專利名稱：消減免疫法制備大腸桿菌0157∶h7抗原單克隆抗體的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備單克隆抗體的免疫方法，特別是涉及一種消減免疫法制備大腸桿 0157:H7抗原單克隆抗體的方法。
技術背景1975年Kohler和Milstein發表了"分泌預定特異性抗體融合細胞的持續培養"的論文， 單克隆抗體技術從此問世。單克隆抗體技術已是現代生命科學研究的重要工具。常規的雜 交瘤技術通常并不能獲得特定目的抗原的單克隆抗體。常規技術制備細菌抗原單克隆抗體， 通常采用生物化學方法分離純化天然蛋白質作為免疫原，然后將免疫小鼠的脾細胞與骨髓 瘤細胞進行融合，用免疫原篩選出分泌抗目的蛋白抗體的細胞株。由于絕大部分的天然蛋 白表達量很低，用生物化學方法分離純化難度大，成本高，現己很少使用。利用基因工程 技術可表達目的蛋白質，但此方法存在制備周期長和抗體親合力相對較弱等不足之處，主 要原因是因為大多數蛋白質都采用大腸桿菌表達系統，表達蛋白后無修飾，不具備天然蛋 白的構象，尤其對那些需要糖基化、磷酸化等修飾作用的蛋白。實驗證明用某些原核表達 蛋白免疫動物制備的抗血清只能與變性蛋白反應，而很難結合天然抗原，這種現象在用桿 狀病毒表達的蛋白中也存在。盡管這類抗體能用于Western Blot實驗，但研究天然蛋白的 結構與功能及對病原微生物的檢測則受到很大的限制。而用真核表達系統如酵母、昆蟲和 哺乳類動物細胞表達蛋白質，存在著實驗周期更長、表達產量更低、技術難度更大等問題。 發明內容本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種使免疫系統直接耙向目的抗原決定 簇，來大幅增加目的抗原單抗的產生數目，并減少單抗篩選的工作量的消減免疫法制備大 腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法。本發明的技術方案概述如下消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟 (1 )選取4-8周齡雌性BALB/c小鼠；(2) 用除大腸桿菌0157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為耐受原腹腔 注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的6-16min、 18-30 h和40-60 h，按每 公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺50-150 mg，用間接ELISA檢測小鼠耐受情 況；(3) 每隔兩周重復步驟(2)，直至BALB/c小鼠對所述耐受原耐受；(4) 在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的7-14d、 14-21d、 28-35d，以大腸 桿菌0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而與大腸桿菌 0157:H7反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。 所述歩驟(1)優選的是選取5-6周齡雌性BALB/c小鼠。所述步驟(2)為用除大腸桿菌0157:H7以外的、己分離鑒定的、商品化的大腸桿菌 為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的8-12 min、 22-26 h和 46-50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺50-150 mg，用間接ELISA檢測小鼠耐受情況。所述除大腸桿菌0157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為大腸桿菌44752、 大腸桿菌44186、大腸桿菌44824、大腸桿菌44336或大腸桿菌44102，還可以選用其它的 大腸桿菌。所述步驟(4)為在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的9-lld、 16-18d、 30-32d ，以大腸桿菌0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠， 在用所述大腸桿菌0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而 與大腸桿菌0157:H7反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌0157:H7的單克 隆抗體。本發明的方法可在不純化抗原的基礎上，較容易的獲得細菌抗原的單克隆抗體；本發 明的方法能提高免疫效果，減少單抗篩選的工作量獲得預期的單克隆抗體。
