專(zhuān)利名稱(chēng)：：減毒的人-牛嵌合副流感病毒(piv)疫苗的制作方法減毒的人-牛嵌合副流感病毒(PIV)疫苗本申請(qǐng)為國(guó)際申請(qǐng)日2000年6月15日、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US00/17066于2002年1月9日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段、申請(qǐng)?zhí)?0810120.5、發(fā)明名稱(chēng)"減毒的人-牛嵌合副流感病毒(PIV)疫苗"的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的相互參考本發(fā)明要求由Bailly等于1999年7月9日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/143,134的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
：人副流感病毒類(lèi)型3(HPIV3)是幼兒和1歲以下兒童嚴(yán)重下呼吸道感染的一般誘因。它是僅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的、導(dǎo)致該年齡段兒童因病毒性下呼吸道疾病入院的誘因(Collins等，B.N.FieldsVirology,pl205-1243，3rded.，vol.1.,Knipe等編輯，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia,1996;Crowe等，Vaccine13:415-421.1995:Marx等,J.Infect.Dis.176:1423-1427,1997,在此引用作為參考)。該病毒的感染使3歲以下兒童發(fā)生顯著病癥。HPIV1和HPIV2喉氣管支氣管炎(哮吼)的主要病因，也能引起嚴(yán)重肺炎和細(xì)支氣管炎(Comns等，1996,同上)。在為期20年的長(zhǎng)期性研究中，發(fā)現(xiàn)HPIV1、HPIV2禾BHPIV3分別占因呼吸道疾病入院總數(shù)的6.0、3.2禾n11.5%,三者的總和占入院總數(shù)的18%，因此，需要有效的疫苗。(Murphy等，VimsRes.11:1-15，1988)。也發(fā)現(xiàn)副流感病毒占兒童中耳炎患者中病毒誘發(fā)的中耳積液的誘因的很大比例(Heikkinen等，N.Engl.J.Med.340:260-264,1999,在此引入作為參考)。因此，需要發(fā)展一種抗這些病毒的疫苗，以預(yù)防嚴(yán)重的下呼吸道疾病和伴隨HPIV感染的中耳炎。HPIV1、HPIV2和HPIV3是不同的血清型，不誘導(dǎo)顯著的交叉保護(hù)性免疫。PIV的主要保護(hù)性抗原是介導(dǎo)病毒附著、穿透和釋放的血凝素(HN)和融合(F)糖蛋白。抗再次感染的保護(hù)主要由病毒中和抗體介導(dǎo)。盡管對(duì)發(fā)展抗HPIV的有效疫苗療法進(jìn)行了大量的努力，仍然沒(méi)有獲得預(yù)防HPIV相關(guān)疾病的被認(rèn)可的疫苗制劑。目前最有前景的是活的減毒疫苗病毒，因其用于非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中時(shí)，即使在被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗體存在時(shí)(一種實(shí)驗(yàn)，模擬具有由母體獲得的抗體的幼兒的狀況)也有效(Crowe等，1995，同上；Durbin等，J.Infect.Dis.179:1345-1351,1999a:分別在此引入作為參考)。兩個(gè)活的減毒PIV3候選疫苗，野生型PIV3JS株的溫度敏感性(ts)衍生物(命名為PIV3cp45)和一個(gè)牛PIV3(BPIV3)株，正在進(jìn)行臨床檢測(cè)(Karron等，Pediatr.Infect.Dis.J.15:650-654.1996;Karron等，1995a，同上；Karron等，1995b，同上；分別在此引入作為參考)。BPIV3候選疫苗是在幼兒和兒童中減毒的、遺傳上穩(wěn)定，并具有免疫原性的。第二個(gè)PIV3候選疫苗(JScp45)是HPIV3JS野生型(wt)株的冷適應(yīng)突變體(Karron等，1995b，同上；和Belshe等，J.Med.Virol.10:235-242,1982a;分別在此引入作為參考)。這種活的、冷傳代(cp)的PIV3候選疫苗具有溫度敏感(ts)、冷適應(yīng)(ca)、和減毒(att)的表型，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)病毒復(fù)制后是穩(wěn)定的。cp45病毒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中可保護(hù)個(gè)體免受人PIV3的攻擊，并且在血清反應(yīng)陰性的幼兒和兒童中是減毒、遺傳上穩(wěn)定，并具有免疫原性的(Belshe等，1982a，同上；Belshe等，Infect.Immun.37:160-165,1982b;Clements等，J.Clin.Micrbiol.2^:1175-1182,1991;Crookshanks等，J.Med.Virol.13:242-249,1984:Hall等，VirusRes.22:175-184,1992;Karron等，1995b，同上；分別在此引入作為參考)。由于這些PIV3候選疫苗是生物學(xué)來(lái)源的，沒(méi)有可靠的方法調(diào)節(jié)其減毒水平，而這正是廣泛臨床應(yīng)用所需的。近來(lái)，重組DNA技術(shù)促進(jìn)PIV3候選疫苗的發(fā)展，使從cDNA得到感染性負(fù)鏈RNA病毒成為可能(綜述參見(jiàn)Conzelmann,J.Gen.Virol.22:381-389，1996;Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.21:11354-11358,1996;分別在此引入作為參考)。文中報(bào)道了在必需病毒蛋白存在時(shí)，從cDNA編碼的反基因組RNA中拯救的一些重組病毒，這些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒(RaV)、猿猴病毒5(SV5)、牛瘟病毒、新城疫病毒(NDV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、腮腺炎病毒(MuV)、和仙臺(tái)病毒(SeV)(參見(jiàn)，如，Garcin等，EMBOJ.li:6087-6094,1995;Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:4477-4481,1995;Radecke等EMBOJ.14:5773-5784,1995;Schnell等，EMBOJ.U:4195-4203，1994;Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.22:8388-8392，1995;Hoffman等J.Virol.21:4272-4277,1997;Kato等GenestoCells1:569-579,1996;Roberts等，Virology247:1-6,1998;Ba觀等，J.Virol.71:1265-1271,1997;國(guó)際公開(kāi)WO97/06270;Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:11563-11567,1995;1997年7月15日的US專(zhuān)利申請(qǐng)08/892，403(相應(yīng)于公布的國(guó)際申請(qǐng)WO98/02530和優(yōu)先權(quán)US臨時(shí)申請(qǐng)1997年5月23日的60/047,634，1997年5月9日的60/046,141，1996年7月15日的60/021,773);1999年4月13日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/291,894;1999年4月13日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/129,006;1999年7月9日Bucholz等的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/143,097;Juhasz等，J.Virol.21:5814-5819,1997;He等，Virology237:249-260,1997;Peters等，J.Virol.21:5001-5009，1999;Whitehead等，Virology247:232-239,1998a;Whitehead等，J.Virol.22:4467-4471，1998b;Jin等，Virology2il:206-214,1998;Bucholz等，J.Virol.21:251-259，1999:Whitehead等，J.Virol.73:3438-3442,1999;Clarke等，J.Virol.M:4831-4838,2000;為各種目的在此分別全文引用作為參考)。在特別與本發(fā)明有關(guān)的方面，近來(lái)發(fā)展了一種獲得具有來(lái)自cDNA的wt表型的HPIV的方法，用于回收感染性的重組HPIV3JS株(參見(jiàn)，如，Durbin等，Virology235:323-332,1997a;1998年5月22日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/083,793;1997年5月23日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/047，575(相應(yīng)于國(guó)際申請(qǐng)WO98/53078)和1997年9月19日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/059,385;在此分別引用作為參考)。此外，這些發(fā)現(xiàn)使可以進(jìn)行病毒cDNA克隆的遺傳操作，以確定生物學(xué)突變體表型變化的遺傳基礎(chǔ)，如，在HPIV3cp45中那些特異于ts、ca和att表型的突變，以及那些特異于其減毒表型的BPIV3的基因或基因組區(qū)段。此外，這些和一些相關(guān)的發(fā)現(xiàn)使可以構(gòu)建具有大量不同突變的新PIV候選疫苗，并估計(jì)其減毒、免疫原性和表型穩(wěn)定性水平(參見(jiàn)1999年7月9日Bailly等的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/143,134;和1999年7月9日Durbin等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/350,821，在此分別引用作為參考)。因此，現(xiàn)在可從cDNA中獲得感染性野生型重組PIV3(r)PIV3，以及其多種ts衍生物，并使用反向遺傳系統(tǒng)產(chǎn)生具有確定的減毒突變的感染性病毒，以及研究現(xiàn)存疫苗病毒減毒的遺傳基礎(chǔ)。例如，發(fā)現(xiàn)在cp45L基因中的三個(gè)氨基酸替代，單獨(dú)或組合，決定ts和減毒的表型。其它ts和減毒突變存在于PIV3cp45的其它區(qū)域。此外，利用cDNA拯救系統(tǒng)，通過(guò)在L中帶有這三個(gè)減毒突變的全長(zhǎng)cDNA中，將PIV3HN和F讀碼框(ORF)替換為PIV1的，制備嵌合PIV1候選疫苗。衍生自該cDNA的重組嵌合病毒定名為rPIV3-l.cp45L(Skiadopoulos等，^Virol.22:1762-1768,1998,Tao等，J.Virol.22:2955-2961，1998;Tao等,Vaccine17:1101-1108,1998，在此引用作為參考)。rPIV3-l.cp45L在倉(cāng)鼠中是減毒的，并能對(duì)PIV1的攻擊誘導(dǎo)高水平抗性。獲得了一個(gè)定名為rPIV3-l.cp45的重組嵌合病毒，其具有cp45中15個(gè)突變的12個(gè)，即，不包括發(fā)生于HN和F的突變，并且在倉(cāng)鼠上下呼吸道中是高度減毒的(Skiadopoulos等，Vaccine18:503-510,1999a)。與HPIV3抗原性相關(guān)的BPIV3提供了一種開(kāi)發(fā)活的HPIV1、HPIV2、HPIV3減毒疫苗的其它方法。第一種用于人的疫苗(被認(rèn)為是來(lái)自牛的活的減毒疫苗)由Jenner在200年前為控制天花而發(fā)明。在接下來(lái)的兩個(gè)世紀(jì)中，痘苗病毒成功地控制了這種疾病，并且對(duì)天花的最終消滅起了重要作用。在疫苗發(fā)展的"Jetmer氏"方法中，使用抗原性相關(guān)的動(dòng)物病毒作為人疫苗?？梢院芎玫剡m應(yīng)其天然宿主的動(dòng)物病毒經(jīng)常在人中不能有效復(fù)制，因此使之減毒。目前，對(duì)于這種宿主范圍限制的遺傳基礎(chǔ)還無(wú)清楚的理解。哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)病毒的演化導(dǎo)致其核苷酸和氨基酸序列與相關(guān)人類(lèi)病毒相應(yīng)序列有顯著的分歧。這些包含許多序列差異的分歧序列決定了宿主范圍減毒表型。具有基于大量序列差異的減毒表型是所希望的疫苗病毒性狀，因其有助于動(dòng)物病毒在人體復(fù)制后減毒表型的穩(wěn)定。目前許可的四價(jià)輪狀病毒是Jenner氏方法發(fā)展疫苗的一個(gè)范例，發(fā)現(xiàn)一種非人的輪狀病毒株(獼猴輪狀病毒，RRV)在人體內(nèi)減毒，并且產(chǎn)生對(duì)抗與其抗原性高度相關(guān)的人血清型3的保護(hù)(Kapikian等，Adv.Exp.Med.Biol.327:59-69,1992)。由于需要對(duì)四種主要人輪狀病毒血清型中任何一種都能誘導(dǎo)抗性的多價(jià)疫苗，對(duì)Jenner氏方法進(jìn)行了修改，即，利用傳統(tǒng)的基因重排遺傳技術(shù)在組織培養(yǎng)過(guò)程中構(gòu)建三種重排列病毒。每一個(gè)單基因重排列的病毒含有10個(gè)RRV基因和一個(gè)單個(gè)的人輪狀病毒基因(編碼血清型1、2或4的主要中和抗原(VP7))。目的是制備具有猿猴病毒減毒特點(diǎn)，以及人輪狀病毒血清型l、2或4的中和特異性的單基因替代物RRV重排列體。基于猿猴RRV在人體內(nèi)宿主范圍限制的四價(jià)疫苗在幼兒和兒童中高效性地抗人輪狀病毒感染(Perez-Schael等，N.Engl.J.Med.337:1181-1187,1997)。不過(guò)，該疫苗病毒在較大的、缺乏母體抗體的血清反應(yīng)陰性幼兒中具有輕微的反應(yīng)原性，因此發(fā)展了一種基于牛輪狀病毒UK株的二代Jenner氏疫苗，以替代RRV疫苗(Clements-Mann等，Vaccine17:2715-2725,1999)。Jenner氏方法也被研究用來(lái)發(fā)明1型副流感病毒和甲肝病毒的疫苗(其在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中為減毒且具免疫原性的)(Emerson等，^Infect.Dis.173:592-597,1996;Hurwitz等,Vaccine15:533-540，1997)。Jenner氏方法曾被用于發(fā)明A型流感病毒的活的減毒疫苗，但沒(méi)有獲得用于人體的持續(xù)減毒的疫苗(Steinhoff等，J.Infect.Dis.1^:1023-1028，1991)。另一個(gè)例子，具有來(lái)自人A型流感病毒的編碼血凝素和神經(jīng)氨酸酶表面糖蛋白的兩個(gè)基因區(qū)段，和來(lái)自鳥(niǎo)A型流感病毒的6個(gè)剩余基因區(qū)段的重排列病毒，在人中是減毒的(Clements等，J.Clin.Microbil.22:219-222,1989;Murphy等，J.Infect.Dis.111:225-229,1985;禾。Snyder等，J.Clin.Microbiol.23:852-857,1986)。這表明鳥(niǎo)病毒的6個(gè)基因區(qū)段中的一個(gè)或多個(gè)使鳥(niǎo)-人A型流感病毒在人體中減毒。利用具有減毒鳥(niǎo)A型流感病毒的單個(gè)基因區(qū)段和剩余來(lái)自人病毒株的基因的重排列病毒確定定位減毒的遺傳決定簇。發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)(NS)、聚合酶(PB1，PB2)和M基因參與鳥(niǎo)A型流感病毒在人體中的減毒表型(Clements等，J.Clin.Microbiol.1^:655-662,1992)。另一項(xiàng)研究中，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)在猩猩中復(fù)制的嚴(yán)格宿主范圍限制，在將BRSV的F和G糖蛋白替代為其HRSV對(duì)應(yīng)物時(shí)只有小部分的改變。這表明F和G參與宿主范圍限制，但還有一個(gè)或多個(gè)另外的牛RSV基因參與(Buchholz等，丄Virol.74:1187-1199,2000)。結(jié)果說(shuō)明多于一個(gè)基因可能以一種不可預(yù)知的方式，參與哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)病毒在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的宿主范圍限制表型。本發(fā)明提供了使用作抗HPIV疫苗的野生型或突變的親代病毒減毒的基礎(chǔ)，其中減毒完全或部分的基于宿主范圍效應(yīng)，該嵌合病毒的至少一個(gè)或多個(gè)主要中和和保護(hù)性抗原決定簇與該疫苗針對(duì)的病毒是同源的。BPIV3的HN和F蛋白與其相應(yīng)的HPIV3蛋白在氨基酸序列上有80。/。的相關(guān)性(Suzu等，NucleicAcidsRes.15:2945-2958,1987，在此引用作為參考)，抗原分析有25%相關(guān)性(Coelingh等，J.Virol.姓3833-3843，1990;Coelingh等，J.Virol.祉90-96，1986;vanWykeCoelingh等.J.Infect.Dis.157:655-662,1988，分別在此引用作為參考)。之前的研究表明BPIV3的兩個(gè)毒株，堪薩斯(Ka)和運(yùn)輸熱(SF)原型在獼猴的上下呼吸道中是減毒的，其中之一，Ka，在猩猩中是減毒的(vanWykeCoelingh等，1988，同上，在此引用作為參考)。Ka病毒免疫非人靈長(zhǎng)類(lèi)誘導(dǎo)對(duì)HPIV3反應(yīng)的抗體，誘導(dǎo)對(duì)猴上下呼吸道中人病毒復(fù)制的抑制(同上)。Ka毒株在人體的后續(xù)評(píng)估表明該病毒在血清反應(yīng)陰性型幼兒中有滿(mǎn)意的減毒效果，并且在完全敏感的幼兒和兒童中，其在復(fù)制后仍保持減毒的表型(Karron等，1996，同上；Karron等，1995a，同上；分別在此引用作為參考)。因此，其主要優(yōu)勢(shì)在于其對(duì)于完全敏感的血清反應(yīng)陰性幼兒和兒童有滿(mǎn)意的減毒效果，并且在人體復(fù)制后仍保持減毒的表型。不過(guò)，在血清反應(yīng)陰性接種者(接種了BPIV3Ka毒株105()組織培養(yǎng)感染劑量so(TCID)50)血清中誘導(dǎo)產(chǎn)生的、HPIV3反應(yīng)性、抑制血凝作用的抗體水平為l:105，比接種活減毒HPIV3疫苗的相同接種者低3倍(Karron等，1995a，同上；Karron等，1995b，同上；分別在此引用作為參考)。BPIV3誘導(dǎo)的人病毒抗體的低水平主要反映了HPIV3和BPIV3之間抗原性差異(Karron等，1996，同上；Karron等，1995a，同上；分別在此引用作為參考)。仍然沒(méi)有對(duì)在人體中抗HPIV3的Ka候選疫苗的效力進(jìn)行確定，但可能這種HPIV3反應(yīng)性抗體的低水平會(huì)表現(xiàn)為保護(hù)性效率的降低。盡管己知BPIV3有在獼猴、猩猩和人呼吸道中限制復(fù)制的宿主范圍基因，但仍然不知道哪個(gè)牛蛋白或非編碼序列決定這種復(fù)制的宿主范圍限制。或許任一BPIV3的蛋白或非編碼序列都可能賦予一種宿主范圍表型。不可能預(yù)先確定哪個(gè)基因或基因組區(qū)段會(huì)賦予減毒表型。這只能通過(guò)將BPIV3的編碼或非編碼序列用HPIV3的對(duì)應(yīng)部分系統(tǒng)替代，并在血清反應(yīng)陰性的獼猴或人中評(píng)估獲得的HPIV3/BPIV3嵌合病毒來(lái)完成。盡管在發(fā)展抗PIV血清型1、2和3的有效疫苗中有許多進(jìn)展，本領(lǐng)域仍然需要另外的工具和方法，工程化安全和有效疫苗以減輕PIV導(dǎo)致的嚴(yán)重的健康問(wèn)題，特別是HPIV感染導(dǎo)致幼兒和兒童的疾病。目前遺留的問(wèn)題包括需要其它工具以產(chǎn)生用于不同臨床背景的、適當(dāng)減毒的、具免疫原性和遺傳穩(wěn)定性的候選疫苗。為達(dá)到這一目標(biāo)，現(xiàn)存的檢測(cè)并在重組疫苗毒株中包含減毒突變的方法需要擴(kuò)展。此外，設(shè)計(jì)抗人PIV疫苗的方法和組合物，也可以用于發(fā)展新的獸用候選疫苗。本發(fā)明令人驚訝地滿(mǎn)足這些需要，并提供了以下所述的其它優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了在人體和其它哺乳動(dòng)物中感染性且減毒的人-牛嵌合副流感病毒(PIV)。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)和生產(chǎn)減毒、人-牛嵌合PIV的新方法，所述PIV可以各種組合物形式在對(duì)PIV感染敏感的宿主中產(chǎn)生期望的、抗PIV的免疫應(yīng)答。本發(fā)明這些方面中包括新的經(jīng)分離的多核苷酸分子和包含該分子的載體，所述多核苷酸分子包含一個(gè)嵌合PIV基因組或反基因組，其包括組合或整合了另一種PIV的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段的部分或完整人或牛PIV"背景"基因組或反基因組。本發(fā)明中也提供了具有用于預(yù)防和治療PIV感染的人-牛嵌合PIV的方法和組合物。因此，本發(fā)明包括一種開(kāi)發(fā)基于HPIV和BPIV3間嵌合體的活減毒PIV候選疫苗的方法。嵌合體通過(guò)一種基于cDNA的病毒回收系統(tǒng)獲得。從cDNA中獲得的重組病毒獨(dú)立復(fù)制，并以與生物學(xué)來(lái)源的病毒同樣方式增殖。本發(fā)明嵌合的人-牛PIV經(jīng)工程化重組，同時(shí)包含來(lái)自人和牛PIV株的核苷酸序列以產(chǎn)生感染性、嵌合病毒或亞病毒顆粒。以這種方式，候選疫苗病毒經(jīng)工程化重組，在對(duì)PIV感染敏感的哺乳動(dòng)物宿主(包括人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)中誘導(dǎo)抗PIV的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，嵌合的人-牛PIV可以被工程化誘導(dǎo)抗特定PIV的免疫應(yīng)答，如抗HPIV3，或誘導(dǎo)抗多個(gè)PIV的多特異性應(yīng)答，如抗HPIV1和HPIV3?？梢砸罁?jù)此處所述方法設(shè)計(jì)其它嵌合病毒，作為非PIV病原抗原的載體，例如，作為呼吸道合胞病毒(RSV)和麻疹病毒的載體。本發(fā)明人-牛嵌合PIV的例子包括一個(gè)嵌合PIV基因組或反基因組(含有人和牛多核苷酸序列，以及一種主要核殼(N)蛋白、一種核殼磷蛋白(P)和一種大的聚合酶蛋白(L)。其它PIV蛋白可能在各種組合中包括，以提供從感染性亞病毒顆粒，直到完整病毒或含有額外蛋白、抗原決定簇或其它附加成分的病毒顆粒。本發(fā)明嵌合的人-牛PIV包括部分或完全的"背景"PIV基因組或反基因組，其來(lái)自或其構(gòu)建依據(jù)一種人或牛PIV毒株或病毒亞型，與另一種PIV病毒或病毒亞型的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段，形成人-牛嵌合PIV基因組或反基因組。本發(fā)明的一些優(yōu)選方面中，嵌合PIV包括組合了牛PIV的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段的，部分或完全的人PIV背景基因組或反基因組。典型的，部分或完全的背景基因組或反基因組作為一種人或牛PIV對(duì)應(yīng)物的異源基因或基因組區(qū)段的受體骨架或載體。人或牛PIV對(duì)應(yīng)物的異源基因或基因組區(qū)段代表與背景基因組或反基因組組合或替換至其中的"供體"基因或多核苷酸，產(chǎn)生表現(xiàn)新表型特征的人-牛嵌合PIV，這種新表型在其來(lái)源的一個(gè)PIV或在二者中不存在。例如，異源基因或基因組區(qū)段在一個(gè)選擇的受體PIV株中的附加或替代，與未修飾的受體和/或供體相應(yīng)的表型相比，可能導(dǎo)致減毒、生長(zhǎng)變化、改變的免疫原性或其它希望的表型變化。可用于本發(fā)明嵌合人-牛PIV中異源替代或添加的基因和基因組區(qū)段包括，編碼PIVN，P，C，D，V，M，F(xiàn)，SH(如適合)，HN禾口/或L蛋白或其一部分的基因和基因組區(qū)段。此外，編碼非PIV蛋白(如腮腺炎和SV5病毒中的SH蛋白)的基因和基因組區(qū)段可能也包括在本發(fā)明人-牛PIV中。調(diào)節(jié)區(qū)域(如基因外3'前導(dǎo)區(qū)或5'非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)、基因起始、終止區(qū)、基因間隔區(qū)或3'或5'非編碼區(qū))也可用作異源替代或附加。本發(fā)明優(yōu)選的人-牛嵌合PIV候選疫苗，在一個(gè)或多個(gè)BPIV3基因或基因組區(qū)段的替代或附加導(dǎo)致減毒的背景中，帶有HPIV3的一個(gè)或多個(gè)主要抗原決定簇。盡管其它蛋白可能也參與保護(hù)性免疫應(yīng)答，PIV的主要保護(hù)性抗原是其HN和F糖蛋白。一些實(shí)施方案中，背景基因組或反基因組是HPIV基因組或反基因組(如HPIV1、HPIV2、或HPIV3背景基因組或反基因組)，其中加入或替代性加入一個(gè)或多個(gè)BPIV基因或基因組區(qū)段，優(yōu)選BPIV3。在以下描述的一個(gè)實(shí)施方案實(shí)例中，BPIV3N基因ORF替代了HPIV的。另外的，背景基因組或反基因組可以是BPIV基因組或反基因組，其組合有一個(gè)或多個(gè)編碼HPIV3、HPIV2或HPIV1糖蛋白、糖蛋白結(jié)構(gòu)域或其它抗原決定簇的基因或基因區(qū)段。與本發(fā)明的方法一致，任何BPIV基因或基因組區(qū)段，單獨(dú)或與一個(gè)或更多其它BPIV基因組合，可以與HPIV序列組合產(chǎn)生人-牛嵌合PIV候選疫苗。任何HPIV，包括特定HPIV血清型(如HPIV3)的不同株，是使BPIV基因減毒的合理受體。一般，被選擇包括在用作抗人PIV疫苗的人-牛嵌合PIV中的HPIV3基因或基因組區(qū)段，將包含一個(gè)或多個(gè)HPIV保護(hù)性抗原，如HN或F糖蛋白。本發(fā)明的一些范例方面中，帶有一個(gè)或多個(gè)?；蚧蚧蚪M區(qū)段的人-牛嵌合PIV表現(xiàn)高度的宿主范圍限制，如在人PIV感染的哺乳動(dòng)物模型(如非人靈長(zhǎng)類(lèi))的呼吸道中。在范例的實(shí)施方案中，人PIV的減毒是通過(guò)對(duì)部分或完整人PIV(如HPIV3)背景基因組或反基因組進(jìn)行附加或替代一個(gè)或更多的?；蚧蚧蚪M區(qū)段。一個(gè)例子中，HPIV3N基因被BPIV3N基因替代，產(chǎn)生新的人-牛嵌合PIV候選疫苗。優(yōu)選的，本發(fā)明人-牛嵌合PIV候選疫苗產(chǎn)生宿主范圍限制的程度，與各自的BPIV親代或"供體"株的宿主范圍限制程度是相當(dāng)?shù)?。?yōu)選的，這種限制應(yīng)有一種真實(shí)的宿主范圍表型，g卩，應(yīng)該特異于研究的宿主，而且在合適的細(xì)胞系中不限制其復(fù)制和疫苗的體外制備。此外，帶有一個(gè)或更多的?；蚧蚧蚪M區(qū)段的人-牛嵌合PIV，在對(duì)PIV感染敏感的宿主中誘導(dǎo)高水平抗性。因此，本發(fā)明提供了使抗PIV活病毒疫苗減毒的新基礎(chǔ)，其基于引入來(lái)自異源PIV(如HPIV3和BPIV3之間)的一個(gè)或更多基因或基因組區(qū)段而產(chǎn)生的宿主范圍效果。本發(fā)明的相關(guān)方面，人-牛嵌合PIV帶有一個(gè)或更多的編碼HPIVHN和/或F糖蛋白的異源基因。另一些，嵌合PIV可能帶有一個(gè)或更多的編碼胞外域(或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和/或跨膜結(jié)構(gòu)域)、或HPIVHN和/或F糖蛋白的免疫原性表位的基因組區(qū)段。這些免疫原蛋白、結(jié)構(gòu)域和表位在人-牛嵌合PIV中特別有用，因?yàn)樗鼈冊(cè)诿庖呋乃拗髦挟a(chǎn)生新的免疫應(yīng)答。特別的，此處的HN和F蛋白、以及免疫原結(jié)構(gòu)域和表位，提供了主要保護(hù)性抗原。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，人PIV亞型或株的一個(gè)或更多免疫原基因或基因組區(qū)段，對(duì)牛背景或受體基因組或反基因組的附加或在其中替代產(chǎn)生一種重組、嵌合的病毒或亞病毒顆粒，其可以產(chǎn)生抗該人供體病毒(包括一個(gè)或更多人PIV亞型或株)的免疫應(yīng)答，而牛骨架賦予的減毒表型使該嵌合體成為發(fā)展疫苗的有用候選物。一些范例的實(shí)施方案中，一個(gè)或更多人PIV糖蛋白基因(如HN和/或F)加入或替代到部分或完全的牛基因組或反基因組中，產(chǎn)生一種減毒的、具感染性的人-牛嵌合體，可在敏感宿主中誘導(dǎo)抗-人PIV的免疫應(yīng)答。其它一些實(shí)施方案中，人-牛嵌合PIV附加地具有來(lái)自多種人PIV株的一個(gè)編碼免疫原蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域或表位的基因或基因組區(qū)段，如編碼分別來(lái)自不同HPIV(如HPIV1或HPIV2)的兩個(gè)HN或F蛋白或其免疫原部分的基因或基因組區(qū)段?；蛘撸谝粋€(gè)HPIV只提供一個(gè)糖蛋白或免疫原決定簇，第二個(gè)糖蛋白或免疫原決定簇由第二個(gè)HPIV，通過(guò)不在該基因組或反基因組中加入額外的編碼糖蛋白或決定簇的多核苷酸的替代提供。HPIV糖蛋白或免疫原決定簇的替代或附加可能通過(guò)在重組病毒或亞病毒顆粒中構(gòu)建編碼嵌合糖蛋白的基因組或反基因組得以實(shí)現(xiàn)，例如第一個(gè)HPIV的免疫原性表位、抗原區(qū)或全部胞外域與異源HPIV的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合。例如，編碼HPIV1或HPIVHN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的異源基因組區(qū)段，在背景基因組或反基因組中，可以與編碼HPIV3HN或F糖蛋白的相應(yīng)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的基因組區(qū)段相連。另一些實(shí)施方案中，人-牛嵌合PIV的基因組或反基因組可能在重組病毒或亞病毒顆粒中編碼替代、附加或嵌合的糖蛋白或其抗原決定簇，產(chǎn)生同時(shí)具有人和牛糖蛋白、糖蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫原性表位的病毒重組子。