖1為豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白SSU98一1549的純化蛋白電泳圖， 其中3為低分子量蛋白標準，從上至下依次為97.4 kDa， 66.2 kDa， 43.0 kDa, 31.0kDa， 20.0kDa; 1為上樣前蛋白誘導物原液，2為上樣后蛋白誘導物穿透 液，4-5為50mMol/L濃度咪唑的洗脫液(不含目的蛋白)，6-8為150mmol/L 濃度咪唑的洗脫液(含目的蛋白)。
圖2針對SSU98一1549特異抗體的比較。病人和健康人的抗體水平比較 (A)，豬感染前后的抗體水平比較(B)。 ELISA實驗用于評價針對SSU98—1549 特異的抗體反應，硫氧還蛋白(Trx)用作陰性對照。.
具體實施例方式
實施例一 豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白SSU98—1549的表達純化及抗體制備 1.材料和方法 1.1菌株和質粒
豬鏈球菌2型98HAH12株[Chen C, Tang J, Dong W， Wang C， Feng Y， et al (2007) A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2 Chinese Isolates. PLoS ONE 2(3): e315];大腸桿菌DH5a， BL21，均為國際標準株；表達載體pET32a(+)為Novagen公司產品。 1.2酶和試劑
EcoRI和XhoI等限制性內切酶以及Taq酶、dNTPs 、 DL15000分子量 標準等PCR所用試劑均為寶生物工程(大連)有限公司產品；DNA回收試劑 盒為天為公司產品；鎳親和層析柱為GE公司產品；質粒提取盒為V-gene公 司產品；弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品；Amp為中諾藥 業產品。1.3 PCR引物設計及SSU98一1549核酸序列，蛋白序列
根據所要擴增的片段，設計一對引物，弓l物兩端分別添加EcoRI和XhoI
酶切位點和保護性堿基，引物Pl和P2可擴增豬鏈球菌2型SSU98一1549
基因開放閱讀框(ORF)全長片斷。引物序列分別為
上游引物P1: 5 '-gcggatccaaaaagaatattcggttg-3，見序列表中序列3; 下游引物P2: 5 (國atotcgagctccccttccttacgtctca-3，見序列表中序歹lj4。 核酸序列>SSU98—1549見序列表中序列2，氨基酸序列>SSU98_1549 見序列表中序列l。
1.4 PCR擴增
按下列順序和條件依次加入各反應物并進行PCR擴增。豬鏈球菌2型模 板DNA 2|iL， lOXbuffer 5pL， 2.5 mmol/L dNTPs 3 U L，引物P1和P2 ( 5 U mol/L ) 各lpL， ddH20 37pL， LA-7b《酶(5U/uL) lpL。擴增的條件為；94 °C 7min; 94°C lmin， 55°C lmin， 72°C 2min， 30個循環；72 。C 7min。
1.5 PCR產物的回收和酶切
PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，后以DNA回收試劑盒回收目的片段， 并以BamHI和XhoI 37t:酶切3h。
在含有100ug/mLAmp的LB肉湯中接種攜帶pET32a空質粒的DH5 a 大腸桿菌單菌落，37。C搖振培養12 16h后，1。/。轉接入100ug/mLAmp的 新鮮LB肉湯37'C搖振培養6h，以質粒抽提試劑盒抽提質粒。BamHI和XhoI 雙酶切后，以DNA回收試劑盒回收酶切產物。將PCR雙酶切回收產物與空 質粒雙酶切回收產物進行連接，并轉化感受態的DH5a宿主菌。感受態細菌 的制備、轉化均按常規方法進行，利用菌落PCR和限制性內切酶酶切進行重 組菌的篩選和鑒定。1.7重組質粒的測序和序列分析
重組質粒的序列測定采用Sanger雙脫氧末端終止法，由北京三博遠志生 物技術有限公司完成，以驗證其閱讀框架，并以BLAST軟件進行同源性分析。 1.8重組質粒在大腸桿菌中的表達和純化
將重組質粒按常規方法轉化感受態的大腸桿菌BL21，利用Amp抗性篩 選重組菌，挑單菌落接種LB肉湯中(含100ug/mLAmp)， 30。C劇烈搖振培養 2 4h，當菌液濃度OD60()達0.5 0.6時，加IPTG至終濃度lmmol/L， 3(TC繼 續劇烈搖振培養2 4h。 6000r/min離心10min ，沉淀以蒸餾水重懸，加等體 積的2X電泳上樣緩沖液煮沸10min， SDS-PAGE檢測。含空pET32a(+)的大腸 桿菌BL21亦同樣經IPTG誘導處理后，SDS-PAGE檢測表達情況。以超聲波破 碎誘導的重組菌，收集上清，以GE鎳親和層析柱進行親和層析，具體步驟按 使用說明書進行。 1.9重組蛋白動物免疫試驗
