專利名稱：人T2R受體hT2R50的新單體型及其在鑒定人苦味調節劑的測定法中的用途的制作方法
技術領域：
然而，盡管已有報道并理解T2R成員調控苦味，且它們可 能在胃腸功能中的起作用，但有需要鑒定活化人苦味T2R味覺受體的特 異性配體。更好地理解不同T2R (特別是人T2R)的結合特性將非常有 益，因為其將更好地促進其在選擇具有預期味覺調節特性(即阻斷或抑 制特異性苦味化合物的味道)的化合物中的用途。另外，它也將提供用 于治療和調節胃腸功能和相關疾病(如肥胖癥、糖尿病、食物吸收、食 物感受、進食障礙)，并調控相關激素和肽(如GLUT2、膽嚢收縮素等) 的化合物的鑒定。
發明內容
"T2R單體型"指見于不同個體的hT2R多肽的天然存在的 等位基因變體，如
圖1所含hT2R50單體型及相應DNA。此類T2R單體 型可與早先報道的最初鑒定的hT2R多肽響應相同或不同的苦味配體。 例如， 一些單體型可參與一些個體品嘗不同的苦味配體或與其它個體不 同地感知此類配體的能力。某些化學感受GPCR在拓樸學上具有"N-末端結構域"、"胞 外結構域"、包含七個跨膜區及相應胞質和胞外環的"跨膜結構域"、"胞 質區，，和"C-末端區，，(參見，例如Hoon等人，Cell, 96:541-51 ( 1999); Buck&Axel， Cell, 65:175-87 ( 1991 ))。使用本領域技術人員已知的方 法，如鑒定疏水性和親水性結構域的序列分析程序(參見，例如Stryer， Biochemistry (生物化學)(第三版，1988);另請參見許多基于互聯網的 序列分析程序，如見于dot.imgen.bcm.tmc.edu的那些中的任何一個)，可在結構上鑒定這些區域。可將這些區域用于制備嵌合蛋白，并用于本 發明的體外測定法(例如配體結合測定法)。本文所用術語"純化的"、"基本純化的"和"分離的"指不含天 然狀態下一般與本發明的化合物結合的其它、不相似的化合物的狀態。 "純化的"、"基本純化的"和"分離的，，優選指所述組合物以重量計包含至 少0.5%、 1%、 5%、 10%或20%，且最優選至少50%或75%重的給定 樣品。在一個優選實施方案中，這些術語指以重量計包含至少95%重的 給定樣品的本發明的化合物。當指核酸或蛋白時，本文所用術語"純化 的"、"基本純化的"和"分離的"核酸或蛋白也指不同于哺乳動物(尤其是 人)身體中天然存在的純化或濃縮狀態。任何大于所述哺乳動物(尤其 是人)身體中天然存在的純化或濃縮程度，包括(1)從其它結合的結構或化合物中純化，或(2)與在哺乳動物(尤其是人)身體中一般不結合 的結構或化合物結合亦在"分離的，，的含義內。可根據本領域技術人員已 知的多種方法和程序分離本文所述核酸或蛋白或所述類別的核酸或蛋 白，或將它們與天然狀態下一般不與它們結合的結構或化合物結合。術語"文庫，，指為不同核酸或多肽分子的混合物的制品，如用 簡并引物對擴增核酸或包括擴增的配體結合區的載體的分離收集而產生 的重組產生的感覺(特別是味覺)受體配體結合區的文庫，或用至少一 種編碼味覺受體的載體各自隨機轉染的細胞的混合物。對于是保守變體的本發明的多肽，常規實驗即確定模擬物是 否在本發明范圍內，即其結構和/或功能未被實質性改變。多肽模擬物組
19合物可含非天然結構組件的任意組合，其一般來自三個結構組a)不是 天然酰胺鍵("肽鍵")連接的殘基連接組；b)非天然殘基取代天然存在 的氨基酸殘基；或c)誘導二級結構模擬(即誘導或穩定二級結構(例如 P轉角、y轉角、p折疊、a螺旋構象等))的殘基。當多肽的所有或一些 殘基通過不是天然肽鍵的化學方式連接時，可將其表征為模擬物。個別 的肽模擬物殘基可通過肽鍵、其它化學鍵或偶聯方式(如，例如戊二醛、 N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來酰亞胺、N，N'-二環己基碳二亞胺 (DCC)或N，N，-二異丙基碳二亞胺(DIC))連接。可替代傳統酰胺鍵 ("肽鍵")連接的連接基團包括，例如酮亞甲基(例如-C(，-.O)--CH2 替代一C(.-O)--NH—)、氨亞甲基(CH2NH )、乙烯、烯烴(CH.dbd.CH )、 醚(CH20 )、硫醚(CH2—S )、四唑(CN4 )、噢唑、逆酰胺(retroamide )、 石l/f戈酰胺或酉旨(參見，，W口 Spatola， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins,第7巻，267-357， Marcell Dekker， Peptide Backbone Modifications, NY ( 1983 ))。還可將含取代了所有或一些天 然存在的氨基酸殘基的被非天然殘基的多肽表征為模擬物；非天然殘基 在科學和專利文獻中已有詳細描述。"經標記的核酸探針或寡核苷酸"是通過連接體或化學鍵共 價結合，或通過離子鍵、范德華鍵、靜電鍵或氫鍵非共價結合標記物， 從而可通過檢測出結合到所述探針的標記物的存在情況來檢測所述探針 的存在情況的核酸探針或寡核苷酸。
