專利名稱：：使用銅氧還蛋白預(yù)防癌癥的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含抑制哺乳動物細(xì)胞、組織和動物中癌前期病變發(fā)生的銅氧還蛋白(cupredoxin)的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物的組合物。本發(fā)明還涉及銅氧還蛋白及其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物作為化學(xué)預(yù)防藥在哺乳動物中抑制癌前期病變發(fā)生和最終的癌癥的用途。
背景技術(shù)：
：癌癥的化學(xué)預(yù)防是使用天然、合成或生物的化學(xué)劑來逆轉(zhuǎn)、抑制或預(yù)防導(dǎo)致侵入性癌癥的致癌過程。近來預(yù)防高風(fēng)險人群的癌癥的臨床試驗(yàn)揭示，化學(xué)預(yù)防療法對于高風(fēng)險患者是一種現(xiàn)實(shí)的治療。化學(xué)預(yù)防療法是基于多病灶區(qū)域致癌作用和多步驟致癌作用的概念。在區(qū)域致癌作用中，整個組織區(qū)廣泛暴露于致癌原導(dǎo)致組織中彌散性上皮病變和變異細(xì)胞的克隆樣增生。整個區(qū)域的這些遺傳突變增加了一種或多種癌前期病變或惡性病變可以在區(qū)域中發(fā)生的可能性。多步驟的致癌作用在這些遺傳和表型改變中逐步蓄積。在多步驟致癌作用中引人注意的一個或多個步驟可以阻止或預(yù)防癌癥的發(fā)展。一般參見，Tsao等人，CACancerJClin54:350-180(2004)。天青蛋白及其他銅氧還蛋白是專門針對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒素。天青蛋白引起J774肺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。Yamada等人，PNAS99(22):14098-14103(2002)。一旦進(jìn)入J774肺癌細(xì)胞，天青蛋白集中于胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞核部分，并與腫瘤抑制劑蛋白p53形成復(fù)合物，由此穩(wěn)定p53，并升高其細(xì)胞內(nèi)水平。/"。誘導(dǎo)天青蛋白-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不限于J774細(xì)胞。天青蛋白還可以進(jìn)入癌細(xì)胞如人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7細(xì)胞。Yamada等人，InfectImmun.70:7054-7062(2002);Punj等人，Oncogene.23:2367-2378(2004)。在這兩種情形下，天青蛋白均提高細(xì)胞內(nèi)p53水平，導(dǎo)致增強(qiáng)Bax形成并誘導(dǎo)此類細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。更有趣地，在載有異種移植的Md-2或MCF-7人癌的裸鼠的腹腔內(nèi)注射天青蛋白明顯導(dǎo)致這種癌癥的顯著退化。/丄小鼠乳腺器官培養(yǎng)物(MMOC)測定可以用于評價潛在化學(xué)預(yù)防藥對于激素誘導(dǎo)的乳腺的結(jié)構(gòu)分化和對于腺體中DMBA-誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生前(preneoplastic)過度增生的肺泡小結(jié)樣病損的發(fā)生的抑制功效。來自年輕、未交配的動物的乳腺，當(dāng)在胰島素(I)+催乳素(P)+醛固酮(A)存在下孵育六天時，可以分化成完全成熟的腺體。這些腺體形態(tài)學(xué)上類似從懷孕小鼠獲得的腺體。醛固酮可以用雌激素(E)+孕酮(Pg)替代。在培養(yǎng)基中加入氫化可的松(H)可剌激乳腺的功能分化。Mehta和Banerjec，ActaEndocrinol.80:501(1975);Mehta禾口Moon，5reosfCa"cer:rmaf加ewf尸rag7o^300，300(BasilAStoll編輯，BlackwellPress1986)。因此，在此培養(yǎng)物系統(tǒng)中觀察的激素誘發(fā)的結(jié)構(gòu)及功能分化，模擬在動物的不同生理學(xué)階段觀察的對于激素的應(yīng)答。在MMOC中癌形成之前，小鼠顯示了不同的腫瘤發(fā)生前的階段。C3H小鼠中此類腫瘤發(fā)生前病損是由鼠科動物乳腺腫瘤病毒引起的，或者在BALB/c小鼠中由DMBA引起。在生長階段的第3天和4天之間腺體暴露于2嗎/mlDMBA，之后腺體在僅含胰島素的培養(yǎng)基復(fù)原2-3周，導(dǎo)致形成乳腺腺泡狀病變(MAL)。Hawthorne等人，PharmaceuticalBiology40:70-74(2002);Mehta等人，MethodsinCellScience19:19-24(1997)。此外，將從含有DMBA-誘導(dǎo)的乳腺病損的腺體制得的上皮細(xì)胞的移植進(jìn)入同源宿主導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。Telang等人，PNAS76:5886-5890(1979)。病理學(xué)上，這些腫瘤類似于當(dāng)給相同品系的小鼠施用DMBA時體內(nèi)觀察到的那些腫瘤。/c/。MMOC中DMBA-誘導(dǎo)乳腺病變形成可以被多種類別的化學(xué)預(yù)防藥如類視黃醇抑制。這些藥物包括衍生自天然產(chǎn)物如brassinin和芪三酚、硫醇類、抗氧化劑、鳥氨酸脫羧酶的抑制劑如OFMO和魚藤素、前列腺素合成抑制劑、Ca調(diào)節(jié)劑等的化學(xué)預(yù)防藥。Jang等人，Science275:218-220(1997);Mehta,Eur.J.Cancer36:1275-1282(2000);Metha等人，J.Natl.CancerInst.89:212-219(1997)。這些研究清楚證明，這種器官培養(yǎng)物系統(tǒng)為測定化合物抗乳腺致癌作用的效力提供了獨(dú)特的模型。可以預(yù)期，結(jié)果與通過體內(nèi)施用此類化合物獲得的抑制密切相關(guān)。MMOC也可以被誘導(dǎo)形成乳腺導(dǎo)管病變(MDL)。如果在培養(yǎng)基中加入雌激素和孕酮而非醛固酮和氫化可的松，則可以誘導(dǎo)MDL。在存在卵巢類固醇的情況下，腺泡狀結(jié)構(gòu)是非常小的，但是在組織病理學(xué)切片中可觀察到導(dǎo)管內(nèi)病變。Mehta等人，J.Natl.CancerInst93:1103-1106(2001)。選擇性地作用于卵巢激素依賴性ER+乳腺癌的抗雌激素藥如他莫昔芬，抑制MDL形成而不抑制MAL。因此，除了傳統(tǒng)MAL誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之外，這種改良的培養(yǎng)物模型目前還可以用于評估化學(xué)預(yù)防藥對于MAL和MOL的作用。需要的是抑制癌前期病變的化學(xué)預(yù)防藥。這樣的化學(xué)預(yù)防藥應(yīng)能夠預(yù)防癌前期病變的最初發(fā)生，誘導(dǎo)形成惡性病變的癌前期病變中的細(xì)胞死亡，和/或預(yù)防癌前期病變發(fā)展成惡性病變。此類化學(xué)預(yù)防藥在治療尤其是處于發(fā)生癌癥的高度風(fēng)險的患者(由于存在高風(fēng)險特征、存在癌前期病變或先前的癌癥或癌前期病變)中具有很大的效用。發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含可以是銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物的肽的組合物，所述肽抑制哺乳動物細(xì)胞、組織和動物中癌前期病變的發(fā)生。特別地，這些組合物可以包含源自銅綠假單胞菌(尸se^fowo"^"m^'"OM)的天青蛋白，和/或天青蛋白的50-77殘基區(qū)域(p28)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可以包含銅氧還蛋白和/或其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物的組合物，其保留抑制哺乳動物細(xì)胞、組織或動物中癌前期病變發(fā)生的能力。這些組合物可以是分離的肽類或藥用組合物等等。本發(fā)明的組合物可以用于預(yù)防哺乳動物患者中癌癥發(fā)生的方法。本發(fā)明的一個方面是分離的肽類，其可以是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物；并且可以抑制哺乳動物組織中癌前期病變的發(fā)生。銅氧還蛋白可以是天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz、aumcyanin、漆樹藍(lán)蛋白和黃瓜堿性蛋白，特別可以是天青蛋白。銅氧還蛋白可以來自生物體如銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌(a/ca/Zgew^/"eca/&)、w/va;eW,/s、木糖氧化無色桿菌(^4c/zrawo6ac^;c少/osoja'(i—、支氣管敗血性博J惠特氏菌CBoraf"e〃a6rawc/z/se/"ca)、甲基單胞菌(Afe^y/omowos腦膜炎奈瑟球菌(iV^sen.a膨"/"g/ri必)、淋病奈瑟球菌(iVe/Mm'ago"or^2oeae)、蠻光假單胞菌CPse"cfo附owasy7worasce"j)、鄉(xiāng)錄針假單胞菌(尸sewfifo附o"asc/z/ororap/^)、苛養(yǎng)木桿菌(^/e//a/a幼Wosa)和副溶血弧菌(W6Wo戶ra/^膨/;^w)，特別是銅綠假單胞菌。在某些實(shí)施方案中，肽可以是SEQIDNO:l、3-19的部分，或者與SEQIDNO:l、3-19具有80%的氨基酸序列相同性。在某些實(shí)施方案中，分離的肽可以是截短的銅氧還蛋白。分離的肽可以是大于約10個殘基且不超過約100個殘基。分離的肽可以包含銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-67、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基36-88、或者SEQIDNO:20-24或者由其組成。本發(fā)明的另一個方面是包含置于藥學(xué)上可接受的載體中的至少一種或兩種本發(fā)明的銅氧還蛋白或分離的肽的藥用組合物。藥用組合物可以配制為用于靜脈內(nèi)施用。在某些實(shí)施方案中，藥用組合物中的銅氧還蛋白可以源自生物體如銅綠假單胞菌、M^J^""S^、糞產(chǎn)堿菌、木糖氧化無色桿菌、支氣管敗血性博德特氏菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、螢光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌和副溶血弧菌，特別是銅綠假單胞菌。銅氧還蛋白可以是SEQIDNO:l、3-19。本發(fā)明的另一個部分是治療哺乳動物患者的方法，其包括給患者施用治療有效量的本發(fā)明的藥用組合物?；颊呖梢允侨?，并可以較一般人群具有更高的發(fā)生癌癥的風(fēng)險。在某些實(shí)施方案中，癌癥可以是黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌或子宮頸癌。在某些實(shí)施方案中，患者可能具有至少一種高危險特征、癌前期病變或者已經(jīng)治愈癌癥或癌前期病變。藥用組合物可以是靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、吸入、局部施用、經(jīng)皮貼片、栓劑、玻璃體注射或口服，特別可以是靜脈注射施用。藥用組合物可以與至少一種其他化學(xué)預(yù)防藥聯(lián)合施用，特別是與另一種化學(xué)預(yù)防藥大約同時施用。本發(fā)明的另一個方面是試劑盒，其包含置于小瓶中的本發(fā)明的藥用組合物。試劑盒可以設(shè)計(jì)為用于靜脈施用。本發(fā)明的另一個方面是研究癌癥發(fā)生的方法，包括用本發(fā)明的銅氧還蛋白或肽接觸哺乳動物的細(xì)胞并測量惡變前細(xì)胞和惡性細(xì)胞的發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是人和/或乳房的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞被誘導(dǎo)發(fā)生癌前期病變。本發(fā)明的另一個方面是表達(dá)載體，其編碼本發(fā)明的肽。根據(jù)以下的附圖和特定實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本發(fā)明的這些和其他方面、益處和特征將變得顯而易見。序列簡述SEQIDNO:1.源自銅綠假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:2.p28(銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77)的氨基酸序列。SEQIDNO:3.源自層理席藻的質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列。SEQIDNO:4.源自氧化亞鐵硫桿菌的鐵硫菌藍(lán)蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:5.源自Achromobactercycloclastes的假天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:6.