將收集的蛋白以PH7.2 10mmol/L的PBS稀釋至0.1mg/ml，加入等量的弗氏 完全佐劑，皮下免疫Wistar大鼠(購自軍事醫學科學院試驗動物中心)，0.5m1/ 只；以后3—5周，分別以0.2， 0.4， 0.8， 1.6mg/ml加弗氏不完全佐劑加強免疫， 第7周斷尾取血ELISA法測抗體效價。同時設立全菌免疫對照組和空白對照組 (pET32a空質粒轉化BL21，誘導表達TRX蛋白，以此蛋白免疫大鼠為空白對 照)。以硫酸銨沉淀法制備抗血清。 2.結果 2.1 PCR結果
PCR產物經電泳后，出現一條約2025bp的條帶，大小與預期一致。 2.2重組質粒的鑒定SSU98—1549基因片段經回收，以Bamffl和Xho I酶切位點定向克隆至 pET-32a中，獲得重組質粒，命名為SSU98一1549-pET-32a。重組質粒轉化感受 態的DH5a宿主菌，經Amp抗性篩選得到重組菌。提取重組質粒，經EcoR I和XhoI雙酶切，可切出約2025bp左右的片斷，說明SSU98—1549片段已成
功克隆。
2.3重組質粒的表達
重組BL21轉化菌經IPTG誘導后，菌體SDS-PAGE顯示有一條90kD的 蛋白帶。經鎳柱純化獲得純化的SSU98—1549蛋白。見圖l。 2.4測序結果和序列分析
克隆的序列長度經測序為2025bp，如序列表中序列2所示，翻譯后為674 個氨基酸殘基，見序列表中序列l。
實施例二豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白ssu98—1549的免疫原性及抗體
介導的調理吞噬試驗 1.材料方法材料同實施例一。
1.1重組豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白ssu98—1549和多抗的制備見實施例
1.2 ssu98一0267抗體介導的調理吞噬
血平板刮取豬鏈球菌2型單菌落，接入THB培養基，37°C， C02孵箱培養 8h后轉接新鮮THB培養基培養8h至對數生長期。取lml菌液(約l X 108CFU/ml) 13，000rpm， lmin集菌，PBS洗菌并重懸，調整至l()6CFU/ml，涂血平板，記 為初始菌量。取50m1 (^106cfu/ml)菌液加入100(il抗體，37。C15min后冰上 15min;加入350^il健康人全血37。C， 3h;加入55W 1 %saponin，冰上20min; 反復吹打后稀釋涂血平板，16h后血平板記數單克隆。1.3感染豬與人中SSU98一0267蛋白特異抗體測定
采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定病人和感染動物中針對該蛋白的 特異抗體，采用健康人的血清和感染前的動物血清作為對照。采用5嗎/ml的 重組蛋白包被酶聯板，包被緩沖液為0.05 M NaHC03 (PH 9.6) ， 4。C包被過 夜，然后采用3% BSA 37 °C封閉3 h。病人和健康人血清樣品1:500稀釋， 感染前后豬血清均1:200稀釋，反應信號通過辣根過氧化物酶(HRP)標記 的二抗進行檢測。 2.結果
2.1重組蛋白抗體介導的調理吞噬作用
經GE鎳親和層析柱層析獲得純化的重組蛋白SSU98—1549，分別加弗氏完 全和不完全佐劑免疫后，制備抗血清，進行間接殺菌試驗。殺菌率計算
(CFUrTrx—CFUr98—1549) /CFUrTrx。 Trx為從含pET32a (+)空載體的大腸桿 菌BL21鎳柱純化的硫氧還蛋白。
抗體介導的調理吞噬試驗分別用SSU98一1549重組蛋白；MRP重組蛋白 免疫大鼠后的大鼠血清調理健康人血，進行人全血對豬鏈球菌2型活菌的殺傷 試驗。SSU98—1549重組蛋白的抗血清調理人全血對豬鏈球菌2型的殺傷率為 40%左右，但低于MRP蛋白的抗血清，MRP蛋白的抗血清調理人全血對豬鏈 球菌2型的殺傷率為90%。
2.2感染的人和豬血清中SSU98—1549特異抗體檢測
我們檢測了 6名豬鏈球菌2型感染的病人和5名健康人血清中 SSU98—0267特異抗體的存在狀況，結果發現與健康人相比，病人SSU98一0267 特異抗體水平明顯升高，見圖2A。我們檢測了豬鏈球菌2型感染豬前后血清 中SSU98—0267特異抗體的存在狀況，結果發現與感染前相比，感染后血清中SSU98—0267特異抗體水平顯著升高，見圖2B。上述實驗結果表明 SSU98 0267可作為診斷耙標用于豬鏈球菌2型感染的血清學診斷。<110>
<120〉
<130>
<160>
<170〉
<210> <211> <212> 〈213〉
豬鏈2型核酸酶表面蛋白.SEQ 序歹U表
中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所 一種豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白、其制備方法及用途
4
Patentln version 3.2 1
674 PRT
<400> 1
