專利名稱：隱孔雀石綠半抗原及制備得到的抗體和抗體的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫化學技術領域，具體涉及一種隱孔雀石綠半抗原 及其制備方法，以及利用所述半抗原制備得到的抗體和抗體的應用。
技術背景水產品中違禁藥物的殘留是近年來食品安全問題中較為突出的問題之一，是困擾世界范圍的難題。農業部從1997年開始，雖先后多次 發文禁止硝基呋喃、孔雀石綠等近40種獸(漁)藥在動物性食品生產 中使用，但由于部分生產者和商販缺乏法律意識和有關科學知識，特 別是受經濟利益的驅使，在養殖生產過程中經常非法使用禁藥，其現 象至今仍較普遍，嚴重威脅人民的身體健康，同時嚴重影響我國水產 品在國際上競爭力，并造成重大經濟損失，已引起社會各界的廣泛關 注。孔雀石綠(malachite green，MG)，孔雀石綠(分子式C23H2sCllN2 ，又名堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠)是一種帶有金屬光澤的綠色結晶體, 屬三苯甲垸類染料，結構見附圖l。從1933年起其作為驅蟲劑、殺菌 劑、防腐劑廣泛用于預防與治療各類水產動物的水霉病、鰓霉病和小 瓜蟲病等，特別在治療水霉病上具有非常有效的作用。孔雀石綠是三 個芳香胺的聚合物，存在潛在的致癌性，這在各種毒理學實驗也得到 了證實。隱孔雀石綠(leucomalachitegreen，LMG)是孔雀石綠的還 原產物，結構見附圖l，是已知的孔雀石綠在魚體及其他生物體內的主要代謝產物和存在形式，其危害比孔雀石綠更大，在體內殘留時間 更長。由于孔雀石綠和無色孔雀石綠在魚體內和環境中殘留時間長，并有致畸、致癌和致突變的危險性，我國于2002年5月將孔雀石綠列 入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》(農業部公告193號)。歐 盟及美國都不允許孔雀石綠用于養殖魚類，日本在其本國內也是限制 使用。但由于孔雀石綠低廉的價格及在水霉病防治方面較好的效果， 因此仍有不法商販在使用，孔雀石綠事件時有發生。孔雀石綠的非法 使用給我們國家經濟和人民健康造成了極其嚴重的后果，其殘留檢測 問題一直備受關注。目前對孔雀石綠及隱孔雀石綠殘留檢測主要是用 氣相色譜法和高效液相色譜法，但設備昂貴且操作繁瑣，不適用于現 場快速檢測。免疫分析檢測技術是近年來在環境、食品安全監測領域 逐漸廣泛應用的一種快速、高通量、低成本的檢測技術，已逐漸成為 世界各國有毒有害殘留物快速篩選檢測的主要方法之一。這為隱孔雀 石綠及孔雀石綠的檢測提供了新的途徑。 發明內容本發明的第一個目的是針對本領域的迫切需要，提供一種隱孔雀 石綠半抗原。本發明的第二個目的是提供所述隱孔雀石綠半抗原的制備方法。 本發明的第三個目的是提供由所述隱孔雀石綠半抗原制備得到 的抗體，以及抗體的應用。本發明的目的通過以下技術方案來予以實現提供一種隱孔雀石綠半抗原，保留隱孔雀石綠的特征結構，在隱孔雀石綠結構的不同化學位點上衍生出具有不同電子結構性質、不同 碳鏈長度以及適合與大分子載體偶聯的活性手臂，所述活性手臂為R 基團、芳香胺、末端羧基直鏈烷基醚或帶有直鏈末端羧基結構的酰胺 鍵。所述隱孔雀石綠半抗原結構式可以為<formula>formula see original document page 8</formula>， 或者<formula>formula see original document page 8</formula>，其中R為(CH2) nCOOH， n為0 4的整數。