專利名稱：家蠶微孢子蟲孢壁蛋白swp25基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種來自于家蠶微孢子蟲孢壁上的與家蠶相互 作用的孢壁蛋白基因SWP25。
技術背景微孢子蟲(臉c/Y^wri'力'a)隸屬于原生生物界(尸roWste)、微孢子蟲門(吣'cro邵ora) (Levine and Corliss 1980)，近期研究表明微孢子蟲在進化上與真菌有著緊密的親緣關 系。微孢子蟲近150個屬1300余種，是專營細胞內寄生，具有抗性極強的孢子，通過極 管刺入宿主組織細胞后將其孢原質注入細胞，完成感染并大量增殖，最終破壞宿主組織。 它能廣泛寄生感染無脊椎動物和脊椎動物，尤其是極具經濟價值的昆蟲、魚類、嚙齒類、 兔類、皮毛動物、靈長類以及家庭寵物如狗和鳥，引發疾病甚至死亡。其中家蠶微孢子蟲 (/Vbse歷a Zw/^/":),能經食下和胚種途徑寄生于家蠶，引發嚴重的傳染性微粒子病，最 終導致家蠶大規模死亡，給世界蠶業造成巨大的經濟損失，成為近100年來影響蠶業生產 的難題。另外新發現，許多屬的微孢子蟲與人類疾病有關，如角膜病、角膜結膜炎、呼吸 疾病、前列腺肥大和擴散感染、肝炎、腦炎、痢疾、肌炎、膽管炎等等，甚至還能機會性 地感染艾滋病(AIDS)患者、器官移植病人、服用免疫抑制劑藥物病人和先天性免疫機能 不健全者，引起呼吸系統、泌尿系統和皮膚潰爛等惡性疾病，加劇病情，加速病人的死亡。 對于微孢子的治療已有報道，如煙曲霉素及它的衍生物抑制甲硫氨酸氨基肽酶2的活 性，阿苯達唑和苯丙咪唑能夠抑制微管蛋白形成，它們被鑒定為治療微孢子的有用藥劑， 然而，對于治療感染人類的多種微孢子仍沒有找到有效、安全的藥物。微孢子蟲能夠產生一種感染性的，能夠抵制環境的孢子，孢子彈出內部極絲并將其內 含物接種到臨近宿主細胞。孢子發芽機制一直吸引著微孢子蟲研究者們。近年來的研究表 明，在微孢子蟲受到外界刺激發芽之前，存在一個微孢子蟲孢子與宿主細胞相互接觸，以 提高宿主細胞感染率的過程，而微孢子蟲的孢壁蛋白在此過程中起著與宿主細胞相互識別 和粘附的作用，如果抑制了微孢子蟲孢子與宿主細胞的粘附作用，就可能降低了宿主細胞 的感染率甚至控制宿主細胞的感染，因此近年來微孢子蟲孢壁蛋白已成為該領域的研究焦 點。發明內容本發明基于蛋白質組學研究和基因組數據分析，克隆分析和免疫學鑒定家蠶微孢子蟲 孢壁蛋白基因SWP25，通過對家蠶微孢子蟲孢壁蛋白基因的克隆，得到了孢壁蛋白SWP25 的編碼序列，具體方法如下(1) 引物設計根據蛋白質組學的方法以及家蠶微孢子蟲的6倍基因組數據，獲得 孢壁蛋白SWP25編碼序列，利用引物設計軟件Primer 5.0進行引物設計，在正向引物加入 BamHI酶切位點，在反向引物加入XhoI酶切位點。引物序列分別為SWP25-primer-F: 5， GCGGATCCATGTTTTCAACTAAGCAAGT 3， SWP25-primer-R: 5'GGCTCGAGTTCATAACATCTAACCAATA 3，(2) NbSWP25基因PCR擴增由于微孢子蟲基因組的高度簡化特點，內含子很少， 基因組序列數據顯示SWP25基因不含內含子，故利用提取的微孢子基因組直接作為模板， 采用基因組PCR擴增目的片段。SWP25基因長度為804 bp;(3) NbSWP25基因克隆NbSWP25擴增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)載體上， 然后進行序列測定，從而獲得NbSWP25的全長編碼序列；(4) 序列分析將家蠶微孢子蟲NbSWP25蛋白與NCBI數據庫所登錄的蛋白質庫同 源比對分析，表明NbSWP25無同源序列存在。序列分析結果見下表Protein SP/Uh ESTNCBiTMD PredictedPredicted pl/MM HBM(Aa)homologueN-glycosylat phosphoryla (kDa) numberion sites tion sitesSWP25 20/268 Yes nono Yes Yes 8.35/30.7 1(5) 蛋白的鑒定將克隆的SWP25基因進行原核表達，制備抗血清，利用免疫印跡、 間接熒光免疫實驗對SWP25蛋白進行鑒定。