0073本文所用"核酸探針或寡核苷酸"的定義是能夠通過一種或 多種類型的化學鍵，通常通過互補堿基配對，通常通過氬鍵形成，結合 具有互補序列的靶核酸的核酸。本文所用探針可包括天然(即A、 G、 C 或T)或經修飾堿基(7-脫氮鳥苷、次黃苷等)。此外，探針中的堿基可通過不是磷酸二酯鍵的連接而連接，只要其不干擾雜交。因此，例如， 探針可為肽核酸，其中作為組成的堿基通過肽鍵，而非磷酸二酯連接連 接。本領域技術人員應理解，探針可依賴于雜交條件的嚴格性而與所述 探針序列缺乏完全互補性的靶序列結合。所述探針任選用同位素、發色 團、發光團、色原進行直接標記，或用如生物素進行間接標記(隨后可 將鏈霉親和素復合體結合至所述生物素)。本領域技術人員可通過測定所 述探針的有無來檢測所選序列或子序列的有無。基于前述內容，本發明提供用于鑒定調節(優選阻斷) hT2R50的新單體型和先前鑒定的人苦味受體hT2R50被苦味化合物(即 吡溱和結構上相關的化合物)的特異性活化的化合物的測定法。本發明 尤其提供用于鑒定調節(例如阻斷)hT2R50及其單體型被苦味配體的活 化的化合物的基于細胞的測定法。預期這些化合物將在人受驗者中調節與hT2R50和其它潛在T2R味覺受體相關的苦味。這可在味覺試驗中確 認。另外，這些核酸也可通過公知的化學合成技術在體外合成， 參見,例如 Carruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. ■ Biol. 47:411-18(1982); Adams, Am. Chem. Soc.， 105:661 ( 1983 ); Belo脂v， Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997); Frenkel， Free Radic. Biol. Med. 19:373-380 ( 1995 ); Blommers， Biochemistry 33:7886-7896 ( 1994 ); Narang, Meth. Enzymol. 68:90 (1979 ); Biwn， Meth. Enzymol. 68:109
(1979 ); Beaucage， Tetra. Lett 22:1859( 1981 );美國專利No. 4,458,066。 然后可通過合成互補鏈并在適當的條件下將所述鏈退火在一起，或通過 使用DNA聚合酶和適當的引物序列添加互補鏈來獲得雙鏈DNA片段。合成寡核苷酸引物對的方法是本領域公知的。可使用"天然 的"堿基對或合成的堿基對。例如，使用人工核堿基提供了操作引物序列 和產生更復雜的擴增產物混合物的通用方法。各種家族的人工核堿基能 夠通過內部鍵旋轉推定多個氬鍵鍵合方向，以提供簡并分子識別的方法。 將這些類似物并入PCR引物的單個位置允許產生復雜的擴增產物文庫。 參見，例如Hoops， Nucleic Acids Res.， 25:4866-71 ( 1997)。還可使用 非極性分子模擬天然DNA堿基的形狀。腺嘌呤的非氫鍵鍵合形狀模擬物 可有效并選擇性針對胸腺嘧啶的非極性形狀模擬物進行復制(參見，例 如Morales, Nat. Struct. Biol.， 5:950-54 ( 1998))。例如，兩個簡并堿基 可為嘧咬堿基6H，8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-cj[l，2j噁溱-7-酮或嘌呤堿基
