專利名稱：：一種病毒抗原的純化方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種病毒抗原純化方法。
背景技術：
：由于人用疫苗的普及率高、用量大，且使用對象多為嬰幼兒和兒童，因此世界衛生組織和各國藥物管理部門均對疫苗中殘留雜蛋白和殘留DNA的量有嚴格的要求。在傳統粗制疫苗包括全毒疫苗的基礎上，純化病毒成分制備純化疫苗，已成為今后發展的必然趨勢。病毒抗原的純化是疫苗研究及生產中的一個關鍵問題。疫苗分離純化研究方興未艾，國內外關于疫苗及其分離純化的論文和專利也相應逐年遞增。針對不同的疫苗制品應選用不同的分離純化路線，但一般而言，都包括兩個基本階段初分離和純化(見圖l)。初分離階段的主要任務是分離細胞和培養液，破碎細胞釋放產物(如果產物在細胞內)，濃縮產物和去除大部分雜質等，這一階段可選用的分離方法包括細胞破碎技術、離心沉降和各種沉淀方法等，純化階段則選用各種具有高分辨率的技術以使產物和少量干擾雜質盡可能分開，達到所需的質量標準，超速離心技術和各種層析技術成為當前達到此目的的主要方法。滅活疫苗或減毒疫苗來源于經減毒或滅活工藝而得的活病原體，或者從被感染的病原體中分離得到的不具傳染性的病毒顆粒。這種疫苗由全顆粒菌體或病毒組成，其純制過程相對于一些亞單位疫苗、基因工程疫苗的生產工藝要簡單許多，主要在于去除病毒核酸和雜蛋白，一般只涉及簡單分離，早期大多釆取連續離心、沉淀、過濾或萃取等物理、化學方法提純。由于具有操作簡單、工藝經濟且易于放大等特點以及有一定的安全性記錄等原因，連續離心法、沉淀和過濾技術在疫苗的分離中仍被普遍采用，但以前那種由簡單分離得到的滅活疫苗和減毒疫苗一般均存在純度、活力以及安全性偏低的缺點，很難再通過藥物管理機構的批準。隨著層析技術的日臻成熟，沉淀、離心和過濾技術在疫苗的分離純化過程中雖仍被廣泛應用，但更多的只是作為起始步驟，用于初分離過程。層析技術因其條件溫和、重復性好、便于產業化，層析技術己逐漸替代沉淀和離心等傳統技術并與之相結合成為疫苗分離純化的主流。但現有文獻中所建立的層析分離純化工藝大多還滯留在實驗室階段，適應于大規模生產的純化工藝還有待研究和開發；同時新疫苗高純度的生產目標帶來的往往是純化技術路線的復雜性，這勢必會對活性疫苗的回收率和生產高效性產生負面影響。因此，需要開發出適應于大規模生產的、高純度的病毒抗原純化工藝
發明內容本發明的目的是提供一種純化效果好的病毒抗原純化新方法，且工藝條件溫和、重復性好、便于產業化。為此，本發明公開了一種病毒抗原純化方法，其特征在于，所述純化方法包括陰離子交換柱純化步驟。本發明的創新點在于純化方法中采用了陰離子交換柱純化步驟，陰離子交換柱中的陰離子交換樹脂作為純化介質，其具有高吸附載量的特性，屬于瓊脂糖凝膠離子交換劑。該介質在分離蛋白質時具有分辨率高，操作簡單，重復性好等優點。其原理為由于待分離的蛋白質分子在不同pH下可分別帶有不同屬性的電荷，從而在作為固定相的離子交換劑和流動相的洗脫液之間發生可逆交換，通過調節洗脫液的pH值，或改變離子濃度等方法，使蛋白質分子在固定相表面發生吸附與解吸附的可逆性變化，達到分離不同蛋白目的。在一定的pH環境下，病毒蛋白及雜蛋白均可帶有負電荷，易吸附到陰離子交換劑上，通過改變洗脫溶液的pH和/或離子強度，病毒蛋白及雜蛋白被依次洗脫，達到進一步分離病毒原液中包括宿主細胞蛋白(HostCellProtein,HCP)在內的殘余雜蛋白及殘余DNA的目的。在一實施例里，所述的病毒抗原可為包括甲型肝炎病毒、乙型腦炎病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、流行性出血熱、流感病毒、乙型肝炎病毒表面抗原、輪狀病毒或人乳頭瘤病毒蛋白抗原的中之一，其中優選包含甲型肝炎病毒的的病毒抗原；以上所提及的病毒，如甲型肝炎病毒、乙型腦炎病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、流行性出血熱、流感病毒、乙型肝炎病毒表面抗原、輪狀病毒或人乳頭瘤病毒，可以在滅活之前或滅活之后進行純化，優選在純化后進行病毒滅活。在一實施例里，一種病毒抗原純化方法，其特征在于，所述純化階段包括下列步驟a)疏水層析純化；b)濃縮洗脫液；c)分子篩層析；d)陰離子交換柱純化；e)分部收集蛋白洗脫峰；其中，在一實施例里，所述疏水層析純化步驟為病毒原液經疏水柱吸附，吸附完畢用1.0mol/LPB(pH6.4pH7.8)溶液淋洗2-5CV(柱床體積)后，用0.02mol/LPB(pH6.4pH7.8)溶液進行線性洗脫2-8CV，收集含目的病毒抗原的蛋白洗脫峰；其中，所述疏水柱優選為PhenylSepharose、OctylSepharose、或ButylSepharose型疏水凝膠柱中之一。