例如，編碼人PIVHN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的異源基因組區(qū)段，在背景基因組或反基因組中，可以與編碼相應(yīng)的PIVHN或F糖蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的基因組區(qū)段相連?；蛘?，人PIVHN或F糖蛋白或其部分，可以與編碼另外PIV株或血清型的HN或F糖蛋白或其部分的基因組區(qū)段相連。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，人-牛嵌合PIV可以通過(guò)以異源基因或基因組區(qū)段替代部分PIV背景基因組或反基因組中的對(duì)應(yīng)的基因或基因組區(qū)段進(jìn)行構(gòu)建?；蛘撸愒椿蚧蚧蚪M區(qū)段可以額外基因或基因組區(qū)段加入，并與完整(或部分，如另一基因或基因組區(qū)段缺失)PIV背景基因組或反基因組組合。例如，可能包括兩個(gè)分別來(lái)自HIPV2和HIPV3的人PIVHN或F基因或基因組區(qū)段。經(jīng)常，異源基因或基因組區(qū)段加入接近部分或完整PIV背景基因組或反基因組中的基因間隔區(qū)位置。或者，該基因或基因組區(qū)段可以位于該基因組的其它非編碼區(qū)，如，位于5'或3'非編碼區(qū)，或部分或完整基因組或反基因組中非編碼核苷酸的其它位置。一方面，非編碼調(diào)節(jié)區(qū)具有有效復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯所必須的順式作用信號(hào)，因此是通過(guò)導(dǎo)入異源基因或基因組區(qū)段，或在此所述的其它突變，修飾這些功能的作用靶點(diǎn)。本發(fā)明更詳細(xì)的方面，減毒突變導(dǎo)入順式作用調(diào)節(jié)區(qū)域，以產(chǎn)生如(l)組織特異性減毒(Gromeier等，J.Virol.21:958-964,1999;Zimmerma皿等.J.Virol.71:4145-4149,1997)，(2)對(duì)干擾素的增強(qiáng)的敏感性(Zhnmermann等，1997，同上)，(3)溫度敏感性(Whitehead等，1998a，同上)，(4)復(fù)制水平的一般限制(Men等，J.Virol.70:3930-3937,1996;Muster等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:5177-5181,1991)，和/或(5)復(fù)制的宿主特異性限制(Cahour等，Virology207:68-76,1995)。這些減毒突變可以多種方式達(dá)到，產(chǎn)生本發(fā)明的人-牛嵌合PIV，如通過(guò)點(diǎn)突變、相關(guān)病毒序列的交換或核苷酸突變。在這里提供的另一些其它方法中，部分或完整PIV背景基因組或反基因組中，異源基因或基因組區(qū)段可以被加入或替代到相應(yīng)于其對(duì)應(yīng)物的野生型基因位置的位置上。一些實(shí)施方案中，背景基因組或反基因組中，異源基因或基因組區(qū)段可以在比其對(duì)應(yīng)的基因或基因組區(qū)段的野生型基因位置更加接近或遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置加入或替代，分別可以增強(qiáng)或降低該異源基因或基因組區(qū)段的表達(dá)。本發(fā)明的一些一般方面，?；蚧蚧蚪M區(qū)段被加入或替代到人PIV背景下，形成減毒的人-牛嵌合PIV?；蛘撸逗象w可以由一個(gè)或多個(gè)人基因或基因組區(qū)段在牛PIV背景下加入或替代，形成減毒的PIV候選疫苗。文中，嵌合PIV基因組或反基因組由部分或完整牛PIV背景基因組或反基因組與來(lái)自人PIV的異源基因或基因組區(qū)段組合而成。優(yōu)選方面中，一個(gè)或多個(gè)?；蚧蚧蚪M區(qū)段替代了人PIV背景基因組或反基因組中對(duì)應(yīng)的基因或基因組區(qū)段。其它一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)人PIV糖蛋白基因，如HN和/或F或編碼人PIV糖蛋白細(xì)胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)或免疫原性表位的基因組區(qū)段，替代了牛PIV背景基因組或反基因組中對(duì)應(yīng)的基因或基因組區(qū)段。例如，人PIV糖蛋白基因HN和F二者都可能替代牛PIV背景基因組或反基因組中HN和F糖蛋白基因的對(duì)應(yīng)部分。以相同方式，本發(fā)明人-牛嵌合PIV可被容易地設(shè)計(jì)為"載體"，以包含來(lái)自不同病原的抗原決定簇，包括來(lái)自超過(guò)一種的PIV株或組(如，人PIV3和人PIV1二者)、呼吸道合胞病毒、麻疹和其它病原(參見(jiàn)，如1999年12月10日Murphy等的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/170,195，在此引用作為參考)。在本發(fā)明更詳細(xì)的方面，人-牛嵌合PIV含有組合了來(lái)自人PIV的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段的部分或完整BPIV背景基因組或反基因組。這些方面中，一個(gè)或多個(gè)HPIV糖蛋白基因HN和F，或一個(gè)或多個(gè)編碼人PIV糖蛋白HN和/或F基因的細(xì)胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)或免疫原性表位的基因組區(qū)段，可能加入BPIV背景基因組或反基因組，或替代BPIV背景基因組或反基因組中對(duì)應(yīng)的基因或基因組區(qū)段，產(chǎn)生嵌合的構(gòu)建體。經(jīng)常，HPIV糖蛋白基因HN和F二者都可能替代BPIV背景基因組或反基因組中HN和F糖蛋白基因的對(duì)應(yīng)部分，如以下所述重組嵌合病毒rBPIV3-FHHNH的范例。這是很好的構(gòu)建體，因其組合了人PIV抗原決定簇和牛PIV的宿主范圍限制元件。結(jié)合本發(fā)明人-牛嵌合PIV中宿主范圍表型效果，通過(guò)引入可增加或降低該嵌合病毒減毒性的附加突變來(lái)調(diào)節(jié)減毒表型是需要的。因此，在本發(fā)明附加方面，得到了嵌合基因組或反基因組被進(jìn)一步修飾的減毒的人-牛嵌合PIV，這種修飾是通過(guò)引入決定產(chǎn)生的病毒或亞病毒顆粒中的一種減毒表型的一個(gè)或多個(gè)減毒突變來(lái)進(jìn)行的。包括RNA調(diào)節(jié)序列或編碼蛋白中的突變。這些減毒突變可以在體外產(chǎn)生，并根據(jù)合理設(shè)計(jì)的誘變策略檢測(cè)減毒效果?；蛘?，減毒突變可以在現(xiàn)存的生物學(xué)來(lái)源的突變體PIV中檢出，此后被包括于本發(fā)明人-牛嵌合PIV中。將減毒和其它期望的表型特異性突變引入本發(fā)明人-牛嵌合PIV可通過(guò)將異源基因或基因組區(qū)段(如編碼L蛋白或其部分的)轉(zhuǎn)移入牛或人PIV背景基因組或反基因組完成。或者，突變存在于選擇的背景基因組或反基因組中，而引入的異源基因或基因組區(qū)段不具有突變，或具有一個(gè)或多個(gè)不同的突變。典型的，?；蛉吮尘盎?受體"基因組或反基因組在相應(yīng)于異源病毒(如異源的?；蛉薖IV，或非PIV的負(fù)鏈RNA病毒)突變位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)被修飾，以含有或編碼供體病毒中發(fā)現(xiàn)的相同或保守地相關(guān)的突變(如一個(gè)保守性氨基酸替代)(參見(jiàn)2000年4月12日的PCT/US00/09695和其優(yōu)先權(quán)1999年4月13日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/129,006，在此引用作為參考)。在一個(gè)模式實(shí)施方案中，?；蛉吮尘盎?受體"基因組或反基因組在相應(yīng)于HPIV3JScp45中突變的一個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)被修飾，如以下所述，以具有或編碼？p45"供體"中發(fā)現(xiàn)的相同或保守地相關(guān)的突變。檢測(cè)并在本發(fā)明人-牛嵌合PIV中引入減毒突變的優(yōu)選突變PIV株包括冷傳代(cp)、冷適應(yīng)(ca)、宿主范圍限制(hr)、小噬菌斑(sp)、和/或溫度敏感(ts)突變體，例如JSHPIV3cp45突變株。在模式實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)減毒突變發(fā)生于聚合酶L蛋白中，如在相應(yīng)于JS野生型HPIV3的Tyr942、Leu992、Thr^8的位置上?；蛘?，N蛋白的減毒突變可被選擇并引入人-牛嵌合PIV中，如在相應(yīng)于JS殘基Val96、Ser389處的氨基酸替代。其它或附加突變可能編碼C蛋白中的氨基酸替代，如在相應(yīng)于JS的11e96處，或編碼M蛋白中的氨基酸替代，如相應(yīng)于Pro則處(如Pro則到Thr的突變)。調(diào)節(jié)本發(fā)明人-牛嵌合PIV減毒的其它突變也存在于F蛋白，如在相應(yīng)于JS殘基Ile42Q或Ala45o處，在HN蛋白，如在相應(yīng)于JS殘基Val^4處。引入本發(fā)明人-牛嵌合PIV中的、來(lái)自生物學(xué)來(lái)源的PIV突變體的減毒突變也包括在PIV基因組或反基因組非編碼部分的突變，例如在3'前導(dǎo)序列。文中的突變范例可在重組病毒3'前導(dǎo)序列(相應(yīng)于JScp45核苷酸23、24、28或45)工程化。其它的突變范例可在重組病毒N基因起始序列工程化，如通過(guò)改變N基因起始序列一個(gè)或多個(gè)核苷酸，如相應(yīng)于JScp45核苷酸62位置處。從JScp45和其它生物學(xué)來(lái)源的PIV和非PIV突變體，得到了減毒突變的大"菜單"，其中每個(gè)突變都可以與其它突變組合，調(diào)節(jié)具有人和?；蚧蚧蚪M區(qū)段嵌合體的基因組或反基因組的重組PIV的減毒水平。例如，本發(fā)明重組PIV內(nèi)的突變包括一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或更多JScp45突變。期望用于疫苗的本發(fā)明人-牛嵌合PIV經(jīng)常有至少兩個(gè)，有時(shí)三個(gè)或更多突變，以獲得滿(mǎn)意的可廣泛用于臨床的減毒。優(yōu)選的，重組人-牛嵌合PIV具有一個(gè)或多個(gè)突變，通過(guò)決定于該突變的密碼子中的多核苷酸替代使其穩(wěn)定。其它可以采用并轉(zhuǎn)入本發(fā)明人-牛嵌合PIV的突變可在非PIV非區(qū)段化負(fù)鏈RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，并引入本發(fā)明PIV突變體。這通過(guò)將發(fā)現(xiàn)于異源負(fù)鏈RNA病毒的突變定位于受體PIV基因組或反基因組的相應(yīng)同源位點(diǎn)，并使受體現(xiàn)存序列突變?yōu)樵撏蛔凅w表型(相同或保守突變)，可以容易地獲得，在2000年4月12日的PCT/US00/09695和其優(yōu)先權(quán)1999年4月13日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/129,006中有說(shuō)明，在此引用作為參考。除了重組人-牛嵌合PIV，本發(fā)明還提供了相關(guān)的cDNA克隆、載體和粒子，均包含HPIV和BPIV序列，并且任選地包括一個(gè)或多個(gè)附加的表型特異性突變。根據(jù)此處描述的方法，這些以選擇性組合引入其是重組cDNA基因組或反基因組的分離的多核苷酸，產(chǎn)生表達(dá)時(shí)穩(wěn)定減毒的感染性病毒或亞病毒顆粒。這一過(guò)程，與常規(guī)表型評(píng)價(jià)一起，提供了具有期望特性(如減毒、溫度敏感、改變的免疫原性、冷適應(yīng)、小噬菌斑、宿主范圍限制、遺傳穩(wěn)定性等)的人-牛嵌合PIV。特別的，選擇候選疫苗，其是減毒的但仍然帶有足以在被免疫的哺乳動(dòng)物宿主中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫原性。在本發(fā)明其它方面中，具有或沒(méi)有額外突變(如來(lái)自生物學(xué)來(lái)源的減毒突變病毒)的人-牛嵌合PIV，構(gòu)建使其具有額外的核苷酸改變，以產(chǎn)生所期望的表型、結(jié)構(gòu)或功能的改變。典型的，所選擇的核苷酸改變應(yīng)特異于一種表型變化，如生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感、冷適應(yīng)、小噬菌斑、宿主范圍限制或免疫原性的改變。本文中的結(jié)構(gòu)變化包括在編碼cDNA的PIV中引入或消除限制性位點(diǎn)，使操作和檢出更容易。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人-牛嵌合PIV基因組或反基因組的核苷酸改變包括，部分或完全缺失一個(gè)基因，或降低或消除(剔除)其表達(dá)。這些改變可以引入人或牛背景基因組或反基因組，或通過(guò)進(jìn)入異源基因或基因組區(qū)段(此處是添加或替代)，引入嵌合基因組或反基因組。文中突變的靶基因包括任何PIV基因，包括核殼蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶亞基L、基質(zhì)蛋白M、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN、小疏水蛋白SH蛋白、(如適用)融合蛋白F和C、D、V讀碼框(ORF)的產(chǎn)物。在重組蛋白保持活性和感染性時(shí)，這些蛋白的任何一個(gè)可以被選擇性缺失、替代或重排，整體或部分，單獨(dú)或與其它期望的修飾組合，以獲得新的缺失或剔除突變體。例如，C、D和/或V基因的一個(gè)或多個(gè)可能整體或部分缺失，或其表達(dá)降低或消除(如，引入終止密碼子、RNA編輯位點(diǎn)突變、改變了起始密碼子特異氨基酸的突變或在靶讀碼框中的移碼突變)。一個(gè)實(shí)施方案中，可以在編輯位點(diǎn)制造突變，因此抑制了編輯消除了RNA編輯產(chǎn)生的mRNA的表達(dá)(Kato等，EMBOJ.16:578-587,1997和Schneider等，Virology227:314-322,1997，分別在此引用作為參考)?；蛘撸珻、D和/或V讀碼框的一個(gè)或多個(gè)可能整體或部分缺失，改變所產(chǎn)生的重組克隆的表型，改善了生長(zhǎng)、減毒、免疫原性或其它期望表型特征(參見(jiàn)1999年7月9日Durbin等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/350,821，在此引用作為參考)。本發(fā)明人-牛嵌合PIV的其它核苷酸改變包括，重組基因組或反基因組中的一個(gè)被選擇基因的順式作用調(diào)節(jié)序列的缺失、插入、添加或重排。和其它在此描述的改變相同，這些改變可以引入人或牛背景基因組或反基因組，或通過(guò)進(jìn)入異源基因或基因組區(qū)段(此處是添加或替代)，引入嵌合基因組或反基因組。一個(gè)范例中，一個(gè)PIV基因的順式作用調(diào)節(jié)序列被改變?yōu)榕c異源調(diào)節(jié)序列相應(yīng)，其可以是不同PIV相同基因的對(duì)應(yīng)順式作用調(diào)節(jié)序列，或不同PIV基因的順式作用調(diào)節(jié)序列。例如，一個(gè)基因末端信號(hào)可以轉(zhuǎn)化或替代為相同PIV株的不同基因末端信號(hào)。其它一些實(shí)施方案中，核苷酸修飾可能包括重組基因組或反基因組中翻譯起始位點(diǎn)的插入、缺失、替代或重排，如消除一種蛋白質(zhì)所選擇形式的翻譯起始位點(diǎn)。此外，各種其它的遺傳改變可以在人-牛嵌合PIV基因組或反基因組中產(chǎn)生，單獨(dú)或和一個(gè)或多個(gè)來(lái)自生物學(xué)來(lái)源的突變PIV的減毒突變組合。例如，非PIV來(lái)源的基因或基因組區(qū)段可以整體或部分插入?；蛘撸梢愿淖兓蚺帕许樞颍蛞粋€(gè)PIV基因組啟動(dòng)子用其反基因組的對(duì)應(yīng)部分替代。在這種重組基因組或反基因組中的不同或額外的改變有利于操作，如在各種非編碼區(qū)或其它位置插入唯一的限制性位點(diǎn)。非翻譯的基因序列可以被去除以增加插入外源序列的能力。在另一些方面，編碼人-牛嵌合PIV基因組或反基因組的多核苷酸或載體可以被修飾，以編碼可在目的宿主中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的非PIV序列(如細(xì)胞因子、T輔助表位、限制性位點(diǎn)標(biāo)記)或微生物病原(如病毒、細(xì)菌、寄生物或真菌)。在這種實(shí)施方案中，構(gòu)建了含有呼吸道合胞病毒(RSV)基因或基因組區(qū)段的人-牛嵌合PIV，例如含有編碼RSV抗原蛋白(如F或G蛋白)、免疫原結(jié)構(gòu)域或表位的基因。本發(fā)明的相關(guān)方面，提供了產(chǎn)生分離的感染性人-牛嵌合PIV的組合物(如具有Piv編碼cDNA的分離的多核苷酸或載體)和方法。本發(fā)明的這些方面中包括了具有人-牛嵌合PIV基因組或反基因組的新的分離的多核苷酸分子和載體。也提供了具有編碼N、P、L蛋白的一個(gè)或多個(gè)分離的多核苷酸分子的相同或不同的表達(dá)載體。這些蛋白也可以直接由基因組或反基因組cDNA表達(dá)。載體優(yōu)選在細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞裂解液中表達(dá)或共表達(dá)，從而產(chǎn)生感染性人-牛嵌合PIV病毒顆?；騺啿《绢w粒。以上產(chǎn)生人-牛嵌合PIV的方法和組合物產(chǎn)生感染性病毒顆?；騺啿《绢w粒，或其衍生物。重組感染性病毒相當(dāng)于天然的PIV病毒顆粒，并有同樣的感染性?？芍苯痈腥拘迈r細(xì)胞。感染性亞病毒顆粒典型的是病毒顆粒的一個(gè)亞成分，在適當(dāng)條件下可引發(fā)感染。例如，具有基因組或反基因組RNA和N、P、L蛋白的核殼是亞病毒顆粒的一個(gè)范例，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，可以引發(fā)感染。本發(fā)明提供的亞病毒顆粒包括缺少一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)區(qū)段或其它感染所非必須病毒成分的病毒顆粒。其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有一個(gè)具有包含上述人-牛嵌合PIV基因組或反基因組的多核苷酸分子的表達(dá)載體，和具有包含編碼PIVN、P、L蛋白的一個(gè)或多個(gè)分離的多核苷酸分子的(與前一個(gè)相同或不同的)表達(dá)載體的細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞裂解液。這些蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)也可以從基因組或反基因組cDNA表達(dá)。表達(dá)后，基因組或反基因組和N、P、L組合產(chǎn)生感染性人-牛嵌合PIV病毒顆?；騺啿《绢w粒。本發(fā)明的人-牛嵌合PIV以各種組合物形式用于在對(duì)PIV敏感的宿主中產(chǎn)生期望的抗PIV免疫反應(yīng)。人-牛嵌合PIV的重組子能在感染的哺乳動(dòng)物宿主中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，且足夠地減毒，不會(huì)在免疫化宿主中引發(fā)嚴(yán)重呼吸道疾病的不可接受的癥狀。此外，該人-牛嵌合PIV的重組子在體外應(yīng)該能有效復(fù)制，使疫苗的制備可行。減毒的病毒或亞病毒顆?？赡艽嬖谟诩?xì)胞培養(yǎng)物的上清中，從培養(yǎng)物中分離，或部分或完全純化。病毒也可以冷凍干燥，根據(jù)需要與多種成分組合以?xún)?chǔ)藏或給藥宿主。本發(fā)明進(jìn)一步提供了新疫苗，其包含一種生理上可接受的載體和/或佐劑，以及分離的減毒人-牛嵌合PIV病毒顆?；騺啿《绢w粒。優(yōu)選實(shí)施方案中，該疫苗包含具有至少一個(gè)，優(yōu)選兩或多個(gè)額外的突變或以上所述的其它核苷酸修飾的人-牛嵌合PIV，使減毒和免疫原性達(dá)到合適的平衡。疫苗配制為每劑10、1(^PFU的減毒病毒。病毒可能具有誘導(dǎo)抗單PIV株或抗PIV多株或組的減毒人-牛嵌合PIV。這方面，人-牛嵌合PIV在制劑中可與其它PIV疫苗株，或其它病毒疫苗病毒如RSV組合。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中刺激免疫系統(tǒng)，以誘導(dǎo)抗PIV免疫應(yīng)答的一種方法。該方法包括以足夠的免疫量，給藥存在于生理上可接受的載體和/或佐劑中的人-牛嵌合PIV的制劑。一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原組合物是包含具有至少一個(gè)，優(yōu)選兩或多個(gè)額外的突變或決定以上所述表型的其它核苷酸修飾的人-牛嵌合Piv疫苗。疫苗配制為每劑103-107PFU的減毒病毒。該疫苗可能具有減毒人-牛嵌合PIV病毒，其可誘導(dǎo)抗單PIV，或抗多PIV(如HPIV1和HPIV3)或抗一個(gè)或多個(gè)PIV和非PIV病原如RSV的免疫應(yīng)答。文中，人-牛嵌合PIV可誘導(dǎo)抗單PIV的單特異性免疫應(yīng)答，或抗多PIV，或抗一個(gè)或多個(gè)PIV和非PIV病原如RSV的多特異性免疫應(yīng)答。或者，具有不同免疫原特性的人-牛嵌合PIV可組合于疫苗混合物中，或在協(xié)調(diào)治療方案中單獨(dú)給藥，以誘導(dǎo)抗單PIV，或抗多PIV，或抗一個(gè)或多個(gè)PIV和非PIV病原如RSV的更加有效的保護(hù)。優(yōu)選的，免疫原組合物通過(guò)例如噴霧、滴劑或氣霧劑給藥于上呼吸道。附圖簡(jiǎn)述圖1圖示了牛PIVKa或SF株的N編碼序列克隆于HPIV3中，即將BPIV3毒株Ka或SF的編碼區(qū)克隆進(jìn)HPIV3背景中。在圖1A-C中，BPIV3N的讀碼框(ORF)替代了全長(zhǎng)rJS反基因組cDNA中的對(duì)應(yīng)HPIV3序列(Durbin等，1997a，同上)。BPIV3Ka和SFN基因首先用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)RT-PCR從毒粒RNA中擴(kuò)增，作為1.9kb片段亞克隆進(jìn)pBluescript中，分別得到pBS-KaN或pBS-SFN。HPIV3rJSN基因作為1.9kb的MluI/EcoRI片段克隆進(jìn)來(lái)自具有rJSHPIV3反基因組5'端的質(zhì)粒pUC119中(Durbin等，1997a，同上；1998年5月22日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/083,793;1997年5月23日的美,臨時(shí)申請(qǐng)60/047,575(相應(yīng)于國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/53078)，和1997年9月19日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/059,385;分別在此引用作為參考)，得到pUC119JSN。圖1A---進(jìn)行誘變，在N的起始和終止密碼子處創(chuàng)建限制性位點(diǎn)。每個(gè)N基因通過(guò)定點(diǎn)誘變修飾，分別在轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)引入Ncol和AflII的切點(diǎn)。Ka和SFN基因的轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)相同，因此可以在這兩種BPIV3N基因進(jìn)行相同的如圖1A所示的誘變反應(yīng)。圖1B-—Ncol/Aflll消化后，來(lái)自代表BPIV3N編碼區(qū)的pBS-KaN或pBS-SFN的1.5kb片段導(dǎo)入Ncol/Aflll消化過(guò)的HPIV3N亞克隆pUC119JSN-NcoI/Afin，代替其對(duì)應(yīng)于HPIV3的部分。圖lC---進(jìn)行誘變，恢復(fù)起始和終止密碼子。每個(gè)嵌合的亞克隆進(jìn)行定點(diǎn)誘變，恢復(fù)HPIV3rJS在翻譯起始密碼子之前或終止位點(diǎn)密碼子之后的序列，以及緊挨起始密碼子之后或終止位點(diǎn)密碼子之前的BPIV3的編碼序列。獲得pUC119B/HKaN和pUC119B/HSFN，用于將BPIV3N基因引入HPIV3cDNA克隆，在圖2說(shuō)明。圖1，A組CAAAAATGTTG(SEQIDNO.10);GCAACTAATCGA(SEQIDNO.11);TAACCATGGTGA(SEQIDNO,12);GCACTTAAGCAC(SEQIDNO.13)。圖1，C組TAACCATGGTGA(SEQIDNO.12);GCACTTAAGCAC(SEQIDNO.13);CAAAAATGTTGA(SEQIDNO.14);GCAACTAGTCGA(SEQIDNO.15)。圖2圖示了HPIV3/BPIV3(Ka或SF株)的嵌合N基因插入HPIV3反基因組cDNA中，即將BPIV3N編碼區(qū)克隆進(jìn)HPIV3反基因組cDNA中。圖2A，側(cè)翼為HPIV3序列的BPIV3Ka或SFN的ORF以來(lái)自pUC119B/HKaN或pUC119B/HSFN的MluI/EcoRI片段進(jìn)行亞克隆，插入pLeft+2G(Durbin等，1997a，同上)。質(zhì)粒pLeft+2G帶有HPIV3rJS反基因組T7啟動(dòng)子后nt1-7437(基因組意義)的5'部分。在T7啟動(dòng)子和HPIV3序列中插入以提高轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)G殘基定位以星號(hào)顯示。圖2B——個(gè)pRight的XhoI/NgoMI片段(Durbin等，1997a，同上；1998年5月22日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/083,793;1997年5月23日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/047,575(相應(yīng)于國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/53078),和1997年9月19日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/059,385;分別在此引用作為參考)，其具有側(cè)翼為丁型肝炎(S肝炎)病毒核酶和T7終止子的HPIV3反基因組3端，克隆進(jìn)經(jīng)修飾的pLeft質(zhì)粒的XhoI/NgoMII窗口中，產(chǎn)生pB/HPIV3KaN和pB/HPIV3SFN。這些嵌合構(gòu)建體每個(gè)都含有HPIV3反基因組RNA的完全正義序列，但不含有被其BPIV3Ka或SF對(duì)應(yīng)部分替代的N編碼區(qū)。圖3提供了本發(fā)明HPIV3、BPIV3和嵌合病毒的N起始密碼子(A)和終止密碼子(B)附近核苷酸序列。單個(gè)ORF的位置分別說(shuō)明于BPIV3Ka在Genbank弁AF178654;BPIV3SF在弁AF178655禾口弁Z11515，在此引用作為參考。N起始密碼子(A)和終止密碼子(B)(下劃線(xiàn)標(biāo)出)的側(cè)翼序列(正義)在親代重組HPIV3JS(rJS)，親代生物學(xué)來(lái)源的BPIV3Ka和SF病毒(Ka禾口SF)，以及嵌合的cKa和cSF病毒中顯示。cKa和cSF病毒序列中的宿主特異性殘基及其在rJS(起始密碼子之前和終止密碼子之后)和Ka或SF中的對(duì)應(yīng)物(起始密碼子到終止密碼子，并二者包括在內(nèi))均以黑體表示。噬菌斑純化的嵌合病毒從毒粒RNA中RT-PCR擴(kuò)增，用TaqDye脫氧終止循環(huán)試劑盒(ABI，F(xiàn)osterCity，CA)測(cè)序。確定預(yù)期的序列確實(shí)存在于每個(gè)嵌合病毒中。圖3A.RJS，GGAACTCTATAATTTCAAAAATGTTGAGCCTATTTGATAC(SEQIDNO.16)。圖3A.cKa和cSF，GGAACTCTATATAATTTCAAAAATGTTGAGTCTATTCGACAC(SEQIDNO.17)。圖3A.Ka禾卩SF，GAAATCCTAAGACTGTAATCATGTTGAGTCTATTCGACAC(SEQIDNO.18)。圖3AA(SEQIDNO.19)。圖3B.cKa和cSF，TCAGTGCATTCGGAAGCAACTAGTCGAATCAACATTTTAA(SEQIDNO.20)。圖3B.Ka禾BSF，IDNO.21)。圖4描述了本發(fā)明BPIV3/HPIV3嵌合病毒的結(jié)構(gòu)，以及利用病毒RNA的RT-PCR產(chǎn)物的Taql消化進(jìn)行確認(rèn)，即通過(guò)TaqI消化來(lái)確定潛在的BPIV3/HPIV3嵌合體的特征。在圖4A示意嵌合的cKa和cSF病毒相對(duì)于其親代BPIV3和HPIV3病毒(但不按比例)的基因組。Ka和SF特異的區(qū)域分別用淺和深陰影表示。rJS基因組上方箭頭表示為進(jìn)行Taql消化而RT-PCR擴(kuò)增嵌合和親代病毒所使用的引物的位置。這些引物導(dǎo)向BPIV3和HPIV3間的保守區(qū)域，使其可以用于擴(kuò)增HPIV3、BPIV3和嵌合的BPIV3/HPIV3病毒。在圖4B顯示了每種病毒Taql消化的預(yù)期產(chǎn)物大小，用圖4A.中引物對(duì)從RNA中擴(kuò)增的為1898bp的PCR產(chǎn)物。該P(yáng)CR產(chǎn)物在圖4B的頂端表示，NORF表示為填充的矩形。Taql片段對(duì)每個(gè)病毒都是唯一的，因此可用于病毒的鑒定，用星號(hào)表示。圖4C顯示了含有側(cè)翼為親代BPIV3和HPIV3病毒序列的嵌合cKa(左)或cSF(右)的PIV3N編碼序列的PCR產(chǎn)物的Taql消化圖。診斷病毒獨(dú)特性和與在4B中的相應(yīng)的唯一性的Taql片段用星號(hào)表示。并表示了DNA凝膠條帶的計(jì)算長(zhǎng)度(bp)。圖5提供了親代和嵌合病毒在MDBK(A)或LLC-MK2(B)細(xì)胞中多周期生長(zhǎng)曲線(xiàn)。6孔板的每個(gè)孔(每孔9.6cm勺中單層的牛MDBK(A)或猿猴L(fēng)LC-MK2(B)細(xì)胞分別以0.01感染復(fù)數(shù)感染親代和嵌合病毒。樣品在指定的時(shí)間點(diǎn)采集，-7(TC儲(chǔ)存，同時(shí)TCIDs。分析其效價(jià)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)用每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的3次樣品的平均值建立?？蓹z測(cè)出的病毒下限為10'5TCID50/ml，以點(diǎn)狀線(xiàn)表示。圖6A-6G給出了牛PIV3Ka株的正義核苷酸全序列(SEQIDNO.22)。圖7A-7G給出了牛PIV3SF株的正義核苷酸全序列(SEQIDNO.23)。圖8A示意嵌合病毒rHPIV3-FBHNB和rBPIV3-FHHNH，及其親代病毒rHPIV3JS和rBPIV3Ka的基因組(不按比例)。F和HN分別用引入M和HN基因序列末端之前的SgrAI和BsiWI位點(diǎn)，在rHPIV3和rBPIV3之間進(jìn)行單限制性片段互換。圖8B顯示BPIV3Ka的反基因組cDNA的排列。