所述隱孔雀石綠半抗原結構式為<formula>formula see original document page 8</formula>或者<formula>formula see original document page 8</formula>，所述隱孔雀石綠半抗原結構式為:其中n為1 4的整數。或者，所述隱孔雀石綠半抗原結構式為:<formula>formula see original document page 9</formula>其中n為1 4的整數。本發明同時提供了所述隱孔雀石綠半抗原的制備方法，采用N， N-二甲基苯胺與芳香醛類物質在甲苯反應體系、Amberlyst 15 Resin 作為反應催化劑條件下合成。所用原料的摩爾比為N，N-二甲基苯胺 芳香醛:催化劑=2:1:0.1;反應溫度為80 100°C，反應時間為8 10h。為了保證所合成隱孔雀石綠系列半抗原的結構準確性，采用過 濾、萃取及減壓柱層析手段對所和成系列隱孔雀石綠半抗原進行分離 純化，并通過質譜(MS)和核磁氫譜^H-NMR)進行鑒定，確證了 所有目標半抗原物質合成成功。主要代表性半抗原的結構見附圖3。本發明提供了由所述隱孔雀石綠半抗原制備得到的隱孔雀石綠人 工抗體，通過采用隱孔雀石綠半抗原與載體蛋白質偶聯得到隱孔雀石 綠人工抗原；隱孔雀石綠人工抗原經免疫動物、細胞融合等生化過程 制備得到所述隱孔雀石綠人工抗體。所述隱孔雀石綠人工抗原的結構式為<formula>formula see original document page 10</formula>/所述隱孔雀石綠人工抗體可應用于檢測食品、農產品或環境樣品 中的隱孔雀石綠和孔雀石綠的殘留量。本發明的有益效果是 (1)本發明通過設計合成隱孔雀石綠半抗原和人工抗原，經免 疫動物產生特異性抗體，通過細胞融合技術篩選到了高親和力、高特異性隱孔雀石綠單克隆抗體。(2) 本發明建立了隱孔雀石綠的快速免疫檢測方法和實驗室標 準檢測方法，并對pH值、離子強度等影響測定的因素進行分析，確 定最佳工作條件，建立標準曲線即目標分析物濃度對抗體的抑制率 的相關曲線。在檢測分析食品、和環境土壤與水等樣品中隱孔雀石綠 殘留時具有很高的特異性和靈敏度，準確度高，回收率可達80 110%，同時操作方法簡單快速，不需要復雜的前處理過程， 一次可 同時檢測大批樣品，成本低廉，對操作人員要求低，便于進行現場監 控，可以與常規方法互為補充。(3) 本發明的隱孔雀石綠半抗原化合物的化學合成方法，其技 術關鍵是采用了高效的催化劑，巧妙地利用化學合成手段從源頭出 發，以芳香胺，芳香醛為反應原料，連續法或一鍋法合成隱孔雀石綠 半抗原。其優點是1)反應條件溫和，操作方便，收率高。2)反應 副產物少，而且反應后處理簡便，減少了對于環境的污染。是一種高 效的合成方法，本發明在免疫分析檢測領域具有深遠的應用價值。總之，本發明成功合成出具有不同活性基團、不同化學位點、不 同手臂長度的隱孔雀石綠半抗原，通過偶聯大分子載體成功制備出人 工抗原。在免疫動物基礎上制備出了針對隱孔雀石綠的高親和力、高 特異性免疫球蛋白，建立了靈敏、快速、高效、經濟的隱孔雀石綠免 疫檢測方法。同時，通過抗原的構效關系分析為免疫學機理定量分析 奠定了基礎，提供了新的研究思路。
圖l孔雀石綠和隱孔雀石綠結構圖 圖2隱孔雀石綠半抗原結構式圖3幾種典型的隱孔雀石綠半抗原結構式 圖4隱孔雀石綠人工抗原結構式 圖5隱孔雀石綠半抗原的合成路線l 圖6隱孔雀石綠半抗原的合成路線2 圖7隱孔雀石綠半抗原的合成路線3 圖8隱孔雀石綠半抗原的合成路線具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例來進一步說明本發明。 實施例l半抗原的合成路線見附圖5。