在一實施例里，所述分子篩層析步驟為將濃縮處理的液體上樣于分子篩凝膠，上樣量為1-15%CV(柱床體積)，用PBS溶液進行洗脫，收集含有目的病毒抗原的蛋白洗脫峰；其中，所述分子篩凝膠優選S印harose型分子篩凝膠。在一實施例里，所述陰離子交換柱純化步驟為所得含有目的病毒抗原的蛋白洗脫液上樣于陰離子交換柱，用0.01mol/LPBpH7.4溶液淋洗后，用含0.52.0mol/LNaCl的0.01mol/LPBpH5.87.4溶液進行線性洗脫，收集含目的病毒抗原的蛋白洗脫峰。在一實施例里，所述的陰離子交換柱填料為CaptoQ、QSepharose、SOURCEQ、DEAESepharose、或DEAESephadex型陰離子凝膠中之一。在一實施例里，所述的病毒抗原原液在精純化前可以用MWCO-100300KD的超濾膜進行濃縮。在一實施例里，上述病毒抗原純化方法，其特征在于所述病毒抗原為甲型肝炎病毒抗原。正如本
技術領域：
人員所公知的，本發明所公開的病毒抗原純化方法，還包括采用組織培養技術或基因工程技術表達、收獲病毒抗原；初分離；純化階段步驟。在一實施例里，上述病毒抗原純化方法還包括初分離階段步驟，其選自等電點沉淀法、鹽析法或有機溶劑抽提法，優選有機溶劑抽提法。在一實施例中，所述有機溶劑抽提法為破碎后的細胞液加入與等體積的三氯甲烷，振搖20分鐘，以4000rpm的速度28'C離心20分鐘，吸取上層蛋白水相。上述純化過程中，淋洗或洗脫液體體積可根據不同病毒或不同表達培養體系的加以變化和調整，這是本
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的技術人員所應該具備的技術常識。6本發明所公開的方法的優點為在生產規模下，實現了對病毒抗原的純化，疫苗成品中的雜質蛋白及殘余DNA含量大大降低，并且所生產的病毒抗原免疫原性好、回收率較高，大大地提高了疫苗成品的安全性；同時本方法工藝條件溫和、重復性好、便于大規模地產業化生產。圖l病毒抗原的純化流程圖。圖2PhenylSepharose6FastFlow疏水凝膠純化色譜圖。圖3Sepharose4FastFlow分子篩凝膠層析色譜圖。圖4QSepharoseFastFlow型離子柱純化色譜圖。圖5SDS-PAGE電泳圖。具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。材料來源Vera細胞工作種子細胞ATCC系列號為No:CCL-81YN-5株HAV:保藏號為CCTCCNO:V200104中國典型培養物保藏中心主要設備和試劑細胞超聲破碎儀SONICSVCF1500，最大輸出功率為1500W超濾器Pellicon2CassetteFilter;Biomax-100A(MWCO100KD)(Millipore公司)；超濾濃縮器，(MWCO100KD)(Millipore公司)；色譜純化儀AKTAPikrt(GEHealthcare公司)色譜柱BPG140/950;INdEX140/500(GEHealthcare公司)純化介質PhenylSepharose、OctylSepharose、ButylSepharose型疏水凝膠(GEHealthcare公司)；Sepharose4FastFlow型分子篩凝膠；CaptoQ、QSepharose、SOURCEQ、DEAESepharose、或DEAESephadex型陰離子凝膠；(GEHealthcare公司)小牛血清購自蘭州民海生物技術有限公司；細胞培養液為199培養基(GIBCO);實施例l:甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原原液和成品制備參考中國專利號ZL0210685.9中的描述中的描述生產甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原原液和成品。病毒抗原原液生產方法如下a.細胞復蘇；取工作細胞庫中的1支或幾支細胞管，將細胞接種到細胞培養瓶中，加入含10%小牛血清的199培養基后置37士rC培養。b.細胞擴增及培養待復蘇細胞生長成致密單層后用胰蛋白酶或其他適宜的消化液消化Vero細胞進行傳代擴增，置35土1'C培養2128天收獲。c.接種HAV:將YN-5株甲肝病毒接種于Vero細胞。d.接毒細胞的收獲和合并將培養21~28天的細胞用胰蛋白酶或其他適宜的消化液進行消化，同一細胞消化批的多瓶細胞收獲液，以每分鐘30004000轉、28'C離心30分鐘，收集細胞沉淀，在無菌條件下合并為1批。e.純化用細胞超聲波粉碎儀以1200W1600W輸出功率破碎細胞。