一種蛇毒抗腫瘤的細胞毒素及其生產工藝的制作方法

專利名稱：一種蛇毒抗腫瘤的細胞毒素及其生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及生化與生物醫藥領域，具體的說是一種蛇毒細胞毒素及其生產 工藝。
技術背景細胞毒素的分離純化最早是在1947年由印度學者用鹽析法(Na2S04和NaCl)從印度眼鏡蛇毒中分離得到的；接著RavdonatandHoller用紙層析法；Braganca等經CM-celMose離子交換層析、Sephadex G-50凝膠過濾等步驟分離出CytotoxinP6;杜雨蒼等用SP-SephadexC-25陽離子交換層析從中華眼鏡蛇毒中分離出5個細胞毒素。但隨著對細胞毒素研究的深入，許多學者注意到采用傳統的分離方法會出現痕量的磷脂酶A2 (PLA2) (0.1 0.5%,w/w)與CTX共同洗脫下來，而PLA2與CTX會產生協同作用，可使CTX的溶血作用顯著增強，也可使它的細胞毒性增加數倍，嚴重干擾了對CTX的生物學活性及其作用機制的研究，因此分離得到不含PLA2的CTX很重要。Hodges等介紹了一種新的從眼鏡蛇毒中分離純化細胞毒素同系物的方法(1)粗毒過SephadexG-50凝膠過濾柱去除大分子雜蛋白，得主要毒素峰；(2)主峰過SP-SephadexC-25陽離子交換層析，線性梯度洗脫得一系列蛋白峰；(3)主峰再過反相高效液相(RP-HPLC)。這種方法對去除痕量磷脂酶A2很有效，同時也保留了CTX的全部生物學活性。 發明內容為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種具有抗腫瘤作用的蛇 毒細胞毒素純品及其生產工藝。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是--種具有抗腫瘤作用的蛇毒細 胞毒素，其特征是取之于現有眼鏡蛇毒凍干粉。所述的眼鏡蛇毒凍干粉是未經雙蒸水溶解的。一種具有抗腫瘤作用的蛇毒細胞毒素生產工藝，其特征是1) 去雜質的眼鏡蛇毒凍干粉未經適量的雙蒸水溶解后，hSP S印harose High Performance陽離子交換柱層析，得20個蛋白峰(I一XX )，收集具有細胞毒素 活性的XII、 XIII峰。2) 收集具有細胞毒素活性的Xn、 XIII峰分別上經Source 30RPC反相層析， 分別得到主蛋白峰一個，即細胞毒素XII和細胞毒素XIII。所述的SP Sepharose High Performance (GE Healthcare公司產品)。所述的Source 30RPC(GE Healthcare公司產品)。 本發明的有益效果是本發明的生產工藝第l步驟與現有技術不同的是 選用高分辨率快速陽離子交換介質SP S印harose H. P ,在MTAexpl。rer蛋白純化 系統進行分離純化，因而獲得高分辨率的分離效果，故可獲得20個蛋白峰，而 使用現有技術工藝最多獲得15個蛋白峰；在AKTAexplorer蛋白純化系統用SP S印harose H. P分離蛋白質不僅分辨率極高，而且有良好的重復性和工藝放大能 力。本發明的第2步驟選用高速低反壓高分辨率Souixe 30RPC介質，獲得高分辨 率精細純化效果，第1步驟獲得的細胞毒素組分經第2步純化即獲得不含PLA的細 胞毒素純品，比現有技術純化步驟具有快速重復性好，適合放大生產。