取N，N-二甲基苯胺2.50g(20.0mmol)于50ml兩口燒瓶中，緩慢加 入5%的Amberlystl5Resin，磁力攪拌幾分鐘，磁力與攪拌時間按照 常規的技術具體選擇，時間一般在5 10min。在攪拌狀態下，加入 1.50g 4-羧基苯甲醛或3-羧基苯甲醛，于80 10(TC攪拌過夜。待反 應結束后過濾催化劑并向反應體系中加入飽和碳酸氫鈉溶液調酸堿 度至pH-9.0，用二氯甲垸萃取。取水相用稀鹽酸調節pH-2，用乙酸 乙酯萃取，將有機層減壓旋轉蒸發得粗產物。粗產物用減壓硅膠柱層 析法進行純化到白色固體物質，其結構式見附圖3 (a)和(b)。附圖5中，合成(a)時，Ri為COOH， R2為H;其波譜數據為 +ESI-MS m/z: 375[(M+H)+]; 腿R(400MHz, ^-Acetone, TMS):5 2.90(s，12H)， 5.44(s，lH)， 6.69(d,/=8.7Hz， 4H)， 6.96(d，/=8.7Hz， 4H)，7.26(d, J=8.2Hz， 2H)， 7.95(d, /=8.2Hz， 2H);合成(b)時，R2為COOH， 為H。其波譜數據為+ESI-MS m/z: 375[(M+H)+]; iH-NMR(400MHz, ^5-Acetone，TMS):S2.88(s， 12H)， 5.45(s， IH)， 6.68(d， J=8.8Hz， 4H)， 6.96(d， J-8.8Hz， 4H)， 7.38-7.41(m, 2H)， 7.85-7.86(m, 2H);實施例2半抗原的合成路線見附圖6。取N，N-二甲基苯胺2.50g(20.0mmol)于50ml兩口燒瓶中，緩慢加 入5%的Amberlystl5Resin,磁力攪拌幾分鐘。在攪拌狀態下，加入 1.53g 3-硝基苯甲醛或4-硝基苯甲醛。通氮氣條件下，于80 10(TC 攪拌過夜。待反應結束后過濾催化劑，減壓旋轉蒸發得到黃色固體。在圓底燒瓶中加入上述粗產物3,75g (約10mmo1)，加入95%的 乙醇10ml，攪拌使之溶解后加入鐵粉4g (約70mmo1)，蒸餾水20ml， 最后滴加lml濃鹽酸，8(TC回流2h停止反應。抽濾得水相，用乙酸 乙酯萃取得有機相，減壓選轉蒸發得淺黃色粗產物。得到的粗產物用 減壓硅膠柱層析法進行純化得到淺黃色固體目標物質，其結構式見附 圖3 (c)禾卩(d)。附圖6中，合成(c)時，&為N02， R2為H， 113為NH2 ， R4 為H;其中(c)的波譜數據為+APCI-MS m々346[(M+H)+]; 丄H-畫R(400MHz， ^j-Acetone， TMS):32.88(s, 12H), 4.45(s， br， 2H)， 5.19(s， 1H)， 6.57(d, /=8.4Hz， 2H)， 6.66(d， /=8.8Hz, 4H)， 6.8(d， J=8.3Hz， 2H)， 6.90(d, J^8.6Hz， 4H);合成(d)時，112為N02， &為H， R4 為NH2 ，R3為H;其中(d)的波譜數據為+ESI-MSm々:346[(M+H)+]; 丄H-麗R(400MHz，Acetone, TMS):52.88(s, 12H)， 4.49(s， br， 2H)，5.19(s， 1H)， 6.35(d， J-7.6Hz， 1H)， 6.43(s， 1H)， 6.47(d, J:7.90Hz， 1H)， 6.66(d，風7Hz, 4H)， 6.91-6.96(m， 5H)。實施例3半抗原的合成路線見附圖7。取12.2g 3-羥基苯甲醛或4-羥基苯甲醛于150ml園底燒瓶，用 20ml蒸餾水溶解，加入4gNaOH攪拌反應。然后在攪拌狀態下逐滴 加入11.6g氯乙酸鈉的溶液，于80 100。C回流攪拌反應2 3h。反 應結束后，加適量濃鹽酸酸化后再加入飽和碳酸氫鈉溶液調節至堿 性，用乙酸乙酯萃取后將水相用稀鹽酸酸化水相至沉淀析出，減壓干 燥沉淀得中間產物。