專利名稱：：與pkr激酶結構域特異性結合的多肽及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程與生物醫藥
技術領域：
，涉及利用噬菌體展示技^1選能與PKR激酶結構域(PKIU)特異性結合的多月級其應用。背景駄PKR是一種由干擾素i秀導的,于雙鏈RNA的蛋白激酶，是^+亥翻i^始因子elF2a激酶家族成員之一。它是一種有551個氨基酸組成的絲氨酸一蘇氨酸激酶，而近其臓究也發現欺有酪氨酸激酶的活性[Su，Q.eta丄Tyrosinephosphorylationactsasamolecularswitchtofull—scaleactivationoftheeIF2aRNA-d印endentproteinkinase.2006.PNAS]。結構上，主要包括2個功能性結構域N端與RNA結合的調節性結構域和C端的催化結構域。PKR在干媳誘導的抗病毒防御應答中發揮主要的作用，被認為是IFN誘導的最具有特征性的抗病毒路徑。PKR也可能是治療多種神經退行性病變的藥物靶標[Peel，AlysonL.PKRActivationinNeurodegenerativeDisease]。其中，阿爾茨海默癥(AD)是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統退行性疾病，H神經纖維絲纏結和神經細胞死亡，理變化為病理特征。P—淀粉秀導的神經細胞凋亡中半胱天冬歐a印ase從PKR的A印251切掉PKR的調節結構域，釋放出組成型激活的elF2a激酶結構域從而導致神經細胞蛋白合成的抑制[MlL0:."a丄Activationofcaspase-8intheAlzheimer'sdiseasebrain.2001.NeurobiolDis.]。以PKRcat作為靶蛋白，抑制劑可以用于開發延緩M癡呆病中神經細胞的死亡，緩解和治療^P癡呆的藥物。在過去的10年間，多肽療法對醫藥行說，被認為是一項很有前途的新開發。，范圍內有600—700種多肽正處于開發階段。其中，在細胞信號ffig各的基lf鵬開究和藥物研發方面，激酶多肽類抑制劑已成為一個非常輸途的領域。例如，多肽PKI抑制PKA的激酶活性I細于研究人淋巴細胞的調亡通路[Zhang，B.eta丄RaclinhibitsapoptosisinhumanlymphomacellsbystimulatingBadphosphorylationonSer-75.2004.Mol.Cell.Biol.]。豆蔻酰基化蛋白激歐的抑制肽在細胞水平和動物水平都能夠牛寺異的抑制PKC的活性。[Spyridopoulos，I."a丄DivergenceofangiogenicandvascularpermeabilitysignalingbyVEGFinhibitionofproteinkinaseCsuppressesVEGF_inducedangiogenesisbutpromotesVEGF-induced,NO~dependentvascularpermeability.2002.Aterioscler.Thromb.Vase.Biol.]。盡管PKR激酶結構^S老年癡呆等疾病中發揮作用，但目前絲簾KR抑制劑和PKR多肽鄉帝擠啲報道。多肽藥物設計中，禾,噬菌體呈現技術構建不同容量的隨機肽庫，從這些月褲中快速篩選出活性多肽，并鑒定其結構，可以簡便決速地獲得與耙好具有強親和力和特異性的小肽或新型蛋白，這翻太段可以作為f離藥物進行開發。
