專利名稱：聚乙二醇化重組人干擾素ω偶合物的制作方法
技術領域：
涉及一種治療對干擾素"敏感的病毒感染的藥物制劑，尤其是一種能夠明顯減少用藥次 數，具有長效作用的聚乙二醇化重組人干擾素偶合物以及其制備工藝。
背景技術：
干擾素是一類天然存在的小分子蛋白質和糖蛋白，它們通過大多數有核細胞對病毒感染 以及其他抗原刺激的反應而產生和分泌。干擾素使細胞能抵抗病 毒感染并對細胞表現 出廣泛的作用。它們通過與細胞表面的特異性膜受體結 合而發揮其細胞活性。
慢性肝炎主要指慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎，兩種肝炎在我國都很常見，尤其是慢性 乙型肝炎。如果不進行有效地抗病毒治療，部分慢性肝炎的病人最終將發展為肝硬化和肝癌。 藥物經濟學分析表明，治療慢性肝炎引起的肝硬化或肝癌的成本，遠遠高于早期階段的抗病 毒治療所需要的成本。
干擾素a是治療慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎的首選藥物，可以有效地抑制或清除病 毒，療效持久，阻止肝硬化或肝癌的發生。但普通干擾素治療具有自身不可克服的缺點，半 衰期短，只有4個小時。所以，干擾素不得不每隔一天就注射一次，使用很不方便。另外， 注射干擾素的宿主可產生針對干擾素的抗體。該反應可引起類似于流感的癥狀，這種癥狀被 作為干擾素的副作用迸行報道；同時該反應還可引起對干擾素的破壞，從而需要更大劑量干 擾素以達到治療效果。
為了解決普通干擾素在臨床治療上的不足，多家生物制藥公司致力于開發長效的干擾素。 其手段是通過對普通干擾素進行聚乙二醇修飾。
聚乙二醇(Poly ethlene glycol, pEG)是一種無毒、無免疫原性的水溶性高分子物質， 可以通過共價件鍵結合方式修飾蛋白質。聚乙二醇修飾蛋白質藥物不僅可以降低免疫原性和 毒性、而且能明顯延長血漿半衰期，提高蛋白質藥物的穩定性。
臨床上，廣泛應用的聚乙二醇化干擾素包括先靈葆雅公司的開發的聚乙二醇化干擾素a -2b (商品名，佩樂能，Peg工ntron);羅氏公司開發的聚乙二醇化干擾素a -2a (商品名，派 羅欣，PegasyS)，通過與利巴韋林聯合廣泛用于慢性乙型和丙型肝炎的治療。
本發明提供了一種聚乙二醇分子與重組人干擾素"的N末端結合，且一個重組人干擾素 "分子結合一個聚乙二醇分子的聚乙二醇化重組人干擾素w藥物的制備方法。
發明內容
本發明所要解決的首要技術課題是提供一種有利于工業化生產、且能明顯減少用藥次數、 用于慢性肝炎臨床治療的聚乙二醇化重組人干擾素藥物。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案
一種聚乙二醇化重組人干擾素O)藥物，其特征在于聚乙二醇化重組人干擾素藥物是由 聚乙二醇和重組人干擾素O)以共價鍵連接。
所述的聚乙二醇化重組人干擾素藥物是由聚乙二醇和重組人干擾素co的N末端通過共價 鍵連接。
每個聚乙二醇分子連接一個重組人干擾素(0分子。
所述的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇(Monomethoxy polyethyleneglycol， mPEG)活化 分子，包括單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG—ALD)和Y型聚乙二醇乙 醛，其分子量在5000-40000之間；最優選的是單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。
聚乙二醇與重組人干擾素發生共價結合反應的比例(摩爾比)約0.25 20，優選比例在 2.5 10之間。
本發明所要解決的再一個技術課題是提供一種上述聚乙二醇化重組人干擾素藥物的生產 工藝。
包括以下過程