N-6-曱氧基-2，6-二氨基嘌呤(參見，例如，Hill, PNAS, 95:4258-63( 1998 ))。 本發明的示例性簡并引物包括核堿基類似物5'-二曱氧基三苯甲基-N-苯 曱酰基-2'-脫氧-胞苷、3'-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)卜亞磷酰胺(序列中 的術語"P",參見上文)。此嗜啶類似物與嘌呤形成包括A和G殘基的氫含于轉位結構域(用于有效的質膜表達)和其余新翻譯多肽 之間的可切割的連接體序列(如因子Xa (參見，例如Ottavi， Biochimie， 80:289-93( 1998 ))、枯草桿菌蛋白酶蛋白酶識別基序(參見，例如Polyak, Protein Eng.， 10:615-19( 1997));腸激酶(Invitrogen, San Diego, Calif.) 等可用于促進純化。例如， 一個構建體可包括連接到六組氨酸殘基的編 碼多肽的核酸序列，接著是疏氧還蛋白、腸激酶切割位點(參見，例如， Williams, Biochemistry, 34:1787-97 ( 1995 ))和C-末端轉位結構域。 所述組氨酸殘基促進檢測和純化，而所述腸激酶切割位點提供從所述融 合蛋白的剩余部分純化所需蛋白的手段。關于編碼融合蛋白的載體的技 術和融合蛋白的應用在科學和專利文獻中已有詳細描述(參見，例如， Kroll、 DNA Cell, Biol，. 12:441-53 (1993 ))。包含配體結合區編碼序列的表達載體(無論是作為單個表達 栽體還是作為表達栽體的文庫)可被導入基因組或導入細胞質或細胞的 核，并可通過科學和專利文獻中已有詳細描述的多種常規技術進行表達。 參見，例如Roberts, Nature, 328:731( 1987); Berger,見上；Schneider, Protein Exper. Purif.， 6435:10 (1995); Sambrook; Tijssen; Ausubel。 來自生物試劑和實驗設備制造商的產品信息也提供有關已知的生物學方 法的信息。所述載體可為從天然來源分離的，從如ATCC或GenBank 文庫的來源獲得或通過合成或重組方法制備的。
核酸可為在細胞中穩定或瞬時表達(例如游離表達系統)的 表達盒、栽體或病毒中進行表達。可將篩選標記物并入表達盒和載體中， 以賦予轉化細胞和序列可選擇的表型。例如，篩選標記物可編碼游離維 持和復制，從而無需整合至宿主基因組。例如所述標記物可編碼抗生素 抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素)或除草劑抗 性(例如綠磺隆(chlorosulfuron )或草丁膦(Basta))，以允許選擇那些 經所需DNA序列轉化的細胞(參見，例如Bkmdelet-Rouault， Gene， 跳.315-17 ( 1997); Aubrecht， J. Pharmacol. Exp. Ther.， 281:992-97 (1997 ))。因為賦予底物(如新霉素或潮霉素)抗性的可選擇標記物基 因僅可用于組織培養，所以也將化學抗性基因用作體外和體內的選擇標 記物。本發明的范圍還包括用于表達本發明的T2R、片段或變體的 宿主細胞。為獲得克隆的基因或核酸(如編碼本發明的T2R、片段或變 體的cDNA)的高水平表達，技術人員通常將感興趣的核酸序列亞克隆 至表達載體，所#達載體含指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子， 和用于翻譯起始的核糖體結合位點(如果是編碼蛋白的核酸)。合適的細 菌啟動子是本領域^^知的，參見例如Sambrook等人。但可使用細菌或 真核表達系統。已將體外結合測定法用于其它GPCR，如代謝型谷氨酸受體 (參見，例如Han和Hampson， J. Biol. Chem. 274:10008-10013( 1999 ))。 這些測定法可能包括替換經放射性或熒光標記的配體，測量內在熒光的 變化或蛋白水解易感性的變化等。在另一個實施方案中，可使用基于熒光偏振("FP")的測
35定法檢測和監控配體結合。熒光偏振是測量平衡結合、核酸雜交和酶活 性的通用實驗室技術。熒光偏振測定法的相同之處在于它們不需要分離 步驟，如離心、過濾、色謙、沉淀或電泳。這些測定是實時、直接在溶 液中進行的，且不需要固定相。偏振值可重復測量，且可在加入試劑后 測量，因為測量偏振很快，且不損壞樣品。 一般而言，此技術可用于測 量從低的皮摩爾至微摩爾水平的熒光團的偏振值。此節描述了如何可使
用熒光偏振以簡單和定量的方式測量配體與本發明的T2R多肽的結合。