發明內容本發明目的是,一種育,與PKR激酶結構JI^異性結合的多形汲其應用。PKR是神經細胞凋亡相，病，如^^癡呆癥藥物開發的新耙點。本發明應用12肽噬菌體展示文庫對Pl進行五輪篩選，獲得了能與Pl賴異性結合的12肽，并且該12肽宮^1I制PKR^的激酶活性。本發明應用噬菌體展示文庫對神經細胞凋亡相關蛋白PKRcat進行篩選，獲得了一，異性結合PKIU的12肽，其氨基M)^列如下Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe國Met-Ala-His-Gln-Thr。戰多肽，該夠與PKR激酶結構域特異性結合，并且f,制PKR^磷酸化elF2a的能力，IC5o約為250nM。戶誠的多肽可以用于抑制PKILt激酶活性。可以應用于開發PKRcat抑制劑。本發明掛共的與PKR激酶結構域特異性結合的多肽的篩選和鑒定步驟如下*^1^人？^進行五輪篩選，獲得與PKR結合的重組噬菌體；ELISA法檢測噬菌體與PKR^的結合；單克隆噬菌體的分離制備；,體基因組單鏈DNA的提取和獲得寡月，列；多肽固相合成，競爭ELISA檢測多肽與PKH的結合；應用體外生物化學方法研究12月樹PKIU激酶活性的影響。本發明的有益皿是本發明12肽倉嫩特異性的與PKIU結合^P制Plt的激酶活性，可應用于Plt抑制劑的藥物設計。圖l.是免疫印跡法(WesternBlot)檢測純化PKR^的激酶活性，圖2.是噬菌體展示中每輪的噬菌體數，以空L作為對照，圖3.是ELISA法檢測篩選得至啲噬菌體和原噬菌體庫與Plt和空孔的結合，圖4.是ELISA法檢測10個噬菌,克隆與Plt及空孔的結合，圖5.是競爭ELISA法檢測合成12肽與PKIU的結合，圖6.是體外酶學方纟at測合成12月樹PKILt激酶活性的影響。實施例l:重組Pl的^J^艦活性的初步研究1.離Pl質粒的構建利用已有的pET28a-PKRf鎌，下面的PCR弓嫩和Pfu聚合酶PCR擴增PKR^:正向引物5'-CATGCCATGGGCGACATGAAAGAAACAAAGTATACTG-3'反向弓l物5'-GGCTCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATTTTTCTC-3'禾,NcoI/XhoI消化擴增DNA片段，并且克KA質粒pET28a(Novagen)。將這樣構建的重組質粒命名為pET28a-PKR^并且導入大腸桿菌BL21。重組質粒pET28a-Plt允許在成熟的Plt的N彩浠具有另夕卜個甲基硫氨,凝口在C具有另外6個組氨酸的重組PKIU的皿。2.魏Pl的純化①.齡有pET28a-Plt的BL21于5mLLB培養基(50ng/ml卡那霉素)，37°C，250rpm搖菌過夜。②.1:50的比例轉接到4個大瓶中(^250mLLB培養基，50ug/ml卡那霉素)，37°C，250rpm搖菌2小時。加入300uMIPTG，27°C，250rpm，過夜誘導。③.將誘導過夜的菌液10000rpm，離心15倂中。用LysisBuffer(20mMTris-HCl，500rnMNaCl，pH7.5)重懸沉淀，10000rpm，離心15射中。.用40raLLysisBuffer重懸所有沉淀，加入PMSF蛋白,制劑至終濃度為lraM，在冰浴中超聲破碎(功率300W，超聲5s，停15s,90循環)。將液12000rpm，15射中離心兩次。將離心后的上清與4mLNi樹脂4。C結合lh。⑥.在蛋白與樹脂結合的同時,清洗蛋白純化儀:先用清水清洗B，，,洗A管置(5mL/辦中)；再用ElutionBuffer(20rnMTris-HCl，500rnMNaCl，250mM咪唑，pH7.5)清洗BM(0.5mL/併中)；最后用LysisBuffer清洗AM(0.5mL/併中)。⑦.將結合蛋白的樹脂離心，棄上清，裝柱，連軒AKTAprimeplus蛋白純化儀(通用電氣)。用LysisBuffer漂洗Beads,洗下一降寺異結合的蛋白。用ElutionBuffer梯度洗脫目的蛋白。⑧.根據蛋白峰的隨，收集相應管的》m液，跑SDS-聚丙烯翻安鵬電泳(SDS-PAGE),考馬斯賠她銜正。3.PKRcat激酶活性的初步分析反應體系為40uL:①.將50ng純化PKILt加入置于冰上試管中，其終濃度為25nM。②.混合底物純化的elF2a，ATP，5XBufferA(lOOmMTris-HCl，200mMKC1，lOmMMgCl2)和雙蒸水使反應液中含終濃度為20mMTris-HCl，40mMKCl，2mMMgCl2，500nMelF2a，IOOpMATP，以此混合液啟始反應。