結果表明SWP25蛋白質在家蠶微孢子蟲孢壁 上表達。上述方法獲得的NbSWP25基因編碼序列及其推斷的氨基酸序列如下 SWP25的序列1 atgttttcaactaagcaagtcgtgctaagctctcUUgtUataagtagcatctataca MFSTKQVVLSSLLFISSIYT61 agcaatgtaaatggtaagaacctttctgtattcggtgcctuttcggatcacctaatgst SNVNGKNLSVFGAFFGSPND121 aatgataatgcccgtgaacactgttgtagtccccgtaacaaatttcatcttacgagcttt NDNAREHCCSPRNKFH匕TSF181 agttctggatgtgatctcc肌a8ag肪gttg組gtctt卿gctgeiatgta朋a肪tccSSGCDLQKEVECLRAECKKS 241 aaagaatgttgcaatgtcgtctctttatgttctggacttagtgaatgtgaatacgttgaaKECCNVVSLCSGLSECEYVE 301 aaaacttgtgatgccstasaacsatactsccaaaascaagcaatasacacggacgtasagKTCDAIKQYYQKQAINTDVK 361 attacattagtcttaaaatggatttacaaatgtatgaacactacttctagggctaaattgITLVLKWIYKCMNTTSRAKLAVFTAHAIFNTSAFACLEAE 481 ggcacctggaaatacagatcaagaggtttacttgctatccaaggagaaaagaactatgggGTWKYRSRGLLAIQGEKNYG 541 cttttaacttcttactctagaaaccgtgaaaatttcaaagaatgtcctcatcgtttggctLLTSYSRNRENFKECPHRLA 601 gacttaaattgtgatgtcatcagtgttactgtcgactggtggtacaga組gtaggaaagDLNCDVISVTVDWWYRNVGK 661 tgttgtaaagattacttcggaagtcttgagattctaaagcctaccgaatggactgctttaCCKDYFGSLEILKPTEWTAL 721 83g3aa肪ctgtgccg3tagggagtctgctagaagattag8et8ac8g3ag肪gattgt3cKKNCADRESARRLENRRRLY 781 gaaatattggtt3g3tgttatgaata8EILVRCYE木本發明的優點是-(1) 微孢子蟲孢壁蛋白在孢子與宿主細胞相互粘附的過程中起著起要的作用，抑制 孢子與宿主細胞之間的粘附能有效控制微孢子蟲的感染。孢壁蛋白SWP25基因具有與宿主 細胞結合的潛在基序。(2) 序列分析結果顯示孢壁蛋白SWP25基因是家蠶微孢子蟲物種所特有的基因，實 驗證明針對SWP25蛋白的抗體與其他蛋白無交叉反應，可以用于家蠶微孢子蟲的免疫學 檢測，為蠶業生產上微粒子病檢測手段帶來革命性的改變。
具體實施例方式
實施例根據蛋白質組學的方法以及家蠶微孢子蟲的6倍基因組數據，通過基因組數據庫以及一系列的克隆與亞克隆，獲得家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP25基因編碼序列CDS，利用引 物設計軟件Primer 5.0進行引物設計，在正向引物加入BamH I酶切位點，在反向引物加 入XhoI酶切位點，分別設計如下引物SWP25-primer-F: 5， GCGGATCCATGTTTTCAACTAAGCAAGT 3 ， SWP25-primer-R: 5'GGCTCGAGTTCATAACATCTAACCAATA 3'從家蠶微孢子蟲基因組DNA上擴增SWP25基因編碼序列，擴增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)載體上，然后進行序列測定，從而獲得SWP25基因的全長編碼序列。將SWP25、 基因不含信號肽的序列克隆到原核表達載體pGEX-4Tl上進行誘導表達，純化表達產物； 將純化的表達產物作為抗原免疫小鼠制備抗血清；利用免疫學的手段對SWP25蛋白或家蠶 微孢子蟲進行診斷、鑒定。
