專利名稱：一種d-氨基酸氧化酶融合蛋白及其載體和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體地說涉及一種D-氨基酸氧化酶融合蛋白及 其表達載體；以及D-氨基酸氧化酶融合蛋白在制備戊二酰基-7-氨基頭孢垸酸上 的應用。
背景技術：
D-氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase, DAAO， EC1.4.3.3)是一種以黃素腺 嘌呤(FAD)為輔酶的黃素蛋白，它對催化反應底物有高度的立體異構選擇性和 廣譜性，被廣泛用于D-氨基酸定性定量分析、生物傳感器、L-氨基酸和a-酮酸 生產等。它在工業上的重要應用之一即為兩歩酶法生產7-氨基頭孢烷酸 (7-ACA) (Pollegioni L等./^/ /M/cra/n.o/5/otec/mo/, 2008, 78: 1-16) 。 DAAO 廣泛存在于哺乳動物的內臟、藻類、真菌和細菌中C孫兵兵等.化學與生物工 程.2007， 24(2): 8-11)。研究人員對DAAO基因進行了一系列克隆、測序和重 組表達研究，以實現其高效表達和酶的有效生產。其中，紅酵母(i /70^ to^/" gradfo)和三角酵母(7Hgo"opw'5 raW"6ifo)中表達的WgDAAO和7VDAAO在工 業上的應用最為廣泛，其cDNA序列同源性為26% (Pollegioni L等.J所otec/mo/, 1997,58 (2): 115-123)。針對D-氨基酸氧化酶的高表達和分離純化研究主要集中在酶的改造和 載體的構建篩選方面。百瑞全球有限公司的專利《重組D-氨基酸氧化酶》 (專利號ZL200410030842.8)提供了一種突變DAAO及其編碼序列，其 第53位的蘇氨酸突變為其它氨基酸，酶活提高了25%以上。復旦大學的 專利申請《一種制備D-氨基酸氧化酶的方法》(申請號200410016825.9)， 在畢赤酵母表達載體中引入6聚組氨酸標簽(His-tag)，可進行二角酵母 DAAO的高效分離。百瑞全球有限公司的專利申請《一種大腸桿菌表達載 體及其應用》(申請號200510089966.8)提供了一種用于高效表達DAAO 大腸桿菌表達載體pRSET-A。通過基因融合引入一些具有特異功能的蛋白或多肽，有可能改善表達宿主 菌細胞的生長狀況、提高目的蛋白的表達水平、改進目的蛋白的提取純化方法以及從分子水平上提高酶的催化活性和穩定性等。常見的用于構建融合蛋白的 特異性功能蛋白有大腸桿菌麥芽糖結合蛋白、硫氧化還原蛋白、谷胱甘肽轉移酶、熒光蛋白、透明顫菌血紅蛋白(FzYmw"7/aHemoglobin, VHb)和多聚絲氨酸 (Poly-Ser)、多聚組氨酸(Poly-His)等。其中，VHb是透明顫菌在貧氧條件下合成的一種可溶性血紅素蛋白分子， 它的一個重要生理功能是從分子水平上提高細胞對氧氣的利用能力，協助細胞 在貧氧環境中生長(吳奕等.生物工程學報，1996, 12(3), 276-283);它還可以 降低外源蛋白對細胞的毒性(Chien U等.所o&A"o/尸rag， 2004， 20: 1359-1365)、提高重組目標蛋白表達的活性和穩定性(Khang Y等.所o&c力 8/oe"g,2003,82:480~488)以及增加H標產品在重組細胞內的產率(YuHM等. F五MSMfcw6/o〃說，2002， 214: 223-227) 。 VHb的開放閱讀框有441bp (包括終 止密碼子)，編碼146個氨基酸殘基。而多聚氨基酸極性肽段的融合表達可以通 過親和層析方法實現目的蛋白的高效分離純化。頭孢菌素類藥物(Cephalosporins)是一族P-內酰胺類廣譜抗生素，通過干 擾細菌細胞壁的合成并加速細胞壁的破壞而起到殺菌的作用。頭孢菌素的抗菌 部位為其母核7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid， 7-ACA)，由雙氫 噻嗪環和p-內酰胺環融合而成，它是各類半合成頭孢菌素類抗生素藥物的重要 中間體。7-ACA主要由頭孢菌素C (Cephalosporin C，CPC)通過酶法或化學法 裂解脫去7-位的D-a-氨基己二酰側鏈得到。酶法具有工藝簡單、安全、高效、 無污染及產品質量穩定等優點，與傳統的、污染嚴重的化學法相比具有較大的 競爭優勢，因而用酶法裂解CPC生產7-ACA已成為發展趨勢。