③.以^)混合液啟始反應，30。C7K浴準確反應10辦中。力口8pL6XLoadingBuffer終止鵬。.9(TC沸水中煮5射中。樣品7轉[]至室溫，'M離心機短暫離心(15s)。⑤.上樣，進行SDS—PAGE電泳。⑥.WesternBlot法檢測elF2a的磷酸化狀態。方法如下lOOmA，電轉移1.5小時。用3%的月劃旨牛^^寸閉膜，室溫搖床輕搖l小時。加入第一抗體(磷酸化elF2a抗體，兔源，Invitrogen)，室溫搖床輕搖l小時。1XTBST(含O.1%Tween附BS，pH7.4)鵬3次，每次5分鐘。與第二抗體反應(HRP偶聯羊抗兔二抗，SantaCruzBiotechnology),室^M,M40^Ht。lXTBSTi^莫3次，每次5射中。去離子7K洗5^H中。力口化學發艦物(ECL)曝光。曝光弓破經繊成像系統ChemidocXRSSystem(Bio-Rad)定量。StripeBuffer(7M鹽麵，10mMDTT)處鵬30倂中。去離子水^3次，每次5併中。用3%的腳旨牛^^寸閉膜，室溫搖床輕搖l小時。力口入第一抗體(anti-elF2aantibody,兔源，SantaCruzBiotechnology),室溫搖床輕搖l小時。1XTBST(含0.1。/。Tween附BS，pH7.4)ftt3次，每次5併中。與第二抗體反應(HRP偶聯羊抗兔二抗，SantaCruzBiotechnology),室溫搖床輕^40分鐘。1XTBST鵬次，每次5併中。去離子ZK洗5併中。加化學發艦物(ECL)曝光。曝光鵬經;鵬成像系統ChemidocXRSSystem(Bio-Rad)定量。eIF2a磷酸化離二磷酸化elF2a曝光弓膨全elF2a曝光鵬。結果從1L菌液中純化出48呢的PI屋白，酶活分析表明純化蛋白具有激酶活性，倉,酸化elF2a;而對照組未加APlelF2a未被磷酸化(圖l)。實施例2:纟SiE輪篩選獲得能與PKRcat特異性結合的重組噬菌體1.第一纖選與睞①.用NaHC03溶液,PKIU蛋白至100pg/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為0.1M。加100|iL該溶液到96孔板的一個孔中，4。C包Mil夜。②.力口150^親賴羊配制的含0.5%(w/v)BSA的TBS(BTBS)溶液到上步包被蛋白的孔中，室溫搖擺平臺方jffil小時。③.與此同時，將噬菌恢10"pfU)加到100nLBTBS中，加到一個空L中，室溫搖擺平臺方爐1小時，目的是將可以與ELISA板非特異性結合的噬菌,收掉。.倒掉蛋白/BTBS溶液，用200)iLTBST(含0.1%Tween的TBS，pH7.4)洗6遍，注意每次都不要讓孔干了。最后一次洗完后，將先前與板吸鵬的噬菌柳TBS溶鵬移到這個孔中。室溫搖擺平臺方^gl小時。⑤.倒掉噬菌^/BTBS溶液，用200(iLTBST洗10遍。⑥.；tal00|oL0.2MGlySine^結合的噬菌體,室溫搖擺平臺驢8辦中，立即轉移到小離心管中，并用Tris-HClbuffer中和到pH為7—8。4。C保存直到測定噬菌^度或擴增。⑦.對照另一孔不包被蛋白按相同方法操作，得至(J艦噬菌體并測定濃度。2.擴增，第二輪及之后幾輪鵬與艦①.保留10-20^L上步得到的噬菌做mOT于測濃度，餘刺余的噬菌體，擴增產生用于下一輪篩選的噬菌體。提ltr將大腸桿菌ER2738[F，laciqA(lacZ)M15proA""B+zzf::TnlO(Tet^/fhuA2supEthiA(lac-proAB)A(hsdMS-mcrB)5(rk—mk"McrB。菌株保存在含50%甘油的LB培養基中，存于-7(TC]接到LB培養基中，搖床培養到OD60tan為0.5時，取lmL已培養的大腸桿菌ER2738轉接到含有30mLLB培養基的三角瓶中，同地^r增的噬菌働n入到t角瓶中，37'C搖床培養4.5小時。