1) 提供pH 4. 0 9. 0、 100mmol/L的鹽濃度的緩沖體系；
2) 在提供的緩沖體系中依次加入適量重組人干擾素"，聚乙二醇和NaBH3CN;
3) 上述混合物在4 37。C，反應12 72小時；
4) 步驟3)反應得到的產物進行SDS-PAGE分析，確定修飾的程度；
5) 用20 mM pH5. 0的醋酸緩沖液透析或者稀釋反應混合物，上CM陽離子交換柱，用 含有0-1M NaCl的20 raM pH5. 0的醋酸緩沖液梯度洗脫，280nm監測洗脫峰；
6) SDS-PAGE分析洗脫峰，收集主要含一個聚乙二醇分子連接一個重組人干擾素分子
的單點修飾洗脫峰；
7)將單點修飾洗脫峰用超濾離心管進行濃縮處理后，冷凍干燥。
與現有技術相比，本發明所具備的突出的實質性特點和顯著的技術進步。 主要表現在以下3個方面
本發明所提供的聚乙二醇化重組人干擾素-"藥物的優點是提供在體內更長時間的血液 水平，具有明顯的長效性，減少注射次數而使患者容易接受；
本發明所述的重組人干擾素-"是采用基因工程的方法,使用本研究室的專利載體，用畢 赤酵母表達，經發酵、純化后獲得，純度大于98%，且保持較高的生物活性；
本發明采用對重組人干擾素-"的N末端選擇性高的修飾方法，即聚乙二醇活性醛和重 組人干擾素"的N末端通過共價鍵方式連接，使產物的均一性得到大大提高，容易純化，純化產物的活性能夠較好地保留。 附圖概述
圖1是重組人干擾素-co與聚乙二醇(PEG)在25°C， pH5.0的條件下反應12小時的 SDS-PAGE圖，圖中M表示低分子量蛋白標準，1， 2, 3分別表示重組人干擾素-co與單甲氧基 聚乙二醇丙醛-20K的摩爾比例為1:2.5， 1:5, 1:10， 5表示1分子聚乙二醇修飾后的重組人 干擾素- 。
圖2是重組人干擾素-co與聚乙二醇(PEG)在25°C ， PH5. 0的條件下反應24小時的SDS-PAGE 圖，圖中M表示低分子量蛋白標準，1， 2， 3分別表示重組人干擾素-co與單甲氧基聚乙二醇 丙醛-20K的摩爾比例為1:2.5， 1:5， 1:10， 4表示未修飾的重組人干擾素-w， 5表示1分子 聚乙二醇修飾后的重組人干擾素-(O 。
圖3是重組人干擾素-ro與聚乙二醇(PEG)在25°C， pH5.0的條件下反應48小時的 SDS-PAGE圖，圖中M表示低分子量標準，1， 2， 3分別表示重組人干擾素-co與單甲氧基聚乙 二醇丙醛-20K的摩爾比例為1:2.5， 1:5， 1:10, 4表示未修飾的重組人干擾素-co， 5表示1 分子聚乙二醇修飾后的重組人干擾素-co。
圖4是重組人干擾素-o)與聚乙二醇(PEG)在25°C， pH5.0的條件下反應60小時的 SDS-PAGE圖，圖中M表示低分子量標準，1表示未修飾的重組人干擾素-(o， 2， 3, 4分別表 示重組人干擾素-co與單甲氧基聚乙二醇丙醛-20K的摩爾比例為l:2.5， 1:5， 1:10， 5表示1 分子聚乙二醇修飾后的重組人干擾素-co。
圖5是皮下注射PEG-rhIFN-(o和rhIFN-(o在家兔體內的濃度時間曲線； 實施例1
在本實施例中使用的重組人干擾素"的純度大于98%，且保持有較高的生物活性； 將重組人干擾素溶于lOOmM的醋酸鹽緩沖液(pH5.0)中，按重組人干擾素"與聚乙二
醇(PEG) 1:2.5 (摩爾比)的比例加入；
加入單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-pr叩ionaldehyde， mPEG-ALD)攪拌溶解，再加入
NaBH4CN(與干擾素的摩爾比為20:1)，室溫反應12-60小時。
實施例2
在本實施例中使用的重組人干擾素"的純度大于98%，且保持有較高的生物活性；
將重組人干擾素溶于lOOmM的醋酸鹽緩沖液(pH5.0)中，按重組人干擾素"與聚乙二
醇(PEG) 1:5 (摩爾比)的比例加入；