將中間產物與N，N-二甲基苯胺按照摩爾比1:2加入50ml兩口燒 瓶中，同時加入5%的Amberlyst 15 Resin，通氮氣下，于80 10(TC 攪拌過夜。待反應結束后過濾催化劑，減壓旋轉蒸發得到黃綠色固體 粗產物，經減壓硅膠柱層析分離得到純目標物質，其結構式見附圖3 (e)禾卩(f)。附圖7中，合成(e)時，Ri為OH， R2為H， R3為CH2COOH , R4為H;其中(e)的波譜數據為+APCI-MS m々405[(M+H)+]; 丄H-腿R(400MHz， ^"Acetone, TMS):52.88(s, 12H)， 4.66(s， 2H)， 5.29(s， 1H)， 6.67(d， /=8.8Hz， 4H)， 6.85(d， J=8.8Hz, 2H)， 6.94(d， J-8.8Hz， 4H)， 7.03(d， /=8.8Hz, 2H);合成(f)時，R2為OH， &為H， R4為CH2COOH ， Rs為H;其中(f)的波譜數據為+APCI-MS m々405[(M+H)+]; iH-畫R(400MHz，Acetone, TMS):52.89(s， 12H)， 4.62(s， 2H)， 5.32(s 1H)， 6.68(d,/=8.8Hz，4H)， 8.74-8.79(m， 3H)， 6.96(d， J:8.8Hz， 4H)，7.19(t，^8.0Hz， 1H)。實施例4半抗原的合成路線見附圖8。于100ml燒瓶中取半抗原c (或d) 3.45g (約O.Olmol)溶于四 氫呋喃溶液，加入10%DMAP作為催化劑。在磁力攪拌狀態下，逐 滴緩慢加入0.015mol的順丁烯二酸酑四氫呋喃溶液。于80 10(TC加 熱回流攪拌反應4h。于反應溶液中加入飽和碳酸氫鈉溶液調節至 pH-9左右，用二氯甲烷萃取溶液。用稀鹽酸調節水相至pl^2左右， 乙酸乙酯萃取，有機相經減壓旋轉蒸發的淡黃色固體物質即為目標粗 產物，減壓硅膠柱層析得目標物質，其結構式見附圖3 (g)和(h)。附圖8中，合成(g)時，&為NH2， R2為H;其中(g)的波 譜數據為+ESI-MSm々444[(M+H)+]; iH-NMR(400MHz, ^"DMSO， TMS):5 2.84(s， 12H)， 5.25(s, 1H)， 5.78(d， /=13.6Hz， 1H), 6.16(d， 7=13.6Hz， 1H)， 6'64(d， /=8.8Hz， 4H)， 6.89(d， J=8.8Hz， 4H)， 6.99(d， /=8.4Hz，2H)， 7.49(d,/=8.4Hz，2H)， 14.43(s，br， 1H);合成(f)時， Rz為OH， &為H， R4為CH2COOH ， R3為H。合成(h)時，R2 為NH2， &為H;其中(f)的波譜數據為+ESI-MS w々444[(M+H)+]; ^-畫R(400MHz， ^tDMSO， TMS):52.89(s， 12H)， 5.27(s， IH)， 6.26(d， ■/=12.0Hz, IH)， 6.26(d,J=12.0Hz， IH)， 6.37(d，《/=12.0Hz, IH)， 6.64(d， 7=8.8Hz, 4H)， 6.79(d， 《/=8.0Hz， IH)， 6.89(d， J=8.8Hz, 4H)， 7.21 (t, 7=8.0Hz， IH)， 7.29(s，lH)， 7.55(d，/=8.0Hz， 1H)， 10.47(s， br， IH)。 實施例5人工抗原的合成、純化及鑒定5.1人工抗原的合成與純化人工抗原的合成采用活潑酯法和重氮法。人工抗原的合成依據帶 羧基的用活潑酯法合成，含有氨基的半抗原采用重氮法合成。