圖1為常規免疫法雜交瘤技術示意圖； 圖2為消減免疫法雜交瘤技術示意圖； 圖3為BALB/c獲得了對大腸桿菌44752的耐受情況；圖4為消減免疫效果。
具體實施方式
本發明的方法中，由于BALB/c小鼠在注射耐受原后注射烷化劑環磷酰胺，使得BALB/c 小鼠對耐受原表面暴露的抗原決定簇耐受，注射免疫原后，BALB/c小鼠選擇性的針對免疫 原表面特有的抗原決定簇發生免疫反應，特異性抗體隨之產生。本發明用的菌體抗原免疫 和篩選，這有利于得到抗天然構象蛋白質的單克隆抗體，有利于單克隆抗體與不同分離毒 株的結合，減少應用中可能受到的限制。下面結合附圖對本發明作進一步的說明。常規雜交瘤技術(見圖l)為免疫小鼠后直接進行融合篩選，由于菌體為細胞型抗原，其 抗原決定簇十分豐富，并且與其同種屬的細菌有嚴重的交叉反應，致使篩選菌體特異性單 克隆抗體的工作量巨大；而消減免疫使部分相同的抗原決定簇在體內被抑制，從而減少單 抗篩選的工作量，增加獲得預期的抗體的機會(見圖2)。消減免疫法可排除針對非本細菌特異性抗原單克隆抗體株。從而巧妙的回避了沒有比 較純的抗原的問題，使得試驗成功排除了很多非特異性單抗，獲得與其他相近屬的菌種不 產生交叉反應的單抗株。并且采用菌體抗原免疫可以避免小分子蛋白免疫原免疫效果不佳、產生的抗體不穩定等弊端，從而使試驗獲得的單抗具有很好的穩定性。實施例1制備抗原生理鹽水溶解凍干菌種大腸桿菌0157:H7、大腸桿菌44752，接種于營養肉湯培養基 37。C培養18h，然后劃線接種于選擇性培養基(遠藤培養萄37。C培養18h，挑選其中的典型 菌落，接種于營養瓊脂培養基上，37C培養18h，用PBS洗下菌落，4000r/min離心20min， 用PBS洗滌2次后經0.4n/。甲醛固定，配制為抗原濃度為108cfu/mL的菌懸液，4'C保存。 消減免疫法免疫小鼠消減免疫法免疫BALB/c小鼠的步驟消減免疫法以大腸桿菌44752為耐受原，大 腸桿菌0157:H7為免疫原，采用5-6周齡雌性BALB/c小鼠。先用耐受原腹腔注射0.5mL 抗原免疫小鼠，分別在注射耐受原后10min， 24h和48h，再腹腔注射環磷酰胺(Cy) (100 mg/kg體重)；每次免疫后三天后眼睚靜脈叢采血，間接ELISA檢測小鼠耐受情況，每隔兩 周重復此免疫及檢測過程，直至小鼠對耐受原耐受。然后，再用免疫原在免疫耐受階段末 次免疫后10d、 17d、 31d免疫小鼠，依次腹腔注射免疫原0.2mL， 0.5mL， 0.8mL。末次免 疫3d時取鼠尾血檢測效價，取與大腸桿菌44752反應效價低而與大腸桿菌0157:H7反應 效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備免疫原的單克隆抗體。免疫耐受階段，以常規免疫方法免疫大腸桿菌44752菌體抗原作為對照，平行地每次 免疫0.5mL抗原。在免疫3天后，取小鼠眼眶血檢測，看受試小鼠是否獲得耐受，動物耐 受則進入免疫階段。耐受后免疫階段，以常規免疫方法免疫大腸桿菌0157:H7菌體抗原作為對照，平行地 依次免疫0.2mL,0.5mL，0.8mL。在末次免疫后3天，取鼠尾血檢測效價，取效價高的小鼠進 行加強免疫，然后按照常規雜交瘤技術制備免疫原大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。 免疫耐受情況免疫耐受階段末次免疫3d后，后眼睚靜脈叢采血，分離血清。圖3，用間接ELISA測 得不管是長程還是短程消減免疫法的BALB/c小鼠血清效價在128x時都不足陰性對照(A值 為0.060)的2.1倍，而對照組(常規免疫法免疫)血清效價在104以上，我們認為BALB/c獲 得了對大腸桿菌44752的耐受。消減免疫效果間接ELISA，分別包被大腸桿菌44752和大腸桿菌0157:H7菌體抗原，以常規方法免 疫大腸桿菌0157:H7菌體抗原的小鼠血清為對照，用未免疫小鼠血清為陰性對照，分別測 定其效價。由圖4可見常規免疫法得到的抗大腸桿菌0157:H7抗血清與大腸桿菌44752的反應 比與大腸桿菌0157:H7抗原反應的效價還高，交叉反應枏當嚴重；而消減免疫法得到的大 腸桿菌0157:H7抗血清與大腸桿菌44752的反應明顯減少。即消減免疫使小鼠免疫系統對 大腸桿菌44752和大腸桿菌0157:H7菌體抗原的共有抗原決定簇的免疫應答被抑制，而對大腸桿菌0157:H7抗原中目的抗原的免疫應答則相對加強。長程、短程兩種消減免疫方法所得的結果無明顯差異。所有小鼠都可獲得耐受，但由于個體差異，不是每只小鼠的血清都對目的抗原有較特異性的反應，大約l/5小鼠的血清呈現特異性。單克隆抗體的制備按照常規雜交瘤技術制備免疫原大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。