DAAO可以催 化CPC生成戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸(611^171-7- amidocephalosporanic Acid, GL-7-ACA)中間產物，然后其在GL-7-ACA酰化酶的作用下脫去側鏈，生成 7-ACA。發明內容本發明第一個目的是提供一種催化活性高的的D-氨基酸氧化酶融合蛋白。 本發明第二個目的是提供含有上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的載體和 轉化體。本發明第三個目的是提供上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白在制備7-氨基頭孢 烷酸上的應用。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案本發明一種D-氨基酸氧化酶融合蛋白，由D-氨基酸氧化酶(DAAO)與透 明顫菌血紅蛋白(VHb)融合而成，且具有D-氨基酸氧化酶活性和透明顫菌血 紅蛋白活性。上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其透明顫菌血紅蛋白可以融合在D-氨基酸 氧化酶的N-端或C-端；優選融合在D-氨基酸氧化酶的N-端。上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，由下述(a)或(b)所述的氨基酸序列組成(a) SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列；(b) 由在(a)的氨基酸序列中替換、添加或缺失1個或幾個氨基酸的氨 基酸序列，且該蛋白質具有D-氨基酸氧化酶活性。上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，是由去除了終止密碼子的146個氨基酸殘 基(aa)的透明顫菌血紅蛋白與三角酵母D-氨基酸氧化酶的356個氨基酸殘基 (aa)連接在一起，透明顫菌血紅蛋白連接在三角酵母D-氨基酸氧化酶的N-端，得到全長具有502個氨基酸的融合蛋白(見SEQIDNO: 1)。上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，在其氨基酸序列的N-端或C-端攜帶有長 度為6 12個的多聚氨基酸標簽，優選插入位置為該融合蛋白的C-端，以實現 融合酶的高效分離純化。所述的多聚氨基酸的優選長度為6個多聚氨基酸。所述的多聚氨基酸是指多聚組氨酸、多聚絲氨酸、或由組氨酸、絲氨酸、 精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、tt氨酸、亮氨酸、脯氨酸等組成的混 合多聚氨基酸。和上述多聚氨基酸標簽螯合的金屬離子可以是鎳離子、鈷離子、銅離子、 鉛離子等金屬離子。上述多聚氨基酸優選為多聚組氨酸，多聚組氨酸的優選長度為6個。上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，由SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列組成； 即在SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的C-端插入6個組氨酸的氨基酸序列。編碼上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白的基因，由下述(a)或(b)的DNA 序列組成(a) SEQIDNO: 2所示的DNA序列；(b) 與(a)的DNA序列具有80n/。以上的同源性的DNA序列，且所編碼 的蛋白質具有D-氨基酸氧化酶活性。編碼在上述D-氦基酸氧化酶融合蛋白C-端攜帶有6個組氨酸標簽的基因， 由SEQ ID NO: 4所示的DNA序列組成。含有上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的重組表達載體、宿主菌均屬于本 發明的保護范圍。按照本領域技術人員熟知的方法，可以構建含有上述D-氨基酸氧化酶融合 蛋白基因的重組表達載體和轉化體。含有上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的表達載體，可以是大腸桿菌誘導 型或組成型表達載體，優選是誘導型表達載體。所述的誘導型表達載體，包括pET或其它系列誘導型表達載體。如一種攜 帶上述融合蛋白基因的誘導型表達載體PET-VDAAO (見圖1)。