②.轉移上歩的培l^/到離心管中，室溫，10000ipm離心15射中。將80%的上清吸至噺的離心管中，加入1/6上清^^只的PEG溶液，4'C節趙夜。③.《C，10000rpm離心30^H中，緩慢倒出上清，再小心的將管壁上的液體離心下來，用微*#液器小心棄掉。.用200nLTBS重懸上步的沉淀，轉移懸游U0.5mL離心管中，室溫10000rpm離心5倂中。⑤.上清轉移到新的0.5龍離心管中，逸就是擴增了的,體。4"保存用于測濃度和下一輪篩選。◎.包被ELISA板的另一個L，加入10HpfU第一輪擴增噬菌體。按第一輪的方法進行第二輪及之后幾輪的篩選和擴增，每輪噬菌體的加入量要,與第一輪一致。3.噬菌鵬度的測定的具體實施①.規桿菌ER2738接種到5mLLB培養基中，37。C搖床培養魏數早中期(OD6oonm大約0.5)。②.融4fcJL層膠(含有0.7。/。瓊脂的LB)，條3ml7管，45。C7j^舒衡，準備好《頓。③.用LB培養勘爭淵兌(或擴增)后的噬菌體進行10倍系列稀釋。稀釋比例如下對于擴增的噬菌艦，對于擴增的噬菌,，稀釋10^和10"倍。對于fm下來的噬菌體液，第一輪按1()2和103,，以后每多一輪就增加10倍稀釋度。.將lO^iL噬菌^^働n入到200iA第一步的ER2738菌液中，，輕輕混勻，室繊置1—5分鐘。轉移第三步中噬菌鵬染的ER2738菌液到第二步中45。C平衡的上層膠中，腿搖動，立即倒入預溫的LB平板(涂有IPTG和X-gal)上，均勻鋪平。⑤.7細5倂中，反轉平板，37。C培養過夜。⑥.計數器統計平社的噬^sm量，根據,倍數計算噬菌體的濃度。結果進行5輪富集篩選，每輪從Plt上洗脫下來的噬菌體量在總體i^漸升高，與對照孔比較實現了104倍富集(表1)。表1中五輪的噬菌體數用圖1。圖1中縱坐標用對數值表示，橫坐標代表輪數。表l篩MPKR^特異性結合的噬菌體<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a.第五輪皿下的u離體量與第四輪持平說明對PKR^結^fl鶴體的富集EiSiiUt頓n，更多輪的,并不能增加富集離。實施例3:ELISA檢測篩選到的噬菌體對PKRcat艦照結合能力①.用NaHC03溶釋蛋白為100pg/mL的溶液，要求NaHCOa的終濃度為O.IM。加lOOpL該溶液到96孔板的兩個孔中，4'C過夜固定。同,照同樣的方法將BSA力口入另兩個孔作對照。②.每孔加100^3%的BSA封閉未結合蛋白的部分，室溫搖擺平臺方爐1小時。③.根據所測的第五輪冼脫下的噬菌體的濃度，將噬菌體用TBST稀釋，每孔加10(VL，噬菌體約109—101G。室溫，離平臺方爐l小時。.*孔用200|JTBST洗6次。⑤.HRP-抗M13抗體(PhaimaciaBiotech公司)按1:5000用TBST稀釋，每孑L加lOO^iL,室溫搖擺平臺方ifil小時。針L用TBST洗6次。⑦.按60^L四氨基聯苯胺(TMB，Sigma公司，lOmg/mL溶于DMSO)加到10mL^f酸-醋酸鈉(Critate-Ac)中，再加入3^LH202配制底物，每孔加l(KVL所配制的底物顯色。⑧.1倂中后加100MLlMH2S。4終lhH應。用酶標儀在OD450nm下測定吸光值。結果第五輪得到的特異性噬菌體庫與PKR^結合能力脇大于原始噬菌體庫，第五輪得到的特異性噬菌體庫與PKR^結合能力也繊大于其與BSA結合能力，即第五輪得至啲B驢體庫能夠特異性與PKR^結合(圖2)。圖2中橫坐標代表不同的噬菌體庫，輕標標平均凈吸光值，lib代表文庫噬菌體，R5代表第五輪篩選到的特異性噬菌體，白色柱代表與PKIU的結合，黑色柱代表與對照的結合。實施例4:單克隆噬菌體的分離制備1.特異性結合的噬菌體克隆的確定①.在測定第五輪淵兌噬菌體的平虹挑取10個單克隆鑒定多鵬列。②.用滅菌的牙^t兆取一個藍色噬^^王轉接^i咅養至對數中期的規桿菌ER2738的i體中。③.37'C搖床培養4—5小時。.