專利名稱：一種快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，屬于蛋白質分離純化技術 領域。
技術背景為了研究蛋白質等生物大分子的細胞定位、相互作用及其動態變化，研究人員急需 新技術和新材料來實現對蛋白質等生物大分子的"標識"、"閱讀"和"查詢"。現在常用 的熒光標記，由于熒光染料分子熒光特性的限制(熒光光譜較寬、量子產率低)，遠遠不 能適用于高通量的生物大分子專一標識。藻膽蛋白是一類光合作用捕光色素-蛋白質復合物，主要存在于藍藻、紅藻、隱藻和 少數甲藻中。在光合作用中起捕獲和傳遞光能的作用，具有強烈的熒光。在藍藻和紅藻中， 藻膽蛋白和少量無色連接蛋白組成超分子復合體一一藻膽體，高效的吸收和傳遞光能。在 80年代中期，美國研究藻類光合作用的學者提出將藻膽蛋白作為熒光標記物，用于診斷試 劑。由于其獨特的優點，藻膽蛋白和藻膽蛋白標記的診斷試劑在90年代初進入國際市場。同常用的熒光標記物相比，藻膽蛋白具有下列優點生產過程安全、無毒，光能吸收 強，熒光產率高，超過90%，背景光干擾和假陽性率低，在pH4-11的范圍內穩定，可以 作雙色、三色和四色標記。所以，這類試劑的應用范圍不斷擴大。但是，由于價格昂貴， 尚未應用到普及型的臨床診斷試劑。我國全部進口，也僅限于用細胞流式儀進行的診斷。藻膽蛋白及其診斷試劑主要由美國生產，德國也有產品向我國推銷，英國和我國臺灣 正在研制。最早研制產品的是美國分子探針公司(Molecular Probes, Inc.)，現在Sigma 公司共有6種藻膽蛋白產品，藻膽蛋白-Biotin/Avidin標記物12種，RPE-IgG或RPE-IgM12 種,RPE單抗標記物3種。藻膽蛋白生產沿用已公開的實驗室方法。藻膽蛋白的種類包括 異藻藍蛋白(APC)、藻藍蛋白(PC)、藻紅藍蛋白(PEC)和藻紅蛋白(PE)四大類。其中存在于 藍藻中的APC是目前常用的藻膽蛋白熒光探針之一，因為，APC亮度大，斯托克位移大。 我國螺旋藻等藍藻已經開始了工業化培養，資源非常豐富，是分離純化APC的很好的材料。 國際市場上決定購、銷關系的主要是價格因素。影響普及型診斷試劑的開發和應用的主要 因素也是藻膽蛋白價格太高。因此，開發APC的快速大量分離純化技術，實現高純度APC 的低成本大量制備，對于APC在普及型診斷試劑的應用具有重要的意義。 發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法。 本發明相對現有方法，只需經過兩步柱層析，就能大量得到高純度的異藻藍蛋白溶液。一種快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，步驟如下(1) 異藻藍蛋白的提取 將藍藻用凍溶和低離子強度溶漲的方法解體溶解，離心分離，取上清液，即得異藻藍蛋白漿液。(2) 異藻藍蛋白的初歩純化用硫酸銨沉淀法，將異藻藍蛋白從異藻藍蛋白漿液中沉淀出來，離心收集沉淀，再用 20mM磷酸緩沖液(pH6.8 7.0)溶解并透析，除去硫酸銨，得異藻藍蛋白粗提液。(3) 羥基磷灰石層析提取異藻藍蛋白 使用羥基磷灰石在異藻藍蛋白粗提液中吸附富集異藻藍蛋白，然后用磷酸緩沖液進行洗脫，得異藻藍蛋白溶液。這一步驟，可以實現低豐度異藻藍蛋白的大量濃縮和富集。(4) 離子交換制備高純度異藻藍蛋白 根據異藻藍蛋白在較寬的pH范圍內保持穩定的特性，利用離子交換層析技術，用具有恒定的離子強度、連續pH梯度的緩沖液進行洗脫，即可以得到高純度的異藻藍蛋白。 所述步驟(1)中的藍藻為螺旋藻。所述步驟(1)異藻藍蛋白的提取的具體操作步驟為將藍藻藻體按重量體積比1: 1(g/ml或kg/1)加入0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH6.8~7.0)，在-20。C下冷凍，然后在20 25。C下，融化2 3h。反復凍融2-4次后，藍藻懸液在4。C下，8000 rpm 10000rpm離心 10 min 15min，上清液即為異藻藍蛋白漿液。所述步驟(2)異藻藍蛋白的初步純化的具體操作步驟為向異藻藍蛋白漿液中加入 固體硫酸銨，至濃度為30%(w/v)，放置4 5h，然后在4。C下，10000 rpm 11000rpm離 心10min 15min，取上清液，向上清液中加入固體硫酸銨，至最終濃度為60%(W/V)，放 置4h以上，然后在4。C下，10000rpm 11000rpm離心10min 15min，棄上清，取沉淀； 將沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH6.8~7.0)中，然后用20rnM的磷酸緩沖液(pH6.8~7.0) 進行透析，收集透析液，即得異藻藍蛋白粗提液。