上述含有D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的宿主菌，其所述的宿主菌是指五. co// BL21(DE3) (Promega公司)或JM109(DE3)(鼎國公司)等。上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因轉化體的構建方法，可以采用常規的氯 化鈣法或電穿孔轉化法(SambrookJ等.《分子克隆實驗指南》，1989)。上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白，采用硫酸銨飽和沉淀進行初步純化。上述攜帶多聚組氨酸標簽的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，可通過N產金屬螯 合層析方法進行高效分離純化。上述D-氨基酸氧化酶融合蛋白、攜帶多聚組氨酸標簽的D-氨基酸氧化酶融 合蛋白、攜帶有上述融合蛋白編碼基因的重組表達載體或轉化體在制備戊二酰 基-7-氨基頭孢烷酸(GL-7-ACA)上的應用。本發明所述融合蛋白的粗酶液或純化酶液可以直接用于從CPC制備 GL-7-ACA，也可以進 -步采用樹脂、硅膠或親和層析柱等載體進行固定化后， 再用于從CPC制備GL-7-ACA。本發明具有如下優點(O、本發明D-氨基酸氧化酶融合蛋白的基因表達 活性高，可以在重組大腸桿菌中高活性表達，比初始三角酵母D-氨基酸氧化酶 的活性提高85%以上；(2)、本發明D-氨基酸氧化酶融合蛋白中表達的透明顫 菌血紅蛋白可以促進重組菌的生長；(3)本發明多聚組氨酸標簽的引入可以實 現融合蛋白的快速分離純化。采用本發明提供的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，能 夠高效催化底物CPC生成GL-7-ACA，為7-ACA的兩步酶法工業化生產奠定基 礎。
圖1.攜帶D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的重組質粒pET-VDAAO示意圖 圖2. D-氨基酸氧化酶融合蛋白的酶活性柱形圖1. 原始D-氨基酸氧化酶單表達的酶活；2. N-端插入(His)6標簽的(His)6-7VDAAO融合蛋白的酶活性(HDAAO);3. C-端插入(His)6標簽的7VDAAO-(His)6的D-氨基酸氧化酶的酶活性 (DAAOH);4. D-氨基酸氧化酶融合蛋白的VHb-7VDAAO (VDAAO)酶活；5. C-端插入(His)6標簽的D-氨基酸氧化酶融合蛋白VHb-7VDAAO-(His)6 (VDAAOH)酶活。圖3.采用多聚組氨酸(His)6標簽和NP+金屬螯合層析分離純化DAAO與 VHb融合蛋白的SDS-PAGE蛋白質電泳圖譜 1分離純化前的融合蛋白酶粗酶液； 2蛋白質分子量標準； 3分離純化后的雜酶液；4分離純化后C-端攜帶組氨酸標簽的融合蛋白VDAAOH，分子量為 55kD。
具體實施方式
實施例1N-端融合型D-氨基酸氧化酶(VHb-7VDAAO)融合蛋白基因的構建 VHb-7VDAAO融合蛋白基因的構建采用overlap-PCR方法，分別使用三對引物Pv.,/Pv.2、 PrM/PD.2和PvVPD.2進行三步擴增。引物由北京賽百盛生物工程公司合成，所用聚合酶及相應擴增緩沖液、四種脫氧核苷酸溶液均由寶生物工 程(大連)有限公司購得。基因測序由寶生物工程(大連)有限公司完成。(1) VHb-7VDAAO融合蛋白的VHb基因搭接片段的擴增首先，以質粒 pBR322-v^(于慧敏等.清華大學學報，2000， 40(2)， 32-35)為模板，擴增N-端 攜帶酶切位點，C-端攜帶7VDAAO部分序列的透明顫菌血紅蛋白基因搭 接片段SEQIDNO:5。其中，引物Pv-!序列為CATGCCATGGGCATGTTAGACCAGCAAACC (下劃線為iVcol酶切位點)(SEQ ID NO: 7 ); PV-2為AACGATTTTAGCCATTTCAACCGCTTGAGC(SEQ ID NO: 8);擴增反應體積為20pl。在一已滅菌的0.2ml PCR薄壁管中，依次加入14.1)^1 無菌水、的擴增緩沖液、1.6^1的四種脫氧核苷酸混合液(每種dNTP濃度2.5mM)、 lpl的引物Pv.i (10 |nmol/L)、 1)al的引物Pv-2 (10|imol/L)、 0,2(il的 pBR322-vgZ)質粒模板、0.12^1的EX TaqDNA聚合酶。將PCR管置于PCR儀 中，首先在94。