旋轉弛豫時間對小分子(例如熒光素)小(大約等于1納秒)， 而對大分子(例如免疫球蛋白)大(大約等于100納秒)。如果粘度和溫度保持恒定，則旋轉弛豫時間和由此偏振與分子體積直接相關。分子體 積的改變可能是由于與其它分子的相互作用、離解、聚合、降解、雜交 或經熒光標記的分子的構象變化。例如熒光偏振已被用于測量蛋白酶、
DNA酶和RNA酶對大的經焚光素標記的聚合物的酶切。它還^皮用于測 量蛋白/蛋白相互作用、抗體/抗原結合和蛋白/DNA結合的平衡結合。 [0143A.固態和溶態高通量測定法合成的聚合物(如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、 聚乙烯亞胺、聚芳硫醚(polyarylene sulfides )、聚硅氧烷、聚酰亞胺和 聚乙酸酯(polyacetate ))也可形成適當的標簽或標簽結合物。本領域技 術人員可通過閱讀本公開明晰，許多其它標簽/標簽結合物對也用于本文 所述測定系統。在另一個實施方案中，可測量轉錄水平以評估被測化合物對 信號轉導的效應。含感興趣的T2R多肽的宿主細胞與被測化合物接觸充 分的時間，以實現任何相互作用，然后測量基因表達的水平。實現此類 相互作用的時間量可根據經驗確定，如通過運行時間過程并將轉錄水平 作為時間函數進行測量。可通過使用本領域的技術人員已知合適的任何 方法測量轉錄量。例如，可使用RNA印記法檢測感興趣的蛋白的mRNA 表達，或可使用免疫測定法鑒定它們的多肽產物。可選地，可用使用報 告基因的基于轉錄的測定法，參見美國專利No. 5,436,128 (通過引用并 入本文)。所述報告基因可為例如氯霉素乙酰轉移酶、熒光素酶、P-半乳 糖普酶、P-內酰胺酶和堿性磷酸酶。此外，可通過將感興趣的蛋白附著 到第二報告分子(如綠色熒光蛋白)而用作間接報告分子(參見，例如 Mistili & Spector, Nature Biotechnology, 15:961-964 ( 1997 ))。"敲除"細胞和動物的構建基于如下前提通過向基因組導入 新的DNA序列(其發揮中斷待抑制基因的DNA序列的某個部分的作 用)，特定基因在哺乳動物細胞中的表達水平可被降低或完全消除。另夕卜， "基因包載插入(gene trap insertion)"可用于破壞宿主基因，且小鼠胚 胎干(ES)細胞可用于產生敲除轉基因動物(參見，例如Holzschu， Transgenic Res 6:97-106 ( 1997))。 一般通過互補核酸序列之間的同源重 組插入外源物。所述外源序列是待修飾的靶基因的某個部分，如外顯子、 內含子或轉錄調控序列或能夠影響靶基因的表達水平的任何基因組序 列，或它們的組合。多能胚胎干細胞中通過同源重組的基因打乾允許技 術人員精確修飾感興趣的基因組序列。可使用任何技術以產生、篩選、 繁殖敲除動物，例如參見Bijvoet， Hum. Mol. Genet. 7:53-62 (1998 ); Meredith, J. Mol. Med. 75:208-216 ( 1997 ); Tojo， Cytotechnology 19:161-165 ( 1995); Mudgett， Methods Mol. Biol. 48:167-184 ( 1995 );
43Longo， Transgenic Res. 6:321-328 ( 1997);美國專利No. 5，616，491; 5,464,764; 5，631，153; 5，487，992; 5,627,059; 5,272,071; WO 91/09955; WO 93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560; WO 91/12650。
01711本發明的核酸還可用作產生"敲除"人細胞及其后代的試劑。 同樣地，本發明的核酸還可用作在小鼠中產生"敲入，，的試劑。人或大鼠 T2R基因序列可替換小鼠基因組中的T2R直向同源物。這樣就產生了表 達人或大鼠T2R的小鼠。此小鼠然后可用于分析人或大鼠T2R的功能， 并鑒定此類T2R的配體。
調節劑在一個實施方案中，高通量篩選方法包括提供含大量潛在的 治療性化合物(潛在的調節劑或配體化合物)的組合化合物或肽文庫。 然后如本文所述在一個或多個測定中篩選此"組合化學文庫"或"配體文 庫"，以鑒定那些表現出所需特征性活性的文庫成員(特定的化合物種類 或亞類)。由此經鑒定化合物可充當常規的"先導化合物"或其自身可用作 潛在的或實際的消費產品。圖1和權利要求書前的序列表中含本文鑒定的新hT2R50單 體型的核苷酸和蛋白序列。從中可看出，圖1所含較長(單體型)形式 的hT2R50蛋白(稱為hT2R50L)比最初鑒定的hT2R50等位基因(這些殘基用加粗和下劃線表示)多出IO個氨基酸，如圖2所示，與最初報 道的單體型(hT2R50)相比，所述10個氨基酸被添加到其C-末端。