PEG法進行融合，間接ELISA篩選陽性克隆，有限稀釋法對陽性孔細胞進行三次克隆化，最終得到19株能穩定分泌抗大腸桿菌0157:H7抗體的雜交瘤細胞株，分別為4D7、 1D8、4A7、 3G12、 1C6、 1H6、 5D8、 5F10、 3F5、 5A2、 5C12、 5H4、 7F1、 6D12、 5F11、 5A5、5A9、 6C11、 7F8。間接ELISA檢測單克隆抗體的交叉反應情況采用間接ELISA檢測，19株抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體與81株細菌抗原的交叉 反應情況見表1和表2: 1D8、3F5、4A7、4D7、5A2、5C12、7F8與44752(大腸桿菌0157:H19) 呈陰性反應，但與大腸桿菌0157:H7反應為陽性。1C6、 1D8、 1H6、 4A7、 5D8、 5A2雜 交瘤細胞株分泌的單克隆抗體特異性較好，且與4株分離株的大腸桿菌0157:H7(E11、E22、 北醫、天防)有很好的抗體反應譜。其它株單克隆抗體均與其他大腸桿菌有在不同程度的交 叉反應，其中5F11、 6C11、 6D12、 7F1雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體與所檢測的細菌株 均能反應。_表1間接ELISA檢測抗大腸桿菌Q157:H7單克隆抗體與42株細菌的交叉反應結果不同雜交瘤細胞株間接ELISA判別結果菌種名稱及菌種號1D8 4A7 1C6 5D8 5A2 1H6 5C12 5H4 '5F10 3G12大腸桿菌8099 — — — — — 一 — _大腸桿菌44186 _ — — — — + —大腸桿菌44824 _ — — — — 一 _ _大腸桿菌44825 — — — — — — — __ —大腸桿菌44336 — — — — — — — — — —大腸桿菌44338 _ — — _ — — — — _ 一沙門氏菌50115 — 一 — — — — 一 + _ —沙門氏菌50303 — — — — — — — — — —沙門氏菌50309 — — — — — — — — 一 一沙門氏菌50312 — — — — — — — _ — —沙門氏菌50770 — — _ _ — 一 一 — — —沙門氏菌50781 — — — — — — — _ _ —志賀氏菌51510 — — — — _ — \ 一志賀氏菌51512志賀氏菌51513志賀氏菌51514志賀氏菌51515志賀氏菌51516志賀氏菌51517志賀氏菌51518志賀氏菌51519志賀氏菌51521志賀氏菌51522志賀氏菌51524志賀氏菌51361志賀氏菌51499 志賀氏菌51135 志賀氏菌51066 志賀氏菌51067 志賀氏菌51081 金黃色葡萄球菌26113 金黃色葡萄球菌29213 小腸結腸耶爾森氏菌52216 小腸結腸耶爾森氏菌52219 肺炎克雷伯氏菌分離株 肺炎克雷伯氏菌46012 弗勞地枸櫞酸菌分離株+大腸桿菌0157:H19 44752—_++_+—+++大腸桿菌0157:H7分離株El 1+_++++—+++大腸桿菌0157:H7分離株E22+—■++++++++大腸桿菌0157:H7分離株北醫++++++++—+大腸桿菌Q157:H7分離株天防++_+__——++續表1間接ELISA檢測抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體與42株細菌的交叉反應結果菌種名稱及菌種號不同雜交瘤細胞株間接ELISA判別結果4D73F55A57F85A97F16D125F11 6C11大腸桿菌8099 大腸桿菌44186 大腸桿菌44824 大腸桿菌44825 大腸桿菌44336 大腸桿菌44338 沙門氏菌50115 .沙門氏菌50303 沙門氏菌50309 沙門氏菌50312 沙門氏菌50770 沙門氏菌50781+++++ —+ + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + +++++++++++++志賀氏菌51510—\+—+\\\\志賀氏菌51512—\———\\\\志賀氏菌51513—\一——\\\\志賀氏菌51514—\——_\\\\志賀氏菌51515_\+—+\\\\志賀氏菌51516\\+\志賀氏菌51517+++++\\+\志賀氏菌51518\\+\志賀氏菌51519+++++\\+\志賀氏菌51521+++++\+\志賀氏菌51522_—一—_++++志賀氏菌51524_一——\\\\志賀氏菌51361—_\\\\\\志賀氏菌51499_一__+志賀氏菌51135++++志賀氏菌51066++++志賀氏菌51067_—\\++++志賀氏菌51081++++金黃色葡萄球菌26113—+\—+++—金黃色葡萄球菌+++小腸結腸耶爾森氏菌52216++++小腸結腸耶爾森氏菌52219++++肺炎克雷伯氏齒分離株++++肺炎克雷伯氏齒46012++++弗勞地枸櫞酸齒分離株++++大腸桿菌0157:HI9 44752—— +一 +++++大腸桿菌0157:H7分離株El 1—_ ++ +++++大腸桿菌CH57:H7分離株E22+— ++ _++++大腸桿菌0157:H7分離株北醫+十++人腸桿菌Q157:H7分離株天防+— —一 ■—++十+表2間接ELISA檢測抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體與39株細菌的交叉反應結果,,工^爿^。 