構(gòu)建編碼BPIV3Ka完全反基因組序列(Genbank弁AF17865)的全長(zhǎng)cDNA。這些cDNA來(lái)自病毒(v)RNA反轉(zhuǎn)錄(RT)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到的亞克隆。測(cè)序該反基因組的多個(gè)亞克隆，只有吻合BPIV3Ka共有序列的可以用來(lái)裝配全長(zhǎng)克隆，但由于nt21和23以同樣頻率出現(xiàn)在病毒群體中，卻與已發(fā)表的序列不同，因此不包括在內(nèi)。圖8C圖示了編碼HPIV3/BPIV3抗原性嵌合病毒的全長(zhǎng)cDNA克隆的產(chǎn)生。其中圖8C1.產(chǎn)生HPIV3和BPIV3全長(zhǎng)克隆；圖8C2.誘變以產(chǎn)生唯一的SgrAI和BsiWI限制性位點(diǎn)；圖8C3.克隆F禾卩HN基因進(jìn)異源全長(zhǎng)cDNA中。該圖表明親代和嵌合牛-人PIV基因組的特點(diǎn)。示意了嵌合病毒rHPIV3FBHNB和rBPIV3-FHHNH，及其親代病毒rHPIV3JS和rBPIV3Ka的基因組(不按比例)。兩個(gè)唯一的限制性位點(diǎn)，SgrAI和BsiWI，分別引入M和HN基因末端。圖8C2中顯示帶有這些引入的限制性位點(diǎn)的重組HPIV3和BPIV3病毒，定名為rHPIV3和rBPIV3。糖蛋白基因在rHPIV3JS和rBPIV3Ka之間互換。突變了的核苷酸序列顯示在每個(gè)cDNA構(gòu)建體下方，指出了每個(gè)序列第一個(gè)核苷酸的位置。引入的SgrAI和BsiWI限制性位點(diǎn)下畫(huà)線(xiàn)，而HPIV3禾口BPIV3之間有差異并由此識(shí)別了插入基因的來(lái)源的核苷酸以黑體表示。圖8C，組1，rHPIV3JSTCCACCGGTGCA(SEQIDNO.4)，TAGACAAAAGGG(SEQIDNO.24)。圖8C，組1，rBPIV3KaTCCAACATTGCA(SEQIDNO.2)，AAGATATAAAGA(SEQIDNO.25)。圖8C，組2，rHPIV3CGCACCGGTGTA(SEQIDNO.5)，TAGACGTACGGG(SEQIDNO.26)。圖8C，組2，rBPIV3TCCACCGGTGCA(SEQIDNO.3)，AAGACGTACGGA(SEQIDNO.27)。圖8C,組3，rHPIV3FBHNBCGCACCGGTGCA(SEQIDNO.28)，AAGACGTACGGG(SEQIDNO.29)。圖8C，組3，rBPIV3-FHHNHAAGACGTACGGG(SEQIDNO.30)，TAGACGTACGGA(SEQIDNO.31)。圖9確定了通過(guò)對(duì)病毒RNA的RT-PCR和EcoRI消化，確定重組病毒的身份。用可同時(shí)識(shí)別HPIV3和BPIV3F和HN序列任何一端保守區(qū)的引物對(duì)，對(duì)病毒RNA進(jìn)行RT-PCR獲得產(chǎn)物。EcoRI消化在這四種病毒中產(chǎn)生獨(dú)特的限制性片段圖。在左邊的示意圖中，水平線(xiàn)表示擴(kuò)增的病毒序列，垂直線(xiàn)表示EcoRI消化切點(diǎn)的位置。線(xiàn)上表示了每個(gè)限制性片段的預(yù)期大小。線(xiàn)下的數(shù)字相應(yīng)于該序列在HPIV3JS(Genbank#AF178654和弁Zl1515)、BPIV3Ka或指定嵌合衍生物反基因組RNA的位置。右邊顯示了PCR產(chǎn)物用EcoRI消化后的1%瓊脂糖凝膠，確定了親代和嵌合病毒。星號(hào)表示包括由于大小相似產(chǎn)生共遷移的兩個(gè)限制性片段的膠帶。圖10顯示親代和嵌合病毒在猿猴L(fēng)LC-MK2細(xì)胞中的多周期復(fù)制。三種嵌合病毒rHPIV3-FBHNs、rBPIV3-FHHNH和rHPIV3Nb(也稱(chēng)作cKa)多周期復(fù)制(輸入的接種量MO^0.01)與其親代病毒BPIV3Ka和rHPIV3相比。病毒效價(jià)以平均1ogK)TCIDM)/ml士三次樣品的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。該分析檢測(cè)下限是10TCID5Q，以點(diǎn)狀水平線(xiàn)表示。圖11記錄了感染后的獼猴在整個(gè)感染過(guò)程中，鼻咽擦拭樣品內(nèi)嵌合和親代病毒的平均效價(jià)。病毒效價(jià)以L(fǎng)LC-MK2細(xì)胞中平均TCID5。/ml士標(biāo)準(zhǔn)誤差(感染同種病毒的4-6只猴子)表示。這顯示了與表3中相同的實(shí)驗(yàn)。A組，rHPIV3-FBHNB的平均效價(jià)與rHPIV3和BPIV3Ka相比。B組，rBPIV3-FHHNH的平均效價(jià)與BPIV3Ka和rHPIV3相比，后兩個(gè)病毒在A組值相同，但分別給出，以便于對(duì)比。由于第5天的效價(jià)遠(yuǎn)低于第4和6天(可能由于采樣的技術(shù)問(wèn)題)，因此不包括在內(nèi)。具體實(shí)施方案的說(shuō)明本發(fā)明提供了作為人和牛PIV基因組或反基因組序列的嵌合體克隆以產(chǎn)生人-牛嵌合PIV的重組副流感病毒(PIV)。人-牛PIV的嵌合構(gòu)建體產(chǎn)生在哺乳動(dòng)物(特別是人)中具感染性的病毒顆?；騺啿《绢w粒，并能產(chǎn)生可用于臨床和獸醫(yī)學(xué)的免疫原組合物。本發(fā)明也提供了設(shè)計(jì)和產(chǎn)生減毒人-牛嵌合PIV的方法和組合物，以及預(yù)防和治療PIV感染的方法和組合物。本發(fā)明嵌合的人-牛PIV經(jīng)工程化重組，引入來(lái)自人和牛PIV株的核苷酸序列，產(chǎn)生感染性嵌合的病毒或亞病毒顆粒。這一方面，候選的疫苗病毒工程化重組后，在對(duì)PIV感染敏感的宿主(包括人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)內(nèi)誘導(dǎo)抗PIV的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，人-牛嵌合PIV可以誘導(dǎo)針對(duì)特定PIV的免疫應(yīng)答，如HPIV3，或針對(duì)多PIV的多特定性免疫應(yīng)答，如HPIV1和HPIV3。本發(fā)明模式的人-牛嵌合PIV包含一個(gè)嵌合的PIV基因組或反基因組，其具有人和牛二者的多核苷酸序列，以及主要核殼蛋白(N)、核殼磷蛋白(P)和一個(gè)大聚合酶蛋白(L)。其它PIV蛋白可能以各種組合包括在內(nèi)，提供從各種感染性亞病毒顆粒到完整病毒顆粒，或帶有額外蛋白、抗原決定簇或其它附加成分的病毒顆粒。本發(fā)明嵌合的人-牛PIV包含部分或全部的"背景"PIV基因組或反基因組，其來(lái)自或其構(gòu)建自組合有另一種PIV株或血清型病毒的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段的人或牛PIV株或血清型病毒，形成人-牛嵌合PIV基因組或反基因組。本發(fā)明的某些方面，嵌合PIV含有組合了牛PIV—個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段的人PIV的背景基因組或反基因組。本發(fā)明的另一些方面，嵌合PIV含有組合了人PIV—個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段的牛PIV(BPIV)的背景基因組或反基因組。典型的，這種部分或全部的背景基因組或反基因組作為受體骨架或載體，在其上加入來(lái)自人或牛PIV對(duì)應(yīng)部分的異源基因或基因組區(qū)段。來(lái)自人或牛PIV對(duì)應(yīng)部分的異源基因或基因組區(qū)段代表"供體"基因或多核苷酸，組合有或替代進(jìn)該背景基因組或反基因組，產(chǎn)生與親代PIV之一或與全部親代PIV相比，具有新表型特點(diǎn)的人-牛嵌合PIV。例如，異源基因或基因組區(qū)段在一個(gè)選擇的受體PIV株中的附加和替代，與未改變的受體和/或供體相應(yīng)的表型相比，可能導(dǎo)致減毒增強(qiáng)或降低、生長(zhǎng)變化、改變的免疫原性或其它希望的表型變化。可用于本發(fā)明嵌合人-牛PIV中異源插入和附加的基因和基因組區(qū)段包括，編碼PIVN，P，C，D，V，M，F(xiàn)，SH，(如適合)，HN和/或L蛋白或其部分的基因或基因組區(qū)段。調(diào)節(jié)區(qū)域(如基因外3'前導(dǎo)區(qū)或5'非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)、基因間隔區(qū))也可用作異源替代或附加序列。部分或完整PIV背景基因組或反基因組中，異源基因或基因組區(qū)段可以在相應(yīng)于其對(duì)應(yīng)物的野生型基因位置上被加入或替代，而其對(duì)應(yīng)的基因或基因組區(qū)段被替代或移位(如，移位于離啟動(dòng)子更遠(yuǎn)的位置)。另一些實(shí)施方案中，部分或完整PIV背景基因組或反基因組中，異源基因或基因組區(qū)段可以在比其對(duì)應(yīng)的野生型基因或基因組區(qū)段的排列位置更接近或遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置上加入或替代，分別可以增強(qiáng)或降低該異源基因或基因組區(qū)段的表達(dá)。產(chǎn)生的人-牛嵌合PIV的異源免疫原蛋白、結(jié)構(gòu)域和表位的引入尤其適用于在免疫化宿主中產(chǎn)生新的免疫應(yīng)答。來(lái)自供體PIV的免疫原基因或基因組區(qū)段，對(duì)不同株的PIV受體基因組或反基因組的添加或替代產(chǎn)生的免疫應(yīng)答抗供體亞型或株、受體亞型或株、或針對(duì)二者。為達(dá)到這一目的，構(gòu)建表達(dá)嵌合蛋白的人-牛嵌合PIV，如特異于一種PIV的免疫原蛋白，其細(xì)胞質(zhì)尾和/或跨膜區(qū)，與特異于另一種PIV胞外域融合產(chǎn)生人-牛融合蛋白，或具有兩種不同人PIV結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。優(yōu)選實(shí)施方案中，人-牛嵌合PIV基因組或反基因組在重組病毒顆?；騺啿《绢w粒中編碼同時(shí)具有人和牛二者的糖蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫原性表位的糖蛋白。例如，編碼人PIVHN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的異源基因組區(qū)段，可以與編碼相應(yīng)牛PIV3HN或F糖蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或跨膜結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列(即，基因組區(qū)段)相連，形成人-牛嵌合PIV基因組或反基因組。其它一些實(shí)施方案中，用于疫苗制劑中的人-牛嵌合PIV可容易地被改變，以適應(yīng)循環(huán)病毒的抗原漂移。典型的，改變發(fā)生在HN和/或F蛋白中。這可能包括一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變的引入；可能包括一種PIV株或組的HN或F全基因，或編碼特定免疫原區(qū)的一個(gè)基因組區(qū)段，通過(guò)替代不同PIV株或組受體克隆的相應(yīng)區(qū)段，或通過(guò)添加該基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝，引入嵌合PIV基因組或反基因組cDNA，產(chǎn)生多抗原形式。修飾后的PIV克隆的子代病毒可以用于抗一些PIV株的疫苗制劑。人PIV的編碼和非編碼序列(如啟動(dòng)子、基因末端、基因起始、基因間區(qū)或其它順式作用元件)經(jīng)對(duì)應(yīng)的異源部分替代后，產(chǎn)生具有多種可能的減毒或其它表型的嵌合PIV。特別的，宿主范圍和其它期望表型來(lái)自用牛或鼠PIV(MPIV)蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域、基因或基因組區(qū)段引入人PIV背景中，由于牛或鼠基因在人細(xì)胞中不能有效作用(如，由于異源序列或蛋白與生物交互作用的人PIV序列或蛋白(即通常與替代序列或蛋白協(xié)作，參與病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯、裝配等的)序列或蛋白不相容，或更典型的，與許可和較不許可的宿主間的宿主范圍限制有差異的一種細(xì)胞蛋白或細(xì)胞環(huán)境的其它方面不相容)。在模式實(shí)施方案中，基于已知的牛和人PIV結(jié)構(gòu)和功能方面，選擇牛PIV序列引入人PIV。HPIV3是單負(fù)鏈病毒目副粘病毒科呼吸道病毒屬的成員(Collins等，1996，同上)。HPIV3是HPIV的最佳代表，代表HPIV的原型。其基因組為負(fù)義的單鏈RNA，長(zhǎng)度為15462個(gè)核苷酸(Galinski等，Virology165:499-510,1988;禾QStokes等.VirusRes.25:91-103.1992;分別在此引用作為參考)。PIV3基因組至少編碼8個(gè)蛋白質(zhì)核殼蛋白(N)、核殼磷蛋白(P)、未知功能的C和D蛋白、基質(zhì)蛋白M、融合糖蛋白F、血凝素-神經(jīng)氨酸酶糖蛋白HN、和一個(gè)大聚合酶蛋白(L)(Collins等，1996，同上)?？赡芤脖磉_(dá)包含P基因內(nèi)VORF的蛋白(Durbin等,Virology261:319-333,1999)。M、HN、F蛋白是包膜相關(guān)的，后兩個(gè)是表面糖蛋白，對(duì)每個(gè)PIV蛋白一樣，是主要的中和和保護(hù)性抗原(Collins等，1996，同上)。在各種PIV中可比較的HN或F蛋白的顯著序列差異被認(rèn)為是這種保護(hù)免疫特異性的基礎(chǔ)(Collins等，1996，同上；Cook等，Amer.Jour.Hvg.22:150-159，1963;Ray等.J.Infect.Dis.162:746-749,1990;分別在此引用作為參考)。除了包含4個(gè)ORF(艮卩P、C、D、V)的PmRNA夕卜，HPIV3基因分別以編碼單個(gè)蛋白的單mRNA轉(zhuǎn)錄(Galinski等，VirologyiM:543-550,1992;和Spriggs等，J.Gen.Virol.67:2705-2719,1986;分別在此引用作為參考)。在該mRNA中，P和C從獨(dú)立但重疊的ORF中翻譯。盡管所有的副粘病毒都編碼P蛋白，只有呼吸道病毒和麻疹病毒屬編碼C蛋白。病毒個(gè)體在表達(dá)的C蛋白數(shù)量上不同，在體內(nèi)和體外病毒復(fù)制的重要性方面也不同。仙臺(tái)病毒(SeV)從CORF不同位點(diǎn)啟動(dòng)，表達(dá)出四種蛋白C，、C、Yl、Y2，其翻譯起始點(diǎn)以mRNA中的順序出現(xiàn)(Curran等，Enzyme4^:244-249，1990;Lamb等，TheParamyxoviruses,D.Kingsbury,PP.181-214，白金出版社，紐約，1991;分別在此引用作為參考)，而HPIV3和麻疹病毒(MeV)僅表達(dá)一個(gè)單獨(dú)的C蛋白(Bellini等，J.Virol.11:908-919，1985;Sanchez等，Virology147:177-186,1985;和Spriggs等，1986，同上，分別在此引用作為參考)。PIV3D蛋白是P和DORF的融合蛋白，通過(guò)共轉(zhuǎn)錄RNA編輯加工，從P基因中表達(dá)，其在RNA編輯位點(diǎn)處將兩個(gè)非模板G殘基加入了mRNA中(Galinski等，1992,同上；和Pelet等，EMBOJ.辺:443-448，1991，分別在此引用作為參考)。副粘病毒中唯一表達(dá)D蛋白的BPIV3，利用RNA編輯表達(dá)該蛋白和第二蛋白，V蛋白。呼吸道病毒、麻疹病毒和Rubulavirus屬的幾乎所有成員都表達(dá)V蛋白。唯一確定不表達(dá)的是HPIV1，因其缺少完整的VORF(Matsuoka等，J.Virol.M:3406-3410,1991，在此引用作為參考)。VORF的特征是存在高度保守的半胱氨基酸豐富區(qū)(Cattaneo等，^:759-764,1989;Park等，J.Virol.^:7033-7039，1992;Thomas等，￡^11M:891-902，1988;和Vidal等，J.Virol.64:239-246,1990;分別在此引用作為參考)。對(duì)存在于各HPIV3病毒的VORF測(cè)序結(jié)果表明該ORF表達(dá)并維持病毒功能(Galinski等，Virology155:46-60,1986;Spriggs，1986，同上；禾口Stokes等，1992，同上；分別在此引用作為參考)。一個(gè)非模板G殘基加入RNA編輯位點(diǎn)后，BPIV3V蛋白表達(dá)(Pelet等，1991,同上，在此引用作為參考)。但HPIV3中，兩個(gè)翻譯終止子存在于編輯位點(diǎn)和VORF之間，仍不清楚是否HPIV3是該ORF不表達(dá)的另一個(gè)例子，或是否其以另一種機(jī)制表達(dá)。一種可能性是HPIV3編輯還發(fā)生在P基因下游的第二處，盡管在細(xì)胞培養(yǎng)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(Galinski等，1992，同上)?；蛘撸赡芎颂求w通過(guò)移碼接近VORF。這類(lèi)似MVP位點(diǎn)的情況。MV表達(dá)C、P、V蛋白，但也表達(dá)從PORF至UVORF的移碼突變所合成的一個(gè)新的R蛋白(Liston等，J.Virol.巡:6742-6750,1995，在此引用作為參考)。遺傳證據(jù)表明HPIV3的VORF是有功能的(Durbin等，1999，同上)。盡管仍不清楚HPIV3表達(dá)V的方式，其VORF在不同株之間的極度保守暗示其確實(shí)是表達(dá)的。V蛋白的功能不十分明確，但V-負(fù)型(V-mi皿s)的MV和SeV重組體在體內(nèi)可以有效復(fù)制，但在體外復(fù)制降低(Delenda等，Virology211:55-62,1997;Delenda等，J.Virol.,:327-337，1998,同上；Kato等，1997a,同上；Kato等，J.Virol.21:7266-7272，1997b;禾卩Valsamakis等,J.Virol.72:7754-7761,1998;分別在此引用作為參考)。PIV的病毒基因組也具有基因外前導(dǎo)序列和非轉(zhuǎn)錄尾序列，包含病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必須的全部或部分啟動(dòng)子，以及非編碼區(qū)和基因間隔區(qū)。因此，PIV遺傳圖以3'-前導(dǎo)序列-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5'非轉(zhuǎn)錄尾序列表示。一些病毒，如獼猴病毒5和腮腺炎病毒，在F和HN之間編碼一未知功能的小疏水蛋白(SH)。轉(zhuǎn)錄從3'起始并通過(guò)在基因邊緣處短的保守結(jié)構(gòu)域指導(dǎo)下的順序終止-起始機(jī)制進(jìn)行。每個(gè)基因的上游末端具有一個(gè)基因起始信號(hào)(GS)，指導(dǎo)其各自基因的起始。每個(gè)基因的下游末端具有一個(gè)基因終止信號(hào)(GE)，指導(dǎo)其各自基因的多腺苷酸化和終止。對(duì)人PIV3JS株(Genbank接入號(hào)Z11575，在此引用作為參考)禾口Washington株(GalinskiM.S.,TheParemyxoviruses,Kingsbury,D.W.eds,pp.537-568,白金出版社，紐約，1991;在此引用作為參考)，牛PIV3910N株(Genbank接入號(hào)D80487,在此引用作為參考)的模式序列進(jìn)行了描述。此處所用術(shù)語(yǔ)"PIV基因"一般指PIV基因組編碼mRNA的部分，典型地，以基因起始信號(hào)(GS)開(kāi)始于上游末端，以基因終止信號(hào)(GE)結(jié)束于下游末端。術(shù)語(yǔ)PIV基因也稱(chēng)為"翻譯讀碼框"或ORF，特別當(dāng)一種蛋白，如C，表達(dá)自附加的ORF而非獨(dú)特的mRNA。為了構(gòu)建本發(fā)明人-牛嵌合PIV基因，需要整體或部分地缺失、插入或替代一個(gè)或多個(gè)PIV基因或基因組區(qū)段。意味著，整體或部分的缺失、插入或替代包括一個(gè)或多個(gè)PIV基因或基因組區(qū)段的讀碼框或順式作用元件。"基因組區(qū)段"是指PIV基因組上任意長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸，可以是ORF、基因或基因外區(qū)域、或其組合的一部分。本發(fā)明包括一種基于HPIV和BPIV3間嵌合體的、發(fā)展活減毒PIV候選疫苗的方法。嵌合體的構(gòu)建通過(guò)一種基于cDNA的病毒回收系統(tǒng)。從cDNA中獲得的重組病毒獨(dú)立復(fù)制，并以與生物學(xué)來(lái)源的病毒同樣方式增殖。本發(fā)明優(yōu)選的人-牛嵌合PIV候選疫苗，在一個(gè)或多個(gè)BPIV3基因或基因組區(qū)段的替代或附加導(dǎo)致的減毒的背景下，帶有一個(gè)或多個(gè)人PIV如HPIV1、HPIV2和/或HPIV3的一個(gè)或多個(gè)主要抗原決定簇。盡管其它蛋白可能也參與保護(hù)性免疫應(yīng)答，PIV的主要保護(hù)性抗原是其HN和F糖蛋白。因此，本發(fā)明提供使用作抗PIV疫苗的野生型或突變親代病毒減毒的新基礎(chǔ)，這種減毒基于BPIV和HPIV之間一個(gè)或多個(gè)基因或基因組區(qū)段的引入所產(chǎn)生的宿主范圍效應(yīng)。BPIV和HPIV之間有許多核苷酸和氨基酸的差異，并反映為宿主范圍效應(yīng)。例如，HPIV3和BPIV3之間以下蛋白的氨基酸相同率為N(86%)、P(65%)、M(93%)、F(83%)、HN(77。/。)和L(91%)。宿主范圍差異例如，HPIV3在獼猴中高度許可地生長(zhǎng)，而B(niǎo)PIV3的兩個(gè)不同株系復(fù)制是限制性的(vanWykeCoelingh等，1988，同上)。盡管仍不了解HPIV3和BPIV3之間宿主范圍差異的基礎(chǔ)，可能包括多個(gè)基因和氨基酸的差異。多基因(可能有順式調(diào)節(jié)序列)的參與，其中又有多個(gè)氨基酸和核苷酸的差異，造成了減毒的廣泛基礎(chǔ)，這很難通過(guò)回復(fù)突變實(shí)現(xiàn)。這與其它因一個(gè)或幾個(gè)點(diǎn)突變?cè)斐蓽p毒的活的減毒HPIV3病毒是相反的。這種情況時(shí)單個(gè)突變的回復(fù)可能導(dǎo)致顯著的毒性恢復(fù)，或?qū)τ趩蝹€(gè)殘基所決定的減毒，導(dǎo)致毒性的完全回復(fù)。以下說(shuō)明的本發(fā)明的模式實(shí)施方案中，背景基因組或反基因組是HPIV基因組或反基因組，異源基因或基因組區(qū)段是來(lái)自BPIV3Ka或SF(其氨基酸序列有99%的相關(guān)性)的N0RF。HPIV3背景反基因組的NORF由BPIV3NORF的對(duì)應(yīng)部分替代，產(chǎn)生新的重組人-牛PIVcDNA克隆。HPIV3的HPIV3NORF由BPIV3Ka或SF替代產(chǎn)生的蛋白與HPIV3N有約70。/。的氨基酸差異(取決于所涉及的毒株)。N是非常保守的蛋白之一，其它如P之類(lèi)的蛋白替代(單獨(dú)或組合)可能導(dǎo)致更大的氨基酸差異。多基因或基因組區(qū)段的參與(各具有許多核苷酸和氨基酸的差異)提供了高度穩(wěn)定、難以回復(fù)突變的減毒的基礎(chǔ)。這種減毒方式與目前利用一個(gè)或更多點(diǎn)突變產(chǎn)生減毒的HPIV候選疫苗截然相反，不會(huì)因單個(gè)突變的回復(fù)導(dǎo)致顯著的，或完全的毒性恢復(fù)。此外，幾種已知的HPIV上的點(diǎn)突變典型地產(chǎn)生溫度敏感型表型。與溫度敏感相關(guān)的減毒存在的一個(gè)問(wèn)題是，該病毒在下呼吸道的復(fù)制被過(guò)度限制，而在上呼吸道減毒。這是因?yàn)楹粑纼?nèi)的溫度梯度，下呼吸道溫度高(因此限制性更強(qiáng))、上呼吸道溫度低(限制性低)。減毒病毒在上呼吸道的復(fù)制導(dǎo)致復(fù)雜癥狀，包括鼻塞、鼻炎、發(fā)熱和中耳炎，而在上呼吸道過(guò)度的減毒使免疫原性降低。因此，僅通過(guò)溫度敏感突變產(chǎn)生的減毒是不理想的。相反，本發(fā)明人-牛嵌合PIV中的宿主范圍突變多數(shù)情況下不產(chǎn)生溫度敏感性。因此，與其它已知的PIV候選疫苗相比，本發(fā)明提供的PIV減毒的新方法遺傳上和表型更穩(wěn)定，更不可能與上呼吸道中殘留毒性相關(guān)。令人驚訝的是，NORF替代了的HPIV3/BPIV3的Ka和SF嵌合重組體都是活性的。BPIV3Ka或SF株的N蛋白分別與HPIV3JS株的515個(gè)氨基酸有70個(gè)的差異。因此，未料道有如此大氨基酸差異的牛N蛋白可以與HPIV3RNA，或其它組成功能性復(fù)制/轉(zhuǎn)錄酶的蛋白相互作用。同樣令人驚訝的是，與HPIV3和BPIV3親代相比，Ka禾卩SF嵌合病毒，在細(xì)胞培養(yǎng)中同樣有效復(fù)制，這顯示，嵌合重組體沒(méi)有表現(xiàn)出在體內(nèi)限制復(fù)制的基因不相容性。這種在體外有效復(fù)制的特性很重要，因其許可高效的生物制備?；谝韵碌难芯坑^察到其它令人驚訝的現(xiàn)象，只帶有一個(gè)?；虻腍PIV3/BPIV3的Ka和SF嵌合重組體(稱(chēng)為cKa和cSF)，在獼猴呼吸道中表現(xiàn)出和其BPIV3親本程度相當(dāng)?shù)乃拗鞣秶拗?。特別是與HPIV3相比，該cKa和cSF病毒在獼猴上呼吸道中，其復(fù)制分別約降低了60和30倍。基于這一結(jié)果，本發(fā)明人-牛嵌合PIV中的其它BPIV3基因可能賦予期望的宿主范圍限制。因此，根據(jù)該方法，可在HPIV和BPIV異源基因或基因組區(qū)段中發(fā)現(xiàn)一系列減毒的決定簇，它們可以以適當(dāng)?shù)慕M合在選擇用于疫苗的人-牛嵌合PIV提供理想水平的宿主范圍限制和免疫原性。在優(yōu)選的疫苗重組子中，以在PIV對(duì)人感染的認(rèn)可的動(dòng)物模型(如倉(cāng)鼠和獼猴)上/下呼吸道中的復(fù)制為特征的減毒，與相應(yīng)的野生型或突變親本PIV株的生長(zhǎng)相比，降低約2倍，經(jīng)常是約5、10、20倍，優(yōu)選50-100倍，多至IOOO倍或更高(如，感染后3陽(yáng)8天檢確定了本發(fā)明人-牛嵌合PIV提供的未預(yù)期的性質(zhì)和優(yōu)勢(shì)，cKa和cSF都能在獼猴呼吸道中誘導(dǎo)高水平的抗HPIV3的保護(hù)，盡管這些病毒在人PIV感染和保護(hù)的模型中表現(xiàn)復(fù)制的極度限制。特別的，這些病毒中任何一個(gè)前期的感染，在上/下呼吸道中，都可誘導(dǎo)對(duì)rJS感染病毒復(fù)制的高水平抗性。與未接種的對(duì)照猴相比，cKa對(duì)猴的感染誘導(dǎo)高水平的保護(hù)，表現(xiàn)為比上呼吸道中野生型HPIV3(rJS)的復(fù)制降低300倍，在下呼吸道中降低IOOO倍。感染cSF的猴，與未接種的對(duì)照猴相比，比上呼吸道中野生型HPIV3(rJS)的復(fù)制降低2000倍，在下呼吸道中降低1000倍。cKa或cSF誘導(dǎo)的保護(hù)，與從前感染了?；蛉薖IV親本的猴相當(dāng)。因此，本發(fā)明人-牛嵌合PIV的感染在猴的上/下呼吸道中提供高水平的保護(hù)，這兩個(gè)嵌合病毒都是有前景的候選病毒。在其它優(yōu)選的病毒重組子中，人-牛嵌合PIV的免疫原活性用來(lái)平衡減毒水平，以獲得候選病毒，典型的標(biāo)志是攻擊病毒復(fù)制的降低，如rJS，在上/下呼吸道中降低約50-100倍，100-500倍，優(yōu)選約500-2000倍，多至3000倍，或更高(如，攻擊后3-8天檢測(cè))。因此，本發(fā)明的重組疫苗病毒保持免疫原活性的同時(shí)，也表現(xiàn)復(fù)制和生長(zhǎng)的降低。這種令人驚訝的表型特征對(duì)疫苗的發(fā)展是非常有利的。BPIV3兩個(gè)株系的N基因賦予HPIV3在獼猴中的減毒表型的觀察顯示，這可能是其它BPIV3株系N基因所共有的性質(zhì)。相應(yīng)的，本發(fā)明的方法中，BPIV的任何基因或基因組區(qū)段，單個(gè)，或與一個(gè)或多個(gè)BPIV基因或基因組區(qū)段組合，可與HPIV序列組合產(chǎn)生適合作為疫苗病毒使用的HPIV3/BPIV3嵌合重組病毒。優(yōu)選實(shí)施方案中，所有的HPIV(包括HPIV1、HPIV2、HPIV3和其突變株系)都可以作為減毒的BPIV基因或基因組區(qū)段的受體。一般，選擇用于HPIV3/BPIV3嵌合病毒中的HPIV基因應(yīng)包括一個(gè)或多個(gè)保護(hù)性抗原，如HN或F糖蛋白。本發(fā)明其它的人-牛嵌合PIV應(yīng)包括HPIV1或HPIV2的保護(hù)性抗原決定簇。例如，可以使HPIV1或HPIV2的HN和/或F基因在減毒的HPIV/BPIV嵌合重組病毒中，以額外的基因表達(dá)?；蛘呖梢岳肏PIV3/HPIV1或HPIV3/HPIV2抗原嵌合病毒(其中HPIV1或HPIV2的HN和/或F基因替代了PIV3中的對(duì)應(yīng)部分)(Skiadopoulos等，1999a,同上；Tao等，1999,同上；1998年5月22日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/083,793;分別在此引用作為參考)，作為一個(gè)或多個(gè)異源減毒的?；蚧蚧蚪M區(qū)段(如Ka或SFN基因或基因組區(qū)段)的受體或背景病毒。這種抗原嵌合病毒因牛N基因的存在而減毒，但可誘導(dǎo)對(duì)HPIV1或HPIV2病毒的免疫。文中利用PIV3cDNA拯救系統(tǒng)獲得了嵌合的PIV1疫苗，艮口，在包含3個(gè)L處減毒突變的PIV3全長(zhǎng)cDNA上，將PIV3的HN和F的讀碼框替換為PIV1的。來(lái)自此cDNA的重組嵌合病毒定名為rPIV3-l.cp45L(Skiadopoulos等，1999a，同上；Tao等，1998,同上；Tao等，1999，同上)。rPIV3-l.cp45L在倉(cāng)鼠中是減毒的，并誘導(dǎo)對(duì)PIV1攻擊的高水平抗性。也得到了另一個(gè)定名為rPIV3-lcp45的重組嵌合病毒，帶有15個(gè)cp45突變中的12個(gè)(g卩，不具有HN和F中的突變)，在倉(cāng)鼠上下呼吸道中高度減毒(Skiad叩oulos等，1999a,同上)。其它HPIV/BPIV嵌合重組體包括兩個(gè)或多個(gè)BPIV基因或基因組區(qū)段，以任何組合，甚至包括除了選定的基因、或選自HN或F基因或基因組區(qū)段抗原決定簇(來(lái)源于HPIV1、HPIV2或HPIV3)外的全部BPIV基因組。本發(fā)明其它的實(shí)施方案定向于具有其它動(dòng)物PIV(如鼠PIV1、狗SV5PIV2病毒、或其它鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳動(dòng)物的PIV)的減毒基因和HPIV骨架(或包括來(lái)自HPIV1、HPIV2和/或HPIV3的嵌合HPIV骨架)組合的人-牛嵌合PIV。本發(fā)明的其它詳細(xì)方面，被用作異源病原(包括其它PIV、非-PIV和非病毒性病原)保護(hù)性抗原的載體。人-牛嵌合基因組或反基因組包括部分或完全的PIV"載體基因組或反基因組"，其組合了編碼一個(gè)或多個(gè)異源病原的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段(參見(jiàn)，如1999年12月10日Murphy等的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/170,195，在此引用作為參考)。