轉移培l^tl到7mL離心管中，10000rpm離心10射中。⑤.將80%的上清吸到新的離心管中，加1/6上清#^只的PEG溶液，4'C沉淀2小時。⑥.4'C，10000rpm離心30併中，緩侵倒出上清，用微誠液器小心4娥留的液體吸棄。⑦.用200nLTBS重懸沉淀，轉移懸液到0.5mL離心管中，4°C，lOOOOrpm離心5射中。⑧.上清轉移到新的0.5mL離心管中，逸就是所挑取的噬菌脾克隆。4'C保存用于測濃度，如果要長期保存，加50%甘油，凍于一2(TC。2.ffl3!ELISA檢測挑取的單克隆①.用NaHCO3溶液稀釋蛋白為100)ag/mL的溶液，要求NaHC03的終濃度為O.IM。對于*單克隆要包MM少兩個孔，一個孔包,妙萬篩的蛋白，另一個孔包被BSA作對照。每孔加100)aL蛋白，4t:過夜固定。②.每孔加100nL3e/。的BSA封閉未結合蛋白的部分，室溫J離平臺方燈1小時。③.根據所測的噬菌脾克隆濃度，將一定量的噬菌脾克隆用TBST稀釋，銜L加100iaL，使噬菌働口入量在109—1010。室溫J離平臺方燈1小時。.^h孑Lffl200WTBST洗6次。.抗條1:5000用TBST稀釋，每孔加100|xL，室溫搖擺平臺方燈1小時。針L用TBST洗6次。⑦.按60^LTMB(10mg/mL溶于DMSO)加到10mLCritate-Ac中，再加入3|^11202配制底物，每孑L加lOO^L顯色。⑧.1倂中后加100(XL1MH2S04終止反應。用酶標儀在OD45(ta下測定吸光值。結果IO個單克隆都表現出對PKIU的高結合性(圖3)。圖3中橫坐標表示不同的噬菌體單克隆，縱坐標表示平均凈吸光值；白色柱^Plt孔的平均凈吸光值；黑色柱表示BSA孔的平均凈吸光值。圖3中針(l織脾克隆均與PHBSA結合。洗滌后，用辣M:氧化物謝禺聯M13抗體及其底物TMB對^Niia行ELISA反應，并檢測OD450nm。對^克M行了兩組檢測，圖中為兩組檢測的平均值。實施例5:噬菌體基因組單鏈DNA的提取和12，列的獲得①.將所挑取的IO個單克隆噬菌體進行擴增。②.取6(VL擴增后的單克隆噬菌鵬液，力口入20ioLPEG溶液，置于4。CfeK^內節趙夜。③.10000rpm離心10射中，棄上清并倒扣離心管，使液^^l^。.加入200pL碘化物緩沖液，再加入500nL^zK乙醇，室溫孵育10辦中。⑤.10000rpm離心10^H中，棄上清，用70%乙醇洗沉淀。⑥.10000rpm離心10射中，棄上清，千燥，讓殘余液鵂發完全。⑦.重懸沉淀于30^L去離子7K中，該溶液即該單克隆噬菌體的基因組單鏈DNA。⑧.以一96gffl弓物(5，-CCCTCATAGTTAGCGTAAC03'，NewEnglandBiolabs隨機十二肽噬菌體展示文庫產品)測序。測序結果用PrimePrimier瀏糊譯，得到多S游列。序列如下Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-AigAsp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe-Met-Ala-HiS"Gln-Thr實施例6:固相多肽合成①.翻Fmoc做錢酸合成的策略，在固相載體上合成多肽；合成^g用TFA(三氟乙酸)切割，乙醚沉淀得到多肽禾,品。②.用制備色譜(HPLC)純化多肽，得到多月衫屯品。用MerckC18色譜柱，含0.05%的TFA的乙麟性梯度冼脫(乙腈濃度在30min內從5%變化到35%)，紫外210nm波長檢測，收集單一組分的峰。③質譜測試(MS)。結果HPLC峰面積積分比較得到兩種多肽會艘均大于95%，質譜中目標肽的W離子,口設計肽的理論M量一致，兩^結果表明獲得了高鄉艘的目標肽。實施例7:合成多肽的競爭ELISA實驗①.用NaHC(V溶液稀釋蛋白為20(ig/niL的溶液，要求NaHC03的終濃度為0.1M。每孔加60^iL，共48個孔，4。C過夜固定。②.倒掉蛋白液，針L用200^LTBS洗四遍。