不同雜交瘤細胞株間接ELISA判別結果菌種名稱及菌種號 -~1C6 1D8 4A7 5A2 5D8 1H6 3G12 4D7大腸桿菌44102 — —— ———— —大腸桿菌44109 — —— ———— —大腸桿菌44110 — — — ———— —人腸桿菌44113 — — — — — — — —大腸桿菌44149 — _一__一一 —大腸桿菌44155 — — — — — — — +大腸桿菌44156 ——— —— —— —大腸桿菌44127 — 一一 ——一+ +大腸桿菌44216 — —— — — 一+ +大腸桿菌44505 — — _ — — _+ +大腸桿菌44561 — — — — — —— _大腸桿菌44813 '— 一一 — — 一一 +變形桿菌49001 — — — — — — — -變形桿菌49087 一 — 一 — 一一一 一變形桿菌49106 — — — — — — — —沙門氏菌50001 _ — — — —沙門氏菌50041 一一 — _ — — 一 一沙門氏菌50042 _______ —沙門氏菌50058 — _ — _ — _一 +沙門氏菌50061 — — — — — — — —沙門氏菌50062 — — — — — — — +沙門氏菌50065 — — — — — — — 一沙門氏菌50067 — — — — — — — 一沙門氏菌50136 — 一 — 一一一一 一沙門氏菌50306 一一一 — 一 — 一 一沙門氏齒50313 一一 — — 一 — — 一沙門氏菌50315 — 一一 — 一一一 一沙門氏菌50322 — 一一 — 一 — + +沙門氏齒50325 — 一一一 — 一一 一沙門氏菌50327 一一一一一 — — 一沙門氏菌50774 一一一一一 — 一 一沙門氏菌50798 — — — 一一一一 +沙門氏菌50825 一一 — 一一一一 +沙門氏菌50885 一一 — 一一 — 一 一沙門氏菌50866 一一一一一 — + +金黃色葡萄球菌26003 — 一一一一 — 一 一金黃色葡萄球菌26071 — 一一一一 — + +小腸結腸耶爾森氏菌52215 小腸結腸耶爾森氏菌52243注- "一"為陰性反應，"+ "為陽性及應，"、"為未進ff試驗。 . 消減免疫法的優勢從實驗結果可以看出，在19株單克隆抗體中，某些株與一些其它血清型的大腸埃希氏 菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌之間有交叉反應，這與細菌之間存有共同抗原 的性質相一致。尤其在同種不同型的細菌之間存在著大量的共同抗原，提示用大腸桿菌 057:H7作為免疫原以常規方法制備單克隆抗體，有極大的篩選工作量，很難獲得專一針 對大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。Luciani等在"Production and characterization of monoclonal antibodies specific foi Escherichia coli 0157:H7" —文中用常規免疫法制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體，獲得 101株分泌抗大腸桿菌OI57:H7的雜交瘤細胞株，間接ELISA檢測這些抗體與28株其他 細菌的交叉反應性，結果有7株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體只與大腸桿菌0157:H7反應， 而不與其他細菌抗原反應，比率為7/101。我們在檢測與76株其他細菌交叉反應性的基礎 上，獲得特異針對大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體比率為6/19。對比而言，我們篩選特異針對大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體的工作量要小得多。這 恰恰表明我們選用消減免疫法制備菌體表面蛋白專一性單克隆抗體的優勢。也正是消減免 疫法的這種優勢使我們在半年的時間就獲得了6株特異針對大腸桿菌0157:H7的單克隆抗 體。目前，利用基因工程技術可表達目的蛋白質，但此方法存在制備周期長和抗體親合力相對較弱等不足之處，而且用表達蛋白免疫動物制備的抗血清只能與變性蛋白反應，而很難 結合天然抗原。我們用消減免疫法制備菌體表面蛋白優勢主要體現在兩方面 一是回避了 找到、表達、純化目的蛋白等大量繁瑣的實驗；另一方面采用菌體抗原免疫可以避免小分 子蛋白免疫原免疫效果不佳、產生的抗體反應性低，不穩定等弊端。 實施例2