上述沉淀與磷酸緩沖液的比例沒有嚴格 限定，只要沉淀能夠完全溶解即可。所述步驟(3)羥基磷灰石層析提取異藻藍蛋白的具體操作如下將預先用20mM磷 酸緩沖液(pH6.8~7.0)平衡過的羥基磷灰石，加入異藻藍蛋白粗提液中，將吸附滿異藻 藍蛋白的羥基磷灰石從溶液中取出，使用20mM磷酸緩沖液(pH6.8~7.0)沖洗羥基磷灰 石，將羥基磷灰石上殘余的C-藻藍蛋白沖洗掉，再用恒定離子強度的緩沖液進行洗脫， 將異藻藍蛋白洗脫下來，即得異藻藍蛋白溶液。由于吸附能力的不同，異藻藍蛋白吸附到 了羥基磷灰石上，而C-藻藍蛋白卻并不發生吸附，仍然存留在溶液中。優選的，所述恒定離子強度的緩沖液為lOOmM磷酸緩沖液(pH6.8 7.0)。所述步驟(4)離子交換制備高純度異藻藍蛋白的具體操作如下取步驟(3)制得 的異藻藍蛋白溶液，在20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.0，含0.05mol/LNaCl)中透析，然后 取透析后的溶液，在瓊脂糖凝膠FF ( DEAE Sepharose Fast Flow)離子交換色譜柱上，用 含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.0，)洗脫，最后用20mmol/L醋酸緩沖 液(pH5.0，含0.05mol/L NaCl)禾Q 20mmol/L醋酸緩沖液(pH3.6，含0.05mol/LNaCl) 各100mL進行梯度洗脫，洗脫速度為60 70mL/h，檢測波長280nm，收集洗脫的藍液體， 得到純化的異藻藍蛋白。優選的，所述的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱是經20mmol/L醋酸緩沖 液(pH5.0，含0.05mol/LNaCl)預先平衡的，規格為0.6X10cm。以上操作步驟如無特別說明，均為本領域常規操作。經吸收光譜檢測，得到的純化異藻藍蛋白A650/A280達到5.0(圖1 )。 一般認為，A650/A280 達到4.5以上，就認為異藻藍蛋白已經純化，因此，該離子交換層析得到的異藻藍蛋白是高純化的。Native—PAGE電泳檢測，只有一個條帶，表明分離純化的APC沒有其它蛋白 的污染(圖3)。現有技術制備異藻藍蛋白的方法為將細胞破碎粗提液經過一次羥基磷灰石柱，再用 SephadexG-100凝膠過濾層析，然后再經歷一次羥基磷灰石柱層析。對比技術中得到的異 藻藍蛋白純度可以達到5.0。與對比技術的三步操作相比，本發明是將粗提液經過一次羥 基磷灰石層析，再經歷一次離子交換層析，只需兩步操作，就可以得到大量高純的異藻藍 蛋白溶液制品，而且有效的降低了成本。現有技術制備異藻藍蛋白時，所使用的羥基磷灰石層析這一步驟，是預先將羥基磷 灰石裝在層析柱內，然后將粗提液進行上柱層析。由于羥基磷灰石柱有層析速度慢的特點， 上樣的過程非常耗費時間，這一步是在異藻藍蛋白提取過程中的非常號費時間的一個步 驟。本發明針對這一現有技術的不足，發明的方法為將預先用20mM磷酸緩沖液 (pH6.8~7.0)平衡過的羥基磷灰石，加入緩沖液同樣為20mM磷酸緩沖液(pH6.8~7.0) 的異藻藍蛋白粗提液中，此時，由于在20mM磷酸緩沖液(pH6.8~7.0)這一特定的離子 強度和pH值條件下，羥基磷灰石對C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的吸附能力的不同，因此異 藻藍蛋白可以吸附到羥基磷灰石上，而C-藻藍蛋白卻并不發生吸附，仍然存留在溶液中。 將吸附滿異藻藍蛋白的羥基磷灰石從溶液中取出，使用20mM磷酸緩沖液(pH6.8 7.0) 沖洗羥基磷灰石，將羥基磷灰石上殘余的C-藻藍蛋白沖洗掉。再將這些羥基磷灰石安裝 到層析柱內，用恒定離子強度的緩沖液進行洗脫，將異藻藍蛋白洗脫下來，就可以得到大 量比較純的異藻藍蛋白。與現有技術相比，本發明在進行羥基磷灰石層析時改變了現有技 術中的上樣這一步驟，而是在特定的離子強度和特定的pH條件下使用羥基磷灰石在粗提 液中對異藻藍蛋白進行選擇性吸附，從而達到吸附并富集異藻藍蛋白的目的。本發明不僅 能將羥基磷灰石層析這一步驟大幅節約時間，而且還可以提高羥基磷灰石的使用效率。本發明的優良效果還在于，以藍藻為材料，經凍溶和低離子強度溶漲快速提取異藻 藍蛋白(APC)，經硫酸銨沉淀以后，使用羥基磷灰石層析法進行初步純化，最后我們根 據異藻藍蛋白(APC)能夠在較寬的pH范圍內保持穩定的特性的特點，利用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析技術，用恒定的離子強度、pH梯度的緩沖液進行洗脫， 可以得到高純度的異藻藍蛋白(APC)。與傳統的應用分子篩層析結合羥基磷灰石層析的復雜分離純化程序相比，本方法克 服了難于規模化快速大量制備異藻藍蛋白的難題，操作簡便，省時省力，對設備要求簡單， 產率高，容易大量制備并且大大降低了 APC的制備成本，從而為將APC應用于超靈敏的生 物醫學檢測奠定了基礎，具有很好的應用前景和經濟效益。