文中的異源病原可以是異源PIV，該異源基因或基因組區(qū)段可被選擇編碼一個(gè)或多個(gè)PIVN、P、C、D、V、M、F、SH(如適用)、HN和/或L蛋白，以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、片段和免疫原區(qū)或表位。構(gòu)建的PIV載體疫苗可誘導(dǎo)多特異性的免疫應(yīng)答，并可與其它疫苗制劑同時(shí)，或以協(xié)同方式給藥。本發(fā)明的模式實(shí)施方案中，人-牛嵌合PIV包括是部分或完全的HPIV基因組或反基因組的載體基因組或反基因組，其組合了，或改變以使其具有，包含一個(gè)或多個(gè)異源PIV抗原決定簇的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段(包括來(lái)自HPIV1、HPIV2或HPIV3的異源HPIV)。本發(fā)明的更詳細(xì)方面，該載體基因組或反基因組是部分或完全的HPIV3基因組或反基因組，而編碼抗原決定簇的異源基因或基因組區(qū)段是一個(gè)或多個(gè)異源的HPIV的。典型的，這種嵌合的基因組或反基因組包含決定減毒的BPIV的一個(gè)或多個(gè)基因或基因組區(qū)段。本發(fā)明的模式實(shí)施方案中，人-牛嵌合PIV包括在部分或完全的HPIV3載體基因組或反基因組內(nèi)，編碼一個(gè)或多個(gè)HN和/或F糖蛋白，或抗原結(jié)構(gòu)域、其片段或表位的一個(gè)或多個(gè)HPIV1或HPIV2基因或基因組區(qū)段。在更具體的方面，編碼HN和F糖蛋白的HPIV1基因替代對(duì)應(yīng)的HPIV3HN和F基因，形成嵌合HPIV3-1載體基因組或反基因組。這種重組構(gòu)建體可用于直接生產(chǎn)疫苗病毒，或通過(guò)加入或引入編碼一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的一個(gè)或多個(gè)基因或基因組區(qū)段，做進(jìn)一步修飾。這種用于生產(chǎn)疫苗病毒的構(gòu)建體典型的包含一個(gè)或多個(gè)決定減毒的異源BPIV基因或基因組區(qū)段，例如，編碼減毒BPIV蛋白(如N)的讀碼框(ORF)。本發(fā)明的一些人-牛嵌合PIV，可用做載體，生產(chǎn)抗HPIV2的疫苗，如，含有HPIV2HN基因讀碼框(0RF)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位加入或引入嵌合的HPIV3-1載體基因組或反基因組中，嵌合的構(gòu)建體因BPIV基因或基因組區(qū)段的引入而減毒。本發(fā)明的相關(guān)方面，載體基因組或反基因組是部分或完全的BPIV基因組或反基因組，編碼抗原決定簇的異源基因或基因組區(qū)段是一個(gè)或多個(gè)異源的HPIV的。典型的，抗原決定簇選自HPIV1、HPIV2或HPIV3HN和F糖蛋白，但抗原結(jié)構(gòu)域、其片段或表位也有作用。一些實(shí)施方案中，在部分或完全的BPIV載體基因組或反基因組中，加入或用之替代編碼一個(gè)或多個(gè)HPIV2抗原決定簇的一個(gè)或多個(gè)基因或基因組區(qū)段。或者，在部分或完全的BPIV載體基因組或反基因組中，加入或?qū)刖幋a多HPIV抗原決定簇的多個(gè)異源基因或基因組區(qū)段。本發(fā)明的另一些方面，提供了作為廣泛非PIV病原載體的人-牛嵌合PIV(參見(jiàn)，如1999年12月10日Murphy等的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/170,195，在此引用作為參考)。本發(fā)明的這方面使用的載體基因組或反基因組可包含部分或完全的BPIV或HPIV基因組或反基因組，異源病原可選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒的亞型A和B、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、線(xiàn)狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、甲病毒和流感病毒。例如，構(gòu)建本發(fā)明人-牛嵌合PIV的BPIV或HPIV載體基因組或反基因組可能包含選自麻疹病毒HA和F蛋白的異源抗原決定簇，或抗原結(jié)構(gòu)域、其片段或表位。模式實(shí)施方案中，含有麻疹病毒HA基因讀碼框(ORF)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位加入或引入BPIV或HPIV載體基因組或反基因組中。另外，本發(fā)明其它的人-牛嵌合PIV可用作載體，從呼吸道合胞病毒(RSV)中引入異源抗原決定簇，例如，通過(guò)引入編碼RSVF和/或G糖蛋白或其免疫原結(jié)構(gòu)域或表位的一個(gè)或多個(gè)基因或基因組區(qū)段。文中所述RSVcDNA的克隆及其它在以下文獻(xiàn)中作了描述1995年9月27日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/007,083;1996年9月27日美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/720,132;1996年7月15日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/021,773;1997年5月9日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/046,141;1997年5月23日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/047,634;1997年7月15日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)08/892,403(相應(yīng)于國(guó)際公開(kāi)WO98/02530);1999年4月13日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)09/291,894;1999年4月13日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/129,006;Collins,等，同上；Bukreyev等，J,Virol,70:6634-6641、1996;Juhasz等，1997，同上；Durbin等，1997a,同上；He等，1997，同上；Baron等，1997,同上；Whitehead等，1998a，同上；Whitehead等，1998b，同上；Jin等，1998,同上；Whitehead等，1999,同上；Burkreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:2367-2372,1999;為各種目的在此全文引用作為參考)。根據(jù)本發(fā)明的這方面，提供了至少包括一個(gè)來(lái)自異源PIV或非PIV病原抗原決定簇的人-牛嵌合PIV。例如，一個(gè)或多個(gè)HPIV3的單個(gè)基因或基因組區(qū)段可被來(lái)自人RSV對(duì)應(yīng)的基因或基因組區(qū)段替代，或RSV的基因或基因組區(qū)段可以額外基因的形式插入或添加?；蛘?，一個(gè)被選定的異源基因或基因組區(qū)段(如編碼RSV糖蛋白細(xì)胞質(zhì)尾、跨膜區(qū)或胞外域)替代了HPIV3中相同基因，或HPIV3中不同基因內(nèi)的對(duì)應(yīng)部分，或者加入HPIV3基因組或反基因組的非編碼區(qū)，產(chǎn)生嵌合的PIV-RSV糖蛋白。一種實(shí)施方案中，人RSVF基因的一個(gè)基因組區(qū)段替代了對(duì)應(yīng)的HPIV3基因組區(qū)段，產(chǎn)生編碼嵌合蛋白的構(gòu)建體，如，PIV的胞質(zhì)尾和/或跨膜區(qū)融合了RSV的胞外域，產(chǎn)生一種新的減毒病毒，禾口/或抗PIV/RSV二者的多價(jià)疫苗。如上所述，通過(guò)引進(jìn)可增加或降低減毒，或改變嵌合病毒表型的額外突變，可以調(diào)整本發(fā)明人-牛嵌合PIV的減毒表型，這是所期望的。作為本發(fā)明的附加方面，提供了從cDNA中獲得重組PIV的材料和方法的詳細(xì)描述，以及此處提出的制造和檢測(cè)全部的突變和核苷酸改變的方法Durbin等，1997a，同上；1998年5月22日美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/083,793;1997年5月23日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/047,575(相應(yīng)于國(guó)際申請(qǐng)WO98/53078);1997年9月19日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/059,385;分別在此引用作為參考。特別的，這些文件說(shuō)明了誘變、分離和定性PIV以獲得減毒突變株(如溫度敏感(ts)、冷傳代(cp)、冷適應(yīng)(ca)、小噬斑(sp)、和宿主范圍限制(hr)突變株)，及發(fā)現(xiàn)決定該減毒表型的遺傳變化的方法和步驟。與這些方法一致，這些文件詳細(xì)說(shuō)明了，在認(rèn)可的模型系統(tǒng)中(包括鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型系統(tǒng))，確定生物學(xué)來(lái)源的和重組產(chǎn)生的減毒人PIV的復(fù)制、免疫原性、遺傳穩(wěn)定性和有效保護(hù)性的方法。此外，這些文件說(shuō)明發(fā)展和檢測(cè)用于預(yù)防和治療PIV感染的免疫原組合物(包括單價(jià)和二價(jià)疫苗)的一般方法。以上引用的文件中也說(shuō)明了產(chǎn)生感染重組PIV的方法，即，構(gòu)建和表達(dá)編碼PIV基因組或反基因組的cDNA并與必需PIV蛋白基因共表達(dá)，還包括可用于產(chǎn)生感染PIV病毒克隆的以下模式質(zhì)粒p3/7(131)(ATCC97990);p3/7(131)2G(ATCC97889);禾Bp218(131)(ATCC97991);依據(jù)布達(dá)佩斯條約，分別保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，10801，UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209，USA)，以上提供了保藏號(hào)。以上引用的文獻(xiàn)中也揭示了構(gòu)建和評(píng)估經(jīng)修飾的感染性重組PIV，其引入了在生物學(xué)來(lái)源的PIV突變體中發(fā)現(xiàn)的表型特異性突變(如冷傳代(cp)、冷適應(yīng)(ca)、宿主范圍限制(hr)、小噬斑(sp)、和/或溫度敏感(ts)突變株，如JSHPIV3cp45突變株)。其它減毒突變可能沒(méi)有輔助的表型標(biāo)志。在這些突變株中發(fā)現(xiàn)的突變可以容易地用于人-牛嵌合PIV。在模式實(shí)施方案中，聚合酶L蛋白上有一個(gè)或多個(gè)減毒突變，如在相應(yīng)于JScp45的Tyr942、Leu992、1^1558上，優(yōu)選將這些突變通過(guò)生物突變體的相同或保守的氨基酸替代，引入本發(fā)明人-牛嵌合PIV中。因此，PIV重組體可能包括一個(gè)Tyr942被His替代、Leu992被Phe替代和/或Thns5s被Ile替代的突變。對(duì)于這些替代氨基酸保守的替代可用于產(chǎn)生期望的突變表型。來(lái)自生物學(xué)來(lái)源的PIV突變體的其它模式突變包括N蛋白的一個(gè)或多個(gè)突變，包括在相應(yīng)于JScp45殘基Val96、Ser，處的氨基酸替代。在詳細(xì)的方面，這些突變代表了Val96到Ala，或Ser^9到Ala，或其保守的替代。本發(fā)明重組PIV中有用的氨基酸替代還發(fā)生在C蛋白上，如在相應(yīng)于JScp45的11e96上的突變，優(yōu)選由11e96的相同或保守的替代突變?yōu)門(mén)hr。來(lái)自生物學(xué)來(lái)源的PIV突變體的其它模式突變包括M基因的一個(gè)突變，如JScp45的Pro199，或F蛋白的多個(gè)突變，包括在JScp45上相應(yīng)于JScp45殘基Ile420或Ala450處，優(yōu)選由Ile420到Val、八1&45()到Thr的替代或保守替代。本發(fā)明其它人-牛嵌合PIV采用HN蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，以下為范例，重組PIV采用了相應(yīng)于JScp45殘基Val384處的一個(gè)突變，優(yōu)選由Val384到Ala的替代。本發(fā)明這方面的其它例子包括這種人-牛嵌合PIV，其在PIV基因組或反基因組非編碼部分(如3'端前導(dǎo)區(qū))具有一個(gè)或多個(gè)突變。文中的突變范例可在重組病毒3'前導(dǎo)序列(相應(yīng)于JScp45核苷酸23、24、28或45)的位置上工程化。其它的突變范例可在重組病毒N基因起始序列工程化，如通過(guò)改變N基因起始序列一個(gè)或多個(gè)核苷酸，如在相應(yīng)于JScp45核苷酸62的位置處。更詳細(xì)的方面，人-牛嵌合PIV在核苷酸23處由T變?yōu)镃，在核苷酸24處由C變?yōu)門(mén)，在核苷酸28處由G變?yōu)門(mén)，和/或在核苷酸45處由T變?yōu)锳。在基因外序列中的其它突變的例子是N基因起始序列在相應(yīng)于JScp45核苷酸62位置處由A變?yōu)門(mén)。可在本發(fā)明人-牛嵌合PIV中工程化的突變范例成功地被工程化，并在重組PIV中恢復(fù)，如以下重組PlV:rcp45、rcp45L、rcp45F、rcp45M、rcp45HN、rcp45C、rcp45F、rcp453'N、rcp453'NL禾口rcp453，NCMFHN(Durbin等，1997a，同上；Skiadopolos等，1998,同上；Skiadopolos等，J.Virol.73:1374-1381,1999b;1998年5月22日美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/083,793;1997年5月23日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/047,575(相應(yīng)于國(guó)際公開(kāi)WO98/53078);1997年9月19日美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/059,385;分別在此引用作為參考)。此外，以上引用的文獻(xiàn)描述了嵌合重組體PIV(如在部分HPIV3背景基因組或反基因組中，有HPIV1HN和F基因的替代)的構(gòu)建，進(jìn)一步改變以帶有HPIV3JScp45中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)減毒突變。這種嵌合重組體具有cp45L基因中發(fā)現(xiàn)的所有減毒突變。之前顯示了所有除異源(HPIV1)HN和F基因外的cp45突變可以引入HPIV3-1重組體，產(chǎn)生減毒的嵌合候選疫苗。從JScp45和其它生物學(xué)來(lái)源的PIV突變體，得到了減毒突變的大"菜單"，其中每個(gè)突變都可以與其它突變組合，調(diào)節(jié)帶有C、D和/或V基因缺失或剔除突變的重組體PIV的減毒、免疫原性和遺傳穩(wěn)定性的水平。文中，本發(fā)明許多重組PIV包括一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或更多來(lái)自生物學(xué)來(lái)源的PIV突變體的突變，如JScp45中發(fā)現(xiàn)的突變之一或組合。優(yōu)選的本發(fā)明重組體PIV具有多個(gè)和至多全部JScp45，或其它生物學(xué)來(lái)源的PIV突變體中發(fā)現(xiàn)的突變。優(yōu)選的，由于在特定于每個(gè)突變的密碼子處有多個(gè)核苷酸替代，這些突變?cè)谌?牛嵌合PIV中穩(wěn)定地抗回復(fù)突變。其它可引入本發(fā)明人-牛嵌合PIV的突變是存在于異源PIV或更遠(yuǎn)源的非區(qū)段化負(fù)鏈RNA病毒的突變，如減毒突變。特別的，負(fù)鏈RNA病毒中的減毒或其它期望的突變可被"轉(zhuǎn)移"，如通過(guò)在人-牛嵌合PIV基因組或反基因組相應(yīng)位點(diǎn)中引入突變。簡(jiǎn)要的，一個(gè)異源負(fù)鏈RNA病毒中期望的突變被轉(zhuǎn)移到PIV受體(如分別?；蛉薖IV)。包括在異源病毒中定位該突變，通過(guò)序列對(duì)比識(shí)別受體RSV中相應(yīng)位點(diǎn)，將PIV受體的天然序列突變?yōu)樵撏蛔兓蛐?通過(guò)相同或保守突變)，以下文獻(xiàn)中作了說(shuō)明2000年4月12日的PCT/US00/09695，和其優(yōu)先權(quán)1999年4月13日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/129,006，在此引用作為參考。如這些文獻(xiàn)所述，優(yōu)選修飾在突變位點(diǎn)編碼改變的受體基因組或反基因組，其保守地相應(yīng)于異源突變病毒中的改變。例如，如果突變病毒中相對(duì)于野生型序列的一個(gè)氨基酸替代標(biāo)記為突變的一個(gè)位點(diǎn)，則重組病毒相應(yīng)殘基處可工程化產(chǎn)生一個(gè)相似的替代。優(yōu)選，該替代應(yīng)包括一個(gè)與突變病毒蛋白中替代殘基相同或保守的氨基酸。但對(duì)于突變蛋白中的替代殘基，也可能非保守地改變突變位點(diǎn)的天然氨基酸(如利用其它氨基酸破壞或消弱野生型殘基的功能)。在其中發(fā)現(xiàn)模式突變并轉(zhuǎn)移于本發(fā)明人-牛嵌合PIV中的負(fù)鏈RNA病毒包括其它PIV(如HPIV1、HPIVHPIV2、HPIV3、HPIV4A、HPIV4B、BPIV3)、RSV、仙臺(tái)病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)等。本發(fā)明使用的多種突變范例在以上引用的文獻(xiàn)中做了說(shuō)明，包括但不限于RSVL蛋白521處苯丙氨酸替代，其相應(yīng)于HPIV3L蛋白456處苯丙氨酸(或保守性相關(guān)的氨基酸)替代并由此可轉(zhuǎn)移為后者。在標(biāo)志為缺失或插入的突變中，可以作為相應(yīng)的缺失或插入，引入在背景基因組或反基因組中，或被引入基因的異源基因或基因組區(qū)段中，引入重組病毒。缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列不一。本發(fā)明中其它的人-牛PIV候選疫苗可以通過(guò)將嵌合PIV基因組或反基因組編碼的一個(gè)類(lèi)似突變改變?yōu)橄膳_(tái)病毒(SeV)中發(fā)現(xiàn)的減毒突變來(lái)獲得。一個(gè)例子中，該減毒突變包含sevc蛋白no處苯丙氨酸的一個(gè)氨基酸替代。改變?cè)揚(yáng)IV基因組或反基因組，以編碼一個(gè)保守殘基的變動(dòng)，其與異源SeV突變體中標(biāo)志該減毒突變的變動(dòng)保守相關(guān)。一個(gè)實(shí)施方案中，該突變引入重組HPIV3的一個(gè)蛋白中，包括HPIV3C蛋白164處苯丙氨酸的一個(gè)氨基酸替代。各種靶蛋白可用于在本發(fā)明嵌合的人-牛PIV中相應(yīng)位點(diǎn)上引入來(lái)自一個(gè)負(fù)鏈RNA病毒的減毒突變。在單負(fù)鏈病毒目中，5個(gè)耙蛋白是高度保守的，在特定區(qū)域或結(jié)構(gòu)域顯示出中等至高度的序列同一性。特別的，該目中所有已知成員都具有同源的五個(gè)蛋白核殼蛋白(N)，核殼磷蛋白(P)，非糖基化的基質(zhì)蛋白(M)，至少一個(gè)表面糖蛋白(HN、F、H或G)和一個(gè)大的聚合酶蛋白(L)。這些蛋白都代表引入減毒突變的有用靶，即在相應(yīng)于異源突變病毒中發(fā)現(xiàn)的減毒突變位點(diǎn)處，改變重組病毒蛋白的一個(gè)或多個(gè)保守殘基。文中，將異源突變轉(zhuǎn)移到本發(fā)明嵌合的人-牛PIV中的方法是基于在第一負(fù)鏈RNA病毒中發(fā)現(xiàn)一個(gè)減毒突變。該突變，由于其在標(biāo)志突變位點(diǎn)處氨基酸序列與野生型中的不同而被發(fā)現(xiàn)，提供了對(duì)作為重組減毒靶點(diǎn)的嵌合病毒中的同源蛋白序列(在背景基因組或反基因組中，或其加入或替代的異源基因或基因組區(qū)段中)的比較指標(biāo)。該減毒突變可以是已知的，或可利用用于產(chǎn)生和表征生物學(xué)來(lái)源突變病毒的誘變和反向遺傳技術(shù)來(lái)識(shí)別?；蛘?，目的減毒突變可通過(guò)如定點(diǎn)誘變和傳統(tǒng)的篩選技術(shù)重新產(chǎn)生和定性。負(fù)鏈RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的每個(gè)減毒突變提供了對(duì)一個(gè)或多個(gè)異源負(fù)鏈病毒中同源蛋白進(jìn)行序列比較的指標(biāo)。文中，分析了現(xiàn)有的序列，也利用傳統(tǒng)的序列分析方法得到用于分析的序列比較，檢出具有減毒突變的蛋白和作為減毒靶重組病毒的不同病毒的同源蛋白之間相應(yīng)的蛋白區(qū)域和氨基酸位點(diǎn)。當(dāng)標(biāo)志該減毒突變的一個(gè)或多個(gè)殘基改變了其"野生型"的特征(其在靶人-牛嵌合病毒蛋白的相應(yīng)位置處是保守的)時(shí)，靶病毒的基因組或反基因組被重組地改變，編碼氨基酸的缺失、替代或插入，改變靶病毒蛋白的保守殘基，從而賦予了該重組病毒同源的減毒的表型。構(gòu)建減毒重組負(fù)鏈病毒的合理設(shè)計(jì)的方法中，在一個(gè)負(fù)鏈RNA病毒中標(biāo)志減毒突變的氨基酸位點(diǎn)的野生型的特征殘基可以是嚴(yán)格保守，也可以在靶人-牛嵌合病毒蛋白的相應(yīng)氨基酸位置處保守替代。因此耙病毒蛋白的相應(yīng)殘基與異源突變病毒的減毒突變所改變的野生型殘基可以相同，或在氨基酸組的結(jié)構(gòu)和功能上保守性相關(guān)。任何一種情況下，可以根據(jù)本發(fā)明的方法，通過(guò)改變靶病毒基因組或反基因組，使其產(chǎn)生改動(dòng)保守殘基的氨基酸缺失、替代或插入，使重組病毒中產(chǎn)生類(lèi)似的減毒。在本發(fā)明中，優(yōu)選改變所述基因組或反基因組，使其產(chǎn)生編碼保守殘基變化，其保守性地與標(biāo)志所述異源突變病毒減毒突變的殘基變化相應(yīng)。例如，如一個(gè)氨基酸替代標(biāo)志一個(gè)在突變病毒中與野生型序列差異的突變，則一個(gè)替代將在該重組病毒的相應(yīng)殘基處工程化。優(yōu)選的，該替代應(yīng)與突變病毒蛋白中被替代殘基相似或保守。但至于被替代殘基也可能在突變蛋白中非保守地改變突變位點(diǎn)的天然氨基酸，(如利用其它氨基酸破壞或削弱野生性殘基的特征和功能)。對(duì)于以缺失或插入為標(biāo)志的情況，可作為相當(dāng)?shù)娜笔Щ虿迦朕D(zhuǎn)移到重組病毒，缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列不一。本發(fā)明其它方面中，異源突變負(fù)鏈病毒中轉(zhuǎn)移的突變可能賦予本發(fā)明人-牛嵌合PIV除了期望的減毒表型外(或同時(shí)伴隨有所期望的減毒表型)的多種表型。因此，病毒重組蛋白中的模式突變除了(或同時(shí)伴隨有)所期望的減毒表型外，還賦予溫度敏感(ts)、冷適應(yīng)(ca)、小噬菌斑(sp)或宿主范圍限制(hr)表型、或生長(zhǎng)或免疫原性的改變。引入人-牛嵌合PIV的來(lái)自生物學(xué)來(lái)源PIV和其它非區(qū)段化負(fù)鏈RNA病毒中的減毒突變，可以天然產(chǎn)生或可以通過(guò)已知的誘變方法引入野生型PIV。例如，不完全減毒親本PIV株可能通過(guò)病毒在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加化學(xué)誘變劑而產(chǎn)生，通過(guò)選擇低于亞適溫度時(shí)傳代的病毒以誘導(dǎo)生長(zhǎng)限制突變而產(chǎn)生，或通過(guò)選擇在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生小噬菌斑的被誘變病毒而產(chǎn)生，方法在以上的引用文獻(xiàn)中有述。"生物學(xué)來(lái)源的PIV"是指任何不通過(guò)重組方式產(chǎn)生的PIV。因此生物學(xué)來(lái)源PIV包括所有天然產(chǎn)生的PIV，包括如具有野生型基因組序列的天然產(chǎn)生的PIV，和具有與參照野生型RSV序列有等位基因差異或突變基因組差異的PIV，例如具有特異于減毒表型的突變的PIV。同樣，生物學(xué)來(lái)源的PIV包括親本PIV經(jīng)人工誘變和選擇方法獲得的PIV突變株。如上所述，可以幾種方式產(chǎn)生足夠減毒的生物學(xué)來(lái)源的PIV，其中之一包括細(xì)胞培養(yǎng)中部分減毒的病毒在漸低的減毒溫度中傳代。例如，部分減毒的突變體在細(xì)胞培養(yǎng)低于最適溫度下的傳代而產(chǎn)生。因此調(diào)節(jié)cp突變體或其它部分減毒PIV突變株，通過(guò)在培養(yǎng)中傳代而使其在低溫培養(yǎng)時(shí)有效生長(zhǎng)。與部分減毒的親本相比，選擇冷傳代突變PIV顯著降低了衍生株的任何殘存毒性。另外，特定突變可以通過(guò)對(duì)部分減毒親本病毒進(jìn)行化學(xué)誘變來(lái)引入，如引入ts突變，或當(dāng)該病毒已是ts突變時(shí)，引入額外的ts突變使足以賦予該減毒衍生物更加強(qiáng)的減毒和/或ts表型穩(wěn)定性。ts突變引入PIV的方法包括，根據(jù)已知方法使病毒在誘變劑(如5-氟尿苷)存在時(shí)復(fù)制。產(chǎn)生減毒的ts突變可產(chǎn)生在任何PIV基因內(nèi)，盡管其特別可能的靶是聚合酶(L)基因。在本發(fā)明使用的模式減毒PIV中，復(fù)制的溫度敏感性的水平，是通過(guò)比較其在許可溫度和在幾種限制性溫度時(shí)的復(fù)制來(lái)確定。將與其在許可溫度時(shí)相比，復(fù)制下降100倍或更多倍的最低溫度作為其截止溫度。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人中，PIV的復(fù)制和毒性都與該突變體截止溫度相關(guān)。JScp45HPIV3被認(rèn)為具有相對(duì)遺傳穩(wěn)定、高免疫原性和滿(mǎn)意的減毒性。對(duì)這種包含多種所述單個(gè)突變和組合突變的生物學(xué)來(lái)源的和重組病毒的核苷酸序列分析顯示，減毒增加的每個(gè)水平都與特定核苷酸和氨基酸相關(guān)。上述引用文獻(xiàn)也公布了如何常規(guī)的區(qū)分偶發(fā)的沉默突變和導(dǎo)致因感染性PIV克隆基因組或反基因組中引入獨(dú)立或組合形式突變所產(chǎn)生的表型差異的突變。該過(guò)程還包括對(duì)親本和衍生病毒的表型特征進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)出導(dǎo)致如減毒、溫度敏感、冷適應(yīng)、小噬菌斑和宿主范圍限制等這些期望性狀的突變。這樣發(fā)現(xiàn)的突變被集結(jié)成一個(gè)"菜單"，可以按需要以單獨(dú)或組合形式引入，以調(diào)整人-牛嵌合PIV的相關(guān)性狀，如減毒、免疫原性、對(duì)減毒表型回復(fù)突變的遺傳抗性等。與以上所述相符，從cDNA中得到PIV的能力使可以在人-牛嵌合PIV中引入特定的工程化改變。特別的，用感染性重組PIV來(lái)檢測(cè)生物學(xué)來(lái)源的減毒PIV株中特定的突變，如特定于ts、ca、att和其它表型的突變。由此識(shí)別需要的突變，并引入重組人-牛嵌合PIV疫苗株中。從cDNA中得到PIV的能力使能夠?qū)⑼蛔儐为?dú)或以各種選擇的組合，常規(guī)地引入全長(zhǎng)cDNA克隆中，其后可以容易地確定具有這些引入突變的所拯救重組病毒的表型。通過(guò)在感染性PIV中鑒定并引入與期望表型(如cp或ts表型)有關(guān)的特定的生物學(xué)來(lái)源的突變，本發(fā)明提供了在鑒定的突變處，或位于其緊鄰處的其它位點(diǎn)特異性修飾。多數(shù)生物學(xué)來(lái)源的PIV中的減毒突變是單核苷酸改變，但也可利用重組技術(shù)將其它"位點(diǎn)特異性"突變引入生物學(xué)來(lái)源的或重組PIV中。此處所述位點(diǎn)特異性突變包括1-3、多至5-15或更多已改變核苷酸(如與野生型PIV序列、選擇的突變PIV株序列或經(jīng)誘變的親本重組PIV克隆不同)的插入、替代、缺失或重排。這類(lèi)位點(diǎn)特異性突變可被引入選擇的生物學(xué)來(lái)源的點(diǎn)突變處，或其區(qū)域內(nèi)?；蛘?，突變可以引入PIV克隆的其它區(qū)域，如在順式作用調(diào)控區(qū)或編碼蛋白活性位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)、免疫原性表位等的核苷酸序列上或其附近。位點(diǎn)特異性PIV突變體典型的具有一個(gè)期望的減毒突變，但也可能表現(xiàn)與減毒無(wú)關(guān)的其它表型，如增強(qiáng)或擴(kuò)大的免疫原性、和/或改善的生長(zhǎng)。位點(diǎn)特異性突變株的進(jìn)一步范例包括在決定減毒點(diǎn)突變的密碼子處引入額外的穩(wěn)定的核苷酸突變的重組PIV。如可行，在親本突變PIV或重組PIV克隆中決定減毒氨基酸變化的密碼子處，引入兩個(gè)或更多核苷酸替代，產(chǎn)生對(duì)減毒表型的回復(fù)具有遺傳抗性的生物學(xué)來(lái)源的或重組的PIV。其它一些實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性的核苷酸替代、添加、缺失或重排被引入靶核苷酸位置的上游或下游(如從1到3、5-10，直到15個(gè)核苷酸或更靠近5'或3'的位置處)，構(gòu)建或消除現(xiàn)有的順式作用元件。除了單和多點(diǎn)突變和位點(diǎn)特異性突變，此處公布的人-牛嵌合PIV的變化包括一或多個(gè)基因或基因組區(qū)段的缺失、插入、替代或重排。包含一或多個(gè)基因或基因組區(qū)段的缺失尤其有用，這種缺失可產(chǎn)生調(diào)整本發(fā)明人-牛嵌合PIV特性的額外的期望的表型效果。因此，1999年7月9日美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/350,821(Durbin等)說(shuō)明了其方法和組合物，改變PIV基因或基因組，使其具有改變起始密碼子編碼性排列的突變，或引入一或多個(gè)終止密碼子的突變，導(dǎo)致一或多個(gè)HPIV基因(以C、D和/或VORF為例)的表達(dá)被降低或消除。或者，可以整體或部分缺失一或多個(gè)C、D和/或VORF，使相應(yīng)的蛋白部分或全部地失去功能，或破壞蛋白表達(dá)。在C、D和/或V或其它非必須基因處有突變的重組PIV具有發(fā)展疫苗的良好表型特征。例如，這些修飾可導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)表型變化，包括(i)細(xì)胞培養(yǎng)中改變的生長(zhǎng)特性，(ii)哺乳動(dòng)物上和/或下呼吸道中減毒，(iii)病毒噬菌斑大小改變，(iv)致細(xì)胞病變效應(yīng)改變，(v)免疫原性改變。一個(gè)命名為rC-KO的缺乏CORF表達(dá)的模式"剔除"突變體可在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中誘導(dǎo)抗野生型HPIV3攻擊的保護(hù)性免疫應(yīng)答，同時(shí)具有良好的減毒表型。