源自糞產(chǎn)堿菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:7.源自木糖氧化無色桿菌反硝化亞種I(A^wwo6actoxy/c^oxWawsssp.(iewz7rzyc<msI)的天青蛋白的氨基酸序歹U。SEQIDNO:8.源自支氣管敗血性博德特氏菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:9.源自甲基單胞菌J.的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:IO.源自腦膜炎奈瑟球菌Z2491的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:11.源自螢光假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:12.源自綠針假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:13.源自苛養(yǎng)木桿菌9a5c的天青蛋白的氨基酸序列。-SEQIDNO:14.源自黃瓜的漆樹藍(lán)蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:15.源自橙色綠屈撓菌的auracyaninA的氨基酸序列。SEQIDNO:16.源自橙色綠屈撓菌的auracyaninB的氨基酸序列。SEQIDNO:17.源自黃瓜的黃瓜堿性蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:18.源自淋病奈瑟球菌F62的Laz的氨基酸序列。SEQIDNO:19.源自副溶血弧菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:20.橙色綠屈撓菌的auracyaninB的氨基酸57-89的的氨基酸序列。SEQIDNO:21.i^e^owo"ossjW"gfle天青蛋白的氨基酸51-77的氨基酸序列。SEQIDNO:22.腦膜炎奈瑟球菌Laz的氨基酸89-115的氨基酸序列。SEQIDNO:23.副溶血弧菌天青蛋白的氨基酸52-78的氨基酸序列。SEQIDNO:24.支氣管敗血性博德特氏菌天青蛋白的氨基酸51-77的氨基酸序。附圖簡述附圖l.附圖l描繪了用于評估p28和天青蛋白功效的所有腺體的照片。附圖1A顯示了DMBA處理的腺體內(nèi)腺泡狀病變的代表性照片及其與用DMBA和化學(xué)預(yù)防藥處理的腺體的比較。附圖1B-lG顯示了p28對于腺泡狀病變的發(fā)生的影響的代表性照片。附圖2.附圖2描繪了顯示p28抗DMBA-誘導(dǎo)的乳腺腺泡狀病變的功效的圖。附圖3.附圖3描繪了導(dǎo)管病變的代表性切片的照片以及p28功效的照片。附圖4.附圖4描繪了顯示p28抗DMBA-誘導(dǎo)的導(dǎo)管病變的功效的圖。發(fā)明詳述定義如本文所用的，術(shù)語"細(xì)胞"包括術(shù)語的單數(shù)或復(fù)數(shù)，除非專門定義為"單個細(xì)胞"。如本文所用的，術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白"是可交換使用，指的是氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語應(yīng)用于這樣的氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)的天然存在的氨基酸的人造化學(xué)類似物。術(shù)語也應(yīng)用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白"也包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y羧基化、羥基化和ADP-核糖基化。應(yīng)當(dāng)理解，多肽不總是完全直鏈的。例如，作為遍在蛋白化作用的結(jié)果，多肽可以是支鏈的，其可能是環(huán)狀的(有或沒有分枝)，這通常作為翻譯后事件的結(jié)果，包括天然加工事件和非天然存在的人為操作帶來的事件。環(huán)狀、支鏈和支鏈環(huán)狀的多肽可以是通過非翻譯的自然過程和完全合成方法合成的。如本文所用的，術(shù)語"藥理學(xué)活性"指的是藥物或其他化學(xué)藥品對于生物學(xué)系統(tǒng)的作用?；瘜W(xué)藥品的作用可以是有益(治療性的)或有害的(毒性)。純的化學(xué)藥品或混合物可以是天然來源(植物、動物或礦物)的或可以是合成的化合物。如本文所用的，術(shù)語"癌前期(premalignant)"指的是癌變前的，或者是不受控制的異常的細(xì)胞分裂之前。如在此所用的，術(shù)語"病變"指的是異常組織的部位。如本文所用的，術(shù)語"病理學(xué)狀態(tài)"包括偏離正常的解剖學(xué)和生理學(xué)的偏差，其構(gòu)成損害活體動物或其一部分的正常狀態(tài)，破壞和改變身體功能的表現(xiàn)，并且應(yīng)答不同的因素(如營養(yǎng)不良、工業(yè)危險或氣候)、特定的感染因子(如蠕蟲、寄生原蟲、細(xì)菌或病毒)、生物的內(nèi)在缺陷(如遺傳異常)或者這些因素的組合。如本文所用的，術(shù)語"病征"包括偏離正常的解剖學(xué)和生理學(xué)的偏差，其損害活體動物或其一部分的正常狀態(tài)，破壞和改變身體功能的表現(xiàn)。如本文所用的，術(shù)語"患有"包括目前顯示病征的癥狀，具有甚至觀察不到癥狀的病癥，在從病征恢復(fù)中，以及已從病征恢復(fù)。如在此所用的，術(shù)語"化學(xué)預(yù)防"是使用藥物、維生素或其他藥劑來嘗試降低癌癥發(fā)生或復(fù)發(fā)的風(fēng)險，或延遲癌癥的發(fā)生或復(fù)發(fā)。如本文所用的，術(shù)語"治療"包括預(yù)防、降低、停止或逆轉(zhuǎn)與待治療的病癥有關(guān)的病癥或癥狀的進(jìn)程或嚴(yán)重度。因此，在適當(dāng)?shù)那闆r下，術(shù)語"治療"包括醫(yī)藥、治療性和/或預(yù)防性施用。治療也可以包括預(yù)防或減少病征如癌癥的發(fā)展。如本文所用的，術(shù)語"抑制細(xì)胞生長"指的是減緩或中止細(xì)胞分裂和/或細(xì)胞擴(kuò)增。此術(shù)語還包括抑制細(xì)胞發(fā)育或增加細(xì)胞死亡。"治療有效量"是這樣的量，有效預(yù)防、降低、停止或逆轉(zhuǎn)待治療患者的特定病癥或特定病癥的已有癥狀的發(fā)展，或者部分或完全地減輕待治療患者的特定病癥或特定病癥的已有癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力確定治療有效量。如本文所用的，術(shù)語"基本上純的"，當(dāng)用于修飾蛋白或本發(fā)明的其他細(xì)胞產(chǎn)物時，是指例如從生長培養(yǎng)基或細(xì)胞內(nèi)含物中分離出的蛋白，為基本上不含或不摻雜其他蛋白和/或其他化合物的形式。術(shù)語"基本上純的"指的是基于干重計(jì)算，至少約75%量的因數(shù)的分離部分，或者至少"75%基本上純的"。更特別地，術(shù)語"基本上純的"指的是基于干重計(jì)，至少85%的分離部分的化合物，或者至少"85%基本上純的"。最特別地，術(shù)語"基本上純的"指的是基于干重計(jì)，至少約95%的分離部分的化合物，或者至少"95%基本上純的"。術(shù)語"基本上純的"也可以用于修飾合成制得的蛋白或本發(fā)明的化合物，其中例如合成蛋白是從合成反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)物中分離出的。如本文所用的，當(dāng)涉及肽或本發(fā)明的化合物時，術(shù)語"藥物等級"是基本上或?qū)嵸|(zhì)上從正常伴隨在其天然狀態(tài)中的物質(zhì)(包括合成試劑和副產(chǎn)物)組分中分離的肽或化合物，并且基本上或?qū)嵸|(zhì)上與將損害其作為藥物用途的組分分離。例如，"藥物等級"肽可以與任何致癌原分離。在某些情況下，"藥物等級"可以是用預(yù)期給藥的方法修飾，如"靜脈藥物等級"，以便表明其基本上或?qū)嵸|(zhì)上與任何使得組合物不適合于靜脈給藥于患者的肽或化合物分離。例如，"靜脈藥物等級"肽可以是從去污劑如SDS和抗菌劑如疊氮化物中分離出的。術(shù)語"分離"、"純化"或"生物學(xué)純"指的是這樣的物質(zhì)，其基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含如其以正常狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的正常伴隨該物質(zhì)的組分。因此，本發(fā)明的分離的肽優(yōu)選不含在其原來的環(huán)境中正常伴隨肽的物質(zhì)。"分離的"區(qū)域是指這樣的區(qū)域，其不包括衍生出該區(qū)域的多肽的整個序列。"分離的"核酸、蛋白或其各自的片段已經(jīng)基本上從其體內(nèi)環(huán)境中除去，以便其可以由技術(shù)人員處理，如但不限于核苷酸測序、限制消化、定向誘變和亞克隆進(jìn)入表達(dá)核酸片段的載體以及獲得基本上純的蛋白或蛋白片段。如在此所用的術(shù)語"變體"，關(guān)于肽，是指同野生型多肽比較其可能具有氨基酸的取代、缺失或插入的氨基酸序列變體。變體可以是野生型肽的截短(truncation)。"缺失"是從野生型蛋白中除去一個或多個氨基酸，而"截短"是從野生型蛋白的一個或多個末端除去一個或多個氨基酸。因此，變體肽可能是由處理編碼多肽的基因制得。變體可以是由改變多肽的基本組成或特征制得，但不改變至少某些其基本藥理學(xué)活性。例如，天青蛋白的"變體"可以是突變型的天青蛋白，其保持抑制癌前期哺乳細(xì)胞的發(fā)展的能力。在某些情況下，變體肽是是用非天然氨基酸合成的，如&(3,5-二硝基苯甲酰)-賴氨酸殘基。(Ghadiri&Fernholz，J.Am.Chem.Soc，112:9633-9635(1990))。在一些實(shí)施方案中，同野生型肽或其部分相比，變體具有不超過20個氨基酸被替代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，同野生型肽或其部分相比，變體具有不超過15個氨基酸被替代、缺失、或插入。在一些實(shí)施方案中，同野生型肽或其部分相比，變體具有不超過10個氨基酸被替代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，同野生型肽或其部分相比，變體具有不超過6個氨基酸被替代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，同野生型肽或其部分相比，變體具有不超過5個氨基酸被替代、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，同野生型肽或其部分相比，變體具有不超過3個氨基酸被替代、缺失或插入。術(shù)語"氨基酸"，如本文所用的，意思是包含任何天然存在或非天然存在或合成的氨基酸殘基的氨基酸部分，即包含由一、二、三或多個碳原子通常是一個((X)碳原子直接連接的至少一羧基和至少一氨基殘基的任何部分。如本文所用的關(guān)于肽的術(shù)語"衍生物"是指衍生自目標(biāo)肽的肽。衍生包括肽的化學(xué)修飾以便肽仍然保持某些其基本活性。例如，天青蛋白的"衍生物"可以是化學(xué)修飾的天青蛋白，保持抑制哺乳動物的細(xì)胞血管發(fā)生的能力。感興趣的化學(xué)修飾包括，但不限于肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)改性、磷酸化或糖基化。此外，衍生的肽可以是多肽或其片段的融合成化學(xué)化合物如，但不限于另外的肽、藥物分子或其他治療劑或藥劑或檢測探針。術(shù)語"氨基酸序列相同性百分?jǐn)?shù)(。/。)"定義為當(dāng)兩個序列對比時，多肽的氨基酸殘基與候選序列氨基酸殘基相同性的百分?jǐn)?shù)。為測定氨基酸相同性%，進(jìn)行序列對比，并且如果需要的話，弓1入缺口以獲得最大％序列相同性;保守取代不視為序列相同性的部分。測定相同性百分?jǐn)?shù)的氨基酸序列對比方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。通常使用可公開獲得的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行膚序列對比，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件。在一特定的實(shí)施方案中，使用Blastp(從NationalCenterforBiotechnologyInformation得到，BethesdaMD)，使用長復(fù)雜濾波器的缺省參數(shù)，expect10、字長3、existence11和extension1。當(dāng)進(jìn)行氨基酸序列對比時，給定的氨基酸序列A同、與或相對給定的氨基酸序列B的％氨基酸序列相同性(其換句話說可表達(dá)為具有或包含同、與或相對給定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列相同性的給定氨基酸序列A)可計(jì)算為%氨基酸序列相同100其中X是通過A和B的序列對比程序?qū)Ρ然蛐蛄袑Ρ人惴▽Ρ榷洖橄嗤ヅ涞陌被釟埢鶖?shù)目，并且Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)目。如果氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，A對B的％氨基酸序列相同性將不等于B對A的％氨基酸序列相同性。當(dāng)更長的序列比較更短的序列時，較短的序列將是"B"序列。例如，當(dāng)比較截短的肽與相應(yīng)的野生型多肽時，截短的肽將是"B"序列?？