Met Lys Lys Asn lie Arg Leu Lys Ser Ser lie Leu Ala Leu Val Ala 15 10 15
Gly Phe Ser Val lie Ala Thr Gin Ala Val Leu Ala Asp Glu Leu Ala 20 25 30
Val Gin lie Met Gly Val Asn Asp Phe His Gly Ala Leu Asp Met Thr 35 40 45
Gly Thr Ala Arg Leu Glu Gly Glu Thr Val Arg Asn Ala Gly Thr Ala 50 55 60
Ala Leu Leu Asp Ala Tyr Met Asp Asp Ser Gin Ala Glu Phe Glu Glu 65 70 75 80
Thr Ala Ala Glu Thr Glu Thr Pro Ala Glu Ser lie Arg Val Gin Ala 85 90 95
Gly Asp Met Val Gly Ala Ser Pro Ser Asn Ser Gly Leu Leu Gin Asp 100 105 110
Glu Pro Thr Val Lys Val Phe Asn Lys Met Asp Val Glu Tyr Gly Thr 115 120 125
Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Glu Gly Leu Asp Glu Tyr Asn Arg lie 130 135 140
Met Thr Gly Glu Ala Pro Lys Lys Gly Gin Phe Asn Glu lie Val Asp 145 150 155 160
Asn Tyr Thr Arg Glu Ala Ala Lys Gin Glu lie Val lie Ala Asn Val 165 170 175
He Asp Lys Glu Thr Gly Glu lie Pro Tyr Gly Trp Lys Pro Tyr Ala 180 185 190
lie Lys Thr lie Pro Val Asn Asp Lys Glu Ala Lys lie Gly Phe lie195
200
豬鏈2型核酸酶表面蛋白.SEQ 205
Gly Val Val Thr Thr Glu lie Pro Asn Leu Val Leu Lys Lys Asn Tyr 210 215 220
Glu Gin Tyr Thr Phe Leu Asn Glu Ala Glu Thr lie Ala Lys Tyr Ala
225
230
235
240
Arg Glu Leu Ala Glu Lys Gly Val Asn Ala lie Val Val Leu Ala His 245 250 255
Val Pro Ala Thr Ser Lys Asp Gly Val Ala Ala Gly Glu Ala Ala Asp 260 265 270
Met lie Ala Lys Leu Asn Glu lie Tyr Pro Glu His Ser Val Asp Leu 275 280 285
Val Phe Ala Gly His Asn His Val Tyr Thr Asn Gly Thr Thr Gly Lys 290 295 300
Thr Leu lie Val Gin Ala Thr Ser Gin Gly Lys Ala Tyr Ala Asp Val
305
310
315
320
Arg Ala Val Tyr Asp Thr Asp lie Ala Asp Phe Lys Ala Val Pro Thr 325 330 335
Ala Lys lie lie Ala Val Ala Pro Gly Gin Lys Thr Pro Ser Pro Glu 340 345 350
lie Gin Ala lie Val Asp Glu Ala Asn Thr lie Val Lys Lys Val Thr 355 360 365
Glu Gin Lys lie Ala Thr Ala Ser Gin Ala Thr Asp lie Ser Arg Glu 370 375 380
Val Asn Glu Phe Lys Glu Ser Ala Val Gly Asn Leu Val Thr Ser Ala
385
390
395
400
Gin Leu Ala lie Ala Lys Lys Ser Gly Tyr Asp Val Asp Phe Ala Met 405 410 415
Thr Asn Asp Gly Gly lie Arg Ala Asp Leu Lys Val Gin Glu Asp Gly 420 425 430
Thr Val Thr Trp Gly Ala Ala Gin Ala Val Gin Pro Phe Gly Asn lie 435 440 445