活潑酯法合成人工抗原步驟稱取lmmol的半抗原和N-羥基琥 珀酰亞胺(NHS) lmmol溶于l.OmlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。 將lmmol N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)溶于1.0mlDMF中，磁力 攪拌下逐滴加入，室溫攪拌3.5h得A液。然后在攪拌狀態下將A液逐 滴加入到BSA溶液中，4"C冰箱攪拌反應過夜。4"C下用9%。的生理 鹽水透析3天，每4h換一次透析液。紫外掃描透析液無小分子吸收 峰時可將透析得到產物分裝于離心管中，-2(TC保存。合成包被人工抗原步驟同上，將BSA換成卵清蛋白(OVA)即 可制得包被抗原。重氮法合成人工抗原步驟稱取lmmol半抗原于10ml稱量皿中， 加入lmll.0mol/L的鹽酸溶液，隨后稱取lmmol NaN02加入稱量皿 中，冰浴攪拌30min。得到淡黃色液體A。攪拌狀態下將A液逐滴加 入到BSA溶液中，4。C反應過夜。4匸下用9%。的生理鹽水透析3天， 每4h換一次透析液。紫外掃描透析液無小分子吸收峰時可將透析得 到的產物分裝于離心管中，-2(TC保存。合成人工包被抗原步驟同上，將BSA換成卵清蛋白(OVA)即 可制得包被抗原。按照上述方法分別由半抗原(a) (h)制備得到8種免疫原， 8種免疫原的結構式見附圖4。 5.2人工抗原的鑒定按照合成隱孔雀石綠免疫原和包被原時反應物和產物的比例，分別取反應物和產物進行200 400nrn紫外掃描分析。偶聯物與半抗原 及載體的吸收峰相比，發生了明顯的變化，表明這幾種人工抗原的合 成是成功的。經計算半抗原與載體(BSA或OVA)的結合比如下:免疫抗原b-BSAa-BSAd-BSAc-MGN-BSA結合比27:139:117:115:1免疫抗原f-BSAe-BSAh-BSAg-BSA結合比31:128:121:134:1包被抗原b-OVAa-OVAd-OVAc-OVA結合比13:114:110:19:1包被抗原f-OVAe- OVAh-OVAg- OVA結合比8:17:19:111:1實施例6抗體的制備6.1免疫動物制備抗血清免疫動物選用Balb/c小鼠，小鼠由中山醫學院動物實驗中心提 供，按照常規免疫手段各免疫三只小鼠。具體方法是將半抗原與蛋白質偶聯制備得到的8種免疫原用 0.9%的NaCl溶液配制成lmg/ml的抗原，加入等體積弗氏佐劑充分 乳化，直至滴入水中乳滴不分散，然后進行動物免疫。免疫方法采用 皮下注射法，初次免疫3 4周后進行加強免疫，以后每隔2周再次 加強免疫。從加強免疫開始，在每次免疫小鼠7天后對小鼠進行尾部 取血，血清經適當稀釋后用間接ELISA測定血清效價。待免疫血清 效價合格后，就進行采血。實驗采血采用尾部取血法。每只小鼠采血80^1左右，取完血清 后在^C冰箱5 6小時，然后以5000rpm離心10分鐘，分離血清。6.2抗血清效價測定幾種免疫原復合物按常規方法各免疫三只小鼠，從加強免疫第二次開始，在每次免疫后第7天尾部取血，血清經適當稀釋后用間接ELISA測定效價。待第5次免疫時，小鼠獲得了高效價的抗體。 其抗血清的效價如下免疫抗原b-BSAa-BSAd-BSAc-BSA1:64001:128001:64001:12800效 價1:128001:128001:128001:64001:12鵬1:256001:64001:6400免疫抗原f-BSAe-BSAh-BSAg-BSA1:256001:512001:128001:25600效 價1:512001:1024001:256001:128001:256001:512001:128001:256006.3抗體的純化與鑒定抗體純化采用辛酸-硫酸銨鹽析，也可采用蛋白A柱層析。