倓t本發(fā)明提供了包含了銅氧還蛋白及其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物的組合物，以及預(yù)防哺乳動物癌癥發(fā)生的方法。本發(fā)明還提供了銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物，其保留了預(yù)防哺乳動物的癌癥的發(fā)生或癌癥的復(fù)發(fā)的能力。更特別地，本發(fā)明提供了包含銅綠假單胞菌天青蛋白以及天青蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物的組合物，以及其治療患者特別是較普通人群處于發(fā)生癌癥的更高風(fēng)險的患者的應(yīng)用。最終，本發(fā)明提供了研究哺乳動物細(xì)胞、組織和動物中癌癥發(fā)生的方法，通過在引起癌前期病變之前或之后使用銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物接觸細(xì)胞，并觀察惡變前細(xì)胞和/或惡性細(xì)胞的發(fā)生。先前，已知由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的氧化還原蛋白即銅氧還蛋白天青蛋白，選擇性進(jìn)入J774肺癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Zaborina等人，Microbiology146:2521-2530(2000)。天青蛋白還可以選擇性進(jìn)入并殺死人黑色素瘤UISO-Mel-2或人乳腺癌MCF-7細(xì)胞。Yamada等人，PNAS99:14098-14103(2002);Punj等人Oncogene23:2367-2378(2004)。源自銅綠假單胞菌的天青蛋白優(yōu)先進(jìn)入J774鼠科動物的網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤細(xì)胞，與腫瘤抑制劑蛋白p53形成復(fù)合物并使之穩(wěn)定，增強(qiáng)p53的細(xì)胞內(nèi)濃度，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Yamada等人，InfectionandImmunity70:7054-7062(2002)。天青蛋白分子不同結(jié)構(gòu)域的詳細(xì)研究顯示，氨基酸50-77(p28)(SEQIDNO:2)代表蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD),其對于內(nèi)在化和隨后的細(xì)胞凋亡活性非常重要。Yamada等人，Cell.Microbial.7:1418-1431(2005)。目前已知，天青蛋白及源自天青蛋白的肽類如p28，具有化學(xué)預(yù)防性質(zhì)。目前已知，天青蛋白和p28預(yù)防小鼠乳腺器官培養(yǎng)物中惡變前的腫瘤發(fā)生前的病變的形成。在小鼠乳腺器官培養(yǎng)物模型中，發(fā)現(xiàn)50^ig/ml天青蛋白抑制67%腺泡狀病變的形成。同樣地，發(fā)現(xiàn)25pg/ml的p28抑制61%腺泡狀病變的形成。參見實(shí)施例l。此外，發(fā)現(xiàn)50嗎/ml天青蛋白抑制79。/。的導(dǎo)管病變的形成，25pg/ml的p28抑制7P/。導(dǎo)管病變的形成。參見，實(shí)施例1。共焦顯微鏡和FAC顯示了天青蛋白和p28進(jìn)入正常的鼠科動物乳房上皮細(xì)胞(MM3MG)和乳房癌細(xì)胞(4T1)。P28還以依賴溫度、時間和濃度的方式進(jìn)入人臍靜脈上皮細(xì)胞(HUVEC)，并以依賴劑量的方式抑制固定在上Matrigd⑧的HUVEC的毛細(xì)管形成。因此，已知天青蛋白及其變體可以用于抑制惡變前的腫瘤發(fā)生前的病變的形成，由此抑制哺乳動物患者中癌癥特別是乳腺癌的發(fā)生。由于銅氧還蛋白和天青蛋白之間的高度結(jié)構(gòu)相似，其他銅氧還蛋白抑制哺乳動物中癌前期病變的發(fā)生是有可能的。這樣的銅氧還蛋白可以在例如細(xì)菌和植物中發(fā)現(xiàn)。多種銅氧還蛋白已知是具有類似的源自銅綠假單胞菌的天青蛋白的那些的藥代動力學(xué)活性。例如，來自氧化亞鐵硫桿菌的鐵硫菌藍(lán)蛋白也可以進(jìn)入巨噬細(xì)胞并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Yamada等人，CellCycle3:1182-1187(2004);Yamada等人，Cell.Micro.7:1418-1431(2005)。來自層理席藻(Phormidiumlaminosum)的質(zhì)體藍(lán)素和來自Achromobactercycloclastes的假天青蛋白也是針對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒素。美國專利公布號20060040269，2006年2月23日公開。因此預(yù)期，其他銅氧還蛋白可以用于本發(fā)明的組合物和方法。進(jìn)一步，保留抑制哺乳動物中癌癥形成能力的銅氧還蛋白變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物也可以用于本發(fā)明的組合物和方法。這些變體和衍生物可以包括，但不限于截短的銅氧還蛋白、保守取代的氨基酸和蛋白修飾如聚乙二醇化和整體烴穩(wěn)定化a-螺旋。本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供了作為銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的肽類，其抑制哺乳動物細(xì)胞、組織和動物中癌前期病變的發(fā)生。本發(fā)明進(jìn)一步提供了作為銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的肽類，其抑制哺乳動物細(xì)胞、組織和動物中癌癥的發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，肽是分離的。在某些實(shí)施方案中，肽是基本上純的或藥用等級。在其他實(shí)施方案中，肽是在組合物中，所述組合物包含所述肽或基本上由所述肽構(gòu)成的。在其他特定實(shí)施方案中，肽是非抗原性的在哺乳動物更特別地是人中不引起免疫反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，肽短于全長的銅氧還蛋白，保留銅氧還蛋白的某些藥理學(xué)活性。特別地，在某些實(shí)施方案中，肽可以保留抑制小鼠乳腺器官培養(yǎng)物中癌前期病變發(fā)生的能力。本發(fā)明還提供了包含至少一種肽的組合物，特別是藥用組合物的形式，所述肽是銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。在特定的實(shí)施方案中，藥用組合物是設(shè)計(jì)用于特定的施用方式，例如但不限于口服、腹腔內(nèi)或靜脈內(nèi)。這樣的組合物可以是在水中與水結(jié)合或者可以是干燥的(如通過冷凍干燥)用于以后的水化。這樣的組合物可以是非水溶劑的形式，如但不限于乙醇。因?yàn)殂~氧還蛋白之間的高度結(jié)構(gòu)同源性，預(yù)期銅氧還蛋白將具有與天青蛋白和p28相同的化學(xué)預(yù)防性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白是但不限于天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、aumcyanin、漆樹藍(lán)蛋白、黃瓜堿性蛋白或Laz。在具體的實(shí)施方案中，天青蛋白來自銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、木糖氧化無色桿菌反硝化亞種I、支氣管敗血性博德特氏菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、螢光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌、Wva，W"s^或副溶血弧菌。在非常特別的實(shí)施方案中，天青蛋白來自銅綠假單胞菌。在其他特別的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白包含SEQIDNO:1、3-19的氨基酸序列。本發(fā)明提供了這樣的肽，同野生型銅氧還蛋白比較其具有氨基酸替代、缺失或插入。本發(fā)明的變體可以是截短的野生型銅氧還蛋白。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包含銅氧還蛋白的一定區(qū)域，其少于全長野生型多肽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包含超過約10個殘基，超過約15個殘基或超過約20個殘基的截短的銅氧還蛋白。在某些實(shí)施方案中，肽包含不超過約100個殘基、不超過約50個殘基、不超過約40個殘基、不超過約30個殘基或不超過約20個殘基的截短的銅氧還蛋白。在某些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白對于肽且更特別是SEQIDN0:1、3-19具有至少約70%氨基酸序列相同性、至少約80%氨基酸序列相同性、至少卯％氨基酸序列相同性、至少約95%氨基酸序列相同性或至少約99%氨基酸序列相同性。在特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77(p28,SEQIDNO:2)、天青蛋白殘基50-67或天青蛋白殘基36-88。在其他實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體是由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77、天青蛋白殘基50-67或天青蛋白殘基36-88構(gòu)成。在其他特定實(shí)施方案中，變體由與天青蛋白以外的銅氧還蛋白等同的殘基組成。還預(yù)期，可以設(shè)計(jì)具有與天青蛋白殘基50-77或天青蛋白殘基36-88相似的藥理學(xué)活性的其他銅氧還蛋白變體。為了實(shí)現(xiàn)此目的，可使用BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)對比目標(biāo)銅氧還蛋白氨基酸序列和銅綠假單胞菌天青蛋白序列，位于銅綠假單胞菌天青蛋白氨基酸序列上有關(guān)殘基以及在目標(biāo)銅氧還蛋白序列上發(fā)現(xiàn)的等同殘基，由此設(shè)計(jì)的等同肽。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體含橙色綠屈撓菌(SEQIDNO:20)的aumcyaninB的至少氨基酸57-89。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含尸sei^omo"os^n'wgae天青蛋白(SEQIDNO:2l)的至少氨基酸51-77。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含腦膜炎奈瑟球菌Laz(SEQIDNO:22)的至少氮基酸89-115。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中銅氧還蛋白變體包含副溶血弧菌天青蛋白(SEQIDNO:23)的至少氨基酸52-78。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，銅氧還蛋白變體包含支氣管敗血性博德特氏菌天青蛋白(SEQIDNO:24)的至少氨基酸51-77。變體還包括用非天然存在的合成氨基酸制得的肽。例如，非天然存在的氨基酸可以是整合入變體肽以延長或優(yōu)化血液中組合物的半衰期。這樣的變體包括，但不限于D,L-肽(非對映異構(gòu)體)，(參見，例如Futaki等人，J.Biol.Chem.276(8):5836-40(2001);Papo等人.CancerRes.64(16):5779-86(2004);Miller等人，Biochem.Pharmacol,36(1):169-76,(1987);含罕見氨基酸的肽(參見，例如Lee等人，J.Pept.Res.63(2):69-84(2004))，含烯烴的非天然的氨基酸接著烴纖維包扎(參見，例如Sehafineister等人，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenski等人，Science305:1466-1470(2004))，以及含s-(3,5-二硝基苯甲酰)-賴氨酸殘基的肽。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是銅氧還蛋白的衍生物。銅氧還蛋白的衍生物是化學(xué)修飾的肽以便肽仍然保留其某些基本活性。例如，天青蛋白的"衍生物"可以是保留其抑制哺乳動物細(xì)胞、組織或動物中癌前期病變的發(fā)展的能力的化學(xué)修飾的天青蛋白。感興趣的化學(xué)修飾包括，但不限于肽的烴穩(wěn)定化、酰胺化、乙?；⒘蛩峄⒕垡叶?PEG)改性、磷酸化和糖基化。此外，衍生肽可以是融合銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物成化學(xué)化合物如，但不限于另外的肽、藥物分子或其他治療劑或藥劑或檢測探針。