喜樹堿的分離提取方法

專利名稱：喜樹堿的分離提取方法
技術領域：
本發明涉及從植物中提取天然有效成份領域，尤其涉及一種以喜樹果 實、喜樹葉為原料，制取喜樹堿的分離提取方法。
(二) 背景技術-
喜樹堿(Camptothecin，CPT)，為淡黃色片狀結晶，分子式為 C20H16N2O4，分子量為348.3,分子結構式為
喜樹(Camptothecaacuminata Demce)是我國特有的一種高大落葉喬 木，屬山茱萸目珙桐科，廣泛分布于長江流域及南方各省區，廣西是重要 的主產地。1966年，美國的Monroe E. Wall首次從喜樹提取物中分離出 喜樹堿，經腫瘤試驗證明這種色氨酸一萜烯類生物堿具有抗癌活性，引起 了人們的廣泛關注。20世紀70年代的研究發現喜樹堿對胃癌、結腸癌、 肝癌、膀胱癌、白血病、慢性粒細胞性血友病等多種惡性腫瘤均有獨特療 效。到1985年Y. H. Hsiang發現喜樹堿能阻斷拓撲異構酶I (T叩o I)的 合成，Topo I是一種與細胞分裂密切相關的一種酶，阻斷這種酶的產生即 可阻止癌細胞的生長，這正是喜樹堿獨特的抗癌機理，這一發現又掀起了 喜樹堿及其衍生物研究的新高潮。
目前，喜樹堿一般從喜樹中提取得到。國家知識產權局分別于以下時 間公開了幾種有關喜樹堿提取工藝的專利工藝1: 1996年5月8是公開 的一種喜樹堿的提取方法，專利公開號為CN1121920，該發明專利以喜樹 果實或根皮為原料，采用磨粉一水煮一煮液濃縮一膏狀物一乙醇分離樹膠 雜質一析出粗品一氯仿混合液多次重結晶后得到產品的工藝路線，并在磨 粉一水煮操作中加入抗氧劑。本方法設備投資少，干燥產品的純度92%， 產出率約為2/10000;工藝2: 1999年12月22日公開的一種喜樹堿的生 產方法，專利公開號為CN1239096，該發明以喜樹葉為主要原料，果實為 輔助原料，經粉碎一乙醇滲漉一超臨界二氧化碳萃取滲漉提取后的剩余物
料一濃縮滲漉液和萃取液一大孔吸附樹脂柱層析一重結晶得到產品的工
藝路線，產品純度為97.5%，產率2/10000 3/10000;工藝3: 2000年4 月26日公開的一種喜樹堿的生產方法，專利公開號為CN1251366，該發明 以喜樹葉及種子為原料，經粉碎一乙醇及水滲漉一濃縮滲漉液一大孔吸附 樹脂柱層析一重結晶后得到產品的工藝路線，產品純度為97.5%,產率 2/10000 3/10000;工藝4: 2003年4月16日公開的喜樹堿的生產工藝， 專利公開號為CN1410426，該發明以喜樹葉為原料，經粉碎一乙醇或堿水 萃取一萃取液濃縮至浸膏一溶劑萃取并結晶得粗品一重結晶后得到產品 的工藝路線，產品純度為97. 5%，產率2/10000;工藝5: 2005年6月1 日公開的喜樹堿的生產工藝，專利公開號為CN1621406，該發明以喜樹堿 含量為8/10000 10/10000喜樹果實為原料，經粉碎一乙醇滲漉一濃縮滲 漉液一濾過得濾液一溶劑萃取一混合溶劑1重結晶純化一混合溶劑2重結 晶純化得粗晶一混合溶劑3精制純化得精品，產品純度94%，產品收率 4.0/10000。
本申請人經研究發現，工藝1和工藝4的產品得率均較低，約為 2/10000;工藝2和工藝3的產品得率均不超過3/10000，其中工藝2中還 采用了超臨界二氧化碳萃取，生產工藝較為復雜，生產設備投資較大，成 本較高；工藝5的產品的得率雖可達到4/10000，但其前提條件是選用的 原料中的喜樹堿的含量須達到8/10000 10/10000喜樹果實，而且由于僅 以喜樹果實為原料，也受到季節性的限制。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種以喜樹果實、喜樹葉為原料，原 料中的有效成分(喜樹堿)提取得率高、產品純度好的喜樹堿的分離提取 方法。