因此，本發(fā)明更詳細(xì)方面中，人-牛嵌合PIV具有在C、D和/或VORF中的缺失和剔除突變，其改變或消除了被選定基因或基因組區(qū)段的表達(dá)。其實(shí)現(xiàn)可通過(guò)在被選定編碼序列中引入移碼突變或終止密碼子，改變翻譯起始位點(diǎn)，改變基因位置或引入上游起始密碼子以改變其表達(dá)速率，改變GS和/或GE轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以變化表型，或改變RNA編輯位點(diǎn)(如生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄的溫度限制等)。本發(fā)明更詳細(xì)方面中提供了這種人-牛嵌合PIV，其中在翻譯讀碼框中引入多個(gè)翻譯終止密碼子，改變起始密碼子，或改變了編輯位點(diǎn)，使在該基因或基因組區(qū)段沒(méi)有缺失情況下，其中一個(gè)或多個(gè)基因(如C、D和/或VORF)的表達(dá)在翻譯或轉(zhuǎn)錄水平被消除。這種形式的剔除病毒在組織培養(yǎng)中常出現(xiàn)生長(zhǎng)速率下降和小噬菌斑。因此，這些方法提供了其它新的減毒突變類(lèi)型，即消除非主要病毒保護(hù)性抗原的病毒基因的表達(dá)。文中，在沒(méi)有缺失基因或基因組區(qū)段時(shí)產(chǎn)生的剔除病毒表型，也可通過(guò)誘發(fā)缺失突變而產(chǎn)生，以有效的防止可能導(dǎo)致靶蛋白表達(dá)恢復(fù)的糾正性突變。利用本領(lǐng)域業(yè)內(nèi)人士已知的設(shè)計(jì)和方法可以獲得幾種其它C、D和/或VORF缺失的基因剔除和剔除突變體(如Kretschmer等，Virology216:309-316.1996;Radecke等，Virology217:418-421,1996;Kato等，1987a,同上；Schneider等，1997，同上；分別在此引用作為參考)?；谧兓奶攸c(diǎn)(即，可能改變少量堿基以插入或消除一個(gè)免疫原性表位或改變一個(gè)小基因組區(qū)段，而大片段的堿基參與基因或大的基因組區(qū)段的添加、替代、缺失或重排)，人-牛嵌合PIV的這些和其它核苷酸修飾可以改動(dòng)供體或受體基因組或反基因組中少量堿基(如，從15-30個(gè)堿基，到35-50個(gè)堿基或更多)，大片段的核苷酸(如，從50-100，100-300，300-500，500-1000個(gè)堿基或更多)，或幾乎全部或全部基因(如，1000-1500，1500-2500，2500-5000個(gè)核苷酸或更多)。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了來(lái)自生物學(xué)來(lái)源的PIV的突變(如cp和ts突變)附加于重組PIV克隆中，在這進(jìn)一步修飾的PIV克隆中伴隨有涉及相同或不同基因的其它類(lèi)型突變。每個(gè)PIV基因的表達(dá)水平可被選擇性的改變，或整體或部分地，單獨(dú)地或與其他所希望的修飾組合，添加、替代或重排基因，以獲得表現(xiàn)新的疫苗特征的人-牛嵌合PIV。因此，除了來(lái)自生物學(xué)來(lái)源的PIV突變體的減毒突變外，或與之組合，本發(fā)明也提供了利用對(duì)感染性PIV克隆的重組工程的多種減毒或改變?nèi)?牛嵌合PIV表型的其它方法。編碼靶基因或基因組區(qū)段(包括嵌合PIV基因組或反基因組中的供體或受體)的分離的多核苷酸序列上可產(chǎn)生多種改變，以引入感染性克隆。更特定的，本發(fā)明為了在重組PIV中獲得期望的結(jié)構(gòu)和表型改變，許可引入使一個(gè)或多個(gè)選自親本基因組或反基因組的核苷酸的缺失、替代、引入或重排的修飾，以及缺失、替代、引入或重排人-牛嵌合PIV克隆內(nèi)整個(gè)基因或基因組區(qū)段的突變。因此提供了人-牛嵌合PIV中僅改變或消除選定基因表達(dá)的修飾，包括，在選定PIV的編碼序列中引入終止子，或改變其翻譯起始位點(diǎn)或RNA編輯位點(diǎn)，改變一個(gè)PIV基因與可操作連接啟動(dòng)子的相對(duì)位置，引入上游起始密碼子以改變其表達(dá)速率，修飾(如，通過(guò)改變位置、變動(dòng)現(xiàn)有序列或用一個(gè)異源序列替代現(xiàn)有序列)GS和/或GE轉(zhuǎn)錄信號(hào)以改變其表型(如生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)錄時(shí)的溫度限制等)，和其它特異于病毒復(fù)制、選定基因的轉(zhuǎn)錄或選定RNA的翻譯的變化程度和性質(zhì)的缺失、替代、添加和重排。文中，任何非生長(zhǎng)所必須的PIV基因或基因組區(qū)段都可以在重組PIV中被消除或改變，以在毒性、病原性、免疫原性和其它表型特征產(chǎn)生期望的效果。對(duì)于編碼序列，非編碼、前導(dǎo)、非轉(zhuǎn)錄尾和基因間隔區(qū)也可同樣被缺失、替代或改變，其表型效果可使用如微復(fù)制子和重組PIV容易地分析。此外，PIV基因組或反基因組中也可產(chǎn)生許多其它遺傳改變，以單獨(dú)或與生物學(xué)來(lái)源的突變PIV來(lái)源的一個(gè)或多個(gè)減毒突變一起，引入人-牛嵌合PIV，調(diào)整其生長(zhǎng)、減毒、免疫原性、遺傳穩(wěn)定性，或其它有利的結(jié)構(gòu)和/或表性效果。前述的引用文獻(xiàn)中也公布了這些其它類(lèi)型的突變，且其可容易地工程化引入本發(fā)明人-牛嵌合PIV。除了這些改變，也可改變?nèi)?牛嵌合PIV中基因的排序，PIV基因組的一個(gè)啟動(dòng)子被其反基因組的對(duì)應(yīng)部分替代，部分基因被替代或移去，甚至整個(gè)基因缺失。制造序列中不同的或額外的改變以有利于操作，如在多個(gè)基因間隔區(qū)等處插入唯一的限制性位點(diǎn)。可以除去不翻譯的基因以增加插入外源序列的能力。引入本發(fā)明人-牛嵌合PIV中的其它突變包括直接作用于順式作用信號(hào)的突變，這可以利用PIV微基因組突變分析檢測(cè)出。例如對(duì)前導(dǎo)序列、非轉(zhuǎn)錄尾序列和側(cè)翼序列的插入和缺失分析檢測(cè)出病毒的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄信號(hào)，并提供了一系列與RNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄下降的各種水平相關(guān)的突變。該順式作用信號(hào)的飽和誘變(每個(gè)位點(diǎn)輪流改為各種核苷酸)也檢測(cè)出許多影響RNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的突變。此處所述任何突變都可插入人-牛嵌合PIV基因組或反基因組中。以上引用文獻(xiàn)中描述的PIV微基因組可輔助用完整的反基因組cDNA對(duì)反式作用蛋白和順式作用RNA序列的評(píng)價(jià)和操作。本發(fā)明人-牛嵌合PIV中的其它突變包括基因組3'末端被其反基因組的對(duì)應(yīng)部分替代，隨之改變了RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。一個(gè)模式實(shí)施方案中，特定PIV蛋白(如保護(hù)性HN禾口/或F抗原)的表達(dá)水平可因其天然序列被用合成并設(shè)計(jì)的符合有效翻譯的序列替代而增加。文中顯示，密碼子的使用是哺乳動(dòng)物病毒蛋白翻譯水平的主要影響因素(Hans等,CurrentBiol.6:315-324，1996，在此引用作為參考)。通過(guò)重組，使編碼PIVHN和F蛋白(二者是主要保護(hù)性抗原)的mRNA中使用的密碼子最適，可使這些基因的表達(dá)增加。另一個(gè)模式實(shí)施方案中，改變了一個(gè)選定PIV基因的翻譯起始位點(diǎn)(優(yōu)選包括-3位置處的核苷酸)周?chē)男蛄?單獨(dú)或同時(shí)引入一上游起始密碼子)，因決定翻譯的上/下調(diào)而改變了PIV基因的表達(dá)(Kozak等，LMol.Biol.196:947-950,1987)。另外，或與此處所述的其它變動(dòng)組合，改變病毒任何選定基因的轉(zhuǎn)錄GS或GE信號(hào)，調(diào)節(jié)人-牛嵌合PIV的基因表達(dá)。其它模式實(shí)施方案中，人-牛嵌合PIV的基因表達(dá)調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。一個(gè)方面中，將PIV基因圖譜中選定基因的位置改為更為接近或遠(yuǎn)離啟動(dòng)子，從而該基因的表達(dá)將分別更高效或更低效。根據(jù)這方面，特定基因的表達(dá)調(diào)節(jié)產(chǎn)生比野生型水平降低或增加2倍，更典型的是4倍，上至IO倍或更高的基因表達(dá)，同時(shí)其交互地位置替代基因表達(dá)水平有相當(dāng)量的下降。這些和其他轉(zhuǎn)位變化，產(chǎn)生具有減毒表型的新的人-牛嵌合PIV，如由于參與RNA復(fù)制的選定病毒蛋白表達(dá)的下降，或產(chǎn)生具有如抗原表達(dá)增加之類(lèi)的其它期望性狀的嵌合PIV。本發(fā)明感染性人-牛嵌合PIV也可根據(jù)這里公布的方法和組合物進(jìn)行工程化，增強(qiáng)免疫原性并誘導(dǎo)比野生型PIV或親本PIV感染的更強(qiáng)的保護(hù)。例如，PIV異源株或型源的或如RSV的非PIV來(lái)源的免疫原性表位可通過(guò)在編碼基因組或反基因組的多核苷酸序列上適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓患尤胫亟M克隆。另外，本發(fā)明重組PIV可被工程化地加入或消除(如通過(guò)氨基酸插入、替代或缺失)免疫原、蛋白結(jié)構(gòu)域或與期望或不期望免疫反應(yīng)相關(guān)的特殊蛋白形式。本發(fā)明方法中，額外的基因或基因組區(qū)段可能被插入人-牛嵌合PIV基因組或反基因組中，或其附近。這些基因可與受體基因受相同的調(diào)控，或受一套獨(dú)立轉(zhuǎn)錄信號(hào)的調(diào)控。目的基因包括以上說(shuō)明的PIV基因和非PIV基因。目的非PIV基因包括編碼細(xì)胞因子(如IL-2到IL-18，尤其是IL-2、IL-6、IL-12、IL-18等)，IL-7和富含在T輔助細(xì)胞表位中的蛋白的基因。這些額外的蛋白可作為獨(dú)立蛋白或現(xiàn)存PIV蛋白(如HN或F)的多余拷貝表達(dá)。這能夠在數(shù)量和質(zhì)量上改變和提高抗PIV的免疫應(yīng)答。人-牛嵌合PIV中缺失、插入、替代和其它涉及全部病毒基因或基因組區(qū)段的改變產(chǎn)生非常穩(wěn)定的候選疫苗，在免疫抑制個(gè)體中尤其重要。這些改變多數(shù)導(dǎo)致減毒的疫苗株，其它則導(dǎo)致不同類(lèi)型的期望表型改變。例如，附屬(非體外生長(zhǎng)所必須的)基因編碼特異地干擾宿主免疫的蛋白，是良好的候選疫苗(參見(jiàn)Kato等，1997a，同上)。疫苗病毒中消除這類(lèi)基因?qū)⒔档投拘院椭虏⌒裕?或提高免疫原性。本發(fā)明其它方面中，提供了生產(chǎn)分離的感染性PIV的組合物(如具有編碼人-牛嵌合PIV的cDNA的分離多核苷酸和載體)。利用該組合物和方法，感染性PIV來(lái)自一個(gè)PIV基因組或反基因組，核殼蛋白(N)，核殼磷蛋白(P)和大的聚合酶蛋白(L)。本發(fā)明相關(guān)方面中，提供了將前述結(jié)構(gòu)表型改變引入重組PIV中，以產(chǎn)生感染性減毒的疫苗病毒的方法和組合物?？衫枚喾N已知方法，將之前定義的突變引入感染性人-牛嵌合PIV克隆中。關(guān)于DNA的"感染性克隆"，是指合成或其它來(lái)源的cDNA及其產(chǎn)物，可轉(zhuǎn)錄出作為產(chǎn)生感染性病毒或病毒顆?；蚪M的模板的基因組或反基因組RNA。因此，可以利用傳統(tǒng)方式(例如定點(diǎn)誘變)將定義的突變引入基因組或反基因組的cDNA拷貝。使用基因組或反基因組cDNA的亞片段裝配此處所述的完整基因組或反基因組cDNA的優(yōu)勢(shì)是，每個(gè)區(qū)域都可以分別操作(越小的cDNA越易裝配)，因此易于裝配出完整cDNA。因此，該完整基因組或反基因組cDNA,或其任何亞片段可用作寡核苷酸定向突變的模板。通過(guò)單鏈?zhǔn)删Ｐ问浇閷?dǎo)(如使用伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室(Richmond，CA)的Muta-gene試劑盒)，或直接用雙鏈?zhǔn)删Ｗ瞿０?如使用Strategene(LaJolla，CA)的Chameleon誘變?cè)噭┖?，或用包含目的突變的寡核苷酸引物或模板中任何的一個(gè)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。然后可以將一個(gè)突變的亞片段裝配于該完整基因組或反基因組cDNA中。還有許多已知并可得的產(chǎn)生突變的技術(shù)，可用于在PIV基因組或反基因組cDNA中產(chǎn)生目的突變。突變范圍不一，可以從單核苷酸改變到包含一個(gè)或多個(gè)基因或基因組區(qū)段的大cDNA片段的替代。因此，在一個(gè)作為范例的實(shí)施方案中，利用伯樂(lè)的Muta-gene噬菌粒體外誘變?cè)噭┖幸胪蛔儭：?jiǎn)述如下，編碼PIV基因組或反基因組一部分的cDNA克隆在質(zhì)粒pTZ18U中，并轉(zhuǎn)化CJ236細(xì)胞(LifeTechnologies)。按生產(chǎn)商的建議制備噬菌粒制劑。通過(guò)在該基因組或反基因組的需要位點(diǎn)引入一個(gè)改變的核苷酸，設(shè)計(jì)出用于誘發(fā)突變的寡核苷酸。擴(kuò)增帶有遺傳改變的基因組或反基因組片段的質(zhì)粒，突變片段被重新引入該全長(zhǎng)基因組或反基因組克隆。本發(fā)明感染性PIV的產(chǎn)生是通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，共表達(dá)產(chǎn)生編碼PIV基因組或反基因組RNA的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)分離的多核苷酸分子以及在產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄復(fù)制核殼中必須的病毒蛋白的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸分子。用于共表達(dá)產(chǎn)生感染性PIV的病毒蛋白包括主要核殼蛋白(N)、核殼磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶糖蛋白(HN)和基質(zhì)蛋白(M)。PIVC、D和VORF的產(chǎn)物也可用于該目的。構(gòu)建編碼PIV基因組或反基因組的cDNA，使其與必須的病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)或體外共表達(dá)以形成感染性PIV。"PIV反基因組"是指作為子代PIV基因組合成模板的分離的正義多核苷酸分子。優(yōu)選，構(gòu)建的cDNA是相應(yīng)于復(fù)制中間體RNA的正義PIV基因組或反基因組，以降低其與編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄復(fù)制核殼所必須的蛋白的互補(bǔ)序列的正義轉(zhuǎn)錄本雜交的可能。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，重組PIV(rPIV)基因組或反基因組僅需要包含對(duì)該病毒或亞病毒顆粒的感染性所必須的基因或其部分。此外，該基因或其部分可以多于一種多核苷酸分子形，式提供，即，一個(gè)基因可以通過(guò)互補(bǔ)或類(lèi)似方法來(lái)源于單獨(dú)的核苷酸分子。其它實(shí)施方案中，PIV基因組或反基因組編碼病毒生長(zhǎng)、復(fù)制和感染的所有功能，而無(wú)需輔助病毒，或質(zhì)?；蜉o助細(xì)胞系提供的病毒功能的參與。"重組PIV"是指一種PIV或PIV類(lèi)的病毒或亞病毒顆粒，其直接或間接來(lái)自一個(gè)重組表達(dá)系統(tǒng)，或從重組表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的病毒或亞病毒顆粒中增殖產(chǎn)生。該重組表達(dá)系統(tǒng)包含一個(gè)可操作地連接的轉(zhuǎn)錄單位的重組表達(dá)載體，該轉(zhuǎn)錄單位具有至少一個(gè)對(duì)PIV基因表達(dá)有調(diào)控作用的遺傳元件，如啟動(dòng)子、一個(gè)可轉(zhuǎn)錄為PIVRNA的結(jié)構(gòu)或編碼序列，以及合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。為了從表達(dá)cDNA的PIV基因組或反基因組中獲得感染性PIV，將該基因組或反基因組與那些在以下情況中必須的PIVN、P和L蛋白共表達(dá)，這些情況包括(i)產(chǎn)生可進(jìn)行RNA復(fù)制的核殼；(ii)使子代核殼可進(jìn)行RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。這種基因組核殼的轉(zhuǎn)錄提供了其它PIV蛋白，并引發(fā)有效感染。另外，共表達(dá)也可提供有效感染所需的其它PIV蛋白。PIV基因組或反基因組與上述病毒蛋白的共同合成也可在體外實(shí)現(xiàn)(無(wú)細(xì)胞系統(tǒng))，如利用組合的轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)，再轉(zhuǎn)染細(xì)胞。另外，RNA基因組或反基因組也可在體外獲得，并轉(zhuǎn)染表達(dá)PIV蛋白的細(xì)胞。本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，編碼生產(chǎn)可轉(zhuǎn)錄和翻譯的核殼中必須蛋白的互補(bǔ)序列由一個(gè)或多個(gè)輔助病毒提供。輔助病毒可以是野生型或突變型。優(yōu)選，該輔助病毒與PIVcDNA編碼的病毒在表型上可區(qū)分。例如，希望提供與該輔助病毒免疫反應(yīng)，而不與PIVcDNA編碼的病毒反應(yīng)的單克隆抗體。這些抗體可以是中和抗體。一些實(shí)施方案中，可使用抗體親和層析，將輔助病毒從重組病毒中分離?？蓪⑼蛔円隤IVcDNA(如在HN或F糖蛋白基因中)，提供與該輔助病毒的抗原性差異，有助于這類(lèi)抗體的獲得(Procurement)。本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，N、P、L或其它期望的PIV蛋白由一個(gè)或多個(gè)非病毒表達(dá)載體編碼，其可以與編碼基因組或反基因組的表達(dá)載體相同或不同。也可根據(jù)需要包括其它蛋白，各由自己的載體編碼，或由編碼N、P、L和其它期望的PIV蛋白中的一個(gè)或多個(gè)或完整基因組或反基因組的載體編碼。由轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的基因組或反基因組和蛋白表達(dá)由T7RNA聚合酶啟動(dòng)子控制下的各個(gè)cDNA產(chǎn)生，而該T7RNA聚合酶啟動(dòng)子是由T7RNA聚合酶表達(dá)系統(tǒng)(如表達(dá)T7RNA聚合酶的痘苗病毒MVA株重組子)的感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)提供的(Wyatt等，Virology210:202-205,1995，在此全文引用作為參考)?？赏ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞或成熟RNA或蛋白的轉(zhuǎn)染獲得該病毒蛋白和/或T7RNA聚合酶。構(gòu)建用于本發(fā)明的PIV反基因組，例如通過(guò)排列克隆的cDNA區(qū)段(其集合代表了完整的反基因組)，PIVmRNA或基因組RNA反轉(zhuǎn)錄拷貝的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR述于美國(guó)專(zhuān)利4,683,195和4，683，202中和PCR方案:方法和應(yīng)用指導(dǎo)(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications)，Innis等，學(xué)術(shù)出版社，SanDiego，1990，分別在此全文引用作為參考)或同類(lèi)。例如，得到的第一構(gòu)建體包含具有始于合適的啟動(dòng)子(如T7RNA聚合酶啟動(dòng)子)的反基因組左臂末端的cDNA，該構(gòu)建體在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中裝配，如質(zhì)粒、裝配型質(zhì)粒、噬菌體或DNA病毒載體。載體可通過(guò)誘變和/或合成多連接體的插入而改變，這種多連接體帶有便于裝配的唯一的限制性位點(diǎn)。N、P、L或其它期望的PIV蛋白可裝配于一個(gè)或多個(gè)載體上以便于制備。反基因組質(zhì)粒右臂末端可包含需要的其它序列，如側(cè)翼的核酶和串聯(lián)的T7轉(zhuǎn)錄終止子。核酶可以是錘頭狀的(產(chǎn)生具有單個(gè)非病毒核苷酸的3'末端)(如Grosfeld等,J.Virol.69:5677-5686,1995)，也可以是任何其它適合的核酶(如S肝炎病毒的核酶，產(chǎn)生沒(méi)有非PIV核苷酸的3'末端)(Perrotts等，Nature350:434-436.1995，在此全文引用作為參考)。左手和右手末端經(jīng)共同的限制位點(diǎn)相連。cDNA構(gòu)建過(guò)程中或構(gòu)建完成后，可在PIV基因組或反基因組中進(jìn)行多種核苷酸的插入、缺失和重排。例如，可以合成特定需要的核苷酸序列，利用方便的限制性位點(diǎn)插入cDNA的合適區(qū)域?；蛘呖墒褂萌缥稽c(diǎn)特異性誘變、丙氨酸掃描、PCR誘變或其它本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)將突變引入cDNA。構(gòu)建編碼基因組或反基因組cDNA的其它方法，包括利用改進(jìn)的PCR條件以使亞單位cDNA成分降低至一或兩個(gè)的(如，在Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:5695-5699,1994中所述的，在此引用作為參考)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。其它實(shí)施方案中使用不同的啟動(dòng)子(如T3，SP6)或不同的核酶(如S肝炎病毒的核酶)。增殖可使用不同的DNA載體(如裝配型質(zhì)粒)，以更能容納大的基因組或反基因組。編碼基因組或反基因組的分離的多核苷酸(如cDNA)通過(guò)轉(zhuǎn)染、電穿孔、機(jī)械插入、轉(zhuǎn)導(dǎo)或其它類(lèi)似方式插入合適的宿主，轉(zhuǎn)染細(xì)胞是能夠支持有效PIV感染的，如HEp-2、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。分離多核苷酸序列的轉(zhuǎn)染可通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，體14:725，1978;Corsaro禾卩Pearson,SomaticCellGenetics2:603，1981;Graham禾卩VanderEb,VirologyH:456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBOJ.1:841-845,1982)、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等編輯,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.,NewYork,1987)、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Hawley-Nelson等,Focus15:73-79,1993)或商業(yè)化試劑如LipofectACE(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)或其它同類(lèi)物，引入培養(yǎng)細(xì)胞中(上述文獻(xiàn)在此全文引用作為參考)。如上所述，本發(fā)明一些實(shí)施方案中，N、P、L和其它期望的PIV蛋白由一個(gè)或多個(gè)輔助病毒編碼，這種輔助病毒在表型上與編碼基因組或反基因組的無(wú)顯著差異。N、P、L和其它期望的PIV蛋白也可以由一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體編碼，這種表達(dá)載體與編碼該基因組或反基因組的載體或其各種組合相同或不同。也可根據(jù)需要包括其它蛋白，各由自己的載體編碼，或由編碼N、P、L或其它期望的PIV蛋白或完整基因組或反基因組的載體編碼。通過(guò)提供感染性PIV克隆，本發(fā)明允許在PIV基因組(或反基因組)中重組產(chǎn)生廣泛的改變，使得到?jīng)Q定期望表型改變的確定的突變。"感染性克隆"是指合成的或其它方式產(chǎn)生的可以直接進(jìn)入感染性毒粒的cDNA或其產(chǎn)物RNA，而該感染性毒?？梢赞D(zhuǎn)錄成作為感染性病毒或亞病毒顆粒模板的基因組或反基因組RNA。如上所述，許多常規(guī)方法(如定點(diǎn)誘變)可將特定的突變引入基因組或反基因組的CDNA拷貝中。此處所述用基因組或反基因組cDNA亞片段裝配全基因組或反基因組cDNA的優(yōu)點(diǎn)在于，每個(gè)區(qū)域都可以分別操作，小的cDNA比大的cDNA容易操作，并容易裝配出全長(zhǎng)的cDNA。因此，全基因組或反基因組cDNA，或其選擇的亞片段可用作寡核苷酸定點(diǎn)誘變的模板。這可通過(guò)單鏈?zhǔn)删Ｐ问浇閷?dǎo)(如使用伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室(Richmond，CA)的MUTA-gene試劑盒)，或直接用雙鏈?zhǔn)删Ｗ瞿０?如使用Strategene(LaJolla，CA)的Chameleon⑤誘變?cè)噭┖?，或用包含目的突變的寡核苷酸引物或模板中任何一個(gè)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。然后可以將一個(gè)突變的亞片段裝配于該完整基因組或反基因組cDNA中。還有許多已知并可得的產(chǎn)生突變的技術(shù)，可用于在本發(fā)明PIV基因組或反基因組cDNA中產(chǎn)生目的突變。因此，在一個(gè)作為范例的實(shí)施方案中，突變利用伯樂(lè)的^4171八^61^@噬菌粒體外誘變?cè)噭┖幸?。?jiǎn)述如下，編碼PIV基因組或反基因組的cDNA克隆在質(zhì)粒pTZ18U中，并轉(zhuǎn)化CJ236細(xì)胞(LifeTechnologies)。按生產(chǎn)商的建議制備噬菌粒制劑。通過(guò)在該基因組或反基因組的需要位點(diǎn)引入一個(gè)改變的核苷酸，設(shè)計(jì)出用于誘發(fā)突變的寡核苷酸。擴(kuò)增帶有遺傳改變的基因組或反基因組的質(zhì)粒。突變范圍可以從單核苷酸改變到具有一個(gè)或多個(gè)基因或基因組區(qū)段的大cDNA片段的引入、插入或缺失。基因組區(qū)段可能相應(yīng)于結(jié)構(gòu)和/或功能域(如蛋白的胞質(zhì)內(nèi)、跨膜或胞外域)、活性位點(diǎn)(如介導(dǎo)與其它蛋白結(jié)合或其它相互作用的位點(diǎn))、表位(如刺激抗體結(jié)合和/或體液或細(xì)胞免疫的位點(diǎn))等。這方面有用的基因組區(qū)段范圍從當(dāng)基因組區(qū)段編碼小的蛋白功能域(如表位)時(shí)的約15-35個(gè)核苷酸，至約50、75、100、200-500和500-1500個(gè)或更多核苷酸。在感染性PIV中引入特定突變的能力有許多應(yīng)用，包括對(duì)PIV病原和免疫原機(jī)構(gòu)的操作。例如PIV蛋白(包括N、P、M、F、HN、L和C、D、VORF)的功能可通過(guò)引入消除或降低蛋白表達(dá)水平或產(chǎn)生突變蛋白的突變進(jìn)行操作。各種基因組RNA的結(jié)構(gòu)特征，如啟動(dòng)子、基因間隔區(qū)和轉(zhuǎn)錄信號(hào)，也可用本發(fā)明的方法和組合物常規(guī)的操作。反式作用蛋白和順式作用RNA序列的效果也容易確定，例如用全反基因組cDNA，在平行分析中利用PIV小基因組(Dimock等，J.Virol.化:2772-2778，1993，在此全文引用作為參考)，其依賴(lài)拯救的狀態(tài)可用于定性那些在獨(dú)立復(fù)制的感染性病毒中過(guò)強(qiáng)的抑制使其難以回收的突變體。本發(fā)明重組PIV內(nèi)基因或基因組區(qū)段的某些替代、插入、缺失或重排(如編碼選定蛋白或蛋白區(qū)域的基因組區(qū)段替代，如編碼胞質(zhì)尾、跨膜區(qū)或胞外域、表位或區(qū)域、結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)域、活性位點(diǎn)或具有活性位點(diǎn)的區(qū)域等)在結(jié)構(gòu)和功能上，與來(lái)自相同或不同PIV或其它來(lái)源的現(xiàn)有"對(duì)應(yīng)"基因或基因組區(qū)段相關(guān)。與野生型或親本PIV或其它病毒株相比，一些改變產(chǎn)生了具有期望表型變化的新重組子。例如，這類(lèi)重組子可能表達(dá)一個(gè)PIV的胞質(zhì)尾和/或跨膜區(qū)與另一個(gè)PIV的胞外域融合的嵌合蛋白。這類(lèi)重組子的其它范例表達(dá)重復(fù)蛋白區(qū)域，如表達(dá)重復(fù)免疫原區(qū)域。此處所述"對(duì)應(yīng)"基因、基因組區(qū)段、蛋白或蛋白區(qū)域，典型的是異源來(lái)源的(如來(lái)自不同的PIV基因，或代表不同PIV型或株中的相同(即，同源或等位)基因或基因組區(qū)段)。文中選擇的典型的對(duì)應(yīng)物具有總的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如每個(gè)對(duì)應(yīng)物可能編碼一個(gè)相當(dāng)?shù)牡鞍谆虻鞍讌^(qū)，如胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外域、結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)域、表位或區(qū)域等。對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域和其編碼基因組區(qū)段包含許多種的集合，其具有由不同結(jié)構(gòu)域或基因組區(qū)段間相同生物活性所限定的不同大小和序列。用于產(chǎn)生本發(fā)明重組PIV的對(duì)應(yīng)基因和基因組區(qū)段，以及這里公布的其它多核苷酸，常與被選擇的多核苷酸"參照"序列(如其它選擇的對(duì)應(yīng)序列)具有基本同一性。此處所述"參照序列"是指用作序列比較的已定義的序列，例如全長(zhǎng)CDNA的一個(gè)區(qū)段或基因，或一個(gè)完整的cDNA或基因序列。一般參照序列至少為20個(gè)核苷酸以上，經(jīng)常是25個(gè)核苷酸以上，更多為50個(gè)核苷酸以上。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸可能(l)各具有一個(gè)彼此相似的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)進(jìn)一步各包含二者間的差異序列，典型的兩個(gè)(或更多)多核苷酸的序列比較是通過(guò)在"對(duì)比窗"上對(duì)比兩個(gè)多核苷酸的序列，以發(fā)現(xiàn)并比較序列相似的局部區(qū)域。