感興趣的衍生物包括化學(xué)修飾，通過化學(xué)修飾本發(fā)明的肽和組合物在血流中的半衰期可以延長或優(yōu)化，如通過本領(lǐng)域熟知的多種方法，包括但不限于，環(huán)化的肽(參見，例如Monk等人，BioDrugs19(4):261-78,(2005);DeFreest等人，J.PeptRes.63(5):409-19(2004))，N-和C-末端修飾(參見，例如Labrie等人，Clin.Invest.Med.13(5):275-8，(1990))，含烯烴的非天然氨基酸接著烴纖維包扎(參見，例如Schamieister等人，J.Am.Chem.Soc.122:589卜5892(2000);Walenski等人，Science305:1466-1470(2004))。在另一個實(shí)施方案中，肽是銅氧還蛋白的結(jié)構(gòu)等價物。測定銅氧還蛋白和其他蛋白之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性的研究的實(shí)例包括Toth等人(DevelopmentalCell1:82-92(2001))。特別地，銅氧還蛋白和結(jié)構(gòu)等價物之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性是通過使用VAST算法測定。Gibrat等人，CurrOpinStructBiol6:377-385(1996);Madej等人，Proteins23:356-3690(1995)。在特定的實(shí)施方案中，得自銅氧還蛋白與結(jié)構(gòu)等價物的結(jié)構(gòu)比較的VASTp值是少于約1(T3,少于約1(TS或少于約1(T7。在其他實(shí)施方案中，銅氧還蛋白和結(jié)構(gòu)等價物的顯著結(jié)構(gòu)同源性是通過使用DALI算法測定。Holm&Sander,J.MoLBiol.233:123-138(1993)。在特定的實(shí)施方案中，配對結(jié)構(gòu)比較的DALIZ得分是至少約3.5、至少約7.0或至少約10.0?？梢灶A(yù)期，本發(fā)明組合物的肽可以是不止銅氧還蛋白的變體、衍生物和/或結(jié)構(gòu)等價物的之一。例如，肽可以是截短的天青蛋白，其已經(jīng)聚乙二醇化，因此制成變體和衍生物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽是使用包含具有烯烴系鏈的a，a-二取代的非天然的氨基酸合成，接著通過釕催化的烯烴復(fù)分解的整體烴"釘針(staple)"。Scharmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walensky等人，Science305:1466-1470(2004)。此夕卜，為天青蛋白的結(jié)構(gòu)等價物的肽可以稠合至其他肽，因此制成為結(jié)構(gòu)等價物和衍生物的肽。這些實(shí)例僅僅是說明，而不限制本發(fā)明。銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以或不可以結(jié)合銅。在某些實(shí)施方案中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物具有與銅綠假單胞菌天青蛋白特別是P28相同的藥理學(xué)活性。在特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白及其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物，可以抑制預(yù)防哺乳動物細(xì)胞、組織或動物且特別地不限于乳腺細(xì)胞中的癌前期病變。本發(fā)明還提供了銅氧還蛋白及其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物，其可以具有抑制哺乳動物的癌前期病變發(fā)生的能力，特別是，但不限于黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和子宮頸癌的細(xì)胞。癌細(xì)胞發(fā)生的抑制是使得癌前期病變的發(fā)生減少，或癌前期病變的發(fā)生增加的速率降低，并且同對照治療相比其是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。因?yàn)槟壳耙阎~氧還蛋白可以抑制哺乳動物細(xì)胞、組織或動物且特別是乳腺細(xì)胞，更特別是小鼠乳腺細(xì)胞的癌前期病變和最終癌癥的發(fā)生，目前有可能設(shè)計(jì)保留這種化學(xué)預(yù)防活性的銅氧還蛋白的變體和衍生物。這樣的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物可以是由以下方法制得，例如創(chuàng)造銅氧還蛋白的不同變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物以及銅氧還蛋白衍生的肽的"庫"，然后使用本領(lǐng)域多種己知方法之一，如實(shí)施例1中示例性的方法檢測各自的化學(xué)預(yù)防活性，特別是小鼠乳腺器官培養(yǎng)物中化學(xué)預(yù)防活性?？梢灶A(yù)期，所得的具有化學(xué)預(yù)防活性的銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物可以用于本發(fā)明的方法，替代天青蛋白或p28或作為它們的補(bǔ)充。在某些特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以抑制小鼠乳腺器官培養(yǎng)物(MMOC)中7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)誘導(dǎo)的癌前期病變至統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于非治療對照的程度?？梢酝ㄟ^使用實(shí)施例1或者如Mehta等人(JNatlCancerInst93:1103-1106(2001))和Mehta等人(MethCellSd19:19-24(1997))中所述的MMOC模型系統(tǒng)來試驗(yàn)肽的此種活性。測定癌癥發(fā)生是否被抑制的其他方法是本領(lǐng)域熟知的并可以使用。在某些特定實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物銅氧還蛋白抑制MMOC模型中乳腺腺泡狀病變(MAL)的發(fā)生至統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于非治療對照的程度。在某些特定實(shí)施方案中，銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物抑制MMOC模型中乳腺腺泡狀病變(MAL)的發(fā)生至統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于非治療對照的程度?？梢酝ㄟ^使用實(shí)施例1中所述的MMOC模型系統(tǒng)來試驗(yàn)肽的此種活性。肽可以是通過使用MMOC模型系統(tǒng)試驗(yàn)這些活性，所述系統(tǒng)通過DMBA誘導(dǎo)形成癌前期病變，如實(shí)施例1所示。評價MMOC模型系統(tǒng)中癌前期病變的發(fā)生可以是由形態(tài)測定分析或組織病理學(xué)分析確定，如實(shí)施例1提供。銅氧還蛋白這些小型的含藍(lán)銅的蛋白(銅氧還蛋白)是參與例如細(xì)菌的電子轉(zhuǎn)移鏈或具有未知功能的電子轉(zhuǎn)移蛋白(10-20kDa)。銅離子唯一地結(jié)合于蛋白基質(zhì)。銅周圍兩個組氨酸和一個半朧氨酸的配體具有特殊的扭曲三角平面排列，引起在金屬位點(diǎn)非常特殊的電學(xué)性質(zhì)和強(qiáng)烈的藍(lán)色。一些銅氧還蛋白已經(jīng)在介質(zhì)中以高分辨率進(jìn)行了結(jié)晶學(xué)鑒定。銅氧還蛋白通常具有低序列同源性，但是高結(jié)構(gòu)同源性。Gough&Clothia,Structure12:917-925(2004);DeRienzo等人，ProteinScience9:1439-1454(2000)。例如，天青蛋白的氨基酸序列是31%相同于auracyaninB的氨基酸序列，是16.3%相同于鐵硫菌藍(lán)蛋白的氨基酸序列，是20.3%相同于質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列，是17.3%相同于假天青蛋白的氨基酸序列。參見，表1。然而，這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相似性是更顯著的。比較天青蛋白和auracyaninB的VASTp值是l(T74，比較天青蛋白和鐵硫菌藍(lán)蛋白的VASTp值是1(T5，比較天青蛋白和質(zhì)體藍(lán)素的VASTp值是l(T56，比較天青蛋白與假天青蛋白的VASTp值是10—41。全部的銅氧還蛋白具有八股的Greekkey|3-桶或p-夾層折疊，并具有高度保守的位點(diǎn)體系結(jié)構(gòu)。DeRienzo等人，ProteinScience9:1439-1454(2000)。由于存在許多長鏈脂肪族殘基如甲硫氨酸和亮氨酸，突出的疏水片存在天青蛋白中銅位點(diǎn)、amicyanin、藍(lán)細(xì)菌質(zhì)體藍(lán)素、黃瓜堿性蛋白的周圍并至較少的范圍，假天青蛋白和真核質(zhì)體藍(lán)素。W。疏水片還發(fā)現(xiàn)至漆樹藍(lán)蛋白和鐵硫菌藍(lán)蛋白銅位點(diǎn)較少范圍，但是具有不同特征。A/。表l.從銅綠假單胞菌到其他蛋白的天青蛋白(1JZG)的序列和結(jié)構(gòu)排列，使用VAST算法。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>'對齊的長度一定量的等同對的C-a原子重疊在兩個結(jié)構(gòu)之間，即，多少殘基已經(jīng)用于計(jì)算3D重疊。2p-VAL:VASTp值是比較的顯著性的測量結(jié)果，表達(dá)為概率。例如，如果p值是0.001，那么純粹靠運(yùn)氣而遇到這種情況的可能的機(jī)會的是1比1000。VAST的p值是調(diào)節(jié)用于使用假設(shè)的多個對照的作用，假設(shè)是在MMDB數(shù)據(jù)庫中存在500個獨(dú)立和不相關(guān)類型的區(qū)域。所示的P值因此符合各個域?qū)Φ呐鋵Ρ容^的p值，除以500。3得分VAST結(jié)構(gòu)-相似性得分。這個數(shù)是與重疊的二級結(jié)構(gòu)元件的數(shù)量和該重疊的質(zhì)量有關(guān)。更高的VAST得分與更高相似性有關(guān)。4RMSD:根意思是平方疊加殘差，以埃計(jì)。這個數(shù)是在兩個結(jié)構(gòu)的最優(yōu)重疊之后計(jì)算出，如等同C-a原子之間平均平方的距離的平方根。注意到，RMSD值衡量結(jié)構(gòu)排列的程度以及使用RMSD作為整個結(jié)構(gòu)相似性的描述信息時，必須考慮這種大小。5C.elegans成年精子蛋白證明是卵母細(xì)胞成熟的ephrin拮抗劑。Kuwabara,GenesandDevelopment17:155-161(2003)。天青蛋白天青蛋白是具有128個氨基酸殘基的含銅蛋白質(zhì)，其屬于銅氧還蛋白家族，涉及植物和一些細(xì)菌中的電子轉(zhuǎn)移。天青蛋白包括源自銅綠假單胞菌(PA)(SEQIDNO:l)、木糖氧化產(chǎn)堿菌(A.ylosoxidans)和反硝化產(chǎn)堿菌((A.denitrificans)的那些。Murphy等人，J.Mol.Biol"vol.315，pp859-71(2002)。天青蛋白間的氨基酸序列同源性在60-90%變化，這些蛋白顯示了強(qiáng)烈的結(jié)構(gòu)同源性。全部天青蛋白具有獨(dú)特的具有Greekkey基序的p-夾層，并且單個銅原子總是位于蛋白的同一區(qū)域。此外，天青蛋白在銅位點(diǎn)周圍具有基本中性的疏水區(qū)。質(zhì)體藍(lán)素質(zhì)體藍(lán)素是藍(lán)細(xì)菌、藻類和植物的可溶性蛋白，其在每個分子中含有一個銅分子，并且它們的氧化型為藍(lán)色。它們出現(xiàn)在葉綠體中，作為電子載體發(fā)揮功能。自從在1978年測定了白楊質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)，藻類(柵藻(Scenedesmus),稱苔(Enteromorpha)，衣藻(Chlamydomonas))和植物(法國菜豆((Frenchbean))質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)也用晶體學(xué)或NMR的方法得到測定，并且白楊質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)已經(jīng)精確到1.33的分辨率。SEQIDNO:3顯示了來自層理席藻、嗜熱的藍(lán)細(xì)菌的質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列。另一種感興趣的質(zhì)體藍(lán)素是來自Ulvapertussiso盡管在藻類和維管植物之間的質(zhì)體藍(lán)素序列趨異(例如在衣藻蛋白和白楊蛋白之間序列相同性為62%),但三維結(jié)構(gòu)是保守的(例如在衣藻蛋白和白楊蛋白之間Ca位置的0.76Arms偏差)。結(jié)構(gòu)特征包括位于八股反平行|3-桶一個末端的扭曲四面體型銅結(jié)合位點(diǎn)、顯著的負(fù)電區(qū)和平坦的疏水表面。銅的位置對于其電子轉(zhuǎn)移功能是優(yōu)化的，負(fù)電和疏水區(qū)被設(shè)想涉及生理反應(yīng)配偶體的識別?；瘜W(xué)修飾、交聯(lián)和定位誘變試驗(yàn)己經(jīng)證實(shí)負(fù)電和疏水區(qū)在與細(xì)胞色素喲結(jié)合相互作用中的重要性，并證明在質(zhì)體藍(lán)素中有兩個功能重要的電子轉(zhuǎn)移路徑模型的正確。