圖1分離純化的異藻藍蛋白的吸收光譜。最大吸收峰為650nm，在620nm處有一肩 峰。A65。/A娜達到了 5.0，表明已經高度純化。圖2分離純化的異藻藍蛋白的熒光發射光譜。用650nm激發，熒光發射峰位于661nm，與標準熒光發射峰相同。圖3分離純化的螺旋藻異藻藍蛋白的Native — PAGE電泳圖譜。在Native — PAGE中，只有一個條帶，進一步說明分離純化的異藻藍蛋白沒有其它蛋白的污染。
具體實施方式
實施例1:一種快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，步驟如下-(1) 原料為螺旋藻。培養后過濾收集，-20匸冷凍保存。(2) 異藻藍蛋白的提取取冷凍保存的螺旋藻藻體10g，將螺旋藻藻體加入0.02 mol/L 磷酸緩沖液(pH6.8~7.0) lOrnl，在-2(TC下冷凍，然后在20'C下，融化2. 5h。反復凍融3 次后，螺旋藻懸液在4。C下，10000rpm離心15min，上清液即為異藻藍蛋白漿液。(3) 異藻藍蛋白的初步純化向上述步驟(2)得到的異藻藍蛋白漿液中加入固體 硫酸銨，至濃度為30%(w/v)，放置4h，然后在4。C下，10000 rpm離心15 min，棄去沉淀， 收集溶液部分。再繼續向溶液中加入固體硫酸銨，至終濃度為60y。(W/V)，放置4h以上， 然后在4匸下，10000 rpm離心15min，收集沉淀部分。將沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH6.98)中，然后對20mM的磷酸緩沖液(pH6.98)進行透析，收集透析液，即異藻藍 蛋白粗提液。(4) 羥基磷灰石層析提取異藻藍蛋白將預先用20mM磷酸緩沖液(pH6.98)平衡 過的羥基磷灰石，加入緩沖液為20mM磷酸緩沖液(pH6.98)的異藻藍蛋白粗提液中，進 行吸附。將吸附滿異藻藍蛋白的羥基磷灰石從溶液中取出，使用20mM磷酸緩沖液(pH6.98)沖洗羥基磷灰石，將羥基磷灰石上殘余的C-藻藍蛋白沖洗掉。再用100mM磷 酸緩沖液(pH6.98)進行洗脫，將異藻藍蛋白洗脫下來，即得異藻藍蛋白溶液。(5) 離子交換法制備高純度異藻藍蛋白將步驟(4)的異藻藍蛋白溶液在20mmol/L 醋酸緩沖液(pH5.0)中透析，透析結束后取透析液上DEAE Sepharose Fast Flow離子交 換色譜柱，該離子交換色譜柱是經20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.0，含0.05mol/LNaCl)預 先平衡的，規格為0.6X 10cm，然后用含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.0) 洗脫，最后用20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.0，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸緩 沖液(pH3.6，含0.05mol/LNaCl)各100mL進行梯度洗脫，洗脫速度為60 70mL/h，收 集藍色液體，得到高純度的異藻藍蛋白。
權利要求
1.一種快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，步驟如下(1)異藻藍蛋白的提取將藍藻用凍溶和低離子強度溶漲的方法解體溶解，離心分離，取上清液，即得異藻藍蛋白漿液；(2)異藻藍蛋白的初步純化用硫酸銨沉淀法，將異藻藍蛋白從異藻藍蛋白漿液中沉淀出來，離心收集沉淀，再用pH6.8～7.0的20mM磷酸緩沖液，溶解并透析，除去硫酸銨，得異藻藍蛋白粗提液；(3)羥基磷灰石層析提取異藻藍蛋白使用羥基磷灰石在異藻藍蛋白粗提液中吸附富集異藻藍蛋白，然后用磷酸緩沖液進行洗脫，得異藻藍蛋白溶液；(4)離子交換制備高純度異藻藍蛋白。
2. 如權利要求l所述的快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，其特征在于，所述步 驟(1)中的藍藻為螺旋藻。