能實現上述目的的喜樹堿的分離提取方法，以喜樹果、喜樹葉為原料， 經粉碎一稀氫氧化鈉溶液浸提一浸提液酸沉除雜一微濾一超濾一納濾一 大孔吸附樹脂柱層析一乙醇解吸，乙醇解吸液濃縮至浸膏一乙酸乙酯萃 取，萃取液結晶，得到喜樹堿粗品一乙酸乙酯-丙酮的混合溶液進行重結 晶得到喜樹堿精品。
喜樹果實、喜樹葉中喜樹堿的含量變化較大，在2/10000 14/10000 之間，本發明優選以喜樹堿含量為7/10000 8/10000的喜樹果實、喜樹 葉為原料；克服了單以喜樹果實為原料受到的季節性限制問題，充分保證 了原料的來源。所述原料的粉碎程度可根據需要確定， 一般進行粗粉即可， 即粉碎后的原料的粒度不小于20目。
為了充分浸出原料中的有效成分喜樹堿，可將原料以稀氫氧化鈉溶液 進行多次浸提， 一般以浸提3次為宜，每次浸提的時間和稀氫氧化鈉溶液 的用量可根據需要確定， 一般為每次浸提2 3小時，每次浸提稀氫氧化
鈉溶液的用量為15 20m1/ (g原料)；浸提完成后，合并3次浸提的浸提 液再進入下道工序。浸提一般在常溫下進行，所述稀氫氧化鈉溶液為質量 濃度為0. 5% 1. 5%的氫氧化鈉溶液。
所述浸提液酸沉除雜，是將浸提液的pH值調至中性，再經120 300 目的濾布進行粗過濾的過程。由于浸提液在經稀氫氧化鈉溶液浸泡時，必 然地帶入了一定量的雜質，為了除去這些雜質及浸提液中的大顆粒物質， 可先將浸提液的pH值調至中性，再經120 300目的濾布進行粗過濾以達 到上述目的。其中，調浸提液的pH值時可用鹽酸，或硫酸，或醋酸等其 它可將浸提液PH值調至中性的酸。
為了進一步除去浸提液中的懸浮固體、細菌、膠體、固體蛋白等微粒 及大分子雜質，還可將粗過濾后的浸提液用微濾膜進行微濾；所述微濾膜 可為陶瓷膜或金屬膜，最好是采用30nm的陶瓷膜進行微濾。
對微濾后的浸提液用截留分子量為10000的膜進行超濾，以去除浸提 液中分子量大于10000的物質。
對超濾后的浸提液用截留分子量為200的膜進行納濾濃縮。在此納濾 過程中，無機鹽和水可以通過，使浸提液中溶劑和溶質分開，達到濃縮 的目的，且在濃縮過程中無相變。
所述大孔吸附樹脂可為極性大孔吸附樹脂，也可為非極性大孔吸附樹 脂，優選AB-8，或HPDIOO，或HPD300，或D101大孔吸附樹脂；其中以 AB-8為最佳。納濾濃縮后的浸提液直接上大孔吸附樹脂柱吸附，上樣的流 速以3 8倍柱體積/小時為宜，直至大孔吸附樹脂柱飽和(通過高效液相 色譜測定)；然后用水洗至洗滌液無色，以除去無機鹽等樹脂不吸附的雜 質，再用乙醇解吸；所述解吸所用的乙醇可為體積濃度為50% 90%的乙醇 水溶液，其用量一般為2. 5 3. 5倍柱體積；所述乙醇解吸液濃縮成浸膏 狀，其比重一般為30 35波美。
為了將浸膏中所含的有效成分喜樹堿更完全的萃取出來，可用乙酸乙 酯對浸膏進行3次萃取；其中，第一次萃取時，乙酸乙酯的用量為8 10m1/ (g浸膏)；第二次萃取時，乙酸乙酯的用量為4 6m1/(g浸膏)；第三次 萃取時，乙酸乙酯的用量為2 4m1/ (g浸膏)。合并萃取液，將其濃縮后 放置析晶，析出的晶體即為喜樹堿粗品。為了使萃取液中的喜樹堿更好的 析晶出來，可將合并后的萃取液濃縮至乙酸乙酯總用量的0. 02 0. 03倍。
所述乙酸乙酯-丙酮的混合溶液中乙酸乙酯與丙酮體積比為1: 4 4: 1，其用量為5 10m1/ (g喜樹堿粗品)；所述重結晶的次數為2 3次。
還可對重結晶得到的喜樹堿精品進行常規的干燥、粉碎、包裝，得到 喜樹堿產品。
本發明的優點在于
1、以喜樹果實、喜樹葉為原料生產喜樹堿，原料采收方便，對喜樹 資源無破壞，實現了資源的可持續利用，解決了原料供應受季節性限制
的問題；
2、 該發明在整個生產過程中不使用氯仿等毒性大的有機溶劑，降低 了對生產操作人員健康的危害；