一個假定的電子轉(zhuǎn)移路徑是相對短的(約4A)，并包括疏水區(qū)中暴露于溶劑的銅配體His-87，而另一條更長(約12-15A)，包括負(fù)電區(qū)中幾乎保守的殘基Tyr-83,Redinbo等人，J.Bioenerg.Biomembr"vol.26(1):49-66(1994)。鐵硫菌藍(lán)蛋白鐵硫菌藍(lán)蛋白是含有藍(lán)銅的單鏈多肽，其得自一種硫桿菌(現(xiàn)在稱為J"WzY/w'o6a"7/i/"。利用多波長不規(guī)則衍射對來自氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillusferrooxidans)的極其穩(wěn)定和高氧化性的銅氧還蛋白鐵硫菌藍(lán)蛋白(SEQIDNO:4)氧化型進(jìn)行X射線晶體結(jié)構(gòu)測定，精確到1.9A分辨率。鐵硫菌藍(lán)蛋白由核心P-夾層折疊構(gòu)成，所述p-夾層折疊由六股和七股的卩-片層組成。與其它銅氧還蛋白類似，銅離子同分布于扭曲四面體的四個保守殘基(His85，Cysl38，Hisl43，Metl48)組成的簇相配位。Walter等人，J.Mol.Biol,,vol.263:730-51(1996)。假天青蛋白假天青蛋白是含有藍(lán)銅的單鏈多肽家族。得自Achrorraobactercycloclastes的假天青蛋白的氨基酸序列顯示于SEQIDNO:5。假天青蛋白的X射線結(jié)構(gòu)分析顯示它與天青蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，盡管這些蛋白質(zhì)之間具有低序列同源性。在假天青蛋白和天青蛋白的整體結(jié)構(gòu)之間存在兩個主要的不同。相對于天青蛋白，假天青蛋白具有由兩個a-螺旋組成的羧基末端延伸。在中部肽區(qū)域，天青蛋白包含延伸的環(huán)，而在假天青蛋白中變短，其形成含有短a-螺旋的瓣。在銅原子位點(diǎn)上唯一的主要不同是，MET側(cè)鏈構(gòu)象和Met-S銅鍵長度，其在假天青蛋白中明顯短于在天青蛋白中。Phytocyanins可辨認(rèn)是phytocyanins的蛋白包括，但不限于黃瓜堿性蛋白、漆樹藍(lán)蛋白、mavicyanin、香辣根花青素、黃瓜剝皮銅氧還蛋白、豌豆豆莢中的假定的藍(lán)銅蛋白以及源自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的藍(lán)銅蛋白。在全部的除了黃瓜堿性蛋白和豌豆豆莢蛋白之外，通常在藍(lán)銅位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的軸向甲硫氮酸配體是用谷氨酰胺替代。Auracyanin指定為auracyaninA、auracyaninB-l禾卩auracyaninB-2的三種小的藍(lán)銅蛋白己經(jīng)從嗜熱的綠色滑動光合細(xì)菌橙色綠屈撓菌中分離。兩種B類型彼此具有幾乎相同的性質(zhì)，但是不同于A類型。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳證明近似的單體分子量為14(A)、18(B-2)和22(B-l)kDa。auracyaninA的氨基酸序列已經(jīng)確定并顯示auracyaninA是139個殘基的多肽。VanDreissche等人，ProteinScience8:947-957(1999)。His58、Cysl23、Hisl28和Metl32是以期望的方式間隔，如果它們是如已知的小型銅蛋白質(zhì)體藍(lán)素和天青蛋白的進(jìn)化保守的金屬配體。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測還表明auracyanin具有一般的P-桶形結(jié)構(gòu)，類似于來自的銅綠假單胞菌的天青蛋白和來自白楊葉的質(zhì)體藍(lán)素的P-桶形結(jié)構(gòu)。然而，auracyanin看來似乎具有兩種小型桶蛋白序列種類的序列特征。與天青蛋白共有序列的整體相似性和與質(zhì)體藍(lán)素的共有序列的整體相似性大致相同，即30.5%。auracyanin的N-末端序列區(qū)1-18顯著地富含甘氨酸和羥基氨基酸。Id.參見，來自橙色綠屈撓菌的auracyanin的A鏈的示例性氨基酸序列SEQIDNO:15(NCBIProteinDataBankAccessionNo.AAM12874)。auracyaninB分子具有標(biāo)準(zhǔn)的銅氧還蛋白折疊。已經(jīng)研究了來自橙色綠屈撓菌的auracyaninB的晶體結(jié)構(gòu)。Bond等人，J.Mol.Biol.306:47-67(2001)。除了另外的N-末端鏈之外，分子是非常類似于細(xì)菌銅氧還蛋白天青蛋白的分子。如在其他的銅氧還蛋白中，Oi配體之一位于多肽的鏈4上,其他三個沿著鏈7和8之間的大環(huán)路分布。參考后三個配體之間的氨基酸間隔，討論Cu的位置幾何學(xué)。aumcyaninB的結(jié)晶學(xué)表征的Cu-結(jié)合域可能是通過N-末端尾部系上細(xì)胞膜的周質(zhì)側(cè)面，該N-末端尾部顯示了與已知的多個其他膜有關(guān)的電子轉(zhuǎn)移蛋白中的系鏈的顯著的序列相同性。B型的氨基酸序列是在McManus等人(JBiolChem.267:6531-6540(1992))中提出。參見，來自橙色綠屈撓菌的aumcyaninB的A鏈的示例性氨基酸序列SEQIDNO:16(NCBIProteinDataBankAccessionNo.IQHQA)。漆樹藍(lán)蛋白漆樹藍(lán)蛋白是phytocyanins的亞類，一類普遍存在的植物銅氧還蛋白。漆樹藍(lán)蛋白的示例性序列在此包括為SEQIDNO:14。來自山葵根的漆樹藍(lán)蛋白即香辣根花青素的晶體結(jié)構(gòu)(Koch等人,J.Am.Chem.Soc,127:158-166(2005))和黃瓜漆樹藍(lán)蛋白(Hart等人，ProteinScience5:2175-2183(1996))也是已知的。蛋白具有類似其他phytocyanins的全部折疊。ephrinB2蛋白外功能區(qū)三級結(jié)構(gòu)具有同漆樹藍(lán)蛋白的顯著相似性。Toth等人，DevelopmentalCell1:83-92(2001)。漆樹藍(lán)蛋白的示例性的氨基酸序列是在NationalCenterforBiotechnologyInformationProteinDataBank發(fā)現(xiàn)為AccessionNo.IJER，SEQIDNO:14。黃瓜堿性蛋白黃瓜堿性蛋白的示例性氨基酸序列在此包括為SEQIDNO:17。黃瓜堿性蛋白(CBP)的晶體結(jié)構(gòu)，l型藍(lán)蛋白，已經(jīng)精確到1.8A分辨率。該分子類似其他藍(lán)銅蛋白，即具有GreekkeyP-桶形結(jié)構(gòu)，不同之處是桶在一邊開口并且更好描述為"J3-夾層"或"J3-taco"。Guss等人，J.MoLBiol.262:686-705(1996)。ephrmB2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)同黃瓜堿性蛋白具有高相似性(rmsdeviation1.5Afor50acarbons)。Toth等人，DevelopmentalCell1:83-92(2001)。Cu原子具有正常藍(lán)色銅NNSS'配合，鍵長Cu-N(His39)-1.93A、Cu-S(Cys79)-2.16A、Cu-N(His84)=1.95A、Cu-S(Met89)=2.61A。二硫化物連接(Cys52)-S-S-(Cys85)，看來似乎是穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)在中起到重要作用。多肽折疊是典型的藍(lán)銅蛋白(phytocyanins)的亞類以及非金屬蛋白，豕草屬變應(yīng)原Ra3，CBP與其具有高度的序列相同性。當(dāng)前可辨認(rèn)為phytocyanins的蛋白是CBP、漆樹藍(lán)蛋白、mavicyanin、香辣根花青素、黃瓜剝皮(acucumberpeeling)銅氧還蛋白、豌豆豆莢中的假定的藍(lán)銅蛋白以及來自擬南芥的藍(lán)銅蛋白。除了CBP和豌豆豆莢蛋白之外，在全部其他蛋白中，通常在藍(lán)銅位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的軸向甲硫氨酸配體被谷氨酰胺替代。黃瓜堿性蛋白的示例性序列在NCBIProteinDataBankAccessionNo.2CBP,SEQIDNO:17中發(fā)現(xiàn)。應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了預(yù)防其他健康患者中新發(fā)惡性腫瘤方法，包括給患者施用至少一種作為以上所述的銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的肽?；瘜W(xué)預(yù)防治療是基于這樣的假設(shè)，即阻斷腫瘤遺傳學(xué)中涉及的過程將防止癌癥的發(fā)生。銅氧還蛋白銅綠假單胞菌天青蛋白和截短的天青蛋白肽p28目前已知抑制癌前期病變的發(fā)生，或是通過抑制癌前期病變的早期形成，或是殺死或抑制存在的癌前期病變的發(fā)生。因此預(yù)期，如上所述的具有抑制癌前期病變發(fā)生的能力的銅氧還蛋白、或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以用于其他健康患者的化學(xué)預(yù)防治療。在某些實(shí)施方案中，這樣的另外的健康患者是較一般人群處于癌癥的更高風(fēng)險。可使用本發(fā)明的組合物治療來預(yù)防的癌癥包括，但不限于黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和子宮頸癌。在某些實(shí)施方案中，患者可以是人。在其他實(shí)施方案中，患者不是人類。本發(fā)明進(jìn)一步包括研究癌癥發(fā)生的方法，包括在用致癌原誘導(dǎo)之前或之后用組合物接觸哺乳動物的細(xì)胞，所述組合物包含銅氧還蛋白或其變體、^f生物或結(jié)構(gòu)等價物，并觀察細(xì)胞的發(fā)展。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是小鼠乳腺細(xì)胞，而在其他實(shí)施方案中，它們是可以變成哺乳動物的癌癥的其他細(xì)胞。較一般人群處于發(fā)生癌癥的更高風(fēng)險的患者可以是具有高危險特征的患者、具有癌前期病變的患者以及已經(jīng)治愈早期癌癥或最后治愈其癌前期病變的患者。一般參見,Tsao等人，CACancerJClin54:150-180(2004)。高危險特征可以是患者的行為、遺傳、環(huán)境或生理學(xué)因素。造成患者不同形式的癌癥的行為因素包括，但不限于吸煙、飲食、飲酒、激素替代治療、更高體重指數(shù)、未生育過、食用檳榔、頻繁使用漱口劑、暴露于人乳頭瘤病毒、童年期和長期日曬、過早的性行為、多個性伴侶以及使用口服避孕藥。造成患者不同形式的癌癥的遺傳因素包括，但不限于癌癥家族史、BRCA1和BRCA2的基因攜帶狀態(tài)、乳房瘤形成的先前史、家族性腺瘤的息肉瘤(FAP)、遺傳的非息肉病的結(jié)腸直腸癌(HNPCC)、紅發(fā)或金發(fā)和淺膚色表型、皮膚干燥病的色素以及種族性。造成患者不同形式的癌癥的環(huán)境特征包括，但不限于暴露于氡、多環(huán)芳香烴、鎳、鉻酸鹽、砷、石棉、氯甲基醚類、苯并芘、輻射和來自橡膠和油漆職業(yè)暴露的的芳香胺。造成患者不同形式的癌癥的其他多方面的因素包括，但不限于具有氣流阻塞的慢性阻塞性肺病、慢性膀胱感染、血吸蟲病、老年和免疫妥協(xié)狀態(tài)。此外，處于發(fā)生癌癥的更高風(fēng)險的患者可以通過使用已經(jīng)開發(fā)用于確定類型的癌癥的多種風(fēng)險模型確定。例如，易患乳腺癌的患者可以使用Gail風(fēng)險、ortheClaus模型等確定。參見Gail等人，JNatlCancerInst81:1879-1886(1989);Cuzick,Breast12:405-411(2003);Huang等人，AmJEpidemiol151:703-714(2000)。具有癌前期病變的患者是較普通人群處于發(fā)生癌癥的更高風(fēng)險。存在患者體內(nèi)和體表的癌前期病變可以是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法確定。可以測量患者的源自癌前期病變的中間體標(biāo)記或生物標(biāo)記以確定患者是否潛伏癌前期病變。大多數(shù)癌癥患者的腫瘤細(xì)胞和鄰近組織學(xué)上正常的組織中存在染色體異常。染色體異常的發(fā)生與癌前期病變至侵潤性癌癥的表型發(fā)生平行。Thiberville等人，CancerRes.55:5133-5139(1995)。因此，與癌癥有關(guān)的染色體異?？梢允怯米鳒y定患者的癌前期病變的中間體標(biāo)記。與癌癥有關(guān)的通常的染色體異常包括，但不限于腫瘤抑制劑基因如3p(FfflT和其他)、9p(pl6臓4、p15腿48和19ARF的9p21)、17p(用于p53基因和其他的17pl3)和13q(用于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因Rb和其他的13q)中的等位基因缺失或雜合性(LOH)喪失。3p和9p中的缺失與吸煙和早期肺癌有關(guān)。Mao等人，J,Natl.CancerInst.89:857-862(1997)。影響3p、5q、8p、17p和18q的缺失是上皮癌的共同變化。一般參見，Tsao等人，CAClin.CancerJ.Clin.54:153(2004)。與癌癥有關(guān)的其他染色體突變包括激活癌基因的那些。其存在可以是用作中間體標(biāo)記的癌基因包括，但不限于Ras、c-myc、表皮生長因子、erb-B2和細(xì)胞周期蛋白E、D1禾QB1。