破碎后的細胞液加入與等體積的三氯甲垸，振搖20分鐘，以每分鐘4000轉的速度28'C離心20分鐘，吸取上層蛋白水相，向離心杯中補充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反復提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超濾膜進行濃縮；超濾濃縮液中加入PB緩沖鹽，并使緩沖鹽充分溶解，經PhenylSepharose6FastFlow型疏水凝膠吸附，吸附完畢用1.0mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，開始用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液進行線性洗脫，收集電導值低于50mS/cm的洗脫液；收集的洗脫液用MWCO=100KD的超濾膜進行濃縮，濃縮至適當體積(該體積根據濃縮液的粘度情況，一般控制在柱床體積的5%以內)后上樣于Sepharose4FastFlow型分子篩凝膠，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液進行洗脫，收集第二洗脫峰；將收集的洗脫液用超濾濃縮器將緩沖液置換成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，完成病毒抗原原液制備。甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)成品生產方法如下a)甲醛處理將上述病毒抗原原液加入終濃度為1:4000的甲醛，經37土1'C、12天滅活。b)超濾濃縮，即得成品。實施例2:甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原原液和成品制備病毒抗原原液生產方法如下a.細胞復蘇；取工作細胞庫中的1支或幾支細胞管，將細胞接種到細胞培養瓶中，加入含10%小牛血清的199培養基后置37土rC培養。b.細胞擴增及培養待復蘇細胞生長成致密單層后用胰蛋白酶或其他適宜的消化液消化Vero細胞進行傳代擴增，置35士1'C培養2128天收獲。c.接種HAV:將YN-5株甲肝病毒接種于Vero細胞。d.接毒細胞的收獲和合并將培養21~28天的細胞用胰蛋白酶或其他適宜的消化液進行消化，同一細胞消化批的多瓶細胞收獲液，以每分鐘30004000轉、28'C離心30分鐘，收集細胞沉淀，在無菌條件下合并為1批。e.純化用細胞超聲波粉碎儀以1200W~1600W輸出功率破碎細胞。破碎后的細胞液加入與等體積的三氯甲烷，振搖20分鐘，以每分鐘4000轉的速度28。C離心20分鐘，吸取上層蛋白水相，向離心杯中補充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反復提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超濾膜進行濃縮；超濾濃縮液中加入PB緩沖鹽，并使緩沖鹽充分溶解，再經PhenylSepharose6FastFlow型疏水凝膠吸附，吸附完畢用l.Omol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，開始用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液進行線性洗脫，收集電導值低于50mS/cm的洗脫液(參見圖2);收集的洗脫液用MWCO-100KD的超濾膜進行濃縮，濃縮至適當體積(該體積根據濃縮液的粘度情況，一般控制在柱床體積的5%以內)后上樣于Sepharose4FastFlow型分子篩凝膠，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液進行洗脫，收集第二洗脫峰(參見圖3);將該收集液上樣于QSepharoseFastFlow型陰離子柱，用O.Olmol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，開始用含0.6mol/LNaCl的0.01mol/LPB(pH7.4)溶液進行線性洗脫，收集第一洗脫峰(參見圖4)。將收集的洗脫液用超濾濃縮器將緩沖液置換成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，即得病毒抗原原液。甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)成品生產方法如下a)甲醛處理將上述病毒抗原原液加入終濃度為l:4000的甲醛，經37士rC、12天滅活；b)超濾濃縮，即得成品。實施例3:甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原原液制備病毒抗原原液生產方法如下a.