專利名稱：一種乙腦疫苗生產用/jev抗體陰性新生牛血清生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域,具體地，涉及一種新生牛血清的生產工藝。
背景技術：
新生牛血清含有豐富的蛋白、細胞因子、酶、激素、有機和無機離子 等物質，可作為一種營養成分和抗體保護劑，被廣泛地用于疫苗生產、診斷試劑 生產、科學研究實驗等領域。目前，國內乙腦疫苗生產廠家使用的新生牛血清基 本依靠進口，原因在于國內的新生牛血清中含有乙型腦炎病毒(Japanese Enc印haiitisVirus,正V)抗體，在乙腦疫苗生產過程中，血清中的抗體會中和部 分疫苗抗原，導致疫苗效價下降，產量降低。因此，生產成本過高的現狀急于需 要國產同類產品進行替代。另外，血清生產廠家多為小型作坊式生產，條件相對 簡陋，難以保證血清的高質量、均一性和穩定性。
本發明采用空斑減少法對新生牛原料血進行乙型腦炎病毒抗體的大規模篩 査，收集合格的血清進行低溫混合、加壓分級過濾，得到乙型腦炎病毒抗體陰性 的新生牛血清。該方法工作效率高、結果可靠、低成本、適用于工業化生產，提 高了乙腦疫苗的質量、效價和保護率，降低了乙腦疫苗的生產成本
發明內容
本發明的目的就是提供一種能簡便、有效地進行乙型腦炎病毒抗體篩 査的方法和快速的無菌新生牛血清生產工藝。該發明保證了新生牛血清不含有乙 型腦炎病毒抗體，保證了無菌狀態，適用于工業化生產，可降低乙腦疫苗的生產 成本。
本發明的內容主要由三部分組成，參見說明書附圖l。 1、篩選乙型腦炎病毒抗體合格的原料血。
收集14小時內出生的新生牛血清。將乙型腦炎病毒減毒活疫苗稀釋成適當 濃度，使每0.2mL含80個 100個PFU，與不同稀釋度的待檢血清等量混合， 置37'C作用1.5小時，接種于BHK-21細胞，分別測定PFU，達到抑制50%空 斑形成的血清為抗乙腦病毒抗體陽性血清，判為不合格；抑制率未達到50%的血 清為抗乙腦病毒抗體陰性血清，判為合格。
根據《中國藥典(2005年)》附錄XIII D小牛血清檢測要求，對其它相關 指標，如牛腹瀉病毒、血紅蛋白、蛋白含量、噬菌體、內毒素等進行檢測，達到標準的可以作為合格的原料血進行生產。
2、 規模化低溫混勻。
在萬級潔凈級別的生產車間將原料血倒入最大容積為1500升、具有雙層夾 套的混合罐中，以25-35轉/分鐘的轉速攪拌血清，使其均勻混合。同時混合罐 的夾套中用乙二醇進行循環制冷，溫度控制在6°C至12°C之間。
3、 加壓分級過濾除菌。
混合罐下游依次連接著三個裝有不同孔徑過濾介質的過濾器。混合罐上有氮 氣通入口，進行加壓，使血清依次通過1.0|am/0.5|im、 0.5|am/0.2|im、 0.1|am的過 濾介質。前兩種介質除去細菌等大分子雜質，后一種介質除去支原體。過濾好的 血清被導入儲存罐，通過分裝機在局部百級潔凈級別的超凈工作臺進行分裝。
具體實施方式
滴定乙腦減毒活疫苗，根據滴定結果，選擇一定稀釋度(例10"4) 的病毒(使其病毒含量為50PFU/mL)與等體積的新生牛血清樣品進行混合，37。C 孵育1.5小時。同時用乙型腦炎病毒陰陽性血清國家參考品設置陰陽性對照。然 后將血清-病毒混和液均勻接種于六孔板的單層BHK-21細胞，于37。C、 5%C02 孵育1.5小時。孵育后，加入以MEM培養液、甲基纖維素、3%谷氨酰胺、7.5% NaHC03及不含有乙腦病毒抗體的胎牛血清組成的營養覆蓋物，置于37。C、 5% C02孵育5天，用P/。結晶紫染色，進行空斑計數。重復測三次。計算抑制率， 達到抑制50%空斑形成的血清為抗乙腦病毒抗體陽性血清，判為不合格；抑制 率未達到50%的血清為抗乙腦病毒抗體陰性血清，判為合格。陽性對照應完全無 空斑形成，陰性對照空斑數應在50個/孔左右。實施結果如附圖2。
