專利名稱：大青葉中4(3h)喹唑酮的微波提取工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥學領域，尤其是中藥有效成分提取方法。
背景技術：
大青葉是我國的傳統中藥，為十字花科植物菘藍(Isatis idigotica Fort)的干燥葉，其化學成分主要有有機酸、靛藍、靛玉紅、菘藍苷、色胺酮、4 (3H)喹唑酮、異牡荊素等化合物。具有清熱解毒，涼血利咽的功效，現代藥理研究表明具有抗菌、抗癌、抗病毒、增強免疫調節的作用。臨床上則用作治療各種病毒性流行感冒、乙型腦炎、單純皰疹病毒性角膜炎、流行性腮腺炎和病毒性肝炎等感染性疾病。據文獻報道，大青葉有效成分4 (3H)喹唑酮具有抗病毒的作用，濃度為0.2%時，可抑制1(T流感病毒；濃度為O. 1%時，可抑制克薩奇病毒；濃度在10—3_10—5mol/L范圍內，可顯著促進脾細胞增殖及刀豆蛋白誘導的淋巴細胞增殖。
中藥有效成分提取常用的傳統方法有水煎法、滲漉法、回流提取法、連續回流提取法等，但這些方法均存在有效成分提取率低、能耗高、提取時間長等缺點。微波提取法是利用微波能來提高提取效率的一種最新發展起來的技術，與傳統提取方法相比，具有設備簡單、使用范圍廣、提取效率高、重現性好、節約時間、節省試劑、污染小等特點。
微波提取法是利用微波熱能來提高提取效率的一種新技術，即利用物質分子偶極振動同微波振動具有相似的頻率，在快速振動的微波場中，分子的偶極振動盡力同磁場振動匹配，而分子偶極振動又往往滯后于磁場，物質分子吸收電磁能以每秒數十億次的高速振動而產生熱能。 一方面，它可使永久偶極的分子產生高達4.9Xl(f次/s的共振頻率，使分子平均動能迅速增加。另一方面，離子化的物質在超高頻電磁場中超高速運動，因摩擦而產生熱效率。因此，微波對物質的加熱是從物質分子中進行的，又稱為"內加熱"。在中藥的有效成分提取中，微波具有很強的穿透力，可以在藥材顆粒內外同時均勻、迅速地加熱。同時，中藥材細胞吸收微波能后，細胞內部溫度迅速上升，其細胞內部液態水汽化產生壓力將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小孔洞，使細胞外溶劑更容易進入細胞內，加速溶解并釋放出有效成分。大大縮短了提取時間，提高了提取效率。
發明內容
本發明的目的為提供從大青葉中提取4 (3H)喹唑酮的微波提取工藝，公開對微波提取工藝起決定作用的幾個因素藥材粉碎粒度、提取溶劑的濃度、微波輻射時間和溶劑倍量。
實現上述目的的技術方案如下
大青葉中4 (3H)喹唑酮的微波提取工藝，將大青葉粉碎為20 — 80目粒度，用30 — 70%體積濃度乙醇溶液作為提取液，溶劑用量為大青葉原料重量的8 — 20倍，微波爐中微波輸出功率為120W時輻照8 — 20分鐘進行提取。
優選的工藝為將大青葉粉碎為40目，用50%體積濃度乙醇溶液作為提取液，用量為大青葉重量的10倍，在微波爐中微波輸出功率為120W時輻照10分鐘。
用上述方法提取的大青葉中4 (3H)喹唑酮的含量用RP-HPLC法進行分析。
試驗過程如下
1、 儀器與試藥1.1儀器
高效液相色譜儀(美國瓦里安公司)；25"1微量進樣器(寧波市鎮海玻璃儀器廠)；色譜柱；symmetry C18 (4. 6X 150咖5u m) (Waters corporation);格蘭仕微波爐(P70D20TL—D5)。
1.2試藥
4 (3H)喹唑酮對照品(上海至誠醫藥基礎科技發展有限公司)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，三蒸水，其它試劑均為分析純。大青葉購自蘭州市安寧醫藥公司(產于甘肅定西)。
2、 方法與結果
2. 1對照品溶液的制備
精密稱取4 (3H)喹唑酮對照品2mg,用甲醇定容于50ml容量瓶中，作為儲備液(濃度為40ug/ml)。然后，分別配成O. 5ug/ml、 lwg/ml、 2yg/ml、 4ug/ml、 8 u g/ml五個濃度的對照品溶液。2. 2供試品溶液的制備