此處所述"對(duì)比窗"是指至少20個(gè)連續(xù)核苷酸位置的概念性區(qū)段，其中一個(gè)多核苷酸序列可以與至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的一個(gè)參照序列相比較，并且與參照序列(不含有添加或缺失)相比較，其中該多核苷酸序列在對(duì)比窗的部分，可能包括對(duì)兩序列的最優(yōu)對(duì)比時(shí)20%或更少的添加或缺失(即間隙)。排列對(duì)比窗的序列的最優(yōu)對(duì)比可通過(guò)以下方法進(jìn)行Smith和Waterman的局部同源算法(Adv.Appl.Math.2:482.1981;在此引用作為參考)，禾PNeedleman&Wunsch的同源排列算法(J.Mol.Biol.48:443,1970;在此引用作為參考)，對(duì)Pearson&1^11^11相似性搜索方法(￡12^Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988:在此引用作為參考)，以及這些算法的計(jì)算機(jī)應(yīng)用(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI,在此引用作為參考)，或通過(guò)檢査，選擇出這多種方法產(chǎn)生的最佳對(duì)比(即，對(duì)比窗上序列相似性最高)。術(shù)語(yǔ)"序列同一性"指對(duì)比窗上兩個(gè)多核苷酸序列相同(核苷酸逐個(gè)比較)。術(shù)語(yǔ)"序列同一性百分比"是比較對(duì)比窗上兩個(gè)最優(yōu)對(duì)比的序列，確定存在于兩序列中的一致核酸堿基(如A、T、C、G、U或I)，以產(chǎn)生相符位點(diǎn)的數(shù)量，用相符位點(diǎn)的數(shù)量除以對(duì)比窗中位點(diǎn)的總數(shù)(即窗的大小)，結(jié)果乘以100得到序列同一性百分比。此處所述術(shù)語(yǔ)"基本同一性"指一個(gè)多核苷酸序列的特征，其中該多核苷酸序列與參照序列在至少20個(gè)核苷酸的對(duì)比窗，經(jīng)常是在至少25-50個(gè)核苷酸的對(duì)比窗中比較，具有至少85%的序列同一性，優(yōu)選至少90%-95%的序列同一性，更多的是至少99%的序列同一性，序列同一性百分比的計(jì)算是通過(guò)在對(duì)比窗上，比較參照序列和可能包括總共20%或更少的該參照序列的缺失或添加的多核苷酸序列而計(jì)算得出的。該參照序列可能是一個(gè)大序列的一個(gè)子集。除了這些多核苷酸序列關(guān)系，本發(fā)明重組PIV編碼的蛋白和蛋白區(qū)域也典型的選擇具有保守性關(guān)系，即，與選擇的參照多肽具有基本的序列同一性或序列相似性。當(dāng)用于多肽，術(shù)語(yǔ)"序列同一性"指肽在相應(yīng)位置上具有相同氨基酸。術(shù)語(yǔ)"序列相似性"指肽在相應(yīng)位置上具有相同或相似氨基酸。術(shù)語(yǔ)"基本同一性"指兩個(gè)肽序列，當(dāng)最優(yōu)排列時(shí)(如用程序GAP或BESTFIT)，具有至少80%的序列同一性，優(yōu)選至少90%的序列同一性，更優(yōu)選的是至少95%的序列同一性或更高(如99%的序列同一性)。術(shù)語(yǔ)"基本相似性"指兩個(gè)肽序列的序列相似百分比相當(dāng)。優(yōu)選的，不一致的殘基位點(diǎn)因保守氨基酸替代而差異。保守氨基酸替代是指具有相似側(cè)鏈的殘基可互換。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸、甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴(lài)氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。此處對(duì)氨基酸的簡(jiǎn)寫(xiě)依據(jù)傳統(tǒng)用法(Immunology-ASynthesis,第二版，E.S.Golub&D.R.Gren編輯，Si羅erAssociates,Sunderland,MA,1991，在此弓l用作為參考)。這20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)、非天然氨基酸(如a，a-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規(guī)氨基酸也是本發(fā)明多肽的合適成分。非常規(guī)氨基酸包括4-羥脯氨酸、7-羧基谷氨酸、e-N,N,N-三甲基賴(lài)氨酸、e-N-乙酰賴(lài)氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴(lài)氨酸、co-N-甲基精氨酸，以及其它相似氨基酸和亞氨基酸(如4-羥脯氨酸)。此外，氨基酸還可以經(jīng)糖基化和磷酸化等修飾。根據(jù)本發(fā)明選擇候選疫苗病毒時(shí)，用已知的方法決定活性、減毒性和免疫原性的標(biāo)準(zhǔn)。最希望用于本發(fā)明疫苗的病毒必須有活性，穩(wěn)定的減毒表型，在免疫宿主體內(nèi)有復(fù)制(即使水平低)，并在受接種者中有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，足以賦予對(duì)抗之后野生型病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重疾病的保護(hù)性。本發(fā)明重組PIV不僅是有活性，比先前的候選疫苗更適合地減毒的，而且在體內(nèi)遺傳上更穩(wěn)定一仍具有剌激保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力，同時(shí)，因多處修飾的存在可將這種保護(hù)擴(kuò)展，如，誘導(dǎo)抗不同病毒株系或亞型的保護(hù)，或一種不同的免疫基礎(chǔ)賦予其這種擴(kuò)展的保護(hù)，如分泌型與血清型免疫球蛋白，或細(xì)胞免疫，以及其它類(lèi)似情況。本發(fā)明重組PIV可以在多種被熟知并通常認(rèn)可的體內(nèi)和體外模型中檢測(cè)，以確認(rèn)疫苗使用中的足夠減毒、對(duì)表型回復(fù)的抗性和免疫原性。體外分析中，修飾了的病毒被測(cè)試如復(fù)制水平、病毒復(fù)制的溫度敏感性(即tS表型)、小噬菌斑或其它期望的表型。修飾了的病毒進(jìn)一步在PIV感染的動(dòng)物模型中測(cè)試。在此引用的各種文獻(xiàn)中描述了多種動(dòng)物模型。評(píng)價(jià)PIV候選疫苗的減毒和免疫原性的PIV模式系統(tǒng)，(包括嚙齒類(lèi)動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類(lèi))，在本領(lǐng)域被廣泛接受，從中獲得的數(shù)據(jù)與人中PIV感染、減毒和免疫原性非常一致。與以上所述一致，本發(fā)明還提供用于疫苗的分離的感染性重組PIV病毒組合物。作為疫苗一個(gè)成分的減毒病毒是經(jīng)分離和(典型的)純化的形式。分離的是指處于非野生型病毒所處的天然環(huán)境的PIV，如處于被感染人的鼻咽處。更常見(jiàn)的，分離的是指包括該減毒病毒為細(xì)胞培養(yǎng)或其它人工培養(yǎng)基的一個(gè)成分，在其中病毒可繁殖，并在控制的背景下定性。例如，本發(fā)明的減毒PIV可在感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生，從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離獲得，并被加入穩(wěn)定劑。本發(fā)明重組PIV可直接用于疫苗制劑中，或根據(jù)需要，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的冷凍干燥方法進(jìn)行冷凍干燥。凍干的病毒典型的保存在約4°C。使用前，凍干的病毒重溶于穩(wěn)定性溶液中(如鹽溶液或包含SPG、Mg+1nHEPES的溶液)，其中也可能存在佐劑，以下將進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明PIV疫苗包含按此處所述方法產(chǎn)生的、具有效致免疫量的PIV作為活性成分。修飾的病毒可與一種生理上可接受的載體和/或佐劑共同引入宿主。本領(lǐng)域已知的載體有水、緩沖的水、0.4%鹽、0.3%甘氨酸，透明質(zhì)酸等。得到的溶液可立即包裝使用，或冷凍干燥，凍干的制劑在給藥之前與無(wú)菌溶液混合，方法如上所述。根據(jù)要求，組合物可能包含藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，使其接近生理狀態(tài)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、滲漲度調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等?？山邮艿淖魟┌ú煌耆ナ献魟?、MPLTM(3-0-去乙酰單磷酸脂質(zhì)A;RIBIImmunoChemResearch,Inc，Hamilton,MT)和IL-2(遺傳研究所，劍橋，MA)，以及其它本領(lǐng)域熟知的合適佐劑。用如上所述的PIV組合物經(jīng)噴霧、滴加、口服、局部或其它途徑免疫后，宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異于PIV病毒蛋白(如F和HN糖蛋白)的抗體作為應(yīng)答。用如上所述的具有有效致免疫量的PIV接種，宿主至少部分或完全地對(duì)PIV的感染免疫，或?qū)p微或嚴(yán)重PIV感染的有抗性，尤其在下呼吸道中。疫苗接種的宿主可以是任何對(duì)PIV或其它近源病毒感染敏感，且對(duì)接種株的抗原產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的動(dòng)物。相應(yīng)的，本發(fā)明提供了制作多種用于人和動(dòng)物的疫苗的方法。包含本發(fā)明PIV的疫苗組合物給藥對(duì)PIV敏感或易受PIV感染攻擊的宿主，以增強(qiáng)該宿主的自身免疫力。這種量是"有效免疫原劑量"。使用中，在有效劑量?jī)?nèi)給藥的PIV精確量依賴(lài)于宿主健康狀態(tài)和體重、給藥方式、制劑性質(zhì)等，但一般范圍是從每個(gè)宿主約103-約107或更多噬菌斑形成單位(pfu)的病毒，常見(jiàn)的是每個(gè)宿主約104-約106噬菌斑形成單位(pfu)的病毒。任何情況時(shí)，疫苗制劑應(yīng)提供足量的本發(fā)明經(jīng)修飾的piv，以有效保護(hù)宿主對(duì)抗嚴(yán)重的或威脅生命的piv感染。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的piv可以和其它piv血清型或株病毒組合，達(dá)到抗多種piv血清型或株的保護(hù)效果。此外，抗多種piv血清型或株的保護(hù)效果也可通過(guò)組合多種血清型或株的保護(hù)性表位于一個(gè)病毒中。典型的，當(dāng)給藥多種病毒時(shí)混合同時(shí)給藥，但也可以分別給藥。一種毒株的免疫可以產(chǎn)生抗同種或不同血清型不同株的保護(hù)。一些情況下，可能希望將本發(fā)明piv疫苗與誘導(dǎo)對(duì)其它藥物(特別是兒童期病毒)保護(hù)性應(yīng)答的疫苗組合使用。本發(fā)明另一些方面中，piv可用作其它病原(如呼吸道合胞病毒RSV或麻疹病毒)保護(hù)性抗原的載體，將編碼這些保護(hù)性抗原的序列引入用來(lái)制造感染性piv的piv基因組或反基因組中(參見(jiàn)，如1999年12月10日Murphy等的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/170,195，在此引用作為參考)。對(duì)所有個(gè)體，重組piv疫苗的精確給藥量以及給藥時(shí)間和重復(fù)性依賴(lài)于宿主健康狀態(tài)和體重、給藥方式、制劑性質(zhì)等，但劑量范圍一般是從每個(gè)患者約103-約1(^或更多噬菌斑形成單位(pfu)的病毒，更常用的是每個(gè)患者約104-約1()spfu的病毒。任何情況時(shí)，疫苗制劑應(yīng)提供足量的減毒piv，以有效刺激或誘導(dǎo)抗piv的免疫應(yīng)答，如可通過(guò)補(bǔ)體活化、噬菌斑中和和/或酶聯(lián)免疫分析，及其它方法進(jìn)行確定。這方面，也需要監(jiān)視個(gè)體是否有上呼吸道疾病出現(xiàn)的跡象和癥狀。對(duì)給藥獼猴，該疫苗的減毒病毒在受接種者鼻咽中的復(fù)制水平，比野生性病毒低約io倍或更低，比不完全減毒piv低約io倍或更低。新生兒和幼兒中，需要多次給藥以誘導(dǎo)足夠水平的免疫。給藥開(kāi)始于出生后第一個(gè)月，兒童期按需要間隔給藥，如隔2個(gè)月，6個(gè)月，1年，2年，以維持對(duì)天然(野生型)piv感染的足夠抗性。相似的，對(duì)重復(fù)性或嚴(yán)重piv感染特別敏感的成人可能需要多次免疫以建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答，包括醫(yī)務(wù)工作者、護(hù)理工作者、家庭中有兒童的成員、老人、心肺功能損壞的個(gè)體。誘導(dǎo)的免疫水平可通過(guò)檢測(cè)中和分泌和血清抗體確定，并需要調(diào)整劑量或重復(fù)接種以維持合適的保護(hù)水平。進(jìn)一步，不同的疫苗病毒給藥不同的受體組。例如，表達(dá)細(xì)胞因子或其它在t細(xì)胞表位中富含的蛋白的工程化piv株可能特別適宜成人，而非幼兒。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的piv疫苗可以組合表達(dá)piv其它亞型或株蛋白的病毒，以產(chǎn)生抗多種piv亞型或株的保護(hù)。或者，該疫苗病毒可以包含工程化引入一個(gè)piv克隆的多種piv亞型或株的保護(hù)性表位。本發(fā)明的piv疫苗誘導(dǎo)抗因后來(lái)感染野生型piv時(shí)產(chǎn)生的嚴(yán)重下呼吸道疾病(如肺炎和細(xì)氣管炎)的免疫應(yīng)答。盡管這種自然循環(huán)的病毒仍有感染性，特別在上呼吸道，其接種導(dǎo)致鼻炎發(fā)病幾率的降低以及對(duì)后來(lái)的野生型感染增強(qiáng)的抗性。接種后，出現(xiàn)可檢測(cè)水平的宿主造成的血清抗體，和可在體外和體內(nèi)中和同源(同一亞型)野生型病毒的分泌性抗體。許多情況下宿主抗體也能中和不同的非疫苗亞型的野生型病毒。本發(fā)明優(yōu)選的piv候選疫苗顯示比在人體內(nèi)自然循環(huán)的野生型病毒顯著降低的毒性。該病毒足夠減毒使感染癥狀在大多數(shù)免疫個(gè)體中不發(fā)生。一些情況時(shí)，該減毒病毒仍然可能分布到未經(jīng)免疫的個(gè)體中。但由于其毒性基本消除，在免疫和偶然宿主中不會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的下呼吸道感染。確定piv候選疫苗的減毒水平可通過(guò)例如量化被免疫宿主呼吸道中的病毒量，并將其與野生型piv或其它被認(rèn)為是候選疫苗株的減毒piv的相應(yīng)量比較。例如，在高度敏感的宿主(如猩猩或獼猴)上呼吸道中，本發(fā)明的減毒病毒復(fù)制與野生型病毒復(fù)制水平相比，被很大程度地限制，如降低10-1000倍。為了進(jìn)一步降低鼻液溢的發(fā)展(其與病毒在上呼吸道中的復(fù)制相關(guān))，一個(gè)理想的候選疫苗病毒應(yīng)表現(xiàn)在上下呼吸道復(fù)制水平都降低的性質(zhì)。但為了賦予免疫個(gè)體保護(hù)，本發(fā)明的減毒病毒應(yīng)在人中有足夠的感染性和免疫原性。確定PIV在感染宿主鼻咽中水平的方法是本領(lǐng)域所熟知的。本發(fā)明疫苗誘導(dǎo)的免疫水平可通過(guò)測(cè)定中和分泌性和血清型抗體的量來(lái)監(jiān)測(cè)?；跈z測(cè)結(jié)果，按需要調(diào)整疫苗劑量或重復(fù)接種，以維持理想水平的保護(hù)。進(jìn)一步，不同的疫苗病毒可能適宜不同的受體組。例如，表達(dá)在T細(xì)胞表位中富含的其它蛋白的工程化PIV株可能特別適宜成人，而非幼兒。本發(fā)明另外的方面中，PIV被用作呼吸道瞬時(shí)基因治療的載體。根據(jù)這一實(shí)施方案，重組PIV基因組或反基因組包含能編碼目的基因產(chǎn)物的序列。該基因產(chǎn)物受與控制PIV表達(dá)相同或不同的啟動(dòng)子控制。通過(guò)共表達(dá)N、P、L或其它需要的PIV蛋白和重組PIV基因組或反基因組來(lái)產(chǎn)生，并編碼目的基因產(chǎn)物的序列，將這樣的感染性PIV給藥患者。給藥一般通過(guò)氣溶膠、噴霧器或其它局部施用，給藥接受治療患者的呼吸道。重組PIV的給藥量應(yīng)足以產(chǎn)生治療或預(yù)防水平的期望的基因產(chǎn)物表達(dá)。這種方法中可給藥的代表性基因產(chǎn)物優(yōu)選適合瞬時(shí)表達(dá)的，如白介素-2、白介素-4、7-干擾素、GM-CSF、G-CSF、紅細(xì)胞生成素以及其它細(xì)胞因子、葡糖腦苷脂酶、苯丙氨酸羥化酶、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞毒素、腫瘤抑制基因、反義RNA和疫苗抗原。以下為說(shuō)明目的提供了一些實(shí)施例，并非是對(duì)其的限制。實(shí)施例1編碼嵌合HPIV3/BPIV3的反基因組cDNA的構(gòu)建和感染性病毒的咴復(fù)以下三個(gè)實(shí)施例研究確定了有助于BPIV3在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中宿主范圍限制的蛋白。該方法是將野生型HPIV3病毒的N蛋白替換為BPIV3上的對(duì)應(yīng)部分。這一替換通過(guò)利用以上所述的反向遺傳系統(tǒng)從cDNA中回收感染性PIV。此研究從BPIV3N開(kāi)始是因?yàn)?，與其它HPIV3和BPIV3蛋白相比，該蛋白具有與其HPIV3對(duì)應(yīng)部分的氨基酸序列適度的差異(參見(jiàn)實(shí)施例1)。構(gòu)建了嵌合的重組病毒，其中HPIV3JS株的N0RF被BPIV3Ka或SF株的替代(圖1)。這些嵌合病毒具有HPIV3親本的HN和F糖蛋白，在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中可誘導(dǎo)對(duì)HPIV3高水平的免疫。兩嵌合病毒被成功獲得。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)都表現(xiàn)高效價(jià)，在獼猴中都表現(xiàn)減毒。因此，N蛋白被認(rèn)為是賦予BPIV3宿主范圍表型的模式蛋白。Ka或SF嵌合重組病毒對(duì)獼猴的免疫誘導(dǎo)對(duì)作為野生型侵入的HPIV3復(fù)制的高水平抗性。因此，本發(fā)明建立了有用的反向遺傳方法，產(chǎn)生組合了BPIV3的宿主范圍減毒特性和HPIV3HN和F保護(hù)性抗原免疫原性的嵌合人-牛PIV。這種嵌合病毒免疫人，可以糾正從前在人中觀察到的BPIV3疫苗具有低于最佳的免疫原性的問(wèn)題。BPIV3Ka或SF株的完全一致核苷酸序列從毒粒RNA的RT-PCR產(chǎn)物中得以確定。這些序列分別在圖6A-6G，7A-7G中。編碼BPIV3Ka反基因組RNA的15456個(gè)核苷酸全序列的全長(zhǎng)cDNA在圖6A-6G中表示(參見(jiàn)GenBank入藏號(hào)弁AF178654)。BPIV3Ka株的GenBank序列與作為范例的cDNA在核苷酸21、23的兩個(gè)位點(diǎn)處不同。發(fā)表序列與作為范例的cDNA序列在Ka株病毒群體中自然產(chǎn)生的頻率相似。本實(shí)施例使用的cDNA序列包含開(kāi)始于核苷酸18的序列，ACTQGIT(SEQIDNO.1)，而相應(yīng)的發(fā)表序列(GenBank入藏號(hào)弁AF178654;圖6A-6G;SEQIDNO.22)為ACTIGGT(核苷酸21、23兩個(gè)位點(diǎn)處的不同以下劃線(xiàn)表示)。為構(gòu)建BPIV3Ka和SF株的共有核苷酸序列，對(duì)毒粒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用超轉(zhuǎn)錄II預(yù)擴(kuò)增系統(tǒng)(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)和200ng的六聚體隨機(jī)引物。第一條鏈的產(chǎn)物進(jìn)行PCR，使用AdvantagecDNAPCR試劑盒(ClontechLaboratories,PaloAlto，CA)。Ka和SF基因組利用與現(xiàn)有副粘病毒中保守RNA區(qū)域同源的引物，分別經(jīng)PCR擴(kuò)增出3-4個(gè)重疊片段。各引物對(duì)的構(gòu)件包括了符合的限制性酶切點(diǎn)(在擴(kuò)增靶序列中不出現(xiàn)的)。用合適的限制性酶消化PCR產(chǎn)物，凝膠純化、將產(chǎn)物連接為串聯(lián)陣列并超聲處理，產(chǎn)生了每個(gè)擴(kuò)增子的獨(dú)立的隨機(jī)文庫(kù)。從這個(gè)cDNA序列片段庫(kù)中可獲得一個(gè)隨機(jī)文庫(kù)，方法是將一個(gè)亞組(約500bp片段)克隆到M13中。插入的cDNA核苷酸序列用TaqDYE脫氧終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(ABI，F(xiàn)oster,CA)進(jìn)行自動(dòng)DNA測(cè)序分析。每個(gè)原始的大RT-PCR片段被以足夠冗余地裝配出一個(gè)連續(xù)的序列(contig)，每個(gè)核苷酸位置都由至少3個(gè)M13的克隆進(jìn)行確定。Ka和SF株的3'和5'末端基因組序列都利用cDNA末端的快速擴(kuò)增系統(tǒng)(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)轉(zhuǎn)為cDNA，并自動(dòng)測(cè)序。這些序列分別公布于圖6A-6G(Ka)，7A-7G(SF)中。對(duì)序列的分析顯示HPIV3禾BBPIV3之間各蛋白的氨基酸相似比例為N(86%)、P(65%)、M(93%)、F(83%)、HN(77。/。)和L(91%)。因此序列的差異分布于許多基因。兩個(gè)病毒N基因演算出的差異出現(xiàn)在GenBank弁AF178654(Ka)和GenBank#AF178655(SF)，未包括在內(nèi)。NORF在BPIV3基因組的位置在其各自的BenBank報(bào)告中指出，在此引用作為參考。以下的實(shí)施例中，因?yàn)槠湓?個(gè)BPIV3和HPIV3蛋白中具有適度的序列差異，Ka或SF病毒的NORF首先被選擇用來(lái)替換HPIV3的相應(yīng)基因。研究中，NORF除3'，5'端和N基因非編碼序列外的序列被替換，使我們可以將cKa和cSF中觀察到的減毒表型賦予N基因編碼的蛋白。構(gòu)建人-牛嵌合全長(zhǎng)PIV3基因組，方法是將BPIV3Ka或SF的N編碼區(qū)作為其HPIV3中對(duì)應(yīng)部分的替代，引入編碼完整HPIV3正義反基因組RNA拷貝的rJScDNAp3/7(131)2G(參見(jiàn)Durbin等，1997a，同上；Hoffman等，1997,同上；Skiadopoulos等，1998，同上；1998年5月22日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/083,793;1997年5月23日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/047，575(相應(yīng)于國(guó)際申請(qǐng)WO98/53078);1997年9月19日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/059,385;分別在此引用作為參考)。具有側(cè)翼序列的HPIV3和BPIV3N編碼區(qū)首先被亞克隆，再進(jìn)一步修飾以許可只有NORF的交換。利用Kunkel的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492,1985，在此引用作為參考)對(duì)具有HPIV3N基因的pUC119JSN和具有BPIV3Ka或SF的質(zhì)粒(pBSKaN和pBSSFN)誘變，以分別在翻譯開(kāi)始和終止位點(diǎn)引入Ncol和AflII限制性酶識(shí)別位點(diǎn)(圖1A)。Ncol/Aflll對(duì)pUC119JSN-NcoI/Afl11消化后，在pUC119JSN-NcoI/Afl11中引入Ncol/Aflll片段的BPIV3N編碼序列以替代HPIV3N編碼序歹!j(圖1B)。這種具有HPIV3的3'和5'端非編碼區(qū)和BPIV3ORF的嵌合N基因經(jīng)定點(diǎn)誘變，恢復(fù)原始的HPIV3的非編碼序列和BPIV3的編碼序列。接著該嵌合N基因利用該人序列中存在的Mlul和EcoRI位點(diǎn)，被引入rJS反基因組5'末端，pLeft，替換相應(yīng)的HPIV3序列(圖2A和2B)。每種情況時(shí)都對(duì)SFNORF進(jìn)行平行反應(yīng)。該嵌合的pLeft與來(lái)自pRight(具有側(cè)翼為5核酶和3'末端T7終止子的rJS反基因組3'末端)的XhoI/NgoMI片段組合(圖2)。得到定名為pB/HPIV3Nka或pB/HPIV3NSF的嵌合PIV3質(zhì)粒，其含有其中NORF編碼BPIV3Ka或SFN蛋白的全長(zhǎng)rJS反基因組。嵌合反基因組HPIV3/BPIV3的cDNA單獨(dú)與兩個(gè)前述質(zhì)粒pTM(PnoC)禾卩pTM(L)、Lipofectace(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)，轉(zhuǎn)染在6孔板上生長(zhǎng)接近匯合的HEp-2細(xì)胞，并用一種前述的表達(dá)噬菌體T7RNA聚合酶(MVA-T7)的修飾的痘苗病毒重組體感染(Durbin等，Virology234:74-83,1997b)。因該反基因組質(zhì)?？僧a(chǎn)生足量的N蛋白，之前研究中支持N的質(zhì)粒被省去。培養(yǎng)物在32t:保持3.5天，然后收集上清，LLC-MK2細(xì)胞中傳代，并在LLC-MK2細(xì)胞中噬斑純化3次。轉(zhuǎn)染后回收的具有人PIV3背景基因組或反基因組和BPIV3N蛋白(定名為rHPIV3-NB的嵌合重組體，或更特異的，"cKa"和"cSF"嵌合重組體)的嵌合病毒，通過(guò)RT-PCR產(chǎn)物(具有來(lái)自三次噬菌斑純化擴(kuò)增后分離的毒粒RNA的NORF開(kāi)始和終止密碼子)測(cè)序的鑒定，予以確認(rèn)(圖3)。該擴(kuò)增產(chǎn)物和相應(yīng)擴(kuò)增的HPIV3rJS和BPIV3Ka或SF序列也進(jìn)行Taql消化，以確認(rèn)cKa和cSF病毒的嵌合特性(圖4)。這3個(gè)親本和2個(gè)嵌合病毒的Taql消化圖是各異的，每個(gè)親本的圖包括獨(dú)特大小的Taql片段，使可以確定rJS、Ka和SF親本序列對(duì)嵌合病毒的貢獻(xiàn)。獲得的cKa和cSF嵌合重組體各具有設(shè)計(jì)的期望序列。實(shí)施例IIHPIV3/BPIV3嵌合病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的復(fù)制活的減毒病毒疫苗在組織培養(yǎng)細(xì)胞中的有效復(fù)制是本發(fā)明人-牛嵌合PIV的一個(gè)特色，因而可有效地生產(chǎn)重組疫苗材料。rJS親本、cKa、Ka親本、cSF和SF親本在牛細(xì)胞系(MDBK)和猿猴細(xì)胞系(LLC-MK2)中的多循環(huán)復(fù)制通過(guò)以上所述方法(Tao等，1998，在此引用作為參考)確定，即，病毒以0.01的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞，在5天的時(shí)期內(nèi)收集樣品(平行三次)(圖5)。這些嵌合病毒在兩種細(xì)胞系中和其人或牛親本病毒同樣有效地復(fù)制，復(fù)制無(wú)顯著的延遲，或得到的病毒效價(jià)無(wú)明顯的下降。任何一種情況，嵌合病毒復(fù)制至10^TCID5o/ml(即，遠(yuǎn)大于目前用于人臨床實(shí)驗(yàn)的活的減毒人或牛PIV疫苗每劑10"或10")(Karron等，1996,同上；Karron等，1995a，同上；Karron等，1995b，同上)。實(shí)施例IIIHPIV3/BPIV3嵌合病毒在獼猴中減毒和保護(hù)效率的評(píng)估BPIV3Ka和SF在獼猴上下呼吸道都是減毒的(vanWykeCoelingh等，1988，同上)。這種減毒的表型與人中的減毒相關(guān)(Karron等，1995a，同上)，因Ka在充分敏感的血清反應(yīng)陰性幼兒和兒童的上呼吸道中，復(fù)制被高度地限制。在BPIV3感染的接種者中未出現(xiàn)咳嗽、哮吼、細(xì)氣管炎或肺病，這暗示KaBPIV3病毒在下呼吸道也是減毒的。因此，獼猴被認(rèn)為是一種廣泛認(rèn)可的合理相關(guān)的模型，以評(píng)估候選PIV疫苗病毒的減毒和其抗野生型PIV的有效性。rJS、cKa、Ka親本、cSF和SF親本以鼻內(nèi)和氣管內(nèi)給藥獼猴，每個(gè)位點(diǎn)每劑量105'GTCID5Q。利用前述方法監(jiān)視其復(fù)制，獲得上(鼻咽擦拭樣品)下(氣管灌洗樣品)呼吸道樣品，測(cè)定LLC-MK2細(xì)胞中病毒效價(jià)(Hall等，1992，同上)。cKa和cSF在上呼吸道顯著地減毒(表1)，與rJSHPIV3親本相比，其平均最大病毒效價(jià)分別顯示了63倍或32倍的降低。cKa和cSF在下呼吸道也有減毒(表1)，但差異不如cKa的顯著。rJS在下呼吸道的低水平復(fù)制使難以以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式表明，基于該位點(diǎn)的減毒表型所引起的進(jìn)一步的復(fù)制限制。表1:在獼猴上下呼吸道中相對(duì)于HPIV3的受限制的cKa和cSF復(fù)制病毒復(fù)制平均最高效價(jià)平均效價(jià)1og,。TCID5。/ml士標(biāo)準(zhǔn)誤差1og,。TCID5。/ml土標(biāo)準(zhǔn)誤差[鄧肯分組]2_[鄧肯分組]鼻咽氣管鼻咽氣管免疫動(dòng)用病物毒1數(shù)rJS4cKa4Ka4cSF4SF4第6天5.3土0.59[a]3.0土0.58[b]2.0土0.27[b]3.3±0.40間2.8±0.48間第7天3.9土0.36[a]2.9士0.42[ab]2.4士0.30[b]3.7士0.57[a]2.6土0.40[ab]第4天1.7土0.45[a]1.5土0.40[a]1.3土0.26[a]1.1土0.25[a]1.6土0.46[a]第6天1.7土0.29[a]1.0士0.19[a]1.3土0.21[a]1.1土0.24[aj1.5土0.40[a]5.3土0.59[a]3.5士0.54[b]2.5土0.30[b]3.8土0.46[b]3.3±0.28問(wèn)2.5士50.51[a]1.5土0.18[ab]1.6土o.15[ab;]1.4土0.26[b]1.8士0.41[ab]i'以鼻內(nèi)和氣管內(nèi)接種猴，每個(gè)位點(diǎn)lml接種物，劑量為105.0TCID50。2'利用鄧肯多差距測(cè)驗(yàn)(『0.05)將每列中平均病毒效價(jià)分為統(tǒng)計(jì)上相似的組(以字母表示)，不同字母的每列平均效價(jià)是統(tǒng)計(jì)上不同的。