Leu Gin Val Val Gin Met Thr Gly Glu Gin lie Tyr Thr Ala Leu Asn 450 455 柳
Gin Gin Tyr Asp Glu Gly Glu Lys Tyr Phe Leu Gin Met Ser Gly lie
15465
豬鏈2型核酸酶表面蛋白.SEQ 470 475 480
l>ys Tyr lie Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Pro Thr Glu Glu Asn Pro Tyr
485 490
495
Lys Val Val Lys Ala Phe Lys Glu Asp Gly Thr Glu lie Val Pro Thr
500 505
510
Glu Thr Tyr Thr Leu Val lie Asn Asp Phe Leu Phe Gly Gly Gly Asp 515 520 525
Gly Phe Ser lie Phe Lys Glu Ala Lys Leu lie Gly Ala lie Asn Pro
530
535 540
Asp Thr Glu Val Phe Val Glu Tyr Leu Thr Asp Uu Glu Lys Ala Gly
545
550 555
560
Gin Thr lie Ser Ala Thr lie Pro Gly Arg Lys Ala Phe Val Glu Lys
565 570
575
Tyr Val Glu Glu Pro Lys Ala Glu Glu Lys Glu Asp Asn Ala Gly Thr
580 585
590
Thr Thr Asp Val Lys Thr Pro Glu Lys Ala Asn Asp Gly Gly Asp Ser 595 600 605
Val Thr Asn Gin Lys Ala Thr Glu Gin Pro Ala Pro Ser Gly Ser Met
610
615 620
Ala Pro lie Ser Asn Lys Lys Thr Glu Lys Ala Ser Gly Asn Gin Thr
625
630 635
640
Leu Pro Asn Thr Gly Gin Glu Ala Leu Gly Ser Leu Leu lie Ser Leu
645 650
655
Gly Gly Leu Val Ser Leu Gly Met Ala Val Ser Val Arg Arg Lys Glu
660 665
670
Gly Glu
<210> 2
<211> 2025
<212〉 腿 <213>
<400> 2
atactagctcttgtagctgg ttttagcgtt60
ttagctgtcc幼attatggg agttaatg3t120
gcgcgattgg犯ggggaaac agttcgt犯t180
atggatgattcacaagcaga atttgaagaa240豬鏈2型核酸酶表面蛋白.SEQ
acagcagcagaaacagagacacctgcagagtctatccgtgttc卿ctgg ggatatggtt300
ggtgcaagtccatcgaattctggacttttgcaactgtaaa agtctttaat360
aaaatggatgttgaatacgg犯ctttggggaaccatgagtttgatgaggg acttgatgag420
tataaccgtatcatgactggtgaagctccaaaaaaaggtcagtttaatga gattgtagat480
aattatactcgtgaagctgctaaacaggaigattgttattgctaacgttat tgacaaagaa540
acaggtga犯ttccgtatggttggaagccctacgctattaagactattcc cgtgaatgat600
a犯g犯gctaagattggctttattggtgtagttacgacagaaattcctaa tcttgttttg660
atgagcagtacacttttttg犯tgaggcagagacgattgc taaatatgcg720
cgtgaattagctgaaaaaggtgtaaatgcgatagttgtactggctcacgt tccggctaca780
agc犯ggatggtgtggctgctggtgaagctgcagatatgattgctaagct犯atgaaatc840
tatcctgaacactcagttgaccttgtatttgctggccataaccatgtcta tacaaacggt900
acaacgggcaaaaccttgattgttcaagctacctcacaaggtaaggctta cgcagatgtt960
agggctgtttatgatacagatattgccgactttaaagctgttccgactgc gaaaattatt1020
gcagtagcaccagggcagaaaacaccaagtccggaaattcaggcaattgt agatgaggca1080