辛酸 在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白都沉淀下來中，上清 中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70^/ml, 兔血清為75pl/ml，小鼠血清為40pl/ml，小鼠腹水為33 |il/ml。 實施例7隱孔雀石綠ELISA測定方法的原理采用間接競爭酶聯免疫分析方法，將藥物分子與大分子載體(如 蛋白質)偶聯制得的復合物作為包被抗原吸附于固相載體(96孔酶 標板)上，制備成固相抗原，然后加入待測藥物和相應抗體，固相抗 原中的藥物，待測藥物，與抗體進行競爭結合反應，待測藥物含量多， 被結合在固相抗原上的抗體就少，反之結合在固相抗原的抗體多，反 應后加入酶標二抗(只能與結合在固相抗原上的抗體相結合)，最后 用底物進行顯色加以測定，當抗體量一定時，加入的待測藥物量就多，與固相抗原結合的抗體就少，顯色反應就減弱，抑制率增高，反之， 則顯色反應增強，抑制率減低，因而可根據已知量藥物的標準線和待 檢樣品的抑制率，推算出待測藥物的濃度。上述內容見申請號為200810025908.2的專利申請資料。7.2最佳抗體工作濃度和包被抗原復合物濃度的確定采用方陣滴定法確定包被抗原濃度、抗體、二抗濃度，在同一包 被濃度下，隨著抗體的稀釋，所得OD值呈下降趨勢，同樣在同一抗 體稀釋度下，隨著包被濃度的下降，所得OD值也呈下降趨勢。選擇 抗體6400倍稀釋最為最適工作濃度，包被抗原濃度0.5pg/ml最佳包 被濃度。7.3標準曲線和檢測靈敏度7.3.1標準曲線的制備，其基本操作步驟如下7.3丄1包被將制備好的抗原溶于50mmol/L、 pH=9.6的碳酸緩沖液 中，配制成合適濃度的包被液，按照每孔100^d加入到96孔板4'C放置過夜。7.3丄2封閉取出包被好的96孔板，甩掉包被液，用PBST洗滌后， 每孔加入5.0%脫脂奶粉200|il，于37°。溫育3h。 7.3.1.3加樣取隱孔雀石綠用甲醇配制一系列濃度的隱孔雀石綠標 準溶液，將制備好的抗體用PBST稀釋成工作濃度。取出封閉好的 96孔板，每孔加入系列濃度的隱孔雀石綠50p〗，再加入抗體工作液 50n，對照孔加入抗體工作液50pl和PBST5(^1。放入37t;溫箱溫育 lh，棄去孔內液體，用PBST溶液洗滌4次。7.3丄4加酶標二抗每孔加入經l: 10000稀釋的羊抗小鼠辣根過氧化物酶溶液10(^1，放入37"C溫箱反應1小時，用PBST溶液洗滌4 次，甩干。7.3丄5顯色每孔加入底物TMB-過氧化氫溶液lOOjil， 37。C溫育 15min，用50pl， 2mol/LH2S04終止反應。在酶標儀上測定450nm波 長下的吸光值，根據抑制率與藥物濃度之間的半對數關系作圖即得到 標準曲線。ELISA方法的標準曲線以抑制率與藥物濃度的半對數曲線表示， 目標分析物濃度對抗體的抑制率用下式計算抑制率(％) = (Amax-Amin) - (Ai-Amin) / (Amax-Amin) *100式中Amax為不加分析物孔平均吸光值；Amin為免疫前小鼠 血清對照孔平均吸光值；Ai為加樣孔平均吸光值。以抑制率為縱坐標，分析物濃度為橫坐標由上述公式計算得隱孔 雀石綠各濃度的抑制率，作圖。通過實驗優選，獲得最佳抗體，當抑 制率為50%時隱孔雀石綠的濃度為lng/ml，最低檢測限(以抑制率 為10%時的濃度表示)為0.005ng/ml。隱孔雀石綠在0.005ng/ml 10 ng/ml范圍內，抑制率與藥物濃度的對數值呈顯著的線性關系，相關 系數為F0.9867。7.4抗體特異性抗體與結構類似化合物的交叉反應程度，通常以抑制抗體最大結合率的50%所需目標分析物的濃度IC50i與所需各種結 構類似化合物的濃度IC50m之比的百分數表示，即交叉反應率C.R (%)。CR (%) =I50i/I50m*100交叉反應越小，抗體特異性越高。將隱孔雀石綠及其類似物做系列稀釋，分別與同一種抗體競爭反 應，按照同樣的方法制作標準曲線，通過曲線上抑制率為50%的分析 物濃度和類似物抑制率為50%時的濃度計算各類似物的交叉反應率。通過實驗得出抗體對隱孔雀石綠的特異性強，與類似物不存在 交叉反應。
