專利名稱：：一種促肝細胞生長素溶液制備工藝的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種生化藥品的制備工藝，特別是一種促肝細胞生長素溶液制備工藝。
背景技術：
：促肝細胞生長素pHGF是一種生化藥品，主要用于治療各種重癥肝炎、慢性活動性肝炎和肝硬化等疾病，療效確切、副作用小，已在臨床應用10余年。促肝細胞生長素pHGF制備的主要原料是促肝細胞生長素溶液，促肝細胞生長素溶液是從新鮮的乳豬肝或小牛肝中提取的生物活性多肽溶液。現有技術促肝細胞生長素溶液制備工藝分兩步，一是材料處理，二是促肝細胞生長素溶液制備。促肝細胞生長素溶液制備關鍵工藝，活性成分提取采用一種物理方法——反復凍融法，在肝臟清洗和肝組織破碎等材料處理后，將破碎的肝漿分裝到容器中，放冷庫冷凍，凍結后取出在恒溫水浴搖床上振搖融化，再放冷庫中冷凍，如此重復操作45次，進行活性成分提取。凍融結束后將勻漿液加熱至7510CrC進行變性，再保溫530分鐘；保溫結束后將提取液用冷卻水冷卻至常溫，用離心機進行離心分離；取離心上清液，用1050KD的超濾膜超濾；超濾液再用HCl或Na0H調節其pH值至6.07.0，最后，再用810KD的超濾膜超濾，即得促肝細胞生長素溶液。現有技術反復凍融法需要進行45次，存在操作麻煩、生產周期長，且收率低、成本高等缺陷。
發明內容本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術存在的缺陷，提供一種操作方便、生產周期短、收率高、成本低，且產品質量符合國家標準要求的促肝細胞生長素溶液制備工藝。本發明解決上述問題所采用的技術方案是該促肝細胞生長素溶液制備工藝，包括材料處理、活性成分提取、加熱變性、固液分離和pH值調整，其特點是所述的活性成分提取采取酶或酸水解的化學提取法，所述的促肝細胞生長素溶液制備工藝包括以下步驟a、材料肝臟清洗步驟，用水把肝臟中的血水沖洗干凈；b、肝組織破碎步驟，將清洗干凈的肝臟進行肝組織破碎；c、活性成分提取步驟，在破碎的肝漿中加肝漿重量0.55倍的水，均勻攪拌成勻漿液，所述的酶水解提取法在勻漿液中加入肝漿重量0.05%5%的酶進行酶水解，水解時間為0.510小時，所述的酸水解提取法用酸調節勻漿液的pH值至1.06.0之間后，放入溫度為-5-30。C的冷庫中凍結540小時，凍結后取出在45'C以下水浴中解凍，再將解凍后的酸水解液用氫氧化鈉調節pH值至6.07.0;d、加熱變性步驟，將酶或酸水解后的勻漿液加熱至7510(TC，保溫530分鐘，使勻漿液中的大分子蛋白質變性沉淀；e、固液分離和pH值調整步驟，將加熱變性保溫結束后的酶或酸水解液用冷卻水冷卻至常溫，進行固液分離，分離后的清液用HCl/NaOH調整pH值至6.07.0，即得促肝細胞生長素溶液。本發明促肝細胞生長素溶液制備工藝所述的"c、活性成分提取步驟"采用酶水解提取法加入的酶為木瓜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶，酶的加入量為肝漿重量的2%，酶水解時間為8小時。本發明促肝細胞生長素溶液制備工藝所述的"c、活性成分提取步驟"采用酸水解提取法加入的酸為鹽酸或磷酸或醋酸，冷庫的溫度為-10±2°C,凍結時間為15±5小時。本發明促肝細胞生長素溶液制備工藝所述的"b、肝組織破碎步驟"的肝組織破碎采用膠體磨勻漿破碎或超聲波破碎。本發明促肝細胞生長素溶液制備工藝所述的"e、固液分離和pH值調整步驟"分為兩步el、分離步驟，將加熱變性保溫結束后的酶或酸水解液用冷卻水冷卻至常溫，用離心機進行離心固液分離；e2、上清液超濾和pH值調整步驟，取離心分離后的上清液，用1050KD的超濾膜超濾，將經過上述超濾的上清液用HCl/NaOH調整pH值至6.07.0，再用810KD的超濾膜進行超濾，超濾液即為促肝細胞生長素溶液。本發明促肝細胞生長素溶液制備工藝所述的"C、活性成分提取步驟"中肝漿中水的加入量為肝漿重量的1倍，所述的"d、加熱變性步驟"的加熱溫度為95土2"，保溫時間為15±5分鐘，所述的"e2、上清液超濾和pH值調整步驟"中前后兩次超濾分別使用50KD的超濾膜和10KD的超濾膜。