C、 5min，接著按94°C、 30s, 52°C、 30s、 72°C、 30s反應條 件循環30次，最后于72X:、 10min，結束擴增反應，獲得用于融合蛋白基因搭 接的VHb基因延伸片段(SEQIDNO:5)。(2) VHb-7VDAAO融合蛋白的7VDAAO基因搭接片段的擴增采用同(l) 所述的PCR反應條件和類似的反應體系，只是將質粒模板替換為pET-DAAO (羅 暉等.三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大腸桿菌中的克隆和表達.微生物學報， 2004, 44(3): 336-339)，所用引物為Ptm和PD—2，其中，Pd-i為GCTCAAGCGGTTGAAATGGCTAAAATCGTT ( SEQ ID NO: 9); Po陽2序列為CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAGTAAG (SEQIDNO:10)(下劃線為/f/"^nn酶切位點)；5 2"c退火時間延長為i分鐘，擴增獲得n-端攜帶VHb部分序列、C-端攜帶酶切位點的7VDAAO基因片段(SEQ ID NO: 6)，用于融合蛋白的構建。(3) VHb和7VDAAO基因的搭接采用同(1)所述的PCR反應條件和 類似的反應體系，只是將基因模板替換為第(1)步擴增獲得的SEQ ID NO: 5 片段和第(2)步擴增獲得的SEQIDNO:6片段各0.1(11。使用的引物為第(1) 步中的Pv—i和第(2)歩中的Pd.2。 52"退火時間延長為1.5分鐘，擴增獲得N-端攜帶Wcol酶切位點、C-端攜帶酶切位點的VHb-7VDAAO融合蛋白基 因，DNA測序結果證實其基因序列是SEQIDNO:2。 實施例2在N-端插入(His)6-tag的7VDAAO基因的構建在7VDAAO基因的N-端插入(His)6-tag采用PCR方法。PCR反應條件同實施例l (2)，所用引物為PHW和PHD-2，其中，Phd.,為CATGCCATGGCTCACCACCACCACCACCACAAAATCGTTGTTATTGGTGCCG ( SEQ ID NO: 11)(下劃線為酶切位點)，Phd-2為CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAG T (SEQ ID NO: 12 )(下劃線為///mnn酶切位點)。引物由北京賽百盛生物工程公司合成。擴增后得到N-端攜帶6個組氨酸標簽(CACCACCACCACCACCAC)和 Wcol酶切位點的的7VDAAO基因(HDAAO)。 實施例3在C-端插入(His)6-tag的7VDAAO基因的構建在7VDAAO基因C-端的插入(His)6-tag采用PCR擴增方法。PCR反應條件同實施例l (2)，只是擴增引物替換為PD!M/PDH-2，其中，P。pm為CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTG (SEQIDNO:13)(下 劃線為iVcoI酶切位點)，PDH-2為CCCAAGCTTCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGGTTTGGACGAGT (SEQ ID NO:14)(下劃線為///"dill酶切位點)。引物由北京 賽百盛生物工程公司合成。擴增后得C-端攜帶6個組氨酸標簽(CACCACCACCACCACCAC)和 歷"dII酶切位點的TvDAAO基因(DAAOH)。實施例4VHb-7VDAAO- (His)6融合蛋白(VDAAOH)基因的構建融合蛋白VHb-7VDAAO-(His)6的基因構建采用PCR方法。PCR反應條件 同實施例l (3)，只是反應體系中PCR擴增模板替換為實施例1 (3)中擴增獲 得的VHb-7VDAAO融合基因，所用引物為PvMM和PDH.2，其中，Pvdh-i的序列為CATGCCATGGGCATGTTAGACCAGCAAACC ( SEQ ID NO:15)(下劃線為AA I酶切位點)，PoH-2同實施例3 (SEQ ID NO:14)。引物 由北京賽百盛生物工程公司合成。擴增獲得融合酶VHb-7VDAAO-(HiS)6 (VDAAOH)基因，其基因序列見SEQ ID NO: 4 。實施例5攜帶融合蛋白基因的質粒載體的構建對實施例1 4中獲得的融合蛋白基因VHb-7VDAAO (VDAAO)、 (His)6-DAAO (HDAAO) 、 DAAO-(His)6 (DAAOH) 、 VHb-7VDAAO-(His)6 (VDAAOH)與質粒載體pET-28a (Novagen公司)分別采用AAcoI////w/in進行雙酶切，酶切反應體系的組成為PCR產物 lO(il 質粒pET-28aDNA 4(_tl(10U/|al) iVc ol (10U/fil) l^il飾疆(10U/|Lll) 1 |Lll 歷"郝(10U/|Lll) l|Lll緩沖液(10xBuffer)2 pi 緩沖液(10xBuffer) 2^1無菌水 6|til 無菌水 12(^1總體積20fil 總體積 20(^1在37。C下反應4小時，分別獲得VDAAO、 HDAAO、 DAAOH和VDAAOH