3、 本發明工藝簡單，操作容易，易于工業化生產；
4、 采用膜分離技術，分離效率高，設備體積小，膜分離的處理能力 易于放大，且易與其他提取工藝耦合；
5、 本發明通過多次浸提充分浸出原料中的有效成分，再經微濾、超 濾、納濾濃縮、大孔吸附樹脂柱層析及多次結晶的工藝，使得本發明的 提取率可達到原料中有效成分喜樹堿含量的70% 80%，提取得到的產品 純度可達98%以上；當選用喜樹堿含量為7/10000 8/10000的原料進行 分離提取時，其產品得率可達到5/10000 6/10000，產品純度為98.5%。
具體實施例方式
實施例1
取10千克喜樹堿含量為7/10000 8/10000的喜樹果實干品，粉碎至 20目；先用150升質量濃度為0. 5%的氫氧化鈉溶液在常溫下浸提2小時， 分離出喜樹果實;再加入200升質量濃度為0. 5%的氫氧化鈉溶液在常溫下 浸提2小時，分離出喜樹果實；再加入150升的質量濃度為0. 5%的氫氧化 鈉溶液在常溫下浸提2小時，分離出喜樹果實，合并三次浸提的浸提液； 用鹽酸將其pH值調至中性，再經120目的濾布進行粗濾；對粗濾后的浸 提液用30nm的陶瓷膜進行微濾；對微濾后的浸提液進行截留分子量為 10000的超濾；對超濾后的浸提液進行截留分子量為200的納濾濃縮；所 得濃縮液以5倍柱體積/h的流速，上AB-8大孔吸附樹脂柱進行吸附，吸 附后用去離子水洗至洗滌液無色后，再用2. 5倍柱體積、體積濃度為80% 的乙醇水溶液進行解吸，收集解吸液，將其在70 8(TC條件下減壓濃縮得 到1千克比重為35波美的浸膏；將浸膏分別以8升、5升、3升的乙酸乙 酯萃取3次，合并萃取液，并濃縮至0.32升，放置12小時后析出喜樹堿 粗品15克；再分別用75毫升、100毫升的乙酸乙酯-丙酮混合溶液(1: 1) 對喜樹堿粗品進行重結晶，得到5.10克喜樹堿產品；其純度為98.53%， 得率為5.1/10000。
實施例2
取100千克喜樹堿含量為3/10000 4/10000的喜樹葉干品，粉碎至 10 20目；先用2000升質量濃度為1. 0%的氫氧化鈉溶液在常溫下浸提3 小時，分離出喜樹葉；再加入2000升質量濃度為1.0%的氫氧化鈉溶液在 常溫下浸提2小時，分離出喜樹葉；再加入2000升的質量濃度為1. 0%的 氫氧化鈉溶液在常溫下浸提2小時，分離出喜樹葉，合并三次浸提的浸提 液；用硫酸將其pH值調至中性，再經300目的濾布進行粗濾；對粗濾后 的浸提液用30nm的金屬膜進行微濾；對微濾后的浸提液進行截留分子量
為10000的超濾；對超濾后的浸提液進行截留分子量為200的納濾濃縮； 所得濃縮液以8倍柱體積/h的流速，上D101大孔吸附樹脂柱進行吸附， 吸附后用蒸餾水洗至洗滌液無色后，再用3. 5倍柱體積、體積濃度為50% 的乙醇水溶液進行解吸，收集解吸液，將其濃縮得到13千克比重為30波 美的浸膏；將浸膏分別以130升、52升、52升的乙酸乙酯萃取3次，合 并萃取液，并濃縮至7升，放置14小時后析出喜樹堿粗品50克；再分別 用500毫升、400毫升、300毫升乙酸乙酯-丙酮的混合溶液(1: 4)對喜 樹堿粗品進行重結晶，得到25.2克喜樹堿產品；其純度為98.12%，得率 為2.52/10000 。
實施例3