一般參見id.在154頁。其他中間體標(biāo)記可以是惡變前細(xì)胞和癌細(xì)胞中基因上調(diào)節(jié)的產(chǎn)物。可以在惡變前細(xì)胞中上調(diào)節(jié)的基因包括，但不限于環(huán)氧合酶COX-l和COX-2、端粒末端轉(zhuǎn)移酶。癌細(xì)胞和一些惡變前細(xì)胞的其他生物標(biāo)記包括，但不限于p53、表皮生長因子受體(GFR)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、RAS、COX-2、Ki-67、DNA非整倍性、DNA聚合酶a、ER、Her2恥"、E-轉(zhuǎn)粘蛋白、RARp、hTERT、p/(^"。、FfflT(3p14)、Bcl國2、VEGF-R、HPV感染、LOHPp"、LOH17p、p-AKT、ZwRNPA2/Bl、RAF、Myc、c-KIT、細(xì)胞周期蛋白Dl、E和Bl、IGF1、bcl-2、p16、LOH3p".3、LOH3/25、LOH印27、LOH〃;"、LOH"《、LOH印、/MSH2、APC、DCC、DPC4、JV18、BAX、PSA、GSTP1、NF-kB、AP1、D3S2、HPV感染、LOH3;W、LOH々、LOH5p、膀胱腫瘤抗原(BTA)、BTKTRAK(Alidex.Inc.,RedmondWA)、尿道基質(zhì)蛋白22、纖維降解產(chǎn)物、自分泌活力因子受體、BCLA-4、細(xì)胞角蛋白20、透明質(zhì)酸、CYFRA21-1、BCA、J3-人絨毛膜促性腺激素和組織多肽抗原(TPA)。一般參見id.在155-157頁。已經(jīng)治愈其早期癌癥或者已經(jīng)決定治療其癌前期病變的患者也是較普通人群處于發(fā)生癌癥的更高的風(fēng)險。第二原發(fā)腫瘤指的是癌癥史的人中的新的原發(fā)癌癥。第二原發(fā)腫瘤是頭頸癌癥的死亡率的主要原因。Id.在150頁。第二原發(fā)腫瘤是不同于轉(zhuǎn)移灶，因?yàn)榍罢呤窃划a(chǎn)生而后者是從已有的腫瘤產(chǎn)生。已經(jīng)治愈乳腺、頭頸、肺和皮膚的癌癥或癌前期病變的患者是處于發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的特別高的風(fēng)險。包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種途徑和服法施用于患者。在特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、局部、口服或吸入施用。.組合物可以通過傳送肽至處于生成癌癥的風(fēng)險的患者的位點(diǎn)的任何方式施用于患者。在特定的實(shí)施方案中，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物是靜脈內(nèi)施用。在一實(shí)施方案中，該方法可以包括向患者共同施用一單位劑量包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物和一單位劑量的包含另一種化學(xué)預(yù)防藥的組合物，以這樣的順序施用，在相同的時間施用，或者在給定的時間之后給予另外的藥，例如在約1分鐘至約60分鐘之后施用另外的藥，或者約1小時至約12小時之后施用另外的藥。感興趣的化學(xué)預(yù)防藥包括，但不限于他莫昔芬、芳香酶抑制藥如來曲唑和阿那曲唑(Arimidex⑧)、類視黃醇如N-[4-羥基苯基]維A酰胺(4-HPR、芬維A胺)、非類固醇類的抗炎劑(NSAID)如阿司匹林和舒林酸、塞來考昔(COX-2抑制劑)、二氟基鳥氨酸(DFMO)、熊去氧膽酸、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑、EKI-785(EGFR抑制劑)、貝伐單抗(VEGF-受體的抗體)、西妥昔單抗(EGFR的抗體)、視黃醇如維生素A、p-胡蘿卜素-、13-順式維甲酸、異維A酸和棕櫚酸視黃酯、(x-生育酚、干擾素、溶瘤細(xì)胞的腺病毒dll520(ONYX-015)、gefitinib、依曲替酯、非那司提、吲哚-3-甲醇、白藜蘆醇、綠原酸、雷洛昔芬和奧替普拉。包含的銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物藥用組合物包含的銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的藥用組合物以任何常規(guī)方法生產(chǎn)，例如常規(guī)混和、溶解、制粒、制糖衣((dragee-making)、乳化、包入膠囊(encapsulating)、包封((entrapping)或凍干過程?；旧霞兓蛩幱玫燃壍你~氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物易于與本領(lǐng)域熟知的藥物學(xué)上可接受載體組合。這樣的載體能夠使配制品被制成片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、混懸劑等等。合適載體或賦型劑也可包括例如填充劑和纖維素制品。其它的賦型劑包括例如矯味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑和其他可接受的添加劑、佐劑或粘合劑。在其他實(shí)施方案中，藥用制劑是基本上不含防腐劑。在其他實(shí)施方案中，藥用制劑可以包含至少一種防腐劑。關(guān)于藥用劑型的一般的方法可以在Ansel等人，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems{LippencottWilliams&Wilkins,BaltimoreMD(1999))中找到。本發(fā)明中所用的包含銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物可用多種方法施用，包括注射(如真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)等等)、吸入、局部施用、栓劑、使用透皮貼劑或經(jīng)口施用。關(guān)于藥物傳送系統(tǒng)的一般信息可以在Ansd等人id.中找到。在某些實(shí)施方案中，包含銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的的組合物可以直接配制和使用為用于皮下和靜脈注射等的可注射形式。注射制劑，特別地，可以有利地用于治療適于化學(xué)預(yù)防治療的患者。包含銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物也可以在與保護(hù)劑如聚乙二醇或類似的包衣劑混合之后口服攝取。當(dāng)注射施用時，銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以配制成水溶液，特別是生理學(xué)適合的緩沖液如Hanks溶液、林格氏液或生理鹽水緩沖液。溶液可以包含配制劑如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。選擇性地，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以是在使用前與適合載體例如無菌的不含熱原的水結(jié)構(gòu)化的粉末形式。在某些實(shí)施方案中，藥用組合物不含加入增強(qiáng)肽刺激的免疫應(yīng)答的佐劑或任何其他物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，藥用組合物包含抑制對于肽的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。當(dāng)施用是通過靜脈內(nèi)液體時，施用銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物所用的靜脈內(nèi)液體可以是由晶體或膠體構(gòu)成。在此所用的晶體是無機(jī)鹽或其他水溶性分子的水溶液。在此所用的膠體包含更大的不可溶分子如明膠。靜脈內(nèi)液體可以是無菌的。用于靜脈內(nèi)施用的晶體液體包括，但不限于標(biāo)準(zhǔn)鹽水(0.9%濃度的氯化鈉溶液)、林格氏乳酸鹽或林格氏溶液、5%右旋糖水溶液有時稱為D5W，在表2中所述。表2.常規(guī)晶體溶液的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>*林格氏乳酸鹽具有28mmol/L乳酸鹽、4mmol/LK+和3mmol/LCa2+。當(dāng)吸入施用時，銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以以氣溶膠噴劑形式從加壓包裝中送遞，或從帶有使用合適拋射劑(例如二氯二氟甲垸、三氯氟甲垸、二氧化碳或其他合適的氣體)的噴霧器送遞。在加壓氣溶膠的情形下，劑量單位可通過提供按計(jì)量量釋放的閥門來確定。用于吸入器或吹入器的例如明膠的膠囊和藥筒可被配制成包含蛋白和合適粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的混合粉末。當(dāng)局部施用時，銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可被配制成溶液、凝膠、油膏、乳劑、混懸劑等等，如本領(lǐng)域公知的。在一些實(shí)施方案中，利用透皮貼劑來施用。當(dāng)通過栓劑(例如直腸或陰道)施用時，銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物也可配制成包含常規(guī)栓劑基質(zhì)的組合物。-當(dāng)口服施用時，銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以通過組合銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受載體配制?？墒褂霉腆w載體，例如甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂等等；這些載體能使銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物配制成片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、混懸劑等等，以用于待治療患者的口服攝入。對于口服固體制劑如散劑、膠囊和片劑，合適的賦形劑包括填充劑例如糖類、纖維素制品、造粒劑和粘合劑。其它常規(guī)載體，如本領(lǐng)域公知的，也包括多價載體，例如細(xì)菌莢膜多糖、葡聚糖，或被基因工程化的載體。此外，包括銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的緩釋制劑允許銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物在延長的時間期間內(nèi)釋放，這樣如果不使用緩釋制劑，所述銅氧還蛋白，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物將從患者的體系中被清除，和/或'例如通過蛋白酶和在引出或增強(qiáng)治療效果之前的簡單水解被降解。本發(fā)明肽的血液中半衰期可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法延長或優(yōu)化。本發(fā)明的肽變體包括，但不限于可以增加其穩(wěn)定性、比活性、血液中的存活力和/或減少銅氧還蛋白的免疫原性同時保留肽抑制哺乳動物細(xì)胞、組織和動物的發(fā)生癌前期病變的能力的不同變體。這樣的變體包括，但不限于減少肽的水解、減少肽的脫酰胺、減少氧化、減少免疫原性、增加肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或增加肽的大小那些變體。這樣的肽類也包括成環(huán)的肽類(參見Monk等人，BioDrags19(4):261-78,(2005);DeFreest等人，J.Pept.Res.63(5):409-19(2004));D，L-肽(非對映異構(gòu)體)，F(xiàn)utaki等人，J.Biol.Chem.Feb23;276(8):5836-40(2001);Papo等人，CancerRes.64(16):5779-86(2004);Miller等人，Biochem,Pharmacol,36(1):169-76,(1987));含不常見氨基酸的肽類(參見Lee等人，J.Pept.Res.63(2):69-84(2004))，N-和C-末端修飾(參見Labrie等人，Clin.Invest.Med.13(5):275國8，(1990))，烴纖維包扎(參見Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenski等人，Science305:1466-1470(2004))和聚乙二醇化。在各種實(shí)施方案中，組合物包含載體和賦形劑(包括但不限于緩沖劑、糖類、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、鰲合劑、助懸劑、增稠劑和/或防腐劑)—、水、油、鹽溶液、水性葡萄糖和甘油溶液、為了近似于生理?xiàng)l件所要求的其它藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤劑等等。應(yīng)理解的是，當(dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的任意合適載體被應(yīng)用于給予本發(fā)明的組合物時，載體的類型將根據(jù)施用方式而變化?；衔镆部捎霉募夹g(shù)以脂質(zhì)體來包封。也可應(yīng)用生物可降解微球作為本發(fā)明藥物學(xué)組合物的載體。