各融合蛋白的基因片段和質粒pET-28a的線性質粒骨架片段。采用常規0.7X瓊脂 糖凝膠電泳，分別回收得到各融合蛋白的基因片段和質粒骨架。采用T4DNA連 接酶(Promega公司)進行連接，連接樣品組成為
各融合蛋白基因酶切片段 6(^1
pET-28a酶切片段(50ng/|iil) 2.5|iil
連接緩沖液 1^1
T4 DNA連接酶(3U/iul) 0.5pl
總體積 10|Lil
連接反應在4'C進行16小時，得連接反應物。
將連接反應物轉化宿主菌五.TOP-10F'的感受態細胞(天根生化科技(北 京)有限公司)，步驟如下取200^il感受態大腸桿菌TOP-10F，細胞，置于無菌 的1.5mL離心管中。分別加入5^U連接反應物，在冰上放置30分鐘，立即將管轉 移至42t:的循環水浴中，放置90秒，立即將管轉移至冰浴中，放置2分鐘，每管 加入0.8mL的LB液體培養基(酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉10g/L， pH7.0)， 在37。C下放置45分鐘，取50idl涂布在含50)iig/ml卡那霉素和20g/L瓊脂粉的LB固 體培養基上，37。C溫育20小時，出現單菌落。挑取菌落接入LB培養基，培養12 小時，分別收獲細胞，采用常規質粒提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限 公司)提取質粒，分別獲得重組質粒pET-VDAAO, pET-HDAAO， pET-DAAOH 和pET-VDAAOH。其中，重組質粒pET-VDAAO的結構見圖l所示。
實施例6
含有融合蛋白基因的轉化體的構建與搖瓶培養
將實施例5中構建的重組質粒pET-VDAAO， pET-HDAAO, pET-DAAOH和 pET-VDAAOH，按照實施例5所述的質粒轉化方法，分別轉入大腸桿菌￡. co// BL21(DE3)的感受態細胞(天根生化科技(北京)有限公司)，獲得表達融合蛋 白的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-VDAAO， BL21(DE3)/pET-HDAAO， BL21(DE3)/pET-DAAOH以及BL21(DE3)/pET-VDAAOH。
平行培養各融合蛋白表達菌株，同時以單獨表達7VDAAO基因的重組菌 BL21(DE3)/pET-DAAO為對照。首先在含50 mg/L卡那霉素的LB培養基中 (50ml/300ml搖瓶)分別接種單菌落，37°C、 200rpm培養12h，制作種瓶。
從種瓶中按照1%接種量轉接到含50mg/L卡那霉素的新鮮LB培養基中，37°C， 200 rpm搖床培養2h，至OD6。o為0.7。加入1 mM誘導劑異丙基-13-D硫 代半乳糖苷(IPTG)， 28。C繼續培養20 h。取5 ml菌液，8000 rpm離心2 min， 以5 ml 0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH8.0)重懸沉淀；在功率為200 W、占空比3/3 的條件下超聲破碎90個循環；13000 rpm離心2 min，分別取上清液和沉淀，4°C 保存用于比色法測定酶活(羅暉等.三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大腸桿菌 中的克隆和表達.微生物學報，2004， 44(3): 336-339)。每分鐘生成1微摩爾丙酮 酸所需的酶量定義為1個酶活單位，用U表示。各重組菌株表達的7VDAAO融 合蛋白與DAAO單酶的酶活對照結果如圖2所示。
由圖2可見，(His)6標簽插入rvDAAO的N-端降低了DAAO的活性，而 C-端插入則沒有影響。VHb與7VDAAO的融合表達使得搖瓶培養中DAAO的 酶活提高了 85^。(His)6標簽在VHb-7VDAAO融合酶C-端的插入使得融合蛋白 的酶活略有降低，但仍然比原始7VDAAO酶活提高62% 。