細胞復蘇；取工作細胞庫中的1支或幾支細胞管,將細胞接種到細胞培養瓶中，加入含10%小牛血清的199培養基后置37士rC培養。b.細胞擴增及培養待復蘇細胞生長成致密單層后用胰蛋白酶或其他適宜的消化液消化Vero細胞進行傳代擴增，置35土rC培養2128天收獲。c.接種HAV:將YN-5株甲肝病毒接種于Vero細胞。d.接毒細胞的收獲和合并將培養21~28天的細胞用胰蛋白酶或其他適宜的消化液進行消化，同一細胞消化批的多瓶細胞收獲液，以每分鐘30004000轉、28'C離心30分鐘，收集細胞沉淀，在無菌條件下合并為1批。e.純化用細胞超聲波粉碎儀以1200W160t)W輸出功率破碎細胞。破碎后的細胞液加入與等體積的三氯甲烷，振搖20分鐘，以每分鐘4000轉的速度28'C離心20分鐘，吸取上層蛋白水相，向離心杯中補充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反復提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超濾膜進行濃縮；超濾濃縮液中加入PB緩沖鹽，并使緩沖鹽充分溶解，再經OctylSepharose4FastFlow型疏水凝膠吸附，吸附完畢用1.0mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，開始用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液進行線性洗脫，收集電導值低于58mS/cm的洗脫液；收集的洗脫液用MWCO=100KD的超濾膜進行濃縮，濃縮至適當體積(該體積根據濃縮液的粘度情況，一般控制在柱床體積的5%以內)后上樣于Seph咖se4FastFlow型分子篩凝膠，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液進行洗脫，收集第二洗脫峰；將該收集液上樣于SOURCE30Q型陰離子柱，用0.01mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，開始用含0.6moi/LNaCl的0.01mol/LPB(pH7.4)溶液進行線性洗脫，收集第一洗脫峰。將收集的洗脫液用超濾濃縮器將緩沖液置換成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，即得病毒抗原原液。實施例4:甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原原液制備病毒抗原原液生產方法如下a.細胞復蘇；取工作細胞庫中的1支或幾支細胞管，將細胞接種到細胞培養瓶中，加入含10%小牛血清的199培養基后置37±TC培養。b.細胞擴增及培養待復蘇細胞生長成致密單層后用胰蛋白酶或其他適宜的消化液消化Vero細胞進行傳代擴增，置35士rC培養2128天收獲。c.接種HAV:將YN-5株甲肝病毒接種于Vero細胞。d.接毒細胞的收獲和合并將培養21~28天的細胞用胰蛋白酶或其他適宜的消化液進行消化，同一細胞消化批的多瓶細胞收獲液，以每分鐘30004000轉、28。C離心30分鐘，收集細胞沉淀，在無菌條件下合并為1批。e.純化用細胞超聲波粉碎儀以1200W1600W輸出功率破碎細胞。破碎后的細胞液加入與等體積的三氯甲垸，振搖20分鐘，以每分鐘4000轉的速度28。C離心20分鐘，吸取上層蛋白水相，向離心杯中補充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反復提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超濾膜進行濃縮；超濾濃縮液中加入PB緩沖鹽，并使緩沖鹽充分溶解，再經ButylSepharoseFastFlow型疏水凝膠吸附，吸附完畢用1.0mol/LPB(pH7.2)溶液淋洗后，開始用0.02mol/LPB(pH7.2)溶液進行線性洗脫，收集電導值低于61mS/cm的洗脫液；收集的洗脫液用MWCO=100KD的超濾膜進行濃縮，濃縮至適當體積(該體積根據濃縮液的粘度情況，一般控制在柱床體積的5%以內)后上樣于Sepharose4FastFlow型分子篩凝膠，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液進行洗脫，收集第二洗脫峰；將該收集液上樣于DEAESephadexA-50型陰離子柱，用0.01mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，開始用含0.8mol/LNaCl的0.01mol/LPB(pH6.0)溶液進行線性洗脫，收集第一洗脫峰。