盡管嵌合病毒在上呼吸道中比其親本BPIV3的復(fù)制稍好，但cKa和cSF中每一嵌合病毒的復(fù)制水平在上下呼吸道中與其牛親本沒(méi)有顯著差異。rJSHPIV3獲得BPIV3Ka或SF之一的N基因，可使人病毒在獼猴中減毒至幾乎相當(dāng)于其BPIV親本的水平。因HPIV3/BPIV3嵌合重組子在體外的組織培養(yǎng)細(xì)胞中可有效復(fù)制，這兩種牛親本病毒表現(xiàn)的宿主范圍限制性表型是由N0RF轉(zhuǎn)移入HPIV3的。可能，但仍未知和不可預(yù)計(jì)的，其它BPIV3基因(如M、P、L)替代其rJSHPIV3的相應(yīng)部分，可以產(chǎn)生與BPIV3N基因替代HPIV3N基因所產(chǎn)生的相似或更大水平的減毒。觀察到cKa和cSF在上呼吸道中的復(fù)制比其BPIV3親本略高，這暗示另外的牛基因有助于該BPIV3親本病毒在該位點(diǎn)的宿主范圍減毒表型。未經(jīng)接種的猴，和先前感染了人或牛PIV3親本病毒或感染了cKa或cSF嵌合病毒的猴，在每個(gè)位點(diǎn)1ml的106QTCID5C)/mlrJS以鼻內(nèi)和氣管內(nèi)接種后42天，接受病毒攻擊。在所述的時(shí)間點(diǎn)采集鼻咽和氣管樣品(表2)。確定各動(dòng)物在LLC-MK2單層細(xì)胞中每個(gè)位點(diǎn)的病毒效價(jià)，所示效價(jià)為平均最高效價(jià)(Hall等，1992，同上)。在上下呼吸道中，任何嵌合病毒的先前感染都誘導(dǎo)對(duì)rJS攻擊病毒復(fù)制的高水平抗性。與未接種的對(duì)照猴相比，先前感染cKa的猴在上呼吸道表現(xiàn)出野生型rJS復(fù)制的300倍抑制，在下呼吸道中降低IOOO倍。先前感染cSF的猴在上呼吸道表現(xiàn)出野生型rJS復(fù)制的2000倍抑制，在下呼吸道降低1000倍。預(yù)先接種了cKa或cSF猴中rJS攻擊病毒復(fù)制的降低水平，與預(yù)先接種了牛或人PIV親本的猴中降低水平相當(dāng)。因此，HPIV3/BPIV3嵌合病毒中任何一個(gè)的感染都在猴上下呼吸道中提供高水平的保護(hù)，二者都是有前景的候選疫苗。依據(jù)前述方法(Coelingh等，J.Infect.Dis.157:655-662,1988)對(duì)第0和28天采集的血清進(jìn)行HAI分析，以HPIV3(JS株)和BPIV3(Ka株)為抗原。盡管相對(duì)于rJS，cKa-N和cSF-N在獼猴上下呼吸道中是高度減毒的，二者中任何一種嵌合病毒可誘導(dǎo)比其相應(yīng)BPIV3親本強(qiáng)2.5-5倍的對(duì)HPIV3的凝血抑制(HAI)抗體。這可能因?yàn)榍逗喜《局写嬖贖PIV3HN蛋白。嵌合病毒誘導(dǎo)的HPIV3特異的HAI反應(yīng)與rJS免疫誘導(dǎo)的反應(yīng)在統(tǒng)計(jì)上難以區(qū)分。此處出現(xiàn)的其它未預(yù)料的結(jié)果是，HPIV3攻擊猴后，預(yù)先免疫了cKa-N或cSF-N的猴中HAI抗體水平顯著高于免疫了rJS、Ka或SF的動(dòng)物中的水平。實(shí)施例IV具有異源融合和血凝素-神經(jīng)氨酸酶糖蛋白的嵌合HPIV3/BPIV3候選疫苗的構(gòu)建和特性在前一實(shí)施例中，BPIV3在靈長(zhǎng)類(lèi)呼吸道中復(fù)制的宿主范圍限制是通過(guò)產(chǎn)生和定性N的讀碼框(ORF)被BPIV3中相應(yīng)部分替代重組PIV3(rHPIV3)來(lái)鑒定的。產(chǎn)生的嵌合病毒rHPIV3-NB，也稱(chēng)為cKa或cSF，在體外有效復(fù)制，但在獼猴上呼吸道復(fù)制受限制，表明獼猴中N蛋白是BPIV3宿主范圍限制的獨(dú)立決定簇(Bailly等，J.Virol.24:3188-3195，2000)。在本實(shí)施例中，產(chǎn)生和定性?xún)蓚€(gè)交互嵌合的HPIV3/BPIV3，以確定牛副流感病毒類(lèi)型3(BPIV3)的融合(F)糖蛋白基因和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)糖蛋白基因?qū)Ψ侨遂`長(zhǎng)類(lèi)呼吸道中限制復(fù)制的貢獻(xiàn)。獲得了一個(gè)異源BPIV3F和HN蛋白基因代替其自身基因的嵌合HPIV3，和具有一個(gè)HPIV3F和HN基因代替其自身糖蛋白基因的BPIV3"骨架"與之交互的嵌合重組體，以評(píng)估這種糖蛋白替代對(duì)HPIV3和BPIV3在獼猴上下呼吸道復(fù)制的效果。因此，一個(gè)嵌合病毒中，HPIV3F和HN基因被BPIV3的相應(yīng)部分代替，產(chǎn)生命名為rHPIV3-FsHNB的嵌合重組體。與之交互的嵌合重組體PIV3(rBPIV3-FHHNH)是重組BPIV3(rBPIV3)F和HN基因被HPIV3的相應(yīng)部分代替而構(gòu)建的。后者中，HPIV3F和HNORF對(duì)BPIV3骨架的導(dǎo)入組合了HPIV3的抗原決定簇和BPIV3骨架，并因此比親本BPIV3提供了改善的候選疫苗。F和HN基因按要求成對(duì)地與同源F和HN基因交換，使副流感病毒保持其全部的功能活性(Deng等，Virology209:457-469,1995;Tanabayashi，J.Virol.70:6112-6118,1996;分別在此引用作為參考)。上述嵌合病毒易于獲得，在猿猴L(fēng)LK-MK2細(xì)胞中表現(xiàn)與其親本病毒相當(dāng)?shù)膹?fù)制動(dòng)力學(xué)，這暗示，異源糖蛋白與PIV3自身蛋白是相容的。BPIV3與HPIV3相比的細(xì)胞病理學(xué)差異與其各自的F和HN基因相伴隨。具有BPIV3F和HN基因的HPIV3在獼猴中復(fù)制的減毒與其BPIV3親本相似，表明BPIV3糖蛋白基因是在獼猴中宿主范圍限制的主要決定簇。具有HPIV3F和HN基因的BPIV3(rBPIV3-FHHNH)在獼猴中復(fù)制的減毒界于HPIV3和BPIV3之間。這些結(jié)果表明F和HN基因在BPIV3的全部減毒中起到重要作用。此外也表明F和HN基因外的BPIV3基因也參與在靈長(zhǎng)類(lèi)的減毒表型。后一發(fā)現(xiàn)與前一實(shí)施例中的一個(gè)結(jié)果一致，即BPIV3的核蛋白序列是其在靈長(zhǎng)類(lèi)減毒的決定因素。盡管其在獼猴呼吸道中限制的復(fù)制，rBPIV3-FHHNH賦予了對(duì)野生型HPIV3攻擊的一定程度的保護(hù)，這與野生型HPIV3前期感染所賦予的保護(hù)難以區(qū)分。這些和相關(guān)結(jié)果中可以明顯看出，rBPIV3-FHHNH是一種有用的候選疫苗。病毒和細(xì)胞Hep-2和猿猴L(fēng)LC-MK2單層培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)在添加了5%的胎牛血清(SummitBiotechologies,Ft.Collins,CO)、50ug/l硫酸慶大霉素和4mM谷氨酰胺(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)的MEM培養(yǎng)基中(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)。野生型BPIV3的Kansas株/15626/84(克隆5-2-4，批號(hào)BPI3-1)(BPIV3Ka)，HPIV3JS野生型，其重組型(rHPIV3)和以BPIV3Ka的NORF替換了HPIV3NORF的rHPIV3病毒(rHPIV3-NB)，分別在以上做了說(shuō)明(也參見(jiàn)Clements等，1991，同上；Karron等，1995a，同上；Bailly等，2000，同上；Durbin等，1997,同上)。根據(jù)上述方法，PIV在LLC-MK2細(xì)胞(ATCCCCL-7)中32。C增殖(Hall等，1992，同上)。表達(dá)噬菌體T7RNA聚合酶的經(jīng)修飾的痘苗株Ankara(MVA)重組病毒由Wyatt等做了說(shuō)明(1995，同上)。構(gòu)建編碼重組BPIV3/HPIV3病毒的反基因組cDNAa)構(gòu)建cDNA以恢復(fù)rBPIV3根據(jù)以上所述，構(gòu)建了編碼BPIV3Ka全部15456個(gè)核苷酸的反基因組RNA的cDNA。利用超轉(zhuǎn)錄II預(yù)擴(kuò)增系統(tǒng)(LifeTechnologies,Ga池ersburg,MD)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用高保真PCR試劑盒(ClontechLaboratories,PaloAlto，CA)擴(kuò)增，從病毒RNA反轉(zhuǎn)錄(RT)中獲得的4個(gè)亞克隆裝配該cDNA。利用以下天然產(chǎn)生的內(nèi)部限制性識(shí)別位點(diǎn)將RT-PCR產(chǎn)物克隆在修飾的質(zhì)粒pUC19中(NewEgnlandBiolabs，Biolabs,Beverly,MA):SmaI(BPIV3Ka序列位點(diǎn)ntl86)、PstI(nt2896)、MluI(nt6192)、SacII(ntl0452)、和BspLUll(ntl5412)。反基因組cDNA的多亞克隆利用PerkinElmerABI310測(cè)序儀和dRhodamine終止循環(huán)測(cè)序(PerkinElmer應(yīng)用生物系統(tǒng)，Warrington,UK)測(cè)序，只有與BPIV3Ka共有序列符合的可用于裝配全長(zhǎng)序列。BPIV3Ka的3'和5'末端被克隆，全長(zhǎng)cDNA的裝配發(fā)生在前述的p(Right)載體中(Durbin等，1997，同上)，該載體經(jīng)修飾具有可被限制性酶XhoI、Smal、MluI、SacII、EcoRI、HindIII、RsrII識(shí)別的新的多連接區(qū)。全長(zhǎng)cDNA克隆pBPIV3(184)從3'到5'具有以下元件T7啟動(dòng)子，2個(gè)非病毒的胱氨酸殘基，BPIV3Ka完全的反基因組序列，S肝炎病毒核酶和一個(gè)T7聚合酶轉(zhuǎn)錄終止子(Bailly等,2000a，同上；和Durbin等,1997a，同上)。b)rHPIV3-FRHNn和rBPIV3-FwHNH的構(gòu)建在BPIV3反基因組cDNA和前述的HPIV3反基因組cDNAP3/7(131)2G(Durbin等,1997a,同上)中引入獨(dú)特的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以促進(jìn)BPIV3和HPIV3間F和HN基因的交換。利用Clontech的轉(zhuǎn)化子定點(diǎn)誘變方法(ClontechLaboratories,PaloAlto，CA)，在rBPIV4811位和rHPIV3JS序列(Genbank接入號(hào)弁Z11575)4835處M基因的下游非編碼區(qū)引入SgrAI限制性位點(diǎn)。限制性酶識(shí)別位點(diǎn)的給定核苷酸編號(hào)表示了酶切后的核苷酸，而非限制性酶識(shí)別位點(diǎn)的第一個(gè)核苷酸。該序列的改變是rBPIV3中從TCCAACATTGCA(SEQIDNO.2)至ljTCCACCGGTGCA(SEOIDNO.3)、rHPIV3中從CGGACGTATCTA(SEQIDNO.4)到CGCACCGGTGTA(SEOIDNO.5)(識(shí)別位點(diǎn)下劃線(xiàn))。BsiWI限制性位點(diǎn)被引入了rBPIV3序列的nt8595禾口rHPIV3JS序列nt8601處的HN基因的下游非編碼區(qū)。該序列的改變是rBPIV3中從GATATAAAGA(SEQIDNO.6)到GACGTACGGA(SEOIDNO.7)并得到pBPIV(107)、rHPIV3中從GACAAAAGGG(SEQIDNO.8)至UGACGTACGGGfSEOIDNO.9)并得到pHPIV(106)。F和HN基因在pBPIV和pHPIV間的交換是通過(guò)各用SgrAI和BsiWI消化，片段經(jīng)凝膠純化，將合適的片段裝配出全長(zhǎng)的cDNA。具有BPIV3F和HN基因的HPIV3骨架，定名為pHPIV(215)，編碼病毒序列的15480個(gè)核苷酸，其中nt4835-8619來(lái)自BPIV3，被用于獲得rHPIV3-FBHNB(^8A-8C)。具有HPIV3F和HN基因的BPIV3骨架，定名為pBPIV(215)，編碼病毒序列的15438個(gè)核苷酸，其中nt4811-8577來(lái)自HPIV3，被用于獲得rBPIV3-FiiHNH(圖8A-8C)。用于從cDNA中回收病毒的BPIV3支持質(zhì)粒編碼BPIV3KaN、P、L基因的支持質(zhì)粒在修飾的pUC19中裝配，接著克隆于前述的pTM-l載體中(Durbin等，1997a，同上)。為了將單個(gè)基因放在緊挨該pTM載體T7啟動(dòng)子的下游，利用定點(diǎn)誘變?cè)贜、P、L讀碼框(ORF)起始密碼子處引入了一個(gè)Ncol位點(diǎn)。該Ncol位點(diǎn)和各ORF下游天然存在的限制性位點(diǎn)(NSpel，PHincII，LBspLU1ll)被用于對(duì)pTM的克隆?？寺『螅琾TM(N)的NcoI位點(diǎn)突變回原始序列，以恢復(fù)第二個(gè)密碼子中的正確氨基酸排列。pTM(P)和pTM(L)中ORF編碼的氨基酸序列沒(méi)有因NcoI位點(diǎn)的引入而改變。轉(zhuǎn)染HEp-2細(xì)胞(6孔板的每個(gè)孔約1.5乂106個(gè)細(xì)胞)生長(zhǎng)到90%匯合，用BPIV3支持質(zhì)粒pTM(N)和pTM(P)各0.2ptg，O.lpgpTM(L)，禾n5/Ltg全長(zhǎng)的反基因組cDNA、12]tdLipofectACE(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)共同轉(zhuǎn)染。各轉(zhuǎn)染混合物也含有1.5X10"筮菌斑形成單位(PFU)的MVA-T7，如前所述(Durbin等,1997a，同上)。培養(yǎng)物在32。C培養(yǎng)12小時(shí)，替換為包含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)。32。C又培養(yǎng)了三天后，收集上清，鋪于25cn^燒瓶中的LLC-MK2單層細(xì)胞，32。C培養(yǎng)5天。上清中的病毒在擴(kuò)增和定性前進(jìn)行3次噬菌斑純化?；厥盏那逗现亟M體的分子特性牛或人PIV3骨架中存在的異源F和HN基因通過(guò)從感染細(xì)胞或上清中分離病毒RNA的RT-PCR在噬菌斑純化重組病毒中得以確認(rèn),其進(jìn)行是使用識(shí)別rHPIV3和rBPIV3上保守序列的引物對(duì)。產(chǎn)生大小相似的片段(rBPIV3中nt4206-9035，rHPIV3中nt4224-9041，rBPIV3-FHHNH中nt4206-9017，rHPIV3-FBHNB中nt4224-9059)，進(jìn)行EcoRI的消化，并1%的瓊脂糖電泳分析(圖9)。每個(gè)病毒中側(cè)翼為引入的SgrAI和BsiWI限制性位點(diǎn)的核苷酸序列，通過(guò)測(cè)序其相應(yīng)的RT-PCR產(chǎn)物來(lái)確認(rèn)。HPIV3/BPIV3嵌合病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的復(fù)制確定LLC-MK2細(xì)胞中BPIV3Ka、rBPIV3-FHHNH、rHPIV3-FBHNB、rHPIV3-NB禾PrHPIV3的多循環(huán)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，以0.01的感染復(fù)數(shù)(MOI)分三份感染細(xì)胞，6天內(nèi)每24小時(shí)收集細(xì)胞，方法同上所述(Tao等，1998，同上)。樣品瞬時(shí)冷凍，在32。C在96孔板的LLC-MK2單層細(xì)胞中做一次效價(jià)分析，方法同上所述(Durbin等，Virology261:319-330,1999b,在此引用作為參考)。靈長(zhǎng)類(lèi)模型研究血凝抑制(HAI)分析(vanWykeCoelingh等，1988，同上)確定的PIV3血清反應(yīng)陰性獼猴以鼻內(nèi)和氣管內(nèi)接種BPIV3Ka、rBPIV3-FHHNH、rHPIV3-FBHNB、rHPIV3-NB或rHPIV3，每毫升105組織培養(yǎng)物感染劑量5Q(TCID5()),每組動(dòng)物為2-4只。從第1-11天和第13天每天采集鼻咽擦拭樣品。在第2、4、6、8、IO天采集氣管灌洗樣品。單個(gè)樣品瞬時(shí)冷凍，在-7(TC保存，直到可用于測(cè)定效價(jià)。樣品效價(jià)在24和96孔板的LLC-MK2單層細(xì)胞中測(cè)定(Durbin等，1999b，同上)。在0和28天采集的猴血清用HPIV3JS和BPIV3Ka進(jìn)行HAI分析，方法同上所述(vanWykeCoelingh等，1988，同上)。接種后28天，HPIV3JS以每個(gè)位點(diǎn)1(^TCID5o鼻內(nèi)和氣管內(nèi)攻擊獼猴。攻擊后第3、4、5、6、7、8天采集鼻咽擦拭樣品。在第4、6、8天采集氣管灌洗樣品。用上述方法以單一分析檢測(cè)樣品效價(jià)。攻擊后28天采集血清。rBPIV3禾卩BPIV3/HPIV3嵌合病毒0HPIV3-FbHNb禾卩rBPIV3-FHHNH)從cDNA的恢復(fù)構(gòu)建一個(gè)定名為pBPIV(184)的編碼BPIV3Ka共有序列的完整BPIV3反基因組cDNA。通過(guò)分別在M和HN基因下游非編碼區(qū)引入唯一的SgrAI和BsiWI位點(diǎn)，對(duì)該BPIV3反基因組cDNA進(jìn)一步修飾(圖8C)。同樣的限制性位點(diǎn)也引入了前述完整HPIV3反基因組cDNA(p3/7(131)2G)的M和HN基因下游非編碼區(qū)(Durbin等，1997a，同上)。HPIV3和BPIV3的F和HN糖蛋白基因因SgrAI-BsiWI限制性片段的互換而交換。由于HPIV3和BPIV3順式作用元件的高度保守性，預(yù)計(jì)全基因的直接交換是可以容許的。具有BPIV3的F和HN基因的HPIV3反基因組cDNA定名為pHPIV(215)，具有HPIV3的F和HN基因的BPIV3反基因組cDNA定名為pBPIV(215)。反基因組cDNApBPIV(184)、pHPIV(215)、pBPIV(215)和p3/7(131)2G分別與三種BPIV3支持質(zhì)粒pTM(N)、pTM(P)、pTM(L)轉(zhuǎn)染HEp-2細(xì)胞。細(xì)胞同時(shí)也轉(zhuǎn)染了表達(dá)T7RNA聚合酶的重組MVA。為了確定回收病毒是否真是預(yù)期的rBPIV3、rHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNH和HPIV3病毒，使用識(shí)別HPIV3JS和BPIV3Ka—致序列的引物對(duì)，RT-PCR分析來(lái)自各克隆病毒的細(xì)胞內(nèi)RNA或上清RNA。該引物對(duì)擴(kuò)增出4.8kbDNA片段，相應(yīng)于M基因、F和HN基因的下游末端和L基因的上游末端(rBPIV3中nt4206-9035，rHPIV3中nt4224-9041，rBPIV3-FHHNH中nt4206-卯17，rHPIV3-FBHNB中nt4224-9059)。每個(gè)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生都依賴(lài)反轉(zhuǎn)錄酶的加入，表明其均來(lái)自病毒RNA，而不含有cDNA(未發(fā)表資料)。PCR產(chǎn)物用EcoRI消化，可預(yù)測(cè)這四種病毒中任一都有不同的獨(dú)特的限制性酶切圖產(chǎn)生(圖9)。觀察到每種情況的預(yù)期表現(xiàn)，確認(rèn)了骨架和插入的F和HN基因。此外對(duì)PCR產(chǎn)物的核苷酸測(cè)序確認(rèn)了導(dǎo)入的限制性位點(diǎn)和側(cè)翼序列的存在。在LLC-MK2細(xì)胞中，由rBPIV3-FHHNH引起的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)難以與HPIV3JS(致密的圓形細(xì)胞和小合胞體)引起的CPE相區(qū)別，但可與BPIV3(大的多室合胞體)相區(qū)分，而rHPIV3-FBHNB引起的CPE與BPIV3引起的相同。這說(shuō)明嵌合PIV的致細(xì)胞病變性是與親本源F和HN基因相伴隨的。BPIV3/HPIV3嵌合病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中有效復(fù)制以0.01MOI感染單層LLC-MK2細(xì)胞，比較rHPIV3-FBHNB和rBPIV3-FHHNH與其親本病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，并監(jiān)測(cè)感染性病毒的產(chǎn)生。這兩種嵌合病毒復(fù)制的動(dòng)力學(xué)和程度與其HPIV3或BPIV3親本相當(dāng)(圖10)。暗示，BPIV3和HPIV3的糖蛋白與異源PIV3的內(nèi)在蛋白相容。這是一個(gè)重要的性質(zhì)，可能有效地制備疫苗病毒。BPIV3/HPIV3嵌合病毒的F和HN基因是獼猴呼吸道中BPIV3Ka復(fù)制宿主范圍限制的決定簇估計(jì)rHPIV3-FBHN"nrBPIV3-FHHNH在獼猴上下呼吸道中復(fù)制的能力。特別的顯示了BPIV3的F和HN基因引入HPIV3對(duì)其在獼猴中復(fù)制的影響，如上關(guān)于BPIV3N蛋白的描述(也參見(jiàn)Bailly等，2000，同上)。此外，也確定了HPIV3的F和HN基因引入BPIV3對(duì)其在獼猴中減毒的影響。如BPIV3中首要的減毒突變是除F和HN以外的基因，則可以預(yù)計(jì)，HPIV3-BPIV3糖蛋白的互換對(duì)BPIV3在獼猴中的復(fù)制沒(méi)有太多的影響。每種病毒以每個(gè)位點(diǎn)1()STCID5()鼻內(nèi)和氣管內(nèi)給藥獼猴。嵌合病毒的復(fù)制水平與其rHPIV3和BPIV3親本病毒和rHPIV3-NB相比(表3)。因?yàn)閞HPIV3親本病毒在下呼吸道中的復(fù)制由低到中等，組間有意義的比較應(yīng)在上呼吸道中進(jìn)行。rHPIV3-FBHNB復(fù)制水平與其BPIV3親本病毒相似，但遠(yuǎn)低于其HPIV3親本(表3;圖11，A組)。這表明BPIV3糖蛋白基因含有BPIV3在獼猴中宿主范圍限制表型的一個(gè)或多個(gè)決定簇。rHPIV3-FBHNs和rHPIV3-NB復(fù)制程度和方式非常相似，顯示這兩種牛遺傳元件中的任一，即N基因?qū)和HN基因?qū)PIV3減毒有相似的程度。表3BPIV3F和HN糖蛋白基因?qū)ζ湓讷J猴呼吸道中限制性復(fù)制的貢獻(xiàn)動(dòng)物平均峰值病毒效價(jià)3在第28天7針對(duì)HPIV3在第28天1針對(duì)免疫用病毒1(log10TCID50/ml±S.E.)[鄧肯分組]4的血清HAI抗體的效價(jià)(平均倒數(shù)BPIV3的血清HAI抗體的效價(jià)(平均倒數(shù)數(shù)2NP擦拭5氣管灌洗6log2±S.E.)1og2土S.E.)rHPIV364.7土0.54[A]2.4土0.37[A]9.5土0.72[A]6.8土1.03[B]rBPIV3-FHHNH43.1土0.58[BJ1.6士0.05[A]6.8土0.63[BC]3.8土0.63[C]rHPIV3-NB63.0士0.60[B;i1.4士0.19[A]8.2土0.48[AB]6.5土0.62[B]rHPIV3-FBHNB42.9土0.28[BJ2.0土0.24[A]4.5士0.29[DJ9.5土0.65[AJBPIV3Ka62.6土0.26[BJ1.6士0.10[A〗5.5士0.62[CD]9.2土0.60[AJL以鼻內(nèi)和氣管內(nèi)接種猴，每個(gè)位點(diǎn)lml接種物，每劑量105GTCID50。2'6個(gè)動(dòng)物的組包含分別來(lái)自前期獼猴實(shí)驗(yàn)的4個(gè)動(dòng)物(Bailly等，2000，同上)。3'不考慮采樣日，組內(nèi)各動(dòng)物最大病毒效價(jià)的平均值。SE^標(biāo)準(zhǔn)誤差。《在32。C的LLC-MK2細(xì)胞中測(cè)定病毒效價(jià)。病毒效價(jià)的可檢測(cè)極限是10TCID5o/ml。利用鄧肯多差距測(cè)驗(yàn)(『0.05)比較平均病毒效價(jià)。每列中不同字母的平均效價(jià)是統(tǒng)計(jì)上不同的。有兩個(gè)字母的效價(jià)與有其中任一字母的效價(jià)無(wú)顯著差異。5'鼻咽擦拭樣品采自第l-ll天和第13天。6'氣管灌洗樣品采自感染后第2、4、6、8和10天。7'0天的效價(jià)小于2.0。第28天是野生型HPIV3攻擊的時(shí)間。**rHPIV3組中兩只動(dòng)物感染了rHPIV3(其針對(duì)糖蛋白交換有兩個(gè)限制性酶識(shí)別位點(diǎn))rBPIV3-FHHNH嵌合病毒的復(fù)制顯著低于rHPIV3(表3)，并在鄧肯多差距測(cè)驗(yàn)中和BPIV3分為一組。但圖11B中關(guān)于其復(fù)制方式的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rBPIV3-FHHNH的復(fù)制水平介于其親本HPIV3和BPIV3之間。Friedman的級(jí)另'J一致性檢測(cè)(Sprent，P.，"AGeneralizationofTheSignTest"AppliedNonparametricStatisticalMethod,pp.123-126，ChapmanandHall，London,1989，在此引用作為參考)支持對(duì)rBPIV3-FHHNH的復(fù)制水平介于其親本HPIV3和BPIV3之間的解釋?zhuān)幢砻鱄PIV3、rBPIV3-FHHNH和BPIV3的平均效價(jià)在感染后3-8天內(nèi)是顯著不同的(d.f.2,8;p<0.05)。觀察到HPIV3F和HN基因的引入導(dǎo)致BPIV3在獼猴中復(fù)制水平的增加，這表明(i)F和HN包含一個(gè)或多個(gè)宿主范圍限制的決定簇(ii)F和HN基因外的一個(gè)或多個(gè)BPIV3遺傳元件，如N蛋白，使病毒在獼猴中減毒。這確定了宿主范圍限制的遺傳基礎(chǔ)可能包括多個(gè)基因。具有HPIV3糖蛋白基因的嵌合BPIV3誘導(dǎo)HPIV3的血清HAI抗體和對(duì)野生型HPIV3攻擊的高水平抗性rBPIV3-FHHNH的重要特點(diǎn)使其成為抗HPIV3的候選活減毒的病毒疫苗，包括BPIV3的減毒基因和HPIV3的抗原特異性，即是主要保護(hù)性抗原的F和HN糖蛋白。因此，記錄了其免疫原性和抗HPIV3攻擊的保護(hù)性效果。BPIV3Ka、rHPIV3-FBHNB、rBPIV3-FHHNH、rHPIV3-NB或rHPIV3感染以免疫獼猴。28天后用HPIV3JS野生性病毒攻擊。采集初次感染前0天和攻擊前的血清。BPIV3和rHPIV3-FBHNB誘導(dǎo)與HPIV3比與BPIV3更有效反應(yīng)的HAI抗體，而HPIV3和rBPIV3-FHHNH與之相反。因此各病毒糖蛋白基因的來(lái)源決定HAI抗體主要針對(duì)HPIV3還是BPIV3。攻擊HPIV3病毒的復(fù)制在預(yù)先免疫的獼猴的上下呼吸道中顯著降低(表4)。盡管抗HPIV3的保護(hù)性效果在不同病毒中沒(méi)有顯著差異，一般具有HPIV3F和HN的病毒在上呼吸道中比具有HPIV3F和HN的病毒保護(hù)性更強(qiáng)。這與具有HPIV3F和HN的病毒誘導(dǎo)高水平的HPIV3-特異性HAI抗體相符合。表4BPIV3/HPIV3嵌合重組病毒在獼猴中的免疫誘導(dǎo)對(duì)野生型HPIV3攻擊的抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>L各選已前接種的猴和未免疫的對(duì)照在免疫28天后，用106TCID5()HPIV3JS攻擊，每個(gè)位點(diǎn)lml接種物。2'6個(gè)動(dòng)物的組包含分別來(lái)自前期獼猴實(shí)驗(yàn)的4個(gè)動(dòng)物(Bamy等，2000，同上)。3不考慮采樣日，組內(nèi)各動(dòng)物最大病毒效價(jià)的平均值。4'在32。C的LLC-MK2細(xì)胞中測(cè)定病毒效價(jià)。病毒效價(jià)的可檢測(cè)極限是10TCIDWml。利用鄧肯多差距測(cè)驗(yàn)(c^0.05)比較平均病毒效價(jià)。每列中不同字母的平均效價(jià)是統(tǒng)計(jì)上不同的。有兩個(gè)字母的效價(jià)與有其中任一字母的效價(jià)無(wú)顯著差異。攻擊日的未經(jīng)免疫動(dòng)物不包括在鄧肯分析中。5'鼻咽擦拭樣品采自攻擊后第3-8天。6.氣管灌洗樣品采自攻擊后第4、6、8天。**rHPIV3組中兩只動(dòng)物感染了rHPIV3基于前述實(shí)施例，本發(fā)明提供BPIV基因輸入毒性HPIV骨架和相反情況，以獲得新的人-牛嵌合PIV候選疫苗。在本實(shí)施例中顯示的模式嵌合重組子，rHPIV3-FsHNB和rBPIV3-FHHNH對(duì)應(yīng)物，在體外復(fù)制，其相應(yīng)的親本病毒也一樣。也確定了BPIV3和HPIV3的F和HN交換是相容的，因?yàn)楦蟛町惖腍PIV3的F和HN蛋白在HPIV3骨架中是高度有功能的(Tao等，J.Virol.72:2955-2961.1998)，該嵌合病毒在體外復(fù)制能力的未減弱說(shuō)明了這一點(diǎn)。rBPIV3-FHHNH在獼猴上呼吸道的復(fù)制水平介于其HPIV3和BPIV3之間，表明BPIV3的F和HN基因?qū)PIV3在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的全面減毒有獨(dú)立的作用。因此，BPIV3的全面減毒是兩個(gè)或多個(gè)遺傳元件的總和，其中之一是F和HN基因，而其它顯示為N。盡管BPIV3本身被估計(jì)是HPIV3的疫苗病毒(Karron等，Pediatr.Infect.Dis.J.15:650-654,1996;Karron等.J.Infect.Dis.171:1107-1114,1995)，但其與HPIV3只有25%的相關(guān)(Coelingh等，J.Infect.Dis.l57:655-662,1988)。因此，如果根據(jù)本發(fā)明修飾為表達(dá)保護(hù)性的HPIV3F和HN的抗原，可提高BPIV3對(duì)抗HPIV3的免疫原性。rBPIV3-FHHNH是這種病毒的代表，并且在本實(shí)施例中，rBPIV3-FHHNH對(duì)獼猴的免疫誘導(dǎo)對(duì)HPIV3的抗體高于BPIV3免疫所誘導(dǎo)的。rBPIV3-FHHNH在上下呼吸道中賦予抗HPIV3攻擊病毒復(fù)制的保護(hù)，其與先前rHPIV3感染賦予的保護(hù)在統(tǒng)計(jì)上難以區(qū)分。同樣的，rHPIV3-Ne(因BPIV3N減毒但具有HPIV3保護(hù)性抗原)也誘導(dǎo)對(duì)HPIV3攻擊的高水平抗性。盡管在獼猴中復(fù)制水平相似，rHPIV3-NB比rBPIV3-FHHNH誘導(dǎo)對(duì)HPIV3更高水平的抗體。盡管其與HPIV3相比是顯著減毒的，rBPIV3-FHHNH在獼猴中比BPIV3復(fù)制水平高。因?yàn)锽PIV3復(fù)制水平在人中低(Karron等，J,Infect.2i^m:1107-1114,1995)，這種增加預(yù)期在受接種者中有良好耐受。另外，此處公布了其它可使本發(fā)明人-牛嵌合病毒減毒的方法，以確保疫苗病毒復(fù)制限制于適當(dāng)水平，如在人幼兒中，預(yù)防受接種者出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道疾病。本發(fā)明其它方面中，rBPIV3-FHHNH在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物復(fù)制的少量增加提供了用rBPIV3-FHHNH作為異源病毒抗原如其它PIV(如HPIV1和HPIV2)的糖蛋白、RSVF和G糖蛋白、麻疹HA糖蛋白，其可以作為添加或替代基因或基因組區(qū)段，引入減毒的HPIV3候選疫苗)載體的可能。