實施例7
D-氨基酸氧化酶融合蛋白的發酵罐放大培養
在5L發酵罐中放大培養BL21(DE3)/pET-VDAAOH，初始裝液量2.5L,發 酵培養基玉米漿3%，酵母膏1%，乳糖0.3%， NH4C10.25%，甘油0.3%; KH2PO40.23%， K2HP04 1.64%， pH7.2。種瓶培養同實施例6，接種量為5%， 通氣量為1VVM。每隔3小時檢測酶活。培養9h時，融合蛋白VDAAOH的酶 活就高達28.5U/ml，比相同條件下培養的對照菌株BL21(DE3)/pET-DAAOH提 高123%，同時，表達融合蛋白VDAAOH的發酵液的OD柳達到43.0，比對照 菌株提高了40%。
實施例8
采用(His)6標簽和Ni^金屬螯合層析分離純化融合蛋白VDAAOH 收獲實施例7中的BL21(DE3)/pET-VDAAOH細胞，按照實施例6所述的 方法進行超聲破碎。采用0.25um的濾膜過濾(天根生化科技(北京)有限公司)， 然后采用N^+金屬螯合層析柱HiTrap Chelating HP (5 ml， GE Healthcare Life Science公司)進行上柱純化。純化設備采用AKTA explorer (Amersham pharmacia biotech公司)。純化過程中流動相流速為4ml/min，進樣量為120ml。其中，蛋 白樣品與結合緩沖液(0.02MNa3PO4， 0.5MNaCl， 0.01M咪唑，調節pH至7.4) 按1: 1的比例進樣。使用洗脫緩沖液(0.02MNa3PO4， 0.5MNaCl， 0.5M咪唑， 調節pH至7.4)進行梯度洗脫。檢測流出液在280rnn的吸光度并收集流出樣品，結果表明，在30%梯度可以洗脫雜蛋白，在50%梯度洗脫得到目的蛋白
VDAAOH。
取2ul純化后的目的蛋白VDAAOH，稀釋10倍進行十二烷基璜酸鈉-聚丙 烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，結果(見圖3)攜帶(His)6標簽的融合蛋白 VDAAOH與雜酶液實現了有效分離。VDAAOH的比酶活從純化前的3.5 U/mg 蛋白，提高到了 264.9 U/mg， VDAAOH的純度達到92%。
實施例9
VHb與7VDAAO的融合蛋白催化CPC生成GL-7-ACA試驗 按照實施例6的方法，對轉化體BL21(DE3)/pET-VDAAO進行搖瓶培養。 收集50ml菌液，用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌后，按照實施例6的方法 低溫超聲破碎，細胞破碎后的粗酶液直接用于3%CPC鈉鹽(溶于0.1MTris-HCl 緩沖液，pH8.0)的催化轉化。將2ml粗酶液加入L5ml3^CPC鈉鹽，37 。C水 浴搖床反應30min，每隔10min加入5(il的H202;。取樣500^1， 8000rpm離心 3min，取100ul上清液與1.9ml的磷酸鹽緩沖液(0.1M， pH=8.0)混合均勻； 采用Shimadzu C18柱，在流動相為7.5%乙腈一15%甲醇一1%乙酸、流速1 mL/min、檢測波長為260nm的條件下，進行高壓液相色譜(HPLC)分析。結 果表明，底物CPC成功地轉化生成了 GL-7-ACA，轉化率為75%。對照7VDAAO 粗酶液的轉化率是70%。 實施例10
插入(His)6標簽的融合蛋白VDAAOH催化CPC生成GL-7-ACA試驗 按照實施例8所述的方法，采用Nih金屬螯合層析柱制備融合蛋白 VDAAOH的純化酶液。按照實施例9所述的方法，進行CPC催化轉化。結果 表明，融合蛋白VDAAOH成功地將底物CPC轉化生成了 GL-7-ACA，底物轉 化率為95%。<formula>formula see original document page 14</formula>SI
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權利要求
1. 一種D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于由D-氨基酸氧化酶與透明顫菌血紅蛋白融合而成，且具有D-氨基酸氧化酶活性和透明顫菌血紅蛋白活性。
2、 按照權利要求1所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于其透明 顫菌血紅蛋白可以融合在D-氨基酸氧化酶的N-端或C端。