將收集的洗脫液用超濾濃縮器將緩沖液置換成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，即得病毒抗原原液。實施例5:甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原原液制備病毒抗原原液生產方法如下a.細胞復蘇；取工作細胞庫中的1支或幾支細胞管，將細胞接種到細胞培養瓶中，加入含10%小牛血清的199培養基后置37土rC培養。b.細胞擴增及培養待復蘇細胞生長成致密單層后用胰蛋白酶或其他適宜的消化液消化Vero細胞進行傳代擴增，置35土rC培養2128天收獲。c.接種HAV:將YN-5株甲肝病毒接種于Vero細胞。d.接毒細胞的收獲和合并將培養21~28天的細胞用胰蛋白酶或其他適宜的消化液進行消化，同一細胞消化批的多瓶細胞收獲液，以每分鐘30004000轉、28。C離心30分鐘，收集細胞沉淀，在無菌條件下合并為1批。e.純化用細胞超聲波粉碎儀以1200W1600W輸出功率破碎細胞。破碎后的細胞液加入與等體積的三氯甲烷，振搖20分鐘，以每分鐘4000轉的速度28'C離心20分鐘，吸取上層蛋白水相，向離心杯中補充等量的0.01mol/LPBS(pH7.4)反復提取35次。合并所有的抽提液，用MWCO-100KD的超濾膜進行濃縮；超濾濃縮液經CaptoQ型陰離子膠吸附，吸附完畢用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，用含2.0mol/LNaCl的0.01mol/LPB(pH7.4)溶液進行線性洗脫，收集含甲肝病毒抗原蛋白的洗脫液；收集的洗脫液加入PB緩沖鹽，并使緩沖鹽充分溶解，經PhenylSepharose6FastFlow型疏水凝膠吸附，吸附完畢用l.Omol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，開始用0.02mol/LPB(pH7.4)溶液進行線性洗脫，收集電導值低于50mS/cm的洗脫液；收集的洗脫液濃縮至適當體積(該體積根據濃縮液的粘度情況，一般控制在柱床體積的5%以內)后上樣于Sepharose4FastFlow型分子篩凝膠，用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液進行洗脫，收集第二洗脫峰；將收集的洗脫液用超濾濃縮器將緩沖液置換成0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液，即得病毒抗原原液。實施例6按常規的方法和市售的試劑，對實施例1~5所得的病毒抗原原液(簡稱抗原原液)和成品分別進行總蛋白濃度、抗原滴度、殘留DNA含量、殘留牛血清白蛋白含量、HCP含量檢測；結果如表l。表1.相關物質含量檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從表1和表2可知，與現有方法(實施例l)比較，采用本發明所述方法生產的甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)成品的殘留DNA含量、殘留牛血清白蛋白含量、HCP含量均大大降低，并且抗原滴度沒有減少，其抗原回收率也沒有顯著地減少。實施例7SDS-PAGE電泳將實施例1和2所制備純化的甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原進行SDS-PAGE電泳，然后銀染。結果參見圖4，1:標準分子量蛋白；2:實施例1所制備純化的甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原；3:實施例2所制備純化的甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原。結果表明與常規的層析純化比較，經過本發明純化方法得到的甲型肝炎滅活疫苗(Vero細胞)病毒抗原中殘留蛋白的組分和含量大大降低。實施例8狂犬病毒抗原純化狂犬病毒抗原純化方法如下a)收獲的病毒滅活液用MWCO=100KD的超濾膜進行濃縮至適當體積，用1:1000的e—丙內酯4'C滅活24小時，37'C水解2小時。b)病毒滅活液上樣于Sepharose4FastFlow型分子篩凝膠，(上樣體積一般為柱床體積的3%)用0.01mol/LPBS(pH7.4)溶液進行洗脫，收集第一洗脫峰。c)將該收集液上樣于QSepharoseFastFlow型陰離子柱，用0.01mol/LPB(pH7.4)溶液淋洗后，開始用含1.0mol/LNaCl的0.01mol/LPB(pH5.8)溶液進行階段梯度洗脫，收集含病毒抗原蛋白的洗脫峰。