此處公布的各種其它實(shí)施方案中，rBPIV3-FwHNH在猴中比BPIV3少量增加的復(fù)制，可以通過(guò)外源病毒保護(hù)性抗原(如RSV糖蛋白，其添加賦予了一種選定水平的減毒)而抵消。這里發(fā)表的數(shù)據(jù)進(jìn)一步定義了BPIV3在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的宿主范圍限制基礎(chǔ)，也確定了rBPIV3-FHHNH是潛在的抗的HPIV3的候選疫苗和異源病毒抗原的載體。微生物保藏信息遵循布達(dá)佩斯條約，以下材料保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209)，并命名如下保藏號(hào)(ATCC97990)CATCC97989)(ATCC97991)質(zhì)粒p3/7(131)p3/7(131)2Gp218(131)存放日期1997年4月18日1997年4月18日1997年4月18日盡管為清楚理解目的通過(guò)實(shí)施例對(duì)上述發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，通過(guò)所述公開(kāi)可以作出一定的改變和變化，并且在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)無(wú)需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)即可實(shí)施，而所述說(shuō)明的給出只是說(shuō)明性的而非限制性的。序列表<110>美國(guó)政府健康及人類(lèi)服務(wù)部(TheGovernmentOfTheUnitedStatesOfAmericaasr印resentedbyTheDepartmentOfHealthAndIlumanServices)<120>減毒的人-牛嵌合副流感病毒(PIV)疫苗(AttenuatedHuman-BovineChimericParainfluenzaVirus(PIV)Vaccines)<130>SPI082276-01〈150〉PCT/USOO/17066<151>2000-06-15<150〉60/143,134<151>1999-07-09<160>31<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉7<212>腿<213>人工序列〈220〉<223〉BPIV3Ka序列多態(tài)性位點(diǎn)的側(cè)翼序列<400>1actggtt7<210>2<2U〉12<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223>用于向rBPIV3Ka引入SgrAl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400>2tccaacattgca12<210>3<211〉12<212〉DNA<213>人工序列〈220>〈223〉用于向rBPIV3引入SgrAl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400〉3tccaccggtgca12<210>4<211〉12<212〉DNA<213>人工序列<220><223>用于向rHPIV3JS引入SgrAl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列〈400〉4tccaccggtgta12<210>5<211>12<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>用于向rHPIV3引入SgrAl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400〉5cgcaccggtgta12<210>6<211>10<212>DNA〈213>人工序列〈220><223>用于向rBPIV3Ka引入BsiWl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400>6gatataaaga10<210>7〈211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223〉用于向rBPIV3引入BsiWl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400>7gacgtaxgga10<210>8<211〉10<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>用于向rHPIV3JS引入BsiWl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400>8g3C3aasggg10〈210〉9〈211>10<212>DNA<213>人工序列<220〉〈223〉用于向rHPIV3引入BsiWl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列〈400〉9gacgtaxggg10<210>10<211>11<212>DNA〈213>人工序列<220〉<223〉N基因起始密碼子的側(cè)翼序列<400>10caaaaatgttg11<210〉11<211〉12<212>DNA<213>人工序列<220><223〉N基因終止密碼子的側(cè)翼序列〈400〉11gcaactaatcga12〈210>12〈211〉12<212>DNA〈213>人工序列<220><223〉引入到N基因起始密碼子上的限制性位點(diǎn)的側(cè)翼序列<400>12taacca.tggtga12〈210>13<211>12<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉引入到N基因終止密碼子上的限制性位點(diǎn)的側(cè)翼序列〈400〉13gcacttaagcac12<210〉14<211〉12<212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223〉用以恢復(fù)N基因起始密碼子前后序列的突變的側(cè)翼序列<400>14caaaaatgttga12<210>15<211>12<212〉DNA<213〉人工序列〈220><223>用以恢復(fù)N基因終止密碼子前后序列的突變的側(cè)翼序列<400>15gcaactagtcga12<210>16<211〉40<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉rJS中N基因起始密碼子的側(cè)翼序列〈400>16ggaactctataatttcaaaaatgttgagcctatttgatac40<210>17〈211〉40<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>cKa和cSF中N基因起始密碼子的側(cè)翼序列〈400〉17ggaactctataatttcaaaaatgttgagtctattcgacac40〈210〉18〈211〉40<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉Ka和SF中N基因起始密碼子的側(cè)翼序列<400>18gaaatcctaagactgtaatcatgttgagtctattcgacac40<210〉19〈211〉40<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>rJS中N基因終止密碼子的側(cè)翼序列<400>19ttaacgcatttggaagcaactaatcgaatcaacattttaa40<210>20<211>40<212>腿〈213〉人工序列<220><223>cKa和cSF中N基因終止密碼子的側(cè)翼序列<400〉20tcagtgcattcggaagcaactagtcgaatcaacattttaa40<210>21〈211〉40<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>Ka和SF中N基因終止密碼子的側(cè)翼序列<400>21tcagtgcattcggaagcaactagtcacaaagagatgacca40<210>22<211>15456〈212〉DNA<213>牛副流感病毒3(Ka株)〈400〉223cca^ca^gagaagagactggtttggg^犯cttaggat60taaagawtttaccgaaaggt犯gggga犯gaaatcctaagactgtaatcatgttgagtc120tattcgacacattcagtgcgcgtaggcaggagaacataacgaaatcagctggtggggctg180ttattcccggactgtgtctatatttgctcttggaccatcaataacagatg240acaatgataaaMgacattggctcttctctttttgtCtCELttctttagac300agcatgcgcatttttagtttctctgttatcaatggcttatgccaacccag360ggtagtaatgatatgttatctacatgat已g420ag已a(bǔ)agacccaggaagacagaaatatggtgggtUgtcgtcaagactagagagatggttt480犯CtgELttggatgttcgggagtgatcttgagtatgatcaagacaatatgt540tgcaaaatggtagaagcacttctacaatcgaggatcttgttcatacttttggatatccat600cgtgtcttggagcccttataatccaagtttggat肌tax;ttgttaaggctataaccagta660t3tcaggattgagg犯鄉(xiāng)3ttctttactcggtt卿agcatttcgacaa720ttaaatccagtctagtgttgagcggtgatgaattggatcaattatgaggt780cccaacagagcttggtaacactcatggttgaaacactgata^caatgsac840atgatctgacaacaatagaaaag肌tatacaaactacatcag卿tgcag900gtcttgcttcatttttcaacacaatcagat3tggcattgagactagaatggc3gctctaa960ctctgtctacccttagaccggatatcaacag3CtC33ggC3ctgatcg3gttatatctat1020caaaggggccacgtgctccttttatatgcattttgagagatcccgtgcatggtgagtttg1080caccaggcaactatcctgccctctggagtt3tgCg3tgggtgtagcagtt1140aggccatgcaacagg卿gtcttatctggatattgaaatgttccaacttg1200gtcaagcagtggcacgtgatgccgagtcgcag3tg兆ttcaatattagagg3tg犯Ctgg1260gggtcacacaagaagccaagcaaagcttgagaagaacatc已gcagttcag1320atacaacctttcstaagcct已C已ggggg3tC3gcca^g31380cagggcagcctgaatccagatgagcctcggtcatccatag1440ttccttatgc已tgggc卿cg犯accggga肌ctgaatcaactacagEiaa1500ttgacagcatgctgaacaaaagactc犯cg1560agaaaaggaaacagagtgacccgagatcaactgacatcacaaacaacacaaatcaaactg1620tttgttcagtgca_ttcgga^gcaactagtcac犯agagatgaccactatc1680agtaagaa犯acttaggattaatggaaattatccaatccag卿cggaag1740gacaaatccagaatccaaccacaactcaatttC3tgg犯gacaatgttca1800aaacaatcaaatcatggattcttggga卿gggatc鄉(xiāng)agata肌tcatctgacatctc1860atcggccctcgacatcattgaattcatactcagcaccgactccc犯gaaa3cacggC3g31920cagcaat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C3gtgataatcaaa13800agag肌ataattctggggattagctctaaag犯ttatcaagtcgtaaaaa13860taagatccataacgagtgattctgaagttaatgaagcttcgaatgttactacacatggaa13920tgacacttcctCELggg3gg3agttatctatcacatcagctgaggttattt13980gtac犯gttgcttgaattgt14040at肌agatagactctttttagg卿aggagcaggagctatgttsgcatgttatgatgcta14100cactcggtcctattacaattctggttta犯tattacagatgtaattggtc14160a^cgggaELttaaaaatcttcccatcagaagtatcattagt3ggtaaaa^ctagga犯tg14220taacacsgattcttaatcgggtgagggtgttattt犯tgggaatcccaattcaacatgga14280gg組gtgagagtttaaitatggagtg組ttcaattggtt14340tsgtacattggg鄉(xiāng)gataggcaaatcaga3g犯3Ctgttttacatgaac14400tattaggattacatatttaatcggggatgatgatgttgtcctagtatcaa14460aaattataccaactattactccgaattggtctaaaatactctatctatacaagttgtatt14520gga鄉(xiāng)atgtaagtgt敏gtcccttaaaacatccaatcctgcctcaacagagctttatt14580ggatgcttactgtactgtaatggaacccagtaatcttgttttatcaaaac14640ttaa肌ggatatcatcagtaga^gaa^taatetattaaaatggataatc11atcaaaaa14700gga^g肌ca^cgaatggttacagcatgaaatcaaagaagg卿aagggattatgggataa14760tgaggccatatcatacagcactgcaaatttttggattccaaatcacttag14820ctaaagaatttttatcaactcctgatttaaccaacattaataatataatt14880caagaacaattaaagatgttatgttcgaatgggtcaatatcactcatgac14940at犯attaggaatctattcccgcttaaaaataaggggaagttaagattac15000tatcacgaag3tt3gtactacattatctttatcaaccagattactgacag15060gccgtttcccagatgaaaaagggcacagaccggatatgtatcattggctg15120atactgatttagaatctttaaagttattatcaagaaatattgtcaaaagttacaaag犯c15180acataggattaatatcatactggtttttaaccaaagaggtcaaaatactaatgaaactta15240taggggg敏caaactactaggaattcccaaacagtacaagatcgatcat15300ttcagggttaaatgaatttgatattg3ttaatacataaaaacaaaaaata15360aaacacctaatcctctcccattcacttccaacaaaatg肌肌gta^gaaaaacatataat15420atacatataccaaacagagtttttctcttgtttggt15456210〉24<211>12<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>用于向rHPIV3JS引入SgrAl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400>24tagacaaaaggg12<210〉25〈211〉12<212>■<213〉人工序列<220>〈223〉用于向rHPIV3JS引入SgrAl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400>25aagatataaaga12<210>26〈211〉12<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>用于向rHPIV3引入BsiWl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400〉26tagacgtacggg12<210>27<211>12<212〉隨<213〉人工序列<220><223>用于向rHPIV3引入BsiWl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400〉27aagacgtacgga12<210>28<211〉12<212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223>用于向rHPIV3F朋NB引入SgrAl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400〉28cgcaccggtgca12<210>29<211>12<212>DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉用于向rHPIV3sFBHNB引入BsiWl位點(diǎn)的位置的側(cè)翼序列<400〉29aagacgtacggg12<210〉30〈211>12<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>rBPIV3sF朋NH中SgrAl位點(diǎn)的側(cè)翼序列<400>30tccaccggtgta12<210>31<211>12〈212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>rBPIV3sFHHNH中Bsi沐l位點(diǎn)的側(cè)翼序列〈400〉31t卿cgtacgga1權(quán)利要求1.一種減毒的感染性人-牛嵌合副流感病毒(PIV)，包含主要核殼(N)蛋白、核殼磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)和組合了不同PIV的一種或多種異源基因或基因組區(qū)段以形成人-牛嵌合PIV基因組或反基因組的人PIV(HPIV)或牛PIV(BPIV)的部分或完整PIV背景基因組或反基因組，至少一種所述異源基因或基因區(qū)段編碼PIVP蛋白。2.權(quán)利要求1的嵌合PIV，還包括編碼一種或多種PIVN、C、D、V、M、F、HN和/或L蛋白或其片段的一種或多種另外的異源基因或基因組區(qū)段。3.權(quán)利要求1或2的嵌合PIV，其中所述一種或多種異源基因或基因組區(qū)段編碼一種或多種PIVN、C、D、V、M、F、HN禾卩/或L蛋白的完整可讀框(ORF)。4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合PIV，其中所述一種或多種異源基因或基因組區(qū)段包括異源調(diào)節(jié)元件，所述異源調(diào)節(jié)元件包含基因外3'前導(dǎo)區(qū)或5'非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)、基因起始信號(hào)、基因末端信號(hào)、RNA編輯位點(diǎn)、包殼信號(hào)、基因間區(qū)或3'或5'非編碼區(qū)。5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合PIV，其中異源基因或基因組區(qū)段替代了部分PIV背景基因組或反基因組中的對(duì)應(yīng)基因或基因組區(qū)段；加入到所述部分或完整PIV背景基因組或反基因組的非編碼區(qū)附近或之內(nèi)；加入或替代到所述部分或完整PIV背景基因組或反基因組內(nèi)相應(yīng)于對(duì)應(yīng)基因或基因組區(qū)段的野生型基因排列位置的位置上；或者加入或替代到所述部分或完整PIV背景基因組或反基因組內(nèi)比對(duì)應(yīng)基因或基因組區(qū)段的野生型基因排列位置更加臨近啟動(dòng)子或遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置處。6.權(quán)利要求2的嵌合PIV，其中所述嵌合基因組或反基因組編碼嵌合糖蛋白。7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合PIV，其中所述嵌合基因組或反基因組包含與一種或多種來(lái)自人PIV的異源基因或基因組區(qū)段組合的部分或完整BPIV背景基因組或反基因組。8.權(quán)利要求7的嵌合PIV，其中選自HN和F的一種或多種HPIV糖蛋白基因，或一種或多種編碼胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外域或其免疫原性表位的基因組區(qū)段，替代了所述BPIV背景基因組或反基因組內(nèi)的一種或多種對(duì)應(yīng)基因或基因組區(qū)段，或者加入到BPIV背景基因組或反基因組中。9.權(quán)利要求8的嵌合PIV，其中HPIV糖蛋白基因HN和F同時(shí)被取代，以替代所述BPIV背景基因組或反基因組中對(duì)應(yīng)HN和F糖蛋白基因。10.權(quán)利要求9的嵌合PIV，其中BPIV3的F和HN基因用它們的HPTV3對(duì)應(yīng)物取代。11.權(quán)利要求7的嵌合PIV，其中人-牛嵌合PIV基因組或反基因組編碼具有HPIV糖蛋白胞外域、抗原決定簇或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。12.權(quán)利要求1的嵌合PIV，其中所述異源基因組區(qū)段編碼糖蛋白胞外域。13.權(quán)利要求7-12任一項(xiàng)的嵌合PIV，其中通過(guò)將一種或多種額外的來(lái)源于人PIV的異源基因或基因組區(qū)段加入或替代到所述部分或完整的牛背景基因組或反基因組內(nèi)，進(jìn)一步修飾所述嵌合基因組或反基因組，以在所述嵌合病毒的培養(yǎng)物中增加遺傳穩(wěn)定性或改變減毒性、反應(yīng)原性或生長(zhǎng)。14.權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)的嵌合PIV，其中所述嵌合基因組或反基因組包含與一種或多種來(lái)自牛PIV的異源基因或基因組區(qū)段組合的部分或完整的人PIV背景基因組或反基因組。15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合PIV，其中通過(guò)引入在一種或多種生物學(xué)來(lái)源的突變PIV或其它突變的非區(qū)段的負(fù)鏈RNA病毒中識(shí)別的一種或多種減毒突變，所述基因組或反基因組被進(jìn)一步修飾。16.權(quán)利要求15的嵌合PIV，其中至少一種其它減毒突變被導(dǎo)致氨基酸點(diǎn)突變的密碼子中多重核苷酸改變而穩(wěn)定化。17.權(quán)利要求15的嵌合PIV，其中所述基因組或反基因組包含至少一個(gè)直至全部減毒突變，其導(dǎo)致了以下氨基酸取代在L蛋白中相應(yīng)于JS的Tyr942、Leu992或Thrl558的位點(diǎn)處，在N蛋白中相應(yīng)于JS的殘基Val96或Ser389的位點(diǎn)處，在C蛋白中相應(yīng)于JS的Ile96的位點(diǎn)處，在M蛋白中相應(yīng)于JS的Pro199的位點(diǎn)處，在F蛋白中相應(yīng)于JS的殘基Ile420或Ala450的位點(diǎn)處，在FIN蛋白中相應(yīng)于JS的殘基Val384的位點(diǎn)處；嵌合病毒3，前導(dǎo)序列在相應(yīng)于JScp45的23、24、28或45位核苷酸的位點(diǎn)處的核苷酸取代；和/或N基因起始序列在相應(yīng)于JScp45的62位核苷酸位置處的突變。18.權(quán)利要求15的嵌合PIV，其中所述額外的突變是在PIVN、P、C、D、V、M、F、HN和/或L基因中的一種或多種和/或3'前導(dǎo)區(qū)、5'非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)、RNA編輯位點(diǎn)、包殼信號(hào)和/或基因間區(qū)中的點(diǎn)突變。19.權(quán)利要求1的嵌合PIV，其中所述嵌合基因組或反基因組的一種或多種基因通過(guò)以下突變整體或部分刪除或基因的表達(dá)降低或消除RNA編輯位點(diǎn)中的突變，移碼突變，改變起始密碼子指定的氨基酸的突變，或在所述基因的可讀框(ORF)中引入一種或多種終止密碼子。20.權(quán)利要求19的嵌合PIV，其中在所述嵌合基因組或反基因組中引入修飾，包括C、D和/或VORF中一種或多種的部分或完全刪除，或者減少或消除所述C、D和/或VORF中一種或多種的表達(dá)的一種或多種核苷酸改變。21.權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的嵌合PIV，其中所述嵌合基因組或反基因組被進(jìn)一步修飾，以編碼能引發(fā)哺乳動(dòng)物宿主的保護(hù)性免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子、輔助T淋巴細(xì)胞表位、限制性位點(diǎn)標(biāo)記或微生物病原的蛋白。22.權(quán)利要求5的嵌合PIV，其中所述嵌合基因組或反基因組進(jìn)一步包含編碼一種或多種異源病原的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組區(qū)段。23.權(quán)利要求22的嵌合PIV，其中背景基因組或反基因組是部分或完整的HPIV3基因組或反基因組，并且編碼抗原決定簇的異源基因或基因組區(qū)段是一種或多種異源HPIV。24.權(quán)利要求22的嵌合PIV，其中所述嵌合基因組或反基因組包含導(dǎo)致減毒的BPIV的一種或多種基因或基因組區(qū)段。25.權(quán)利要求2的嵌合PIV，其中編碼一種或多種HN和/或F糖蛋白或其抗原結(jié)構(gòu)域、片段或表位的一種或多種HPIV1或HPIV2基因或基因組區(qū)段，被加入或合并到所述部分或完整的HPIV3載體基因組或反基因組中。26.權(quán)利要求25的嵌合PIV，其中編碼HN和F糖蛋白的兩種HPIV1基因均取代了嵌合基因組或反基因組中的對(duì)應(yīng)HPIV3HN和F基因，并且編碼HPIV2的一種或多種抗原決定簇的一種或多種基因或基因區(qū)段被加入到嵌合基因組或反基因組中。27.權(quán)利要求26的嵌合PIV，其中包含HPIV2HN或F基因的可讀框(ORF)的轉(zhuǎn)錄單位被添加到嵌合基因組或反基因組中。28.權(quán)利要求2的嵌合PIV，其中背景基因組或反基因組是BPIV基因組或反基因組，并且其中所述一種或多種基因或基因區(qū)段編碼一種或多種HPIV1、HPIV2或HPIV3HN和F糖蛋白或者其抗原結(jié)構(gòu)域、片段或表位。29.權(quán)利要求22的嵌合PIV，其中所述異源病原選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A亞型和B亞型、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、EB病毒、線(xiàn)狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、甲病毒和流感病毒。30.權(quán)利要求29的嵌合PIV,其中所述一種或多種異源抗原決定簇選自麻疹病毒的HA和F蛋白、呼吸道合胞病毒A亞型或B亞型的F、G、SH和M2蛋白、腮腺炎病毒的HN和F蛋白、人乳頭瘤病毒L1蛋白、人免疫缺陷病毒1型和2型的gpl60蛋白、單純皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒的gB、gC、gD、gE、gG、gH、gl、gj、gK、gL和gM蛋白、狂犬病病毒G蛋白、EB病毒gp350蛋白、線(xiàn)狀病毒G蛋白、布尼亞病毒G蛋白、黃病毒E和NS1蛋白和甲病毒E蛋白，以及其抗原結(jié)構(gòu)域、片段和表位。31.權(quán)利要求30的嵌合PIV，其中所述異源病原是麻疹病毒，而所述異源抗原決定簇選自麻疹病毒HA和F蛋白以及其抗原結(jié)構(gòu)域、片段和表位。32.權(quán)利要求31的嵌合PIV,其中包含麻疹病毒HA基因的可讀框(ORF)的轉(zhuǎn)錄單位被添加到包含HPIV3背景基因組或反基因組的嵌合基因組或反基因組中。33.權(quán)利要求22的嵌合PIV，其包含來(lái)自呼吸道合胞病毒(RSV)的基因或基因組區(qū)段。34.權(quán)利要求33的嵌合PIV，其中所述來(lái)自RSV的基因或基因組區(qū)段編碼RSVF和/或G糖蛋白或其免疫原性結(jié)構(gòu)域或表位。35.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合PIV，其是亞病毒顆粒。36.—種用于引發(fā)抗PIV的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，其在生理上可接受的載體中包含免疫充分量的任何前述權(quán)利要求的嵌合PIV。37.權(quán)利要求36的免疫原性組合物，配制成10、1(^PFU的劑量。38.權(quán)利要求36或37的免疫原性組合物，配制用于通過(guò)噴霧、滴劑或氣霧劑向上呼吸道給藥。39.權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述嵌合PIV引發(fā)對(duì)抗至少兩種選自HPIV1、HPIV2和HPIV3的病毒的免疫應(yīng)答。40.權(quán)利要求39的免疫原性組合物，其中所述嵌合PIV引發(fā)對(duì)抗HPIV3和選自HPIV1和HPIV2的另一病毒的免疫應(yīng)答。41.一種分離的多核苷酸分子，包括編碼權(quán)利要求l-35任一項(xiàng)的嵌合PIV的基因組或反基因組的多核苷酸。42.從一種或多種編碼所述PIV的分離的多核苷酸分子制備感染性減毒的嵌合PIV顆粒的方法，包括在細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞裂解物中表達(dá)表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求41的分離的多核苷酸和PIVN、P和L蛋白。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述嵌合PIV基因組或反基因組和N、P和L蛋白由兩種或多種不同的表達(dá)載體表達(dá)。44.一種表達(dá)載體，包含可操作連接的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、權(quán)利要求41的多核苷酸序列和轉(zhuǎn)錄終止子。全文摘要本發(fā)明提供了減毒的感染性人-牛嵌合副流感病毒(PIV)，包含主要核殼(N)蛋白、核殼磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)和組合了不同PIV的一種或多種異源基因或基因組區(qū)段以形成人-牛嵌合PIV基因組或反基因組的人PIV(HPIV)或牛PIV(BPIV)的部分或完整PIV背景基因組或反基因組，至少一種所述異源基因或基因區(qū)段編碼PIVP蛋白。本發(fā)明還提供了編碼所述病毒基因組或反基因組的分離多核苷酸，通過(guò)表達(dá)所述多核苷酸而制備病毒的方法，以及包含免疫充分量的嵌合PIV的免疫原性組合物。文檔編號(hào)C07K14/115GK101392239SQ20081009852公開(kāi)日2009年3月25日申請(qǐng)日期2000年6月15日優(yōu)先權(quán)日1999年7月9日發(fā)明者亞歷山大·C·施密特,安娜·P·德賓,布賴(lài)恩·R·墨菲,彼得·L·柯林斯,簡(jiǎn)·E·貝利,馬里奧·H·斯基亞道普洛斯申請(qǐng)人:美國(guó)政府健康及人類(lèi)服務(wù)部