同時新生牛血清樣品進行牛腹瀉病毒、血紅蛋白、蛋白含量、噬菌體、內毒 素等指標的檢測，檢測方法和標準參見《中國藥典(2005年)》附錄XIIID小
牛血清檢測要求。
在萬級潔凈級別的生產車間將合格的原料血1200升，倒入混合罐中，以 25-35轉/分鐘的轉速全程攪拌血清，使其均勻混合。同時混合罐的夾套中用乙二 醇進行循環制冷，溫度控制在6。C至12。C之間。均勻攪拌半小時后，開啟氮氣 進入閥、三個過濾器的上游閥門和儲液罐的上下游閥門，使初始血清緩慢通過過濾器，將其中殘留的消毒水壓出，收集l萬mL血清，該部分血清不分裝，可用 于下批血清的生產。然后開啟儲液罐與分裝機相連的閥門，實現過濾和分裝同時 進行。生產過程中，三個過濾器的壓差控制在0.15-0.2 MPa之間，分裝速度控 制在每分鐘5L血清左右。
圖1為新生牛血清生產流程示意圖。所標結構依次為1—混合罐；2、 —裝有孔徑為1.0|im/0.5|jm過濾介質的過濾器；3—裝有孔徑為0.5pm/0.2nm過 濾介質的過濾器、4一裝有孔徑為0.1pm過濾介質的過濾器；5—儲液罐；6—分
裝機；7—血清原料進口； 8—氮氣加壓通氣口； 9—攪拌器；10—夾套；ll一閥門。
圖2為空斑減少法試驗示例。經過3次重復試驗，8批血清中的第2批、第4批 血清的空斑減少率達到50%以上，檢測結果判為陽性，說明其中含有乙型腦炎病 毒抗體。其余的六批血清空斑減少率未達到50%，為合格血清。陽性對照無空斑 形成。陰性對照的空斑數在50個左右。
權利要求
1.一種乙腦疫苗生產用/乙型腦炎病毒抗體陰性新生牛血清生產工藝，其特征在于(1)用空斑減少法(PRNT)篩選乙型腦炎病毒抗體陰性的新生牛血清。(2)低溫大規模混合血清。(3)加壓分級過濾。
2. 如權利要求書1 (2)所述，其特征在于運用空斑減少法(PRNT)進行乙型 腦炎病毒抗體篩選。
3. 如權利要求書1 (3)所述，其特征在于在最大容積為1500升的具有雙層夾 套的混合罐中進行大規模血清混合。
4. 如權利要求書l (3)所述，其特征在于混合罐中有攪拌器進行攪拌，攪拌速 度在25-35轉/分鐘之間，
5. 如權利要求書l (3)所述，其特征在于該罐夾套中用冷媒進行低溫制冷，溫 度控制在6。C至12。C之I'曰J。
6. 如權利要求書l (4)所述，其特征在于混合罐上端有氮氣加壓通氣口，在過 濾中施加壓力。
7. 如權利要求書l (4)所述，其特征在于進行三級過濾，采用的過濾材料介質 孔徑分別為1.0)am/0.5(^m、 0.5|^m/0.2)am、 0.1|im。
全文摘要
本發明涉及一種新生牛血清生產工藝，具體地說，涉及一種乙腦疫苗生產用/乙型腦炎病毒抗體陰性新生牛血清生產工藝。本發明生產工藝，其工藝流程包括乙型腦炎病毒抗體陰性原料血清篩選、大規模混合、加壓分級過濾和分裝。本發明的優點是采用空斑減少法篩選出乙型腦炎病毒抗體陰性的粗制血清進行加工生產，工作效率高、結果可靠、低成本、適用于工業化生產，提高了乙腦疫苗的質量、效價和保護率，降低了乙腦疫苗的生產成本。
文檔編號C07K1/34GK101525372SQ20081003427
公開日2009年9月9日 申請日期2008年3月6日 優先權日2008年3月6日
發明者嚴正龍, 軍 唐, 勇 沈, 華 王, 醇 邵, 陳繼東 申請人:上海九諾生物科技有限公司