以下結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明圖l為蛇毒經SP-S印harose H. P陽離子交換柱層析圖譜。圖中眼鏡蛇毒粗毒經SP-S印harose H. P陽離子交換色譜分離得到20個蛋白峰，分別記為i 、 n、 m、 iv、 v、 vi、 vn、 vni、 ix、 x、 xi、 xii、 xm、 xiv、 xv、 xn、 xvn、 xvm、 xn和xx。測定各洗脫峰對大鼠離體心臟和離體 隔神經隔肌標本的影響的影響，發現組分x工、XII、 xin和xiv具有抑制心臟 收縮幅度，使心臟停于收縮期，能抑制直接刺激膈肌引起的收縮，初歩鑒定為細胞毒素組分。圖2和圖3為具有細胞毒活性蛋白峰經Source30 RPC反向層析圖譜。 將XII、 XlII用Source30 RPC柱進一步純化，各得到主蛋白峰l個，分別記為CTX—XII 和CTX_XIII。經鑒定他們均具有殺傷腫瘤細胞作用。其中圖2為Source 30RPC反相層析純化CTX-XII; 圖3為Source 30RPC反相層析純化CTX-XIII。
具體實施方式
實施例1:1、眼鏡蛇毒粗毒的離子交換色譜取舟山眼鏡蛇毒粗毒10,0g溶于雙蒸水100ml中，4"C過夜低溫(4 。C) 15000Xg離心15 min，取上SP S印harose High Performance陽離子交換 層析柱(5.0X29cm)，用O. 05mol / L磷酸緩沖液(pH 5. 8)及O. 0-0. 5 mol / L NaCl階段性梯度洗脫，10ml/管，流速18ml/min，用MTA Explorer蛋白純化 系統監測收集洗脫峰。結果眼鏡蛇毒粗毒的SP S印harose H. P柱層析分離 共得20個蛋白峰(參見

圖1)。 2、各分離組分的生物活性鑒定 1)組分對大鼠離體心臟灌流的影響 參照Langendorff法，健康SD系大鼠處死后迅速取出心臟(心臟上連有約 lcm長的主動脈)，立即置入氧飽和的Krebs液(每升Krebs含NaCl 6.9g， KC1 0.35g， MgS04 7H20 0.29g， KH2P04 0'16g， Glucose 2g， NaHC03 2.1g，無水 CaCl2 0.28g ， pH7.0)中，輕輕擠壓心臟，主動脈固定于心臟套管上，37。C恒 溫水浴，Kreb's液灌流，持續通02，藥液從心臟套管注入，心臟收縮力通過張 力換能器描計于二道生理記錄儀上。各組分對大鼠離體心臟標本的影響結果 組分I一X和XVI—XX對Langendorff心臟標本收縮作用無影響；組分XI XV使大鼠離體Langendorff心臟收縮幅度減少，最后停搏于收縮期(參見圖2)。 2)組分對大鼠離體膈神經-膈肌標本的影響參照Bulbring法制備標本，取SD系大鼠處死后，自胸骨左緣打開胸腔，分 離膈神經，保留部分肋骨和中心腱，膈肌制成扇形，將標本立即置入氧飽和的 Kreb's液中，把中心腱連接線與換能器相連，肋骨端連接線放入盛有Kreb's液的 恒溫3(TC水浴槽中(持續通02)，并固定好兩個刺激電極，用0.5ms超強方波， 每5min交替刺激神經和肌肉，收縮張力通過換能器描計于二道生理記錄儀上， 描計一段曲線作對照，向浴槽內加入待測組分。觀察各組分對大鼠離體膈神經-膈肌標本的影響結果組分VIII — X有神經肌肉阻斷作用，抑制間接刺激膈肌引 起的收縮；組分XI XV能抑制直接刺激膈肌引起的收縮(參見圖2)。由此鑒 定組分VIII—X為神經毒素，XI XV為細胞毒素。3、 細胞毒素的精細純化 Source 30RPC反相層析純化CTX經SP-S印harose H. P陽離子交換柱分離所得到的XII、XI11峰再過Resource 30RPC反相層析。洗脫條件A液為0. lyoTFA+iO。/。乙腈;B液為 . 12%TFA+70%& 腈，線形梯度洗脫，監測波長280nm，洗脫速度為10ml/niin。4、 理化性質測定1)純度鑒定采用SDS-PAGE (Tris-Tricine系統)堿性不連續電泳。