加入單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-propionaldehyde， mPEG-ALD)攪拌溶解，再加入
NaBH4CN(與干擾素的摩爾比為20:1)，室溫反應12-60小時。
6實施例3
在本實施例中使用的重組人干擾素0)的純度大于98%，且保持有較高的生物活性；
將重組人干擾素溶于100mM的醋酸鹽緩沖液(pH5.0)中，按重組人干擾素co與聚乙二 醇(PEG) 1:10 (摩爾比)的比例加入；
加入單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-propionaldehyde， mPEG-ALD)攪拌溶解，再加入 NaBH4CN(與干擾素的摩爾比為20:1)，室溫反應12-60小時。 實施例4
在本實施例中使用的重組人干擾素"的純度大于98%，且保持有較高的生物活性。 將重組人干擾素"溶于20mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中，按重組人干擾素"與聚乙二
醇(PEG) 1:2.5 (摩爾比)的比例依次加入重組人干擾素"和單甲氧基聚乙二醇縮丙醛 (mPEG-propionaldehyde, mPEG-ALD)，攪拌溶解，再加入Na朋4CN(與干擾素的摩爾比為
20:1)，室溫反應24-72小時。
實施例5
在本實施例中使用的重組人干擾素^0的純度大于98%，且保持有較高的生物活性。 將重組人干擾素co溶于20mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中，按重組人干擾素"與聚乙二
醇(PEG) 1:5 (摩爾比)的比例依次加入重組人干擾素co和單甲氧基聚乙二醇縮丙醛 (mPEG-propionaldehyde, mPEG-ALD)，攪拌溶解，再加入NaBH4CN(與干擾素的摩爾比為
20:1)，室溫反應24-72小時。
實施例6
在本實施例中使用的重組人干擾素"的純度大于98%,且保持有較高的生物活性。 將重組人干擾素"溶于20mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中，按重組人干擾素"與聚乙二
醇(PEG) 1: 10 (摩爾比)的比例依次加入重組人干擾素"和單甲氧基聚乙二醇縮丙醛 (mPEG-propionaldehyde， mPEG-ALD)，攪拌溶解，再加入NaBH4CN(與干擾素的摩爾比為
20:1),室溫反應24-72小時。
實施例7聚乙二醇化重組人干擾素"的分離純化工藝
將重組人干擾素與聚乙二醇反應得到的產物對20mM pH5.0的醋酸緩沖液透析后，上CM 陽離子交換柱，吸附后用含有0-1M NaCl的20 mM PH5. 0的醋酸緩沖液梯度洗脫，280nm監 測洗脫峰，收集主要含一個聚乙二醇分子連接一個重組人干擾素分子的聚乙二醇化重組人干 擾素，經過濃縮處理后，所得到的聚乙二醇化重組人干擾素藥物的純度可大于98%，在經過 濾除菌、冷凍干燥后即為產品。
例8聚乙二醇化重組人干擾素藥物在家兔血液中的存留時間實驗。本研究在家兔(新西蘭大耳白)中進行，采用皮下注射聚乙二醇化重組人干擾素，并以 重組人干擾素(rIFN-")作為對照，評價其在家兔血液中的存留時間。
分別在5min， 10min， 15min， 30min， 45min, lh, 1.5h， 2h， 4h， 8h， 12h， 24h取血， 加肝素鈉抗凝，離心取出血漿，冷凍保存待測。
采用雙抗夾心法測定血漿中聚乙二醇化重組人干擾素和重組人干擾素的含量，測定波長 490nm，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制mPEG-rhIFN-"和rhIFN-co在家兔血清中的
存留時間曲線.