取500千克喜樹堿含量為6/10000的喜樹葉干品，粗粉后先用8000 升質量濃度為1. 0%的氫氧化鈉溶液在常溫下浸提3小時，分離出喜樹葉； 再加入10000升質量濃度為1. 5%的氫氧化鈉溶液在常溫下浸提2小時，分 離出喜樹葉；再加入7500升的質量濃度為0. 5%的氫氧化鈉溶液在常溫下 浸提3小時，分離出喜樹葉，合并三次浸提的浸提液；用醋酸將其pH值 調至中性，再經200目的濾布進行粗濾；對粗濾后的浸提液用30nm的陶 瓷膜進行微濾；對微濾后的浸提液進行截留分子量為10000的超濾；對超 濾后的浸提液進行截留分子量為200的納濾濃縮；所得濃縮液以3倍柱體 積/h的流速，上HPD300大孔吸附樹脂柱進行吸附，吸附后用去離子水洗 至洗滌液無色后，再用3倍柱體積、體積濃度為90%的乙醇水溶液進行解 吸，收集解吸液，將其濃縮得到60千克比重為32波美的浸膏；將浸膏分 別以540升、300升、120升的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，并濃縮 至24升，放置12小時后析出喜樹堿粗品450克；再分別用4500毫升、 2700毫升的乙酸乙酯-丙酮混合溶液(2: 3)對喜樹堿粗品進行重結晶， 得到238克喜樹堿產品；其純度為98.08%，得率為4. 76/10000。
權利要求
1、喜樹堿的分離提取方法，其特征在于以喜樹果、喜樹葉為原料，經粉碎→稀氫氧化鈉溶液浸提→浸提液酸沉除雜→微濾→超濾→納濾→大孔吸附樹脂柱層析→乙醇解吸，乙醇解吸液濃縮至浸膏→乙酸乙酯萃取，萃取液結晶，得到喜樹堿粗品→乙酸乙酯-丙酮的混合溶液進行重結晶得到喜樹堿精品。
2、 根據權利要求1所述的喜樹堿的分離提取方法，其特征在于所 述稀氫氧化鈉溶液浸提的次數為3次，每次浸提2 3小時；每次浸提時，稀氫氧化鈉溶液的用量為15 20m1/ (g原料)。
3、 根據權利要求1所述的喜樹堿的分離提取方法，其特征在于所述微濾是將粗過濾后的浸提液用微濾膜迸行過濾。
4、 根據權利要求3所述的喜樹堿的分離提取方法，其特征在于所 述微濾膜為30nm的陶瓷膜。
5、 根據權利要求1所述的喜樹堿的分離提取方法，其特征在于所述超濾是將微濾后的浸提液用截留分子量為10000的膜過濾。
6、 根據權利要求1所述的喜樹堿的分離提取方法，其特征在于所述納濾是將超濾后的浸提液用截留分子量為200的膜過濾。
7、 根據權利要求1 6中任何一項所述的喜樹堿的分離提取方法，其 特征在于所述解吸所用的乙醇是體積濃度為50% 90%的乙醇水溶液，其 用量為2.5 3.5倍柱體積。
8、 根據權利要求1 6中任何一項所述的喜樹堿的分離提取方法，其 特征在于所述浸膏用乙酸乙酯萃取3次，第一次萃取時，乙酸乙酯的用 量為8 10m1/ (g浸膏)；第二次萃取時，乙酸乙酯的用量為4 6 m1/ (g 浸膏)；第三次萃取時，乙酸乙酯的用量為2 4m1/ (g浸膏)。
9、 根據權利要求1 6中任何一項所述的喜樹堿的分離提取方法，其 特征在于所述乙酸乙酯-丙酮的混合溶液中乙酸乙酯與丙酮的體積比為 1: 4 4: 1，其用量為5 10m1/ (g喜樹堿粗品)。
10、 根據權利要求1 6中任何一項所述的喜樹堿的分離提取方法， 其特征在于所述重結晶的次數為2 3次。
全文摘要
本發明涉及從植物中提取天然有效成份領域，具體為喜樹堿的分離提取方法，其工藝路線為以喜樹果、喜樹葉為原料，經粉碎→稀氫氧化鈉溶液浸提→浸提液酸沉除雜→微濾→超濾→納濾→大孔吸附樹脂柱層析→乙醇解吸，乙醇解吸液濃縮至浸膏→乙酸乙酯萃取，萃取液結晶，得到喜樹堿粗品→乙酸乙酯-丙酮的混合溶液進行重結晶得到喜樹堿精品。本發明喜樹堿的分離提取方法通過多次浸提充分浸出原料中的有效成分，再經微濾、超濾、納濾濃縮、大孔吸附樹脂柱層析及多次結晶的工藝，使得本發明的提取率可達到原料中有效成分喜樹堿含量的70％～80％，提取得到的產品純度可達98％以上。
文檔編號C07D491/22GK101348488SQ20081007378
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月12日 優先權日2008年9月12日
發明者呂光政, 龐顯庭, 龐玉萍, 蓮 陳, 陳元勝, 韋彩珠 申請人:桂林普蘭德生物科技有限公司