精密稱取大青葉粉末15g，置于圓底燒瓶中，加入提取液浸泡12h。然后進行微波提取， 提取液過濾濃縮至無醇味，用PH為2的酸水回流提取，靜置過夜，過濾除去不溶于酸的雜質， 然后用氯仿萃取，除去脂溶性雜質，用氨水將酸水母液調至pH為9，濃縮制得浸膏。精密稱 取制得的浸膏0.5g，用甲醉定容于25ml容量瓶，作為供試品溶液，備用。
2. 3 4 (3H)喹唑酮含量測定
2.3.1色譜條件流動相乙腈甲醇水=5: 15: 80，測定波長225nm,流速0. 8ml/min， 進樣量20u 1。
2.3.2標準曲線的制作以峰面積積分值為縱坐標，進樣量為橫坐標繪制標準曲線，計算出回 歸方程為y= IX 107x—15867， R2=0. 9998。結果表明4 (3H)喹唑酮濃度在0. 5 — 8 y g/ml范 圍內呈良好的線性關系。見表l、圖l。
表l對照品濃度和峰面積4 (3H)喹唑酮對照品濃度(進樣20nl)測得平均峰面積
0. 5 u g/ml83908
1 U g/ml188067
2 li g/ml362476
4 u g/ml759174
8 u g/ral1545470
2.3.3精密度試驗取同一對照品溶液，連續進樣5次，測定峰面積，分別為
1520888、 1553731、 1505470、 1555978、 1513926， RSD為1,68X。
2.3.4穩定性試驗將對照品溶液在室溫(20 — 25X:)下保存一周，每天測定峰面積分別為 1520888、 1569537、 1535648、 1555440、 1485164、 1535224、 1501112，結果表明穩定性良好， 無明顯變化，RSD為1.92%。
2. 3. 5加樣回收率試驗稱取藥材樣品3份，每份15g，分別精密添加己知濃度的對照品適量,
5按樣品提取和含量測定方法操作，平均回收率為97.93%， RSD為1.54X。見表2。
表2加樣回收率試驗結果_
大青葉中4 (3H)喹唑加入40u g/ml對照測得4 (3H)喹唑
編號 回收率/%_酮含量/lig/ml_品溶液/ml_酮含量/y g/ml_
1 55.2 5 67.25 98.90
2 55.2 5 65.41 96.19
3 55.2 5 67.12 98.71
2.3.6大青葉中4 (3H)喹唑酮含量的測定分別稱取相應藥材粒度(過20、 40、 80目篩)的大青葉各三份，每份15g，按正交實驗編號。按2.2制備供試品溶液，取供試品溶液2ml，0.45um微孔濾膜濾過，按正交實驗號分別進樣20ul測定含量。見圖2、圖3。
2.3.7正交試驗設計選用了對提取率有影響的四個因素(藥材粒度、提取溶劑濃度、微波輻射時間、溶劑倍量)，考慮三個水平，以L (3"正交表進行試驗分析。見表3、表4、表5。
表3正交試驗影響因素水平表_
_^_
水平 J_^_^_p_
藥材粒度/目 乙醇濃度/% 微波時間/min 溶劑倍量
1 20 30 10 10
2 40 50 15 15
3 80 70 20 20
6表4 U (34)正交試驗結果
實驗號ABCD大青葉中4 (3H)喹唑酮含量/
W g/g
1111129,8
2122221. 14
3133317.05
421239. 57
5223155. 2
6231240. 24
7313213.37
8321328.43
9332134.48
Ki67. 9952. 7498. 47119. 48
K2105. 01104. 7765. 1974. 75
E =249. 28
K376. 2891. 7785.6255. 05
R12. 3417. 3411.0918. 14
表5方差分析結果
方差來源 離均差平方和 自由度 均方_^_^_
A 251.6242 2 125.8121 1.3400 〉0.05
B 488.8291 2 244.4146 2.6031 〉0.05
C (誤差) 187.7851 2 93.8926
D_726. 6765_^_363. 3383 3. 8697 〉0. 05注Fo.05 (2' 2) =19，Fo.oi (2, 2) =99