該項試驗結果表明，rhIFN-"經皮下注射后，10min-30min在小鼠血液中達到高峰，隨 后迅速下降，4h在血液中基本被清除；而聚乙二醇化重組人干擾素經皮下注射，45min在家 兔血液中達到高峰后，能持續維持24小時以上，24小時體內仍然具有較高濃度的PEG-rhIFN-w。這說明與IFN-"對照品相比較，聚乙二醇化重組人干擾素經皮下注射途徑給藥，能顯著 的延長在血液中的存留時間，延遲被清除的時間，具有長效的作用。
權利要求
1、一種聚乙二醇化人干擾素ω偶合物，相比于未結合的人干擾素ω，具有更長的生物體內半衰期，保留至少10％的抗病毒生物學活性，其中每個人干擾素ω(hIFN-ω)以共價鍵連接一分子的聚乙二醇，聚乙二醇分子量在5000～40000之間。
2、 根據權利要求1所述的一種聚乙二醇化人干擾素co偶合物，其中人干擾素co是重組的；
3、 根據權利要求1所述的一種聚乙二醇化人干擾素co偶合物，其中人干擾素w是通過 N末端氨基共價鍵與聚乙二醇連接。
4、 根據權利要求1所述的一種聚乙二醇化人干擾素"偶合物，其中人干擾素"是通過 賴氨酸的氨基與聚乙二醇連接。
5、 根據權利要求1所述的一種聚乙二醇化人干擾素o)偶合物，其中人干擾素"是通過 半胱氨酸的巰基與聚乙二醇連接。
6、 根據權利要求l所述的聚乙二醇化人干擾素"偶合物，其特征在于每個聚乙二醇 分子連接一個重組人干擾素^(hlFN-")分子。
7、 根據權利要求l所述的聚乙二醇化人干擾素w偶合物，其中PEG是線形的；
8、 根據權利要求l所述的聚乙二醇化人干擾素"偶合物，其中PEG是分支的；
9、 根據權利要求1所述的聚乙二醇化重組人干擾素"偶合物，其特征在于所述的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇(monomethoxy polyetnylene glycol, mPEG)活化分子，包括單 甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)、單甲氧基聚乙二醇丁醛、Y型聚乙二醇乙醛、單甲氧基 聚乙二醇琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺，其分子量在5000 40 OOO之間；最優 選的是單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)，分子量為20000。
10、 根據權利要求l所述的聚乙二醇化人干擾素w偶合物，其特征在于聚乙二醇與重 組人干擾素"(rhIFN-")發生共價結合反應的比例(摩爾比為0. 25 20，優選比例在2. 5 IO之間。
11、 根據權利要求1所述的聚乙二醇化重組人干擾素"藥物的生產工藝，包括以下過程(1) 提供pH4.0 9.0、 10 100mraol/L的鹽濃度的緩沖體系；(2) 重組人干擾素"與聚乙二醇醛在(1)步驟提供的體系中反應12 72小時，溫度控制在 4 37。C;(3) 經步驟(2)反應得到的產物經過陽離子交換層析分離純化，收集一個聚乙二醇分子連 接一個重組人干擾素w分子的聚乙二醇化重組人干擾素co (PEG-rhIFN-co)，經過過濾除菌，冷凍干燥后即得。
12、根據權利要求6所述的聚乙二醇化重組人干擾素"藥物的生產工藝，其特征在于 聚乙二醇與重組人干擾素"((hIFN-")發生共價結合反應的緩沖體系優選的pH值在4.5 5. 5之間，優選的溫度在2Q 25。C，優選的時間為24 48小時。
全文摘要
本發明公開了聚乙二醇化重組人干擾素ω偶合物及其制備工藝，相比未修飾的人干擾素ω，在人體內具有更長的半衰期，能夠明顯減少用藥次數，降低毒副作用，特別適合于治療對干擾素ω敏感的慢性病毒感染，臨床上具有廣泛的應用前景。
文檔編號C07K1/00GK101591387SQ20081011073
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月28日 優先權日2008年5月28日
發明者玲 付, 軍 任, 侯利華, 張金龍, 徐春娥, 冰 李, 李建民, 薇 陳 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所