aataccattgtt犯aaaagtaactgagcaacagctagtca agcgacagat1140
atttcacgcgaagtgaatgaatttaaagaaagtgctgtaggtaatctagt aacatcggct1200
caattagctatcgctaagaaatcgggttatgatgttgactttgcaatgac犯acgatggc1260
gggattcgggC3gatttg犯ggtccaagaagatggaacagttacttgggg agcagcacaa1320
gctgttcaaccatttggg犯tatcctac犯gtcgttcaaatgacaggtga gcagatttat1380
acagccttaaatcaacaatatgatgaaggttccttcaaat gtctggaatt1440
aceicgaaggctgacaatccaacggaagaaaatccttataa ggttgtteiaa1500
gccttcaaag3卿tggg3Cgg卿ttgttcctatacact tgtcatcaac1560
gacttcttatttggtggtggggatggcttctcgattttcaaagaagctaa actgattggt1620
gctatcaatcagtatttgtgg3gtacttg3ctgatttaga aaaagcaggt1680
caaacc3ttagtgcaacaattccaggtagaaaagcatttgtagagaagta cgtagaagaa1740
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aaagcaaatgacggtggcgatagtgtaacaaatcagaaagcaaccgagca accggcacca1860
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<211〉 28
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權利要求
1.一種豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白，其特征在于具有序列表中序列1的氨基酸序列。
2. 根據權利要求l的豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白，其編碼基因具有序 列表中序列2的核苷酸序列。
3. —種表達豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白的重組表達質粒，其特征在于含有序列表中序列2的核苷酸序列。
4. 根據權利要求3所述的重組表達質粒，其中表達質粒為大腸桿菌表達 質粒pET32a。
5. —種表達豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白的菌株，其特征在于含有權利 要求3所述重組表達質粒。
6. 根據權利要求5所述菌株，其中表達菌株為大腸桿菌BL21。
7. 權利要求1或2所述豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白的制備方法，包括 如下步驟(1) 克隆該核酸酶表面蛋白基因；(2) 將該基因與大腸桿菌表達質粒相連接，轉化大腸桿菌；(3) 誘導表達；(4) 對表達產物進行分離純化。
8. 根據權利要求7所述方法，其中大腸桿菌表達質粒為pET32a，大腸桿 菌為co/z'BL21。
9. 權利要求1或2所述的豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白在制備豬鏈球菌 2型感染診斷試劑中的應用。
10. 權利要求1或2所述的豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白在制備豬鏈球菌 2型疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白，還公開了該蛋白質的制備方法及用途。本發明的豬鏈球菌2型核酸酶表面蛋白在genebank中的編號為gi|146321396，其制備方法包括克隆該核酸酶表面蛋白基因；將基因與大腸桿菌表達質粒相連接，轉化大腸桿菌；誘導表達；對表達產物進行分離純化等步驟。本發明的核酸酶表面蛋白可用作診斷靶標，在豬鏈球菌感染的動物和人可檢測到該蛋白特異的抗體，同時又是重要的保護性抗原，可用于制備疫苗。
文檔編號C07K14/315GK101613401SQ20081011551
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月25日 優先權日2008年6月25日
發明者姜永強, 煒 張, 李文君, 華 江, 耿紅冉, 媛 袁, 鄭玉玲, 郝淮杰 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所