合適的生物可降解微球己公開于例如美國專利號4,897,268、5,075,109、5,928,647、5，811，128、5,820,883、5,853,763、5,814,344和5,942,252。藥用組合物可以通過常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)來滅菌或無菌過濾。所得水性溶液可以其現(xiàn)有形式或凍干形式被包裝，凍干制劑在施用前與無菌溶液相組合。施用銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以配制為藥用組合物并任何適合的途徑施用，例如口服、含服、吸入、舌下、直腸、陰道、經(jīng)尿道、經(jīng)鼻腔、局部、經(jīng)皮即透皮或胃腸外(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和冠狀動脈內(nèi))或玻璃體施用。其藥用制劑可以是以有效達(dá)到其預(yù)期目標(biāo)的任何劑量來施用。更特別地，組合物是以治療有效量施用。在特定的實(shí)施方案中，治療有效量通常是約0.01-20mg/天/kg的體重。包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的化合物是用于預(yù)防癌癥，單獨(dú)或聯(lián)合其他活性劑。當(dāng)然，適宜的劑量將根據(jù)例如所用的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的化合物、宿主、施用方式以及潛在癌癥的性質(zhì)和嚴(yán)重度變化。然而，人中的令人滿意的治療結(jié)果被認(rèn)為是在約0.001-約20mg/kg的體重獲得。人的標(biāo)明的每日劑量是便于施用約0.7mg-約1400mg的包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的化合物，例如每日施用、每周施用、每月施用和/或連續(xù)施用。每日施用可以是每日1-12次的分開施用。選擇性地，施用可以是每隔一天、每隔兩天、每隔三天、每隔四天、每隔五天、每周，并且在增至31天中類似進(jìn)行。選擇性地，施用可以是使用貼片、靜脈注射等連續(xù)的。確切的制劑、施用途徑和劑量是由主治醫(yī)師根據(jù)患者的病癥確定。劑量和間隔時間可以個體調(diào)節(jié)以提供足以維持治療作用的活性銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的血漿水平。通常，期望的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物是以與藥用載體的混合物的形式施用，所述藥用載體是根據(jù)預(yù)期的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐選擇。在一個方面，銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物是為DNA送遞，以便在原位生成多肽。在一個實(shí)施方案中，DNA是"裸露的"，例如Ulmer等人，Science,vol.259:1745-1749(1993)的描述和Cohen,Science,vol.2591691-1692(1993)的綜述。通過將DNA包被于可有效地被運(yùn)送進(jìn)細(xì)胞的載體例如生物可降解珠上，可提高裸DNA的攝取。在這些方法中，所述DNA可存在于多種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的送遞系統(tǒng)中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。將DNA引入這些表達(dá)體系中的方法對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。參見例如WO90/11092，WO93/24640，WO93/17706和美國專利號5,736,524。用于生物間運(yùn)輸遺傳物質(zhì)的載體可分為兩大類:克隆載體是在適當(dāng)宿主細(xì)胞中帶有繁殖非必需區(qū)域的復(fù)制質(zhì)粒或噬菌體，外源DNA可插入其中:所述外源DNA可被復(fù)制和繁殖，如同它是載體的組分。表達(dá)載體(例如質(zhì)粒、酵母或動物病毒基因組)用于將外源遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞或組織中，以使得轉(zhuǎn)錄并翻譯所述外源DNA，例如銅氧還蛋白的DNA。在表達(dá)載體中，引入的DNA與元件(例如向宿主細(xì)胞發(fā)出信號對插入DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動子)可操縱地連接。一些啟動子特別地有用，例如應(yīng)答特定因子控制基因轉(zhuǎn)錄的可誘導(dǎo)啟動子。銅氧還蛋白及其變體和衍生物多核苷酸與可誘導(dǎo)啟動子的可操縱地連接可控制銅氧還蛋白及其變體和衍生物應(yīng)答特定因子的表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)的可誘導(dǎo)啟動子的實(shí)例包括那些對a-干擾素、熱休克蛋白、重金屬離子和類固醇例如糖皮質(zhì)激素(Kaufinan，MethodsEnzymol.185:487-511(1990))和四環(huán)素作出反應(yīng)的啟動子。其它期望的可誘導(dǎo)啟動子包括對引入構(gòu)建體的細(xì)胞不是內(nèi)源性的，但是當(dāng)誘導(dǎo)劑被外源提供時在那些細(xì)胞中是反應(yīng)性的。一般而言，有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒。然而，也包括其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。載體的選擇由待使用的生物體或細(xì)胞以及載體期望的命運(yùn)決定。一般而言，載體包括信號序列、-復(fù)制起始位點(diǎn)、標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。包含銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的試劑盒在一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種處于包裝或容器中的下列物質(zhì)的試劑盒(l)包含至少一種銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的藥理學(xué)上活性組合物；(2)另外的化學(xué)預(yù)防藥；(3)把生物活性組合物給予患者的器械如注射器、霧化器等。當(dāng)提供試劑盒時，組合物中的不同成分可在分開的容器中包裝，如果適合，并在使用前立即混合。分開包裝此組分可允許長期的貯存，而不喪失活性組分的功能。試劑盒中的試劑可在任意種類的容器中提供，要求不同組分的使用期得到保存并不被容器的材料所吸收或改變。例如，密封的玻璃安瓿可含有凍干的銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物，或在中性、不反應(yīng)性氣體例如氮?dú)庀掳b的緩沖液。安瓿可由合適的材料構(gòu)成，例如玻璃、有機(jī)聚合物如聚碳酸醋、聚苯乙烯等、陶瓷、金屬或通常用于保存相似試劑的任何其它材料。其它合適容器的實(shí)例包括簡易瓶，其由與安瓿相似的物質(zhì)焊接而來，和封套((eiwelopes)，其可包含金屬箔封閉的內(nèi)部，例如鋁和合金。其它的容器包括試管、管形瓶、燒瓶、瓶、注射器等等。容器可有無菌存取口，例如有塞子的瓶子，該塞子可用皮下注射針頭刺穿。其它容器可具有兩室，兩室被容易去除的膜分開，去除所述膜后允許組分混合?？扇コた蔀椴Ａ?、塑料、橡膠等。試劑盒也可提供指導(dǎo)材料。說明書可印在紙或其它載體上，和/或以電子可讀介質(zhì)提供，例如軟盤、CD-ROM、DVD-ROM、壓縮盤(Zipdisc)、錄像帶、錄音帶、閃存盤等。詳細(xì)的說明書與試劑盒可以不是以物理形式在一起的，而是使用者可以被指引去試劑盒的制造商或分銷商指定的互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)，或由電子郵件提供。銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的修飾銅氧還蛋白或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以是化學(xué)修飾或遺傳上改變以產(chǎn)生如上說明的變體和衍生物。這樣的變體和衍生物可以是由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。除了銅氧還蛋白的天然存在的等問基因變體之外，變化可以是通過將突變進(jìn)入銅氧還蛋白編碼序列，所述序列招致編碼銅氧還蛋白的氨基酸序列的改變，所述改變不顯著改變銅氧還蛋白抑制癌前期病變的發(fā)生的能力。"非必需的"氨基酸殘基是這樣的殘基，其可以從銅氧還蛋白的野生型序列改變的，而不改變藥理學(xué)活性，反之，"必需的"氨基酸殘基是這樣的藥理學(xué)活性所需要的。例如，保守在銅氧還蛋白中的氨基酸殘基預(yù)測是特別不適合被改變，因此"必需的"。其保守取代不改變多肽的藥理學(xué)活性的氨基酸的制備是本領(lǐng)域熟知的。有用的保守取代是如表3中所示，"優(yōu)選的取代"。由此一類氨基酸用相同類的另一種氨基酸替代的保守取代落入本發(fā)明的保護(hù)范圍，只要取代不實(shí)質(zhì)上改變化合物的藥理學(xué)活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>影響(l)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如P-折疊或a-螺旋構(gòu)象、(2)電荷、(3)疏水性，或(4)靶位點(diǎn)的側(cè)鏈體積的非保守取代可改變藥理學(xué)活性。表4所示，基于共同側(cè)鏈性質(zhì)，給殘基分類。非保守取代要求這些類型中的一個的成員變換成另一種類型。取代可以是引入保守取代位點(diǎn)或更特別地引入非保守位點(diǎn)。表4氨基酸種類<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>變體多肽可以使用本領(lǐng)域熟知的制備，如寡核苷酸介導(dǎo)的(定向)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變。定向誘變(Carter,BiochemJ.237:1-7(1986);Zoller和Smith,MethodsEnzymol.154:329-50(1987))，盒式誘變、限制選擇誘變(Wells等人，Gene34:315-23(1985))或其他已知技術(shù)可以對克隆的DNA進(jìn)行以產(chǎn)生銅氧還蛋白變體DNA。銅氧還蛋白的已知突變也可以用于創(chuàng)造用于本發(fā)明方法的變體。例如，天青蛋白的C112D和M44KM64E突變株已知具有不同于天然的天青蛋白的細(xì)胞毒性和生長阻止活性，而這種改變的活性可以用于本發(fā)明的治療方法。對本發(fā)明更完整的理解可通過參考下列具體實(shí)施例來獲得。描述實(shí)施例目的僅在于說明，而并不是試圖限制本發(fā)明的范圍。當(dāng)環(huán)境提示或使得這樣更便利時，形式的變化和等同取代也包含在本發(fā)明中。盡管在本文使用了特定的術(shù)語，但是這些術(shù)語是為了描述，而不是為了限制。如上文所列出的對本發(fā)明的修飾和變化可以在不偏離本發(fā)明精神或范圍下進(jìn)行，因此本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)認(rèn)為只是如所附權(quán)利要求書中所指明的那樣。實(shí)施例實(shí)施例1.肽P-28對于MMOC模型中DMBA-誘導(dǎo)的乳房病變的作用小鼠乳腺器官培養(yǎng)物(MMOC)模型允許評價潛在化學(xué)預(yù)防藥對于應(yīng)答DMBA的乳腺腺泡狀病變(MAL)或乳腺導(dǎo)管病變(MDL)的產(chǎn)生的功效。在適當(dāng)孵育環(huán)境下的DMBA根據(jù)培養(yǎng)基中激素環(huán)境形成MAL或MDL。Hawthorne等人，PharmaceuticalBiology40:70-74(2002);Mehta等人，J.Natl,CancerInst.93:1103-1106(2001)。培養(yǎng)物中雌激素和孕酮處理的腺體生成導(dǎo)管病變，而醛固酮和氫化可的松處理的腺體形成不依賴于雌激素和孕酮的腺泡狀病變。乳腺不暴露于致癌原或化學(xué)預(yù)防藥，在無生長促進(jìn)激素存在下經(jīng)過結(jié)構(gòu)復(fù)原，然而在第3天和第4天之間采用DMBA處理24小時防止激素消失引起的結(jié)構(gòu)復(fù)原。假定，這是因?yàn)橄贀p失了正常的激素應(yīng)答性，目前改變了其發(fā)生過程。移植轉(zhuǎn)變的細(xì)胞進(jìn)入同源的小鼠產(chǎn)生的乳腺癌證明這些未被抑制部位的惡變前的腫瘤發(fā)生前的性質(zhì)。胸的乳腺對被從各個Balb/c小鼠無菌離體，腺體分成多個組。p28的作用是在4個不同稀釋的培養(yǎng)基中評價。不含測試藥物的致癌原處理的腺體用作測定在化學(xué)預(yù)防藥不存下的發(fā)病率的百分比的測量方法。另外的對照是包括用作化學(xué)預(yù)防藥的陽性對照。天青蛋白是以50昭/ml的濃度包含在培養(yǎng)基中。對于腺泡狀病變(MAL)，染色的腺體是評估病損的發(fā)生率(同在給定的治療組中的全部量的腺體比較，包含任何病損的腺體)。對于導(dǎo)管病變(MDL)，適用類似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，然而，如以下方法部分中指出的，激素組合對于腺泡狀病變和導(dǎo)管病變是不同的。