消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟-
(1) 選取4周齡雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大腸桿菌44186為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐 受原的6min、 18h和40h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺50mg，用間 接ELISA檢測小鼠耐受情況；
(3) 每隔兩周重復步驟(2)，直至BALB/c小鼠對所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的7d、14d、28d，以大腸桿菌0157:H7 為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌0157:H7末 次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而與大腸桿菌0157:H7反應效價 高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。
實施例3
消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟 (1 )選取8周齡雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大腸桿菌44824為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐 受原的16 min、 30h和60 h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺80mg，用 間接ELISA檢測小鼠耐受情況；
(3) 每隔兩周重復步驟(2)，直至BALB/c小鼠對所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的14dd、 21d、 35d，以大腸桿菌 0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而與大腸桿菌0157:H7 反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。
實施例4
消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟
(1) 選取5周齡雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大腸桿菌44336為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐 受原的8min、 22h和46h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺100 mg，用 間接ELISA檢測小鼠耐受情況；
(3) 每隔兩周重復步驟(2)，直至BALB/c小鼠對所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的9d 、 16d、 30d，以大腸桿菌 0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而與大腸桿菌0157:H7反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。 實施例5
消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，包括如下步驟
(1) 選取6周齡雌性BALB/c小鼠；
(2) 用大腸桿菌44102為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐 受原的12 min、 26h和50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺150 mg， 用間接ELISA檢測小鼠耐受情況；
(3) 每隔兩周重復步驟(2)，直至BALB/c小鼠對所述耐受原耐受；