權利要求
1、家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP25基因，其特征在于其序列如下ATGTTTTCAA CTAAGCAAGT CGTGCTAAGC TCTCTTTTGT TTATAAGTAG CATCTATACA60AGCAATGTAA ATGGTAAGAA CCTTTCTGTA TTCGGTGCCT TTTTCGGATC ACCTAATGAT120AATGATAATG CCCGTGAACA CTGTTGTAGT CCCCGTAACA AATTTCATCT TACGAGCTTT180AGTTCTGGAT GTGATCTCCA AAAAGAAGTT GAATGTCTTA GAGCTGAATG TAAAAAATCC240AAAGAATGTT GCAATGTCGT CTCTTTATGT TCTGGACTTA GTGAATGTGA ATACGTTGAA300AAAACTTGTG ATGCCATAAA ACAATACTAC CAAAAACAAG CAATAAACAC GGACGTAAAG360ATTACATTAG TCTTAAAATG GATTTACAAA TGTATGAACA CTACTTCTAG GGCTAAATTG420GCCGTATTCA CTGCTCATGC CATTTTCAAT ACCAGTGCAT TTGCATGCCT TGAAGCCGAA480GGCACCTGGA AATACAGATC AAGAGGTTTA CTTGCTATCC AAGGAGAAAA GAACTATGGG540CTTTTAACTT CTTACTCTAG AAACCGTGAA AATTTCAAAG AATGTCCTCA TCGTTTGGCT600GACTTAAATT GTGATGTCAT CAGTGTTACT GTCGACTGGT GGTACAGAAA TGTAGGAAAG660TGTTGTAAAG ATTACTTCGG AAGTCTTGAG ATTCTAAAGC CTACCGAATG GACTGCTTTA720AAGAAAAACT GTGCCGATAG GGAGTCTGCT AGAAGATTAG AAAACAGAAG AAGATTGTAC780GAAATATTGG TTAGATGTTA TGAATAA807。
2、家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP25基因編碼的蛋白質，其特征在于其序列如下:MFSTKQVVLSSLLFISSIYTSNVNGKNLSVFGAFFGSPNDNDNAREHCCSPRNK冊LTSF60SSGCDLQKEVECLRAECKKSKECCNVVSLCSGLSECEYVEKTCMIKQYYQKQAINTDVK120ITLVLKWIYKCMNTTSRAKLAVFT艦IFNTSAFACLEAEGTWKYRSRGLLAIQGEKNYG180LLTSYS腿ENFKECraRLADLNCDVISVT簡WYRNVGKCCKDYFGSLEILKPTEWTAL240KKNCADRESARRLENR服LYEILVRCYE268-
全文摘要
一種家蠶微孢子蟲孢壁蛋白基因SWP25，依據蛋白質組學的方法和家蠶微孢子蟲的6倍基因組數據，經過克隆與亞克隆得到，編碼序列，并經一系列生物技術克隆以及免疫學手段證實。本發明所獲得的家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP25基因為家蠶微孢子蟲物種所特有。粘附實驗分析表明，把這分別把SWP25封閉后，微孢子蟲感染宿主的能力被抑制，為防治家蠶微粒子病提供有力手段；免疫學實驗表明針對SWP25蛋白的抗體與其他蛋白無交叉反應。該基因可用于家蠶微孢子蟲病的免疫學及分子生物學檢測。
文檔編號C07K14/435GK101250536SQ20081006941
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月3日 優先權日2008年3月3日
發明者向仲懷, 周澤揚, 李春峰, 潘國慶 申請人:西南大學