由表4、表5結果表明，大青葉中4 (3H)喹唑酮含量采用微波提取方法時，各因素對4(3H)喹唑酮提取影響的大小為D〉B〉A〉C，其中因素D各水平間具有顯著性差異。在本實驗條件下微波提取工藝的最佳組合是A2B2CA，即藥材粒度40目、50%乙醇、微波輻射時間lOmin、IO倍量溶劑為優，其余各因素采用的試驗水平都能提取到4 (3H)喹唑酮。
試驗結果表明，溶劑倍量，提取溶劑濃度是微波提取工藝的主要影響因素，對4 (3H)喹唑酮的提取有顯著差異。在實驗范圍內，考慮試劑生產成本，最佳提取條件是AACJX,即藥材粒度40目、50%乙醇、微波輻射時間lOmin、 IO倍量提取溶劑為優。
本發明的有益效果
1、 最佳工藝驗證試驗表明，分別稱取3份大青葉藥材，按照最佳組合提取工藝進行提取，結果3份藥材中4 (3H)喹唑酮的含量分別為55. 26ug/g, 56.26pg/g， 53. 81 u g/g， RSD=2.24%。說明本工藝用微波提取4 (3H)喹唑酮是完全可行的。
2、 本發明提取效率高，提取速度快，節省時間，能耗少。
3、 節省試劑，成本低，污染少。
圖1為本發明4(3H)喹唑酮含量色譜分析的標準曲線圖
圖2為4(3H)喹唑酮對照品色譜圖
圖3為樣品中4(3H)喹唑酮色譜圖
具體實施例方式
實施例1
稱取大青葉15g，粉碎為20目粉末，置于圓底燒瓶中，加入體積濃度為30%的乙醇溶液作為提取液，用量為120ml，浸泡12h，然后在微波輸出功率為700W爐中，采用底火功率，即輸出功率為17%， g卩 120W微波提取8min，提取液過濾，濃縮至無醇味，用pH為2的鹽酸溶液回流提取，靜置過夜，過濾，除去不溶于酸的雜質，然后再用氯仿萃取，除去脂溶性雜質，用氨水將酸度調至PH9，濃縮制得含有4(3H)喹唑酮的浸膏。實施例2
稱取大青葉15g，粉碎為40目粉末，置于圓底燒瓶中，加入體積濃度為50%的乙醇溶液 作為提取液，用量為150ml，浸泡12h，然后微波提取10min，以下步驟與實施例1相同，制 得含有4(3H)喹唑酮的浸膏。
實施例3
稱取大青葉15g，粉碎為40目粉末，置于圓底燒瓶中，加入體積濃度為70%的乙醇溶液
作為提取液，用量為225ral，浸泡12h，然后微波提取20min，以下步驟與實施例1相同，制
得含有4(3H)喹唑酮的浸膏。 實施例4
稱取大青葉15g，粉碎為80目粉末，置于圓底燒瓶中，加入體積濃度為50%的乙醇溶液 作為提取液，用量為300ml，浸泡12h，然后微波提取15min,以下步驟與實施例1相同，制 得含有4(3H)喹唑酮的浸膏。
9
權利要求
1、大青葉中4(3H)喹唑酮的微波提取工藝，其特征為將大青葉粉碎為20—80目粒度，用30—70％體積濃度乙醇溶液作為提取液，用量為大青葉原料重量的8—20倍，在微波爐中微波輸出功率為120W時輻照8—20分鐘進行提取。
2、 根據權利要求1所述的大青葉中4 (3H)喹唑酮的微波提取工藝，其特征為將大青葉 粉碎為40目，用50%體積濃度乙醇溶液作為提取液，提取溶劑用量為大青葉重量的IO倍， 在微波爐中微波輸出功率為120W時輻照10分鐘。
全文摘要
本發明為大青葉中4(3H)喹唑酮的微波提取工藝，涉及中藥的有效成分提取方法，傳統的水煎、滲漉、回流提取等方法存在著有效成分提取率低、能耗高，提取時間長等缺點。本發明采用微波能進行提取，公開了下列影響提取效率的重要因素的范圍提取時大青葉粉碎粒度為20-80目，用30-70％體積濃度的乙醇溶液作為提取液，用量為大青葉重量的8-20倍，在微波中微波輸出功率為120W時輻照8-20分鐘進行微波提取，本發明具有提取效率高、能耗少，節省試劑，成本低，污染小的有益效果。
文檔編號C07D239/88GK101486685SQ20081000117
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月18日 優先權日2008年1月18日
發明者宇 劉, 華蘭英, 梁劍平, 王學紅, 王曙陽, 濤 許, 郭志延, 恒 魏 申請人:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所