本發明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的范圍之內。權利要求1.一種病毒抗原純化方法，其特征在于，所述純化方法中包括陰離子交換柱純化步驟。2.根據權利要求1所述的病毒抗原純化方法，其特征在于所述的病毒抗原可為包括甲型肝炎病毒、乙型腦炎病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、流行性出血熱、流感病毒、乙型肝炎病毒表面抗原、輪狀病毒或人乳頭瘤病毒蛋白抗原的中之一。3.根據權利要求1所述的病毒抗原純化方法，其特征在于所述陰離子交換柱的填料為CaptoQ、QSepharose、SOURCEQ、DEAESepharose、或DEAESephadex型陰離子凝膠中之一。4.根據權利要求1所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述純化方法包括下列步驟a)疏水層析純化；b)濃縮洗脫液；C)分子篩層析；d)陰離子交換柱純化；e)分部收集蛋白洗脫峰。5.根據權利要求4所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述疏水層析純化步驟為病毒抗原經疏水柱吸附，吸附完畢用pH6.47.81.0mol/LPB溶液淋洗；然后pH6.47.80.01mol/LPB溶液進行線性洗脫，收集含目的病毒抗原的蛋白洗脫峰。6.根據權利要求5所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述疏水柱選自PhenylSeph咖se、OctylSepharose、或ButylSeph咖se型疏水凝膠柱。7.根據權利要求4所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述的濃縮洗脫液步驟采用MWCO=100~300KD的超濾膜進行濃縮。8.根據權利要求4所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述分子篩層析步驟為將疏水層析純化收集的液體上樣于分子篩凝膠，上樣量為1-5%CV，用0.01mol/LPBSpH6.47.4溶液進行洗脫，收集含目的病毒抗原的蛋白洗脫峰。9.根據權利要求8所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述分子篩凝膠優選Sepharose型分子篩凝膠。10.根據權利要求4所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述陰離子交換柱純化步驟為所得含有目的病毒抗原的蛋白洗脫液上樣于陰離子交換柱，用0.01mol/LPBpH7.4溶液淋洗后，用含0.52.0mol/LNaCl的pH5.87.40.01mol/LPB溶液進行線性洗脫，收集目的病毒抗原的蛋白洗脫峰。11.根據權利要求10所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述陰離子交換柱的填料為CaptoQ、QSepharose、SOURCEQ、DEAESepharose、或DEAESephadex型陰離子凝膠中之一。12.根據權利要求4所述的病毒抗原純化方法，其特征在于所述純化方法還包括初分離步驟，其選自等電點沉淀法、鹽析法或有機溶劑抽提法。13.根據權利要求12所述的病毒抗原純化方法，其特征在于所述初分離階段的方法為有機溶劑抽提法。14.根據權利要求13所述的病毒抗原純化方法，其特征在于所述有機溶劑抽提法為破碎后的細胞液加入與等體積的三氯甲烷，振搖20分鐘，以4000rpm的速度28。C離心20分鐘，吸取上層蛋白水相。15.根據權利要求4-14所述的病毒抗原純化方法，其特征在于，所述病毒抗原為甲型肝炎病毒抗原。全文摘要本發明屬于生物
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，具體涉及一種病毒抗原純化方法。本發明公開了一種病毒抗原純化方法，其特征在于，所述純化方法包括陰離子交換柱純化步驟。本發明所公開的純化方法的優點為在生產規模下，實現了對病毒抗原的純化，疫苗成品中的雜質蛋白及殘余DNA含量大大降低，并且所生產的病毒抗原免疫原性好、回收率較高，大大地提高了疫苗成品的安全性；同時本方法工藝條件溫和、重復性好、便于大規模地產業化生產。文檔編號C07K1/00GK101638427SQ20081004368公開日2010年2月3日申請日期2008年8月1日優先權日2008年8月1日發明者毅劉,劉昊智,施松明,超程申請人:上海澤潤生物科技有限公司