凝 膠濃縮膠4%T， 3%C;分離膠16.5%T， 6%C。負極緩沖液O.lmol/LTris， 0.1mol/LTricine， 0.1%SDS， pH8.25;正極緩沖液0.2mol/L Tris， pH 8.9。在 Hoefer電泳儀上電泳，穩流40mA。凝膠用0.025X考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)R-250染色，7%冰醋酸脫色。在SDS-PAGE (Tris-Tricine系統)上，組分 XII XHI均呈單一條帶。2.4.2分子量測定SDS-PAGE (Tris-Tricine系統)得到的凝膠，在ImageMaster VDS凝膠成像系統上計算CTXXII XI11的分子量估計值。分子量為 7.235禾B 7.381kDa。2、 4、 3、磷脂酶A2(PLA2)活力測定稱取500mg卵磷脂加入0.01M脫氧膽酸10ml，在瑪瑙研缽里研磨使之乳化， 然后加入0.01M CaCl210ml， 1M NaCl lOml，混勻后用2M KOH調PH為8.0， 用水稀釋至100ml，每次取10ml作測定用。加蛇毒樣品溶液100uJ (含毒lmg)， 37'C恒溫，用0.02MKOH滴定游離脂肪酸，記錄半小時的不同時間消耗的KOH 的ml數，換算成脂肪酸的umol數，作圖。以初速的直線部分計算比活，單位 為游離脂肪酸的umol數/mg蛇毒，分鐘。結果酶活力測定結果均為0，顯示組 分X XHI均不混有磷酯酶A2。本實施例所述的細胞毒素活性鑒定及其抗腫瘤活性測定方法同文獻"1. 舟山眼鏡蛇毒細胞毒素的分離純化及其體外抗腫瘤活性中國生化藥物雜志 2003;24(3):127-30; 2.舟山眼鏡蛇毒細胞毒素-F的體內抗腫瘤作用福建醫科 大學學報2003; 37(3) :298-300; 3.舟山眼鏡蛇毒細胞毒素-F對人鼻咽癌細胞 和乳心肌細胞的作用研究福建醫科大學學報2004; 38(2) :121-124 "等。
權利要求
1. 一種具有抗腫瘤作用的蛇毒細胞毒素，其特征是蛇毒細胞毒素取之于現有眼鏡蛇毒凍干粉。
2、 根據權利要求l所述的蛇毒細胞毒素，其特征是:所述的眼鏡蛇毒凍干粉是 未經雙蒸水溶解的。
3、 一種具有抗腫瘤作用的蛇毒細胞毒素生產工藝，其特征是1) 去雜質的眼鏡蛇毒凍干粉未經適量的雙蒸水溶解后，上SPS印haroseHigh Performance陽離子交換柱層析，得20個蛋白峰I一XX ，分別收集具有細胞毒素 活性的XII、 XIII峰；2) 收集具有細胞毒素活性的XII、 Xin峰分別上經Source 30RPC反相層析，分別得到主蛋白峰一個，即細胞毒素xn和細胞毒素xin。
全文摘要
本發明公開了一種蛇毒抗腫瘤的細胞毒素及其生產工藝，屬生化與生物醫藥領域。本發明蛇毒細胞毒素取之于現有眼鏡蛇毒凍干粉。本發明工藝為應用凍干眼鏡蛇毒用已知的緩沖液溶解上SP-Sepharose H.P陽離子交換柱(5.0×29cm)，用磷酸緩沖液和NaCl階段性梯度洗脫，10ml/管，流速18ml/min，用KTAExplorer蛋白純化系統監測收集洗脫峰，收集具有細胞毒作用的XII、XIII峰，再經Source 30RPC反相層析，分別得到細胞毒素XII和細胞毒素XIII，它們分子量約為6000-7000道爾頓，等電點大于10。本發明獲得不含PLA₂的蛇毒抗腫瘤的細胞毒素純品，比現有技術純化步驟具有快速重復性好，適合放大生產等。
文檔編號C07K14/435GK101270159SQ20081007105
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月16日 優先權日2008年5月16日
發明者許云祿 申請人:福建醫科大學