本發明與現有技術相比具有以下優點1、本發明擯棄了現有技術采用的反復凍融活性成分提取工藝，而采用酶水解提取法或酸水解提取法等化學提取工藝，簡化了操作，縮短了生產周期。2、本發明酶水解提取法或酸水解提取法制備的促肝細胞生長素溶液產品質量完全符合相關的國家藥品監督管理局國家藥品標準要求，且制備收率高、生產成本低。檢定結果表示酶水解提取法或酸水解提取法制備的促肝細胞生長素溶液產品的性狀、pH值、蛋白質、高分子量物質含量、多肽含量和活性等指標均達到或超過國家藥品標準規定的指標。根據統計相同的投產量，酶水解提取法產出促肝細胞生長素溶液量最大、酸水解提取法產出量其次、現有技術反復凍融提取法產出量最低；制備的溶液多肽含量也是酶水解提取法最高、酸水解提取法其次、反復凍融提取法最低；單位成本酶水解提取法最低、酸水解提取法第二、反復凍融提取法最高。具體實施方式下面通過實施例，對本發明作進一步的闡述。實施例1:該促肝細胞生長素溶液制備工藝，包括材料處理、活性成分提取、加熱變性、固液分離和超濾、pH值調整，材料處理主要進行肝臟清洗和肝組織破碎。本實施例活性成分提取采取酶水解化學活性成分提取方法，具體制備工藝包括以下六個步驟。1、材料肝臟清洗步驟去除新鮮的乳豬肝或小胎牛肝的脂肪和筋膜，用水把肝臟中的血水沖洗千凈。2、肝組織破碎步驟將清洗干凈的肝臟切碎，加入潔凈水，進行肝組織破碎。本實施例肝組織破碎采用膠體磨勻漿破碎，也可以采用超聲波等其它破碎方式。3、活性成分提取步驟在破碎的肝漿中以hl的重量比例加水，均勻攪拌制成勻漿液，加入的水量根據肝漿的具體情況，可以在肝漿重量的0.55倍之間調整；再在勻漿液中加入肝漿重量0.05%5%的酶進行酶水解，水解時間為0.510小時。酶可以選用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶中的一種，實施例酶的加入量為肝漿重量的2%，酶水解時間為8小時。4、加熱變性步驟將經過酶水解的勻漿液加熱至7510(TC，使勻漿液中的大分子蛋白質變性沉淀，加熱保溫時間為530分鐘。實施例加熱溫度控制在95土2t:，保溫時間為15士5分鐘。5、分離步驟加熱變性保溫結束后將酶水解液用冷卻水冷卻至常溫，進行固液分離，實施例采用離心機進行固液離心分離，也可以采用其它的固液分離方式。6、上清液超濾和pH值調整步驟取離心分離后的上清液，用1050KD的超濾膜超濾,再用HCl/NaOH調節經超濾分子截留的超濾溶液的pH值至6.07.0，再次用810KD的超濾膜迸行超濾，超濾液即為促肝細胞生長素溶液。實施例這前后兩次超濾分別選用50KD的超濾膜和10KD的超濾膜。實施例2:本實施例采取酸水解化學活性成分提取法，酸水解提取法的活性成分提取步驟的操作如下在經過"a、材料肝臟清洗步驟"和"b、肝組織破碎步驟"的破碎肝漿中加入肝漿重量1倍的水，均勻攪拌使其成為勻漿液，用酸調節勻漿液的pH值至1.06.0之間后，放入溫度為-5-3(TC的冷庫中凍結540小時，凍結后取出在45。C以下水浴中解凍，再將解凍后的酸水解液用氫氧化鈉調節pH值至6.07.0。本實施例酸水解提取法使用的酸為鹽酸或磷酸或醋酸，冷庫的溫度控制在-10土2'C，凍結時間為15士5小時。本實施例的其它操作步驟同于實施例1。根據促肝細胞生長素溶液中華人民共和國藥品監督管理局國家藥品標準WS-100(U-(HD-0860)-2002的規定，對采用反復凍融法、酸水解提取法和酶水解提取法制備的促肝細胞生長素溶液進行檢測，得出酶水解提取法制備的產品質量最優，現有技術反復凍融法相對比較最次。三種制備工藝制備的促肝細胞生長素溶液檢測結果詳見表1。表1三種制備工藝制備的促肝細胞生長素溶液檢測結果對照表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注l:"不得過6.0%"指根據標準規定的測定法，采用液相色譜儀，記錄色譜圖，按峰面積歸一化計算，小于胰島素峰保留時間的峰面積之和不得過6.0%。注2:"不得小于4.0"指根據標準規定的促肝細胞生長素活性測定法(附一)測定，刺激指數不得小于4.0。注3:多肽含量按照標準規定的福林酚測定法(附二)測定。