[01881如圖2所示，hT2R50L的延長的C-末端序列與其它近緣 hT2R (如hT2R61、 64，和75 )高度同源或相同。迄今獲得的遺傳分析提 示hT2R50L等位基因的相對頻率估計是46%。這是基于發明人的來自 24個體(其中約50%為歐洲血統和50°/。為亞洲血統)的測序數據。
[0189j使用下文描述的體外測定，我們發現hT2R50單體型識別并 響應2種結構上相關的苦味分子(2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪)。這些結果顯 示于圖3。在約5mM的濃度下，這兩種吡嗪化合物均被人品嘗為苦味。 相同的體外測定顯示短和長形式的hT2R50均可響應所述苦味分子，而 近緣的hT2R75和61卻顯示無響應(圖4 )。
hT2R50測定條件
[0190本文新hT2R50單體型及其它hT2R的活化是在檢測胞內鈣 濃度的變化的基于細胞的測定中測量的。簡言之，將人胚胎腎細胞接種 于48孔組織培養板中。24小時后，用含hT2R50單體型或另一個hT2R 核酸序列的質粒和含嵌合G蛋白(G16gust44)的質粒瞬時轉染所述細 胞。再過24小時后，將所述細胞與鈣特異性熒光染料(Fluo-4; Molecular Probes)溫育，所述染料提供用于檢測細胞內釣濃度的變化的快速、簡 單和可靠的基于熒光的方法。T2R活化引起信號級聯，其導致PLC活化 和隨后的胞內鈣濃度升高。此4丐濃度升高改變了細胞內鈣染料的熒光性 質。使用熒光顯微術監控這些變化。
序列表
視紫質轉位結構域的蛋白序列(SEQIDNO: 1) MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV
hT2R50L的DNA和蛋白序列(SEQ ID NO: 2 )
48編碼DNA序列atgataacttttctgcccatcatattttccattctagtagtggttacatttgttattggaaattttgctaatggcttcatagcgttggtaaattccaccgagtgggtgaagagacaaaagatctcctttgctgaccaaattgtcactgctctggcggtctccagagttggtttgctctgggtgttattattaaattggtattcaactgtgttgaatccagctttttgtagtgtagaattaagaactactgcttataatatctgggcagtaaccggccatttcagcaactggcctgctactagcctcagcatattttatttgctcaagattgccaatttctccaaccttatttttcttcgcttaaagaggagagttaagagtgtcattctggtgatgctgttggggcctttgctatttttggcttgtcatctttttgtggtaaacatgaatcagattgtatggacaaaagaatatgaaggaaacatgacttggaagatcaaattgaggcgtgcaatgtacctttcagatacgactgtaaccatgctagcaaacttagtaccctttactgtaaccctgatatcttttctgctgttagtctgttctctgtgtaaacatctcaagaagatgcacctccatggcaaaggatctcaagatcccagtaccaaggtccacataaaagttttgcaaactgtgatctccttcctcttgttatgtgccatttactttgtgtctgtaataatatcagtttggagttttaagaatctggaaaacaaacctgtcttcatgttctgccaagctattggattcagctgttcttcagcccacccgttcatcctgatttggggaaacaagaagctaaagcagacttatctttcagttttgtggcaaatgacgtactgggtgaaagga gagaagccttcatctccataghT2R50單體型蛋白序列(SEