專利名稱：鯊魚蛋白降壓肽及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從鯊魚肉的酶解產物中分離純化出的具有新的氨基酸序列的降壓 肽及其制備方法與應用，屬于海洋生物技術領域。
技術背景由食物蛋白經過部分酶解所得的短肽越來越引起食物學家的重視。這些短肽具有 各種活性，比如提高免疫力，提高營養吸收率，抗高血壓活性。具有這些活性的蛋 白已經從食物蛋白酶解物中純化出來，這些肽在蛋白質序列內是沒有活性的，只有通 過酶解或食物加工從蛋白中釋放出來才具有活性。血管緊張素轉化酶(ACE)是一種能夠催化血管緊張素1轉化成血管緊張素2的羧 肽酶，能夠導致血壓升高，因此抑制ACE活性，可以導致血液中的血管緊張素2的濃 度降低，從而導致血壓降低。雖然人工合成的ACE抑制劑具有明顯的降血壓效果，但 是副作用太大，因此現在必須找到更安全、新穎、高效的治療高血壓的藥物。現在從 不同的蛋白中通過不同的酶進行酶解，在其酶解物中發現了許多ACE抑制短肽，這些 蛋白資源包括牛奶蛋白、大豆蛋白、雞蛋蛋白、雞肉蛋白、海洋魚類蛋白、藻類等， 到現在為止已有兩百多種具有ACE抑制活性的酶解活性肽被報道，但是現在報道的 ACE抑制短肽主要來源于陸地蛋白的酶解物，來源于海洋蛋白酶解物的報道較少，因 此，今后，海洋生物蛋白酶解物將成為今后篩選新的ACE抑制肽的重要來源。鯊魚本身對外界致癌物質和微生物、病毒等具有極強的免疫力，鯊魚抗癌防病的 機理一直尚未研究清楚。目前對鯊魚的研究和應用只限于鯊魚魚肝油和鯊魚軟骨提取 物，但是鯊魚魚肝油和鯊魚軟骨僅僅只是鯊魚身體的一小部分，對除了鯊魚魚肝油和 鯊魚軟骨之外的大部分鯊魚材料的研究和應用尚停留在初級階段。鯊魚蛋白用于酶解 分離降高血壓肽的好原料。 發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種鯊魚蛋白降壓肽及其制備方法與應用。一種鯊魚蛋白降壓肽，其特征在于，是如下短肽之一或組合Cys-Phe 肽1,Glu-Tyr 肽2，Phe-Glu 肽3。本發明所述的鯊魚蛋白降壓肽具有較高的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性， 為白色粉末狀，易溶于水，其中，Cys-Phe降壓肽的ICso值0.523 mg/ml對應為 1.96pM， Glu-Tyr降壓肽的ICso值0.824 mg/ml對應為2.68pM， Phe-Glu降壓肽的IC50 值0.426mg/ml對應為1.45 uM。本發明上述鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，包括酶解鯊魚蛋白制備酶解液、從酶解液中分離純化降壓肽和降壓肽的序列測定。具體步驟如下 (一)酶解鯊魚蛋白制備酶解液按鮮重稱取鯊魚肉45 50重量份原料，打漿，然后加入45 50重量份的蛋白酶 制劑，調pH值到6.8 7.3，溫度45 5(TC，攪拌酶解5.5小時，酶解完畢后，離 心，取上清液，即得酶解液。(二) 從酶解液中分離純化降壓肽用3000Da的超濾膜將酶解液超濾，將超濾小于3000Da的超濾液過Sephadex G-15 柱(1.6X80cm, medium Pharmacia),用蛋白核酸檢測儀，在214畫處進行檢測，根據 從色譜柱分離得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱重后，測定ACE抑制活 性，將抑制活性高的組分多次收集，然后進一步用高壓液相色譜分離；PDA檢測器檢 測波長為220nm，然后根據所得的肽的譜圖將肽峰分別收集濃縮，測定ACE抑制活 性，得到具有高的ACE抑制活力的肽。進一步優選的，所述的高壓液相色譜柱為反相C18柱。(三) 降壓肽的序列測定將分離純化得到的具有高的ACE抑制活力的肽，用氨基酸自動測序儀測定氨基酸 組成，再通過液質連用儀(PE SC正X API 4000 LC/MS-MS systems, Applied Biosystems， USA),分析肽的分子量和肽段的分布，然后進行肽的氨基酸序列分析。進一步優選的，所述的肽的氨基酸序列分析是將肽用6N的HC1在115°C全水解 22小時，通過氨基酸自動測序儀進行測定。優選的，所述的(一)酶解鯊魚蛋白制備酶解液的步驟中的蛋白酶制劑通過如下方 法制得，所述組份的量均為重量份 (1)液體種子制備培養基餅粉2~3份、玉米粉2~3份、麩皮1~1.5份、Na2HP04 0.4 0.5份、 KH2PO4 0.03 0.04份、水100份，滅菌，冷卻，接種枯草芽孢桿菌SM98011 (5ac/腸. SwWfc SM98011)的茄子瓶菌種的菌懸液5 10份，通風攪拌，培養15~18小時，作 為液體種子待用。、 (2)液體深層發酵制備蛋白酶制劑培養基豆餅粉3 3. 5份、玉米粉3. 5 5. 0份、麩皮2. 0 2. 5份、Na2HP04 0. 4 0. 5份、KH2P04 0. 03 0. 04份、水100份，滅菌，接種上述步驟(1)的液體種 子，接種量為培養基重量的5 7%，通風攪拌，控溫，發酵37 40小時，得蛋白酶制 劑，酶活為4000U/ml。該步驟(2)的培養基中還可加入豆油0.3 0.35重量份作消泡 劑。所述的(二)從酶解液中分離純化降壓肽步驟中測定肽的ACE抑制活性方法可用傳 統方法如分光光度法或高壓液相色譜法，也可用毛細管電泳法。優選的，毛細管電泳法 具體步驟如下將10 y 1含有ImM底物Hip-His-Leu和0. 8mU的血管緊張素轉化酶(ACE)的系列 樣品反應液分別和若干10u 1的0. 03 40mg/ml酶解液混合為若干組樣品。所述系列 樣品反應液和酶解液都用100 mM的硼酸緩沖液(包含0.3M NaCl， pH 8.3)配制。反 應液在37。C反應30 min，然后用0. 1%三氟乙酸TFA (10yl)中止反應。血管緊張 素轉化酶抑制反應產物直接在毛細管電泳儀上進行檢測。毛細管電泳儀為BeckmanCoulter P/ACE MDQ (Fullerton， CA)裝置，配備有PDA (photodiode array)檢測 器，數據采集、分析、系統控制用P/ACE MDQ軟件，該軟件來自Beckman Coulter (Fullerton, CA)。中止反應后的混合物樣品直接用毛細管電泳進行檢測，上樣壓力為 lpsi，時間為5秒，電泳電壓20kV，紫外吸收為228mn，電泳時間5分鐘，電泳緩沖 液為20mM的硼酸緩沖液(pH 9.18)。每測定一個樣品之后用緩沖液沖洗毛細管1分 鐘。底物和產物馬尿酸分別在2.5分鐘和3.5分鐘出峰，根據上述軟件計算馬尿酸的 峰面積。ACE抑制活性的計算(IC5。值的計算) 馬尿酸配制成不同濃度0. 2mM， 0. 4mM， 0. 6mM， 0. 8mM, 1. 0mM, 1. 2mM， 2mM, 4mM, 6mM， 通過毛細管電泳測定其峰面積與馬尿酸濃度的線性關系。 峰面積KXChip+N ACE活力(umol/min卜VXChip + t V:反應體積，t:反應時間，K:根據峰面積和馬尿酸濃度求出的曲線常數， Chip:馬尿酸濃度，N:馬尿酸濃度曲線與Y軸的交點。通過血管緊張素轉化酶作用，不含任何抑制肽，從底物Hip-His-Leu釋放出來的 馬尿酸HA的量被定義為100% ACE活力。抑制50%的ACE活力的海洋蛋白酶解產物 的量被定義為酶解產物的抑制活力。IC5。值的計算采用線性對數法，以Log (ACE活力 /(l-ACE活力))對Log (水解產物濃度mg/ml)作圖，所得直線與X軸的交點對應的 值為M, 1()M為酶解產物抑制ACE活力的ICs。值。上述反應試劑和實驗操作，如未作特別說明的，均為本領域常規反應試劑及實驗 操作。本發明鯊魚蛋白降壓肽在制備降壓藥物中的應用。本發明鯊魚蛋白降壓肽具有較 高的ACE抑制活性，降血壓效果好。本發明所得的短肽產品干燥處理后為白色粉末， 易溶于水，可用于制備降壓藥物。本發明的優良效果在于將陸地微生物酶工程技術應用于鯊魚的深層次開發利用。 具體體現在7、用鯊魚作為酶解原料么從酶解液通過色譜方法分離純化具有降血壓 功能的肽義用ACE反應來檢測各步產物的降壓活性么并對得到的具有新序列的具 有較高ACE抑制活力的肽，IC50值分別為1.96pM， 2.68pM和1.45pM。
圖1是實施例1步驟(3)經過3000Da的膜超濾的鯊魚酶解液經過Sephadex G-15柱分離的色譜圖。圖2是Sephadex G-15柱分離的D組分樣品在高壓液相的反相C18柱上分離得到 的色譜峰。圖3、圖4和圖5分別是C18柱上分離得到的色譜峰中的e、 h、 q號樣品的ICs。 值的線性對數圖，證明e、 h、 q號樣品是具有高的ACE抑制活力的純肽，它們分別是 分離純化的3條肽Cys-Phe, GIu-Tyr禾B Phe-Glu。
具體實施方式
下面結合說明書附圖和實施例對本發明做進一步闡述，但不限于此。實施例l.從鯊魚酶解物中分離純化得到三條肽Cys-Phe、 Glu-Tyr和Phe-Glu。(1) 蛋白酶制劑的制備種子培養基以重量份牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、瓊脂2份、NaCl 0.5份為培 養基，水98份，pH為7. 1，滅菌，劃線接枯草芽孢桿菌SM98011 Sw6,/fc SM懇1)菌種，30。C培養，培養20小時。發酵培養基豆餅粉3份、玉米粉2份、麩皮1份、Na2HP04 0.4份、KH2P04 0.04份、水100份，加豆油0.3份作消泡劑。120。C滅菌30分鐘，冷卻后，接上種子 的菌懸液10份，150升發酵罐中，裝樣量70升，于3(TC下，通風量(V風/ V液'時 間)l: 0.6，攪拌330轉/分鐘，培養36小時。此時pH7.0。(2) 酶解短肽的制備首先稱取50份(鮮重)的鯊魚肉，打漿。然后加入50份(液體重量)的蛋白酶 制劑，調pH值到7.2， 5CTC，攪拌酶解5小時，酶解完畢，5000rpm離心，上清為酶 解短肽液。(3) 降壓肽的分離純化將上清液用3000Da的膜超濾，然后將超濾液上Sephadex G-15柱，分離得到6個 峰，分別收集，測定ACE抑制活力，得到第D號峰具有較高的ACE抑制活力(見圖1) ，反復收集，上高壓液相色譜，將D號樣品進一步分離，得到17個色譜峰(見圖2) ，其中有3個峰具有較高的ACE抑制活力，這3個峰對應的肽分別為Cys-Phe， Glu-Tyr禾Q Phe-Glu。(4) 降壓肽的序列測定將步驟(3)得到的具有較高ACE抑制活力3個純肽用6N的HC1全水解，用氨基 酸自動測序儀測定氨基酸組成，然后用液質連用儀分析3條肽的分子量和肽段的分布， 分析出3條肽的氨基酸序列為Cys-Phe, Glu-Tyr和Phe-Glu。毛細管電泳法測定IC50 值分別為為1.96, 2.68和1.45 )iM。如圖3,圖4和圖5所示。根據現有技術具有酶 解ACE抑制肽的ICs。值為0. 2u M-600線ICs。值越小,說明對ACE的抑制作用越強， 降血壓效果越好。由此證明，從鯊魚酶解物中分離純化的三條肽具有較高的ACE抑制活 性。本實施例所得的短肽產品干燥處理后為白色粉末，易溶于水。 實施例2:如實施例1所述，所不同的是原料鯊魚的用量不一樣，取45份(鮮 重)的鯊魚肉，打漿。然后加入50份(液體重量)的蛋白酶制劑。本發明的短肽具有較高的ACE抑制活性，因為本發明的三條肽均為二肽，因此， 在消化道內，很難被進一步的酶解，可被直接吸收利用，因此，推測在體內也會發揮 較好的降血壓活性。本發明的特點在于集酶工程技術和肽純化鑒定技術于一體，對 對鯊魚至今未被有效利用的蛋白部分進行了深入的開發利用，發現了有新的氨基酸序 列組成的ACE抑制肽并保證了在體內的功能性，為以后降壓藥物的開發奠定了基礎。
權利要求
1.一種鯊魚蛋白降壓肽，其特征在于，是如下短肽之一或組合Cys-Phe肽1，Glu-Tyr肽2，Phe-Glu肽3。
2. 如權利要求1所述的鯊魚蛋白降壓肽，其特征在于,所述的鯊魚蛋白降壓肽具 有較高的血管緊張素轉化酶抑制活性，為白色粉末狀，易溶于水，其中，Cys-Phe降 壓肽的IC5o值為0.523 mg/ml對應為1.96|xM， Glu-Tyr降壓肽的ICso值為0.824 mg/ml 對應為2.68pM， Phe-Glu降壓肽的ICso值為0.426mg/ml對應為1.45 ^M。
3. —種權利要求l所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，具體步驟如下(1) 酶解鯊魚蛋白制備酶解液按鮮重稱取鯊魚肉45 50重量份原料，打漿，然后加入45 50重量份的蛋白酶 制劑，調pH值到6.8 7.3，溫度45 5(TC，攪拌酶解5.5小時，酶解完畢后，離 心，取上清液，即得酶解液；(2) 從酶解液中分離純化降壓肽用3000Da的超濾膜將酶解液超濾，將超濾小于3000Da的超濾液過Sephadex G-15 柱(1.6X80cm， medium Pharmacia),用蛋白核酸檢測儀，在214nm處進行檢測，根據 從色譜柱分離得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱重后，測定ACE抑制活 性，將抑制活性高的組分多次收集，然后進一步用高壓液相色譜分離；PDA檢測器檢 測波長為220nm,然后根據所得的肽的譜圖將肽峰分別收集濃縮，測定ACE抑制活 性，得到具有高的ACE抑制活力的肽；(3) 降壓肽的序列測定將分離純化得到的具有高的ACE抑制活力的肽，用氨基酸自動測序儀測定氨基酸 組成，再通過液質連用儀(PE SC正X API 4000 LC/MS-MS systems, Applied Biosystems, USA),分析肽的分子量和肽段的分布，然后進行肽的氨基酸序列分析。
4. 如權利要求3所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所 用高壓液相色譜柱為反相C18柱。
5. 如權利要求3所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述 的肽的氨基酸序列分析是將肽用6N的HC1在115°C全水解22小時，通過氨基酸自動測 序儀進行測定。
6. 如權利要求3所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，步驟(1)中的所述的蛋白酶制劑通過如下方法制得，均為重量份 液體種子制備培養基餅粉2~3份、玉米粉2~3份、麩皮1~1.5份、Na2HP04 0.4~0.5份、 KH2P04 0.03~0.04份、水100份，滅菌，冷卻，接種枯草芽孢桿菌SM98011 (脂〃肌 SM98011)的茄子瓶菌種的菌懸液5~10份，通風攪拌，培養15~18小時，作 為液體種子待用；液體深層發酵制備蛋白酶制劑培養基豆餅粉3 3. 5份、玉米粉3. 5 5.0份、麩皮2.0 2. 5份、Na2HP04 0.4 0.5份、KH2P04 0.03 0.04份、水100份，滅菌，接種上述的液體種子，接種量 為培養基重量的5 7%，通風攪拌，控溫，發酵37 40小時，得蛋白酶制劑。
7. 如權利要求6所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，所述蛋白酶制 劑的制備步驟中的培養基中加豆油0. 3 0. 35重量份作消泡劑。
8. 如權利要求3所述的鯊魚蛋白降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(2) 中測定肽的ACE抑制活性方法是毛細管電泳法。
9. 權利要求1所述的鯊魚蛋白降壓肽在制備降壓藥物中的應用。
全文摘要
鯊魚蛋白降壓肽及其制備方法與應用，屬于海洋生物技術領域。從鯊魚的蛋白酶解產物中分離純化出新的具有兩個氨基酸的降壓肽，具有較高的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性。制備步驟包括酶解鯊魚蛋白制備酶解液、從酶解液中分離純化降壓肽和降壓肽的序列測定。本發明降壓肽可應用于制備降壓藥物。本發明將微生物酶工程技術應用于鯊魚的深層次開發利用，得到的具有新序列短肽，具有高的ACE抑制活力。
文檔編號C07K5/065GK101240016SQ20081001440
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月28日 優先權日2008年2月28日
發明者何海倫, 昊 吳, 周百成, 張玉忠, 陳秀蘭 申請人:山東大學