權利要求
1、一種隱孔雀石綠半抗原，其特征在于保留隱孔雀石綠的特征結構，在隱孔雀石綠結構的不同化學位點上衍生出具有不同電子結構性質、不同碳鏈長度以及適合與大分子載體偶聯的活性手臂，所述活性手臂為R基團、芳香胺、末端羧基直鏈烷基醚或帶有直鏈末端羧基結構的酰胺鍵。
2、 根據權利要求1所述隱孔雀石綠半抗原，其特征在于所述隱孔雀石綠半抗原結構式為<formula>formula see original document page 2</formula>其中R為(CH2) nC00H， n為0 4的整數。
3、根據權利要求1所述隱孔雀石綠半抗原，其特征在于所述隱 孔雀石綠半抗原結構式為<formula>formula see original document page 2</formula>
4、根據權利要求1所述隱孔雀石綠半抗原，其特征在于所述隱孔雀石綠半抗原結構式為其中n為1 4的整數。
5、根據權利要求1所述隱孔雀石綠半抗原，其特征在于所述隱孔雀石綠半抗原結構式為<formula>formula see original document page 3</formula>其中n為1 4的整數。
6、 一種權利要求l、 2、 3、 4或5所述隱孔雀石綠半抗原的制備 方法，其特征在于采用N， N-二甲基苯胺與芳香醛類物質在甲苯反應 體系、Amberlyst 15 Resin作為反應催化劑條件下合成。
7、 根據權利要求6所述隱孔雀石綠半抗原的制備方法，其特征在 于所用原料的摩爾比為N， N-二甲基苯胺芳香醛:催化劑=2:1:0.1; 反應溫度為80 100°C ，反應時間為8 10h。
8、 一種利用權利要求1所述隱孔雀石綠半抗原制備得到的隱孔雀 石綠人工抗體，其特征在于通過采用隱孔雀石綠半抗原與載體蛋白質 偶聯得到隱孔雀石綠人工抗原；隱孔雀石綠人工抗原經免疫動物制備得到所述隱孔雀石綠人工抗體。
9、根據權利要求8所述利用隱孔雀石綠半抗原制備得到的隱孔雀石綠人工抗體，其特征在于所述隱孔雀石綠人工抗原的結構式為/
10、根據權利要求8或9所述隱孔雀石綠人工抗體的應用，其特征在于應用于檢測食品、農產品或環境樣品中的隱孔雀石綠和孔雀石綠的殘留量。
全文摘要
本發明公開了一種隱孔雀石綠半抗原，保留隱孔雀石綠的特征結構，在隱孔雀石綠結構的不同化學位點上衍生出具有不同電子結構性質、不同碳鏈長度以及適合與大分子載體偶聯的活性手臂，所述活性手臂為R基團、芳香胺、末端羧基直鏈烷基醚或帶有直鏈末端羧基結構的酰胺鍵；由隱孔雀石綠半抗原制備得到隱孔雀石綠人工抗體，應用于檢測隱孔雀石綠和孔雀石綠的殘留量時具有很高的特異性和靈敏度，準確度高，回收率可達80～110％，同時操作方法簡單快速，不需要復雜的前處理過程，一次可同時檢測大批樣品，成本低廉，對操作人員要求低，便于進行現場監控，并可以與常規方法互為補充，成功建立了靈敏、快速、高效、經濟的隱孔雀石綠免疫檢測方法。
文檔編號C07C233/43GK101245032SQ200810026199
公開日2008年8月20日 申請日期2008年1月31日 優先權日2008年1月31日
發明者孫遠明, 徐小艷, 沈玉棟, 宇 王, 弘 王, 肖治理, 雷紅濤 申請人:華南農業大學