3. 如權利要求l所述的快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，其特征在于，所述步 驟(1)異藻藍蛋白的提取的具體操作步驟為將藍藻藻體加入pH6.8 7.0的0.02 mol/L磷 酸緩沖液，在-20。C下冷凍，然后在20 25'C下，融化2 3h;反復凍融2-4次后，藍藻懸 液在4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10 min 15min,上清液即為異藻藍蛋白漿液。
4. 如權利要求l所述的快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，其特征在于，所述步 驟(2)異藻藍蛋白的初步純化的具體操作步驟為向異藻藍蛋白漿液中加入固體硫酸銨， 至濃度為30%,為重量體積比，放置4 5h，然后在4。C下，10000 rpm 11000rpm離心10 min 15min，取上清液，向上清液中加入固體硫酸銨，至最終濃度為60%,為重量體積比，放置 4h以上，然后在4。C下，10000rpm 11000rpm離心10min 15min，棄上清，取沉淀；將沉 淀溶于pH6.8~7.0的20rnM的磷酸緩沖液中，然后用pH6.8~7.0的20rnM的磷酸緩沖液進行透 析，收集透析液，即得異藻藍蛋白粗提液。
5. 如權利要求l所述的快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，其特征在于，所述歩 驟(3)羥基磷灰石層析提取異藻藍蛋白的具體操作如下將預先用pH6.8~7.0的20mM磷 酸緩沖液平衡過的羥基磷灰石，加入異藻藍蛋白粗提液中，將吸附滿異藻藍蛋白的羥基磷灰 石從溶液中取出，使用pH6.8 7.0的20mM磷酸緩沖液沖洗羥基磷灰石，將羥基磷灰石上殘 余的C-藻藍蛋白沖洗掉，再用恒定離子強度的緩沖液進行洗脫，將異藻藍蛋白洗脫下來， 即得異藻藍蛋白溶液。
6. 如權利要求5所述的快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，其特征在于，所述恒 定離子強度的緩沖液為pH6. 8~7.0的100mM磷酸緩沖液。
7. 如權利要求l所述的快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，其特征在于，所述步 驟(4)離子交換制備高純度異藻藍蛋白的具體操作如下取步驟(3)制得的異藻藍蛋白溶 液，在pH5.0、含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸緩沖液中透析，然后取透析后的溶液， 在DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱上，用pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L 醋酸緩沖液洗脫，再用pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩沖液和pH3.6、含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸緩沖液各lOOmL進行梯度洗脫，洗脫速度為60 70mL/h， 檢測波長280nm，收集洗脫的藍液體，得到純化的異藻藍蛋白。
8、如權利要求7所述的快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，其特征在于，所述的 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱是經pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋 酸緩沖液預先平衡的，規格為0.6X10cm。
全文摘要
一種快速大量制備高純度異藻藍蛋白的方法，屬于藍藻分離純化技術領域。本發明利用凍溶和低離子強度溶漲快速提取異藻藍蛋白，經硫酸銨分級沉淀、羥基磷灰石吸附富集異藻藍蛋白，并通過羥基磷灰石層析大量制備得到較純的異藻藍蛋白，最后利用離子交換層析技術，得到高純度的異藻藍蛋白。本方法省去了傳統的應用分子篩層析結合羥基磷灰石層析共三步層析的復雜分離純化程序，克服了難于規模化快速大量制備的難題，大大降低了APC的制備成本，從而為將APC應用于超靈敏的生物醫學檢測奠定了基礎。
文檔編號C07K1/30GK101240011SQ20081001440
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月28日 優先權日2008年2月28日
發明者周百成, 張熙穎, 張玉忠, 蘇海楠, 解彬彬, 陳秀蘭 申請人:山東大學