腺體固定在福爾馬林中，然后用于組織病理學(xué)處理。切片是用曙紅和hematoxelene染色并在顯微鏡下評估。在此，比較對照組和治療組之間的導(dǎo)管病變的多樣性。器官培養(yǎng)操作用于研究的實(shí)驗(yàn)動物是年輕的、未交配的BALB/c雌性小鼠，3-4周大，從CharlesRiver，Wilmington,MA.獲得。小鼠通過皮下注射1嗎雌二醇-17卩+111^孕酮每日治療，持續(xù)9天。治療是前提，因?yàn)槿绻麆游锊挥妙惞檀碱A(yù)先處理就不能應(yīng)答體外的激素。全部培養(yǎng)物操作是詳細(xì)描述。Jang等人，Science275:218-220(1997);Mehta,Eu.J.Cancer36:1275-1282(2000);Mehta等人，J.Natl.CancerInst89:212-219(1997);Mehta等人，J.Natl.CancerInst.93:1103-1106(2001)。簡要地，動物通過頸脫位法殺死，胸的乳腺對是從silkrafts上切開，在不含血清的WaymouthMB752/1培養(yǎng)基(5個腺/5ml/皿)中孵育10天。培養(yǎng)基補(bǔ)充谷氨酰胺、抗生素(青霉素和鏈霉素100單位/ml培養(yǎng)基)和生長促進(jìn)激素、每ml培養(yǎng)基補(bǔ)充5嗎胰島素(I)、5昭催乳素(P)、1嗎醛固歐A)和1嗎氫化可的松(H)，用于誘發(fā)乳腺腺泡狀病變(MAL)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。對于導(dǎo)管病變(MDL)的誘導(dǎo)而言，培養(yǎng)基包含5pg/ml、5pg/mlP、0.001^g/ml雌二醇17P和1i^g/ml孕酮(Pg)。Mehta等人，J.Natl.CancerInst.93:1103-1106(2001)。致癌原、DMBA(2嗎/ml)在第3天和第4天之間加入培養(yǎng)基。對于本研究而言，DMBA是以4mg/ml的最終濃度溶解于DMSO，50昭的I加入100ml培養(yǎng)基得到2^ig/ml最終濃度。對照皿含有為載體的DMSO。在第4天，通過在新鮮的培養(yǎng)基中漂洗腺體并將其轉(zhuǎn)移到含不含DMBA的新鮮培養(yǎng)基的新皿中，從培養(yǎng)基除去DMBA。在孵育10天之后，腺體在僅含I(5嗎/ml)的培養(yǎng)基中保持14天。在整個培養(yǎng)期間，腺體保持在37'C的95%02和5%(302的環(huán)境中。在前10天的促進(jìn)生長階段，化學(xué)預(yù)防藥包含在培養(yǎng)基中。試驗(yàn)的肽p28是在12.5pg/ml到100pg/ml的4個濃度下評估。在培養(yǎng)基中50pg/ml下評估天青蛋白。肽溶解于無菌水并在使用前過濾。培養(yǎng)基是每周變化三次(周一、周三和周五)。在暴露結(jié)束，腺體固定在福爾馬林中。結(jié)果是通過卡方檢驗(yàn)和Fisher's精確試驗(yàn)分析。MAL的形態(tài)測定分析對于MAL的檢查而言，腺體是在明礬洋紅中染色，用于評估病變的存在。腺體用于對存在或不存在乳房病變、每個腺體病變嚴(yán)重性以及試劑的毒性計(jì)分。儲藏在二甲苯中的腺體用于評估各個腺體的乳腺病變的存在或不存在、發(fā)病率和嚴(yán)重性，在解剖顯微鏡下進(jìn)行。乳腺根據(jù)乳房病變的陽性或陰性記分，百分比發(fā)病率測定為顯示病變的腺體和該組中腺體總量的百分比?；瘜W(xué)預(yù)防藥引起的導(dǎo)管的擴(kuò)張或乳房結(jié)構(gòu)的崩解被認(rèn)為是毒性作用。數(shù)據(jù)接受發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)分析以測定潛在化學(xué)預(yù)防藥的效力。附圖1A顯示了DMBA處理腺體及其比較用DMBA和化學(xué)預(yù)防藥處理的腺體中的腺泡狀病變代表性照片。p28對于腺泡狀病變發(fā)生的作用是在附圖1B-1G中所示，并總結(jié)在附圖2中。在25ng/ml濃度時，肽p28抑制MAL形成67。/。。增加濃度進(jìn)一步高至IOOng/ml不增強(qiáng)肽的功效。肽與天青蛋白的比較，表明p28是如同天青蛋白一樣對于MAL發(fā)生有效的。在50pg/ml濃度的天青蛋白產(chǎn)生67n/。的抑制。統(tǒng)計(jì)分析表明，相對于DMBA對照，p28的作用在大于12.5pg/ml的濃度時具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性(pO.Ol，F(xiàn)isher'sExactTest;ChiSquareanalysis)。MDL的組織病理學(xué)評價對于MDL，腺體是處理用于組織病理學(xué)評價。腺體是縱向切成5-微米的切片并用曙紅hematoxeline染色。各個腺體的縱向切片分成多個區(qū)域，評估各個區(qū)域的導(dǎo)管病變。Mehta等人，J，Natl.CancerInst.93:103-1106(2001)。簡要地，根據(jù)區(qū)域評估整個腺體；同較大的腺體相比，較小的腺體將具有更少的總的范圍。因此，各個腺體將具有不同量的范圍。穿過管的切片數(shù)常常從一個腺體到另一個腺體也是變化巨大的。這導(dǎo)致組與組之間的不同量。測定含導(dǎo)管增生或異型的范圍，并與評估各個腺體的范圍的總量比較。在增生或異型以及嚴(yán)重閉塞的腺體之間沒有差別。包含這些組織病理學(xué)表現(xiàn)之一的任何區(qū)域是認(rèn)為對于病變是陽性的。比較治療組和對照組，用于計(jì)算嚴(yán)重度和抑制的百分比。圖3顯示了代表性的導(dǎo)管病變。DMBA誘發(fā)的導(dǎo)管病變隨增生即完全阻塞導(dǎo)管的的異型變化。測定導(dǎo)管病變/導(dǎo)管部分的總量的比例。此外，12.5jag/ml濃度的p28僅僅抑制15%的MDL形成。然而，同50昭/ml天青蛋白一樣，25ng/ml時存在顯著的抑制病變。p28在大于12.5pg/ml濃度時的功效是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(pO.Ol，F(xiàn)ishersExactTest)。這些結(jié)果是在附圖4中總結(jié)?；瘜W(xué)預(yù)防藥的作用常常在MAL和MDL之間有區(qū)別的。例如，他莫昔芬抑制MDL的發(fā)生而不抑制MAL的發(fā)生。有趣地發(fā)現(xiàn)，天青蛋白和p28既抑制雌激素和孕酮依賴性的導(dǎo)管病變也抑制雌激素和孕酮不依賴性的腺泡狀病變。這個實(shí)驗(yàn)表明，p28和天青蛋白均可以預(yù)防乳房組織中癌前期病變的發(fā)生。因此，p28和天青蛋白可以用作哺乳動物患者的化學(xué)預(yù)防藥。權(quán)利要求1、一種分離的肽，其是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物；其可以抑制哺乳動物組織的癌前期病變的發(fā)生。2、權(quán)利要求l的分離的肽，其中銅氧還蛋白選自天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz、auracyanin、漆樹藍(lán)蛋白和黃瓜堿性蛋白。3、權(quán)利要求2的分離的肽，其中銅氧還蛋白是天青蛋白。4、權(quán)利要求1的分離的肽，其中銅氧還蛋白來自選自銅綠假單胞菌(尸seM(io膨wasoen/g/"o51(3)、糞產(chǎn)堿斷<2/￡70/扭"&y^ecfl/Zs)、木糖氧化無色桿菌(Jc/zra附o6o"erxy/(WoxzV^2")、支氣管敗血性博德特氏菌(5oni"e//a6ra打c/^epft'ca)、甲基單胞菌(A/e^y/omo"oss;.)、腦膜炎奈瑟球菌(Afeissen'a附e"/"g/ftVfe)、淋病奈瑟球菌(iVe/^en.ago"or/Vzoeae)、螢光假單胞菌(尸5^wdo附o"asy7Momscms)、綠針假單胞菌(/^ewd歸o"asc/z/orara/to)、苛養(yǎng)木桿菌(辦/eZ/(3/a幼W/asa)和副溶血弧菌(F6n'o/^ra/zaemo/j^ew)的生物體。5、權(quán)利要求4的分離的肽，其來自銅綠假單胞菌。6、權(quán)利要求1的分離的肽，其是選自SEQIDNO:l、3-19的肽的部分。7、權(quán)利要求l的分離的肽，其中選自SEQIDNO:l、3-19的序列與其具有至少80。/。氨基酸序列相同性。8、權(quán)利要求l的分離的肽，其是截短的銅氧還蛋白。9、權(quán)利要求8的分離的肽，其中所述肽超過約10個殘基，且不超過約100個殘基。10、權(quán)利要求8的分離的肽，其中所述肽包含選自銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-67、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基36-88和SEQIDNO:20-24的序列。11、權(quán)利要求10的分離的肽，其中所述肽由選自銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-67、銅綠假單胞菌天青蛋白殘基36-88和SEQIDNO:20-24的序列組成。12、權(quán)利要求l的分離的肽，其中所述肽包含與選自殘基50-77、殘基50-67和殘基36-88的銅綠假單胞菌天青蛋白區(qū)域等同的銅氧還蛋白的殘基。13.一種藥用組合物，其包含置于藥學(xué)上可接受的載體中的至少一種權(quán)利要求1的銅氧還蛋白或肽。14.權(quán)利要求13的組合物，其包含至少兩種銅氧還蛋白或肽。15.權(quán)利要求13的組合物，其中藥用組合物被配制為用于靜脈內(nèi)施用。16.權(quán)利要求13的組合物，其中銅氧還蛋白來自選自銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、木糖氧化無色桿菌、支氣管敗血性博德特氏菌、甲基單胞菌、腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、螢光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌和副溶血弧菌的生物體。17.權(quán)利要求16的組合物，其中銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌。18.權(quán)利要求13的組合物，其中銅氧還蛋白選自SEQIDNO:l、3-19。19.一種治療哺乳動物患者的方法，包括給患者施用治療有效量的權(quán)利要求13的組合物。20.權(quán)利要求19的方法，其中患者是人。21.權(quán)利要求19的方法，其中患者發(fā)生癌癥的風(fēng)險較一般人群更高。22.權(quán)利要求21的方法，其中癌癥選自黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌和子宮頸癌。23.權(quán)利要求21的方法，其中患者具有至少一種高風(fēng)險特征。24.權(quán)利要求19的方法，其中患者具有癌前期病變。25.權(quán)利要求19的方法，其中患者已經(jīng)治愈癌癥或癌前期病變。26.權(quán)利要求19的方法，其中藥用組合物通過選自靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、吸入、局部施用、透皮貼片、栓劑、玻璃體注射和口服的方式施用。27.權(quán)利要求24的方法，其中施用方式是靜脈注射。28、權(quán)利要求21的方法，其中藥用組合物與至少一種其他化學(xué)預(yù)防藥共同施用。29、權(quán)利要求26的方法，其中藥用組合物與另一種化學(xué)預(yù)防藥大約同時施用。30、一種試劑盒，其包含置于小瓶中的權(quán)利要求13的組合物。31、權(quán)利要求30的試劑盒，其中試劑盒設(shè)計(jì)為用于靜脈施用。32、一種研究癌癥發(fā)生的方法，包括用權(quán)利要求1的銅氧還蛋白或肽接觸哺乳動物的細(xì)胞；并測量惡變前細(xì)胞和惡性細(xì)胞的產(chǎn)生。33、權(quán)利要求32的方法，其中細(xì)胞是人的細(xì)胞。34、權(quán)利要求32的方法，其中細(xì)胞是乳腺細(xì)胞。35、權(quán)利要求32的方法，其中細(xì)胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生癌。36、表達(dá)載體，其編碼權(quán)利要求1的肽。全文摘要本發(fā)明涉及包含可以是銅氧還蛋白的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物的肽的組合物，所述肽抑制哺乳動物細(xì)胞、組織和動物的癌前期病變的發(fā)生。特別地，這些組合物可以包含源自銅綠假單胞菌天青蛋白和/或天青蛋白的50-77殘基區(qū)域(p28)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含銅氧還蛋白和/或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物，其保留抑制哺乳動物細(xì)胞、組織和動物的癌前期病變發(fā)生的能力。這些組合物可以是肽類或藥用組合物等等。本發(fā)明的組合物可以用于預(yù)防哺乳動物細(xì)胞、組織和動物的癌前期病變的發(fā)生，并由此預(yù)防癌癥。文檔編號C07K14/00GK101595124SQ200780041762公開日2009年12月2日申請日期2007年9月13日優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日發(fā)明者A·查克拉博蒂,T·達(dá)什古普塔申請人:伊利諾斯大學(xué)理事會