3、 按照權利要求1或2所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于由 下述(a)或(b)所述的氨基酸序列組成(a) SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列；(b) 在(a)的氨基酸序列中替換、添加或缺失1個或幾個氨基酸的氨基 酸序列，且該蛋白質具有D-氨基酸氧化酶活性。
4、 按照權利要求3所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于所述的 D-氨基酸氧化酶融合蛋白的氨基酸序列的N-端或C-端攜帶有長度為6 12個的多聚氨基酸標簽
5、 按照權利要求4所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于所述的 多聚氨基酸標簽在該融合蛋白的C-端。
6、 按照權利要求4所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于所述的 多聚氨基酸是多聚組氨酸、多聚絲氨酸、或由組氨酸、絲氨酸、精氨酸、谷氨 酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸等組成的混合多聚氨基酸。
7、 按照權利要求6所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于和所述 的多聚氨基酸標簽螯合的金屬離子是鎳離子、鈷離子、銅離子、鉛離子等。
8、 按照權利要求7所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于所述的 多聚氨基酸標簽是多聚組氨酸。
9、 按照權利要求8所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于該融合 蛋白由SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列組成。
10、 編碼權利要求3所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白的基因，其特征在于 由下述(a)或(b)的DNA序列組成(a) SEQIDNO: 2所示的DNA序列；(b) 與(a)的DNA序列具有80Q/。以上的同源性的DNA序列，且所編碼 的蛋白質具有D-氨基酸氧化酶活性。
11、 編碼權利要求9所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白的基因，其特征在于由SEQ ID NO: 4所示的DNA序列組成。
12、 含有權利要求10或11所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的重組表 達載體。
13、 含有權利要求10或11所述的D-氨基酸氧化酶融合蛋白基因的宿主菌。
14、 按照權利要求12所述的重組表達載體，其特征在于所述的表達載體是 大腸桿菌誘導型或組成型表達載體。
15、 按照權利要求14所述的重組表達載體，其特征在于所述的表達載體是 誘導型表達載體PET-VDAAO 。
16、 按照權利要求13所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌是五co// BL21(DE3)或JM109等。
17、 權利要求3或4所述的0-氨基酸氧化酶融合蛋白在制備戊二酰基-7-氨基頭孢垸酸上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種D-氨基酸氧化酶融合蛋白及其載體和應用，本發明主要是將D-氨基酸氧化酶與透明顫菌血紅蛋白融合在一起形成同時具有兩種蛋白活性的D-氨基酸氧化酶融合蛋白，該融合蛋白的催化活性比其初始蛋白提高85％以上，其具有的透明顫菌血紅蛋白活性促進了重組細菌的生長；本發明還通過多聚氨基酸標簽進行親和層析實現高效的分離純化；本發明D-氨基酸氧化酶融合蛋白可應用于催化底物頭孢菌素C生成戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸。
文檔編號C07K19/00GK101280022SQ200810104198
公開日2008年10月8日 申請日期2008年4月16日 優先權日2008年4月16日
發明者于慧敏, 程 文, 沈忠耀, 暉 羅, 馬現峰 申請人:清華大學