③.每孔加200^3%的BSA封閉未結合蛋白的部分，室溫搖擺平臺腹置l小時。.倒掉BSA液，加入不同濃度梯度的多肽1和多肽2(6個梯度)，每L加謂^L，室溫搖擺平臺驢1小時。多肽1和多肽2分別以無餅列(ScrambledSequence:)為對照，其它步驟相同。.^h孑L^應加入109的噬菌體(如加入多肽l的孑L用帶有多肽1的噬菌體去競爭)，讓其和多肽競爭與蛋白的結合，室溫矛離平臺廳1小時。⑥.針孑L用200ioLTBST洗8次。⑦.抗條1:5000用TBST,，毎孔加60ijL，室溫搖擺平臺方燈1小時。⑧.旨孔用TBST洗8次。⑨.60(xLTMB(10mg/mL溶于DMSO)加入到10mLCritate-Ac(pH6.0)中，再加入3^11202即為底物，每孔加100^L顯色。90s后加50nLlMH2SO4終止鵬。⑩.用^t示儀在OD450nm下測定吸光值。.結果隨著多肽1和多肽2濃度增加，表征噬菌粘Plt結合的OD^逐漸斷氐；而無餅列多肽的加入并不引起OD^的附氏(圖4)。表明合成多肽l和合成多肽2f灘與對應噬菌體競爭結合Pl實施例8:多JWPKR^,活性的影響①.用DMSO配制5m^ml多肽(多肽l，多肽2，對照多肽)儲液，保存于一7(TC冰箱。②.用緩沖液TBS稀釋多肽l至100ng/mL，對照多肽至100jxg/mL;用含2XDMSO的TBS■多肽2至10^ig/mL。用含2%DMSO的TBS3^#釋多肽1至濃度為50jag/mL，10嗎/mL，5嗎/mL，l嗎/mL;稀釋多肽2至5ng/mL，2.5ng/mL，l嗎/raL，0.5嗎/mL。③.1(VL不同濃度多肽與50ng純化PKILt混合，冰上孵育15射中。.其棘驟與鄉例l(3)Plt活性的初步分析相同，求得elF2a的磷酸ftf號。結果:對照多月樹Plt激酶活性沒有影B向，多肽1和多肽2抑制PKR^對elF2a的磷酸化反應(圖5)。多肽1的I"約為2.5yM，多月太2的ICso約為250nM。SEQUENCELISTING〈110〉南開大學〈120〉與PKR激酶結構域特異性結合的多tt^其應用〈160>2〈210>1〈211〉12<212>PRT〈213〉AI序列<220><221〉PEPTIDE〈222>(1)..(12)〈223〉〈400〉1SerValHisLeuTyrHisSerThrLysThrLeuAig1510〈210〉2〈211>12〈212〉PRT<213〉AX序列〈220〉<221>PEPTIDE〈222〉(1)..(12)<223>〈■>2AspTyrMetSerThrLeuPheMetAlaHisGinThr1510權利要求1.與PKR激酶結構域特異性結合的多肽，其氨基酸序列如下Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe-Met-Ala-His-Gln-Thr。2.如權利要求l戶腿的多肽，其特征在于，該多肽能與PKR激酶結構鵬異性結合，并且能,制Plt磷酸化elF2a的能力，IQo約為250nM。3.權利要求1戶腿的多肽在開發Plt抑制劑中的應用。全文摘要一種能夠與PKR激酶結構域特異性結合的多肽及其應用。本發明應用噬菌體展示文庫技術，篩選能夠與PKR<sub>cat</sub>特異性結合的12肽，其氨基酸序列為Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe-Met-Ala-His-Gln-Thr。該12肽具有與PKR<sub>cat</sub>特異性結合的特性，并且能夠抑制其激酶活性。因此，該12肽對研究PKR<sub>cat</sub>在細胞調亡中作用及PKR<sub>cat</sub>抑制劑的開發具有實用價值。文檔編號C07K7/00GK101314614SQ20081005352公開日2008年12月3日申請日期2008年6月16日優先權日2008年6月16日發明者常云松,張宏愷,張翠竹,曹又佳,杜明娟申請人:南開大學