(4) 在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的lld、 18d、 32d，以大腸桿菌 0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌 0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而與大腸桿菌0157:H7 反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體。
用于做耐受原的大腸桿菌除了上述幾個實施例所舉出的，還可以選其它的除大腸桿菌 0157:H7以外的商品化的大腸桿菌。
權利要求
1.消減免疫法制備大腸桿菌O157:H7抗原單克隆抗體的方法，其特征是包括如下步驟(1)選取4-8周齡雌性BALB/c小鼠；(2)用除大腸桿菌O157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的6-16min、18-30h和40-60h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺50-150mg，用間接ELISA檢測小鼠耐受情況；(3)每隔兩周重復步驟(2)，直至BALB/c小鼠對所述耐受原耐受；(4)在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的7-14d、14-21d、28-35d，以大腸桿菌O157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠，在用所述大腸桿菌O157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而與大腸桿菌O157:H7反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體。
2. 根據權利要求所述消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，其特 征是所述步驟(1)為選取5-6周齡雌性BALB/c小鼠。
3. 根據權利要求所述消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，其特 征是所述步驟(2)為用除大腸桿菌0157:H7以外的、己分離鑒定的、商品化的大腸桿 菌為耐受原腹腔注射免疫所述BALB/c小鼠，分別在注射所述耐受原的8-12 min、 22-26 h 和46-50 h，按每公斤所述BALB/c小鼠體重腹腔注射環磷酰胺50-150 mg，用間接ELISA 檢測小鼠耐受情況。
4. 根據權利要求1或3所述消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法， 其特征是所述除大腸桿菌0157:H7以外的、已分離鑒定的、商品化的大腸桿菌為大腸桿菌 44752、大腸桿菌44186、大腸桿菌44824、大腸桿菌44336或大腸桿菌44102
5. 根據權利要求1所述消減免疫法制備大腸桿菌0157:H7抗原單克隆抗體的方法，其 特征是所述步驟(4)為在使所述BALB/c小鼠出現耐受的末次免疫后的9-lld、 16-18d、 30-32d ，以大腸桿菌0157:H7為免疫原腹腔注射免疫所述對耐受原耐受的BALB/c小鼠， 在用所述大腸桿菌0157:H7末次免疫3d取鼠血檢測效價，取與所述耐受原反應效價低而 與大腸桿菌0157:H7反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌0157:H7的單克 隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種消減免疫法制備大腸桿菌O157∶H7抗原單克隆抗體的方法，步驟為(1)選BALB/c小鼠；(2)用除大腸桿菌O157∶H7以外的大腸桿菌為耐受原免疫BALB/c小鼠，在注射耐受原后，腹腔注射環磷酰胺，檢測小鼠耐受情況；(3)隔兩周重復步驟(2)，直至BALB/c小鼠對耐受原耐受；(4)在使BALB/c小鼠出現耐受后，以大腸桿菌O157∶H7免疫BALB/c小鼠，取與耐受原反應效價低而與大腸桿菌O157∶H7反應效價高的小鼠按照常規雜交瘤技術制備大腸桿菌O157∶H7的單克隆抗體。本發明的方法在不純化抗原的基礎上，較易獲得細菌抗原的單克隆抗體，提高免疫效果，減少單抗篩選工作量。
文檔編號C07K16/12GK101323642SQ20081005395
公開日2008年12月17日 申請日期2008年7月25日 優先權日2008年7月25日
發明者李君文, 王新為, 王景峰, 諶志強, 邱志剛, 婧 郎, 敏 金, 陳照立 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所