從反復凍融法、酸水解提取法和酶水解提取法3種制備工藝的收率、產品中有效成分多肽含量以及生產成本統計中，得知酶水解提取法最先進，其收率最高，投入100Kg乳豬肝，能產出促肝細胞生長素溶液142Kg;溶液中多肽含量最高，達到22.0mg/ml，總多肽量遠遠高于其他2種方法；制備成本最低，若以現有技術反復凍融法作為1來測算，則酸水解提取法的成本為0.5,酶水解法的制備成本為0.25。三種制備工藝的收率和成本詳見表2。表2三種制備工藝的收率和成本比較表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1、一種促肝細胞生長素溶液制備工藝，包括材料處理、活性成分提取、加熱變性、固液分離和pH值調整，其特征在于所述的活性成分提取采取酶或酸水解的化學提取法，所述的促肝細胞生長素溶液制備工藝包括以下步驟a、材料肝臟清洗步驟，用水把肝臟中的血水沖洗干凈；b、肝組織破碎步驟，將清洗干凈的肝臟進行肝組織破碎；c、活性成分提取步驟，在破碎的肝漿中加肝漿重量0.5～5倍的水，均勻攪拌成勻漿液，所述的酶水解提取法在勻漿液中加入肝漿重量0.05％～5％的酶進行酶水解，水解時間為0.5～10小時，所述的酸水解提取法用酸調節勻漿液的pH值至1.0～6.0之間后，放入溫度為-5～-30℃的冷庫中凍結5～40小時，凍結后取出在45℃以下水浴中解凍，再將解凍后的酸水解液用氫氧化鈉調節pH值至6.0～7.0；d、加熱變性步驟，將酶或酸水解后的勻漿液加熱至75～100℃，保溫5～30分鐘，使勻漿液中的大分子蛋白質變性沉淀；e、固液分離和pH值調整步驟，將加熱變性保溫結束后的酶或酸水解液用冷卻水冷卻至常溫，進行固液分離，分離后的清液用HCl/NaOH調整pH值至6.0～7.0，即得促肝細胞生長素溶液。2、根據權利要求l所述的促肝細胞生長素溶液制備工藝，其特征在于:所述的"c、活性成分提取步驟"采用酶水解提取法加入的酶為木瓜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶，酶的加入量為肝漿重量的2%，酶水解時間為8小時。3、根據權利要求1所述的促肝細胞生長素溶液制備工藝，其特征在于所述的"c、活性成分提取步驟"采用酸水解提取法加入的酸為鹽酸或磷酸或醋酸，冷庫的溫度為-10±2°C，凍結時間為15士5小時。4、根據權利要求2或3所述的促肝細胞生長素溶液制備工藝，其特征在于所述的"b、肝組織破碎步驟"的肝組織破碎采用膠體磨勻漿破碎或超聲波破碎。5、根據權利要求4所述的促肝細胞生長素溶液制備工藝，其特征在于所述的"e、固液分離和pH值調整步驟"分為兩步el、分離步驟，將加熱變性保溫結束后的酶或酸水解液用冷卻水冷卻至常溫，用離心機進行離心固液分離；e2、上清液超濾和pH值調整步驟，取離心分離后的上清液，用1050KD的超濾膜超濾，將經過上述超濾的上清液用HCl/NaOH調整pH值至6.07.0，再用810KD的超濾膜進行超濾，超濾液即為促肝細胞生長素溶液。6、根據權利要求5所述的促肝細胞生長素溶液制備工藝，其特征在于所述的"c、活性成分提取步驟"中肝漿中水的加入量為肝漿重量的1倍，所述的"d、加熱變性步驟"的加熱溫度為95±2°C，保溫時間為15±5分鐘，所述的"e2、上清液超濾和pH值調整步驟"中前后兩次超濾分別使用50KD的超濾膜和10KD的超濾膜。全文摘要本發明公開了一種促肝細胞生長素溶液制備工藝，該制備工藝，包括材料肝臟清洗步驟，肝組織破碎步驟，活性成分提取步驟，加熱變性步驟，固液分離和pH值調整步驟，其特點是所述的活性成分提取采取酶或酸水解的化學提取法，所述的酶水解提取法加入的酶為木瓜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶，所述的酸水解提取法加入的酸為鹽酸或磷酸或醋酸。本發明采用酶水解提取法或酸水解提取法等化學提取工藝，克服了現有技術反復凍融法存在的缺陷，簡化了促肝細胞生長素溶液制備操作，縮短了生產周期，制備的促肝細胞生長素溶液產品質量完全符合國家藥品監督管理局相關的國家藥品標準要求，且制備收率高、生產成本低。文檔編號C07K1/12GK101225101SQ20081005981公開日2008年7月23日申請日期2008年2月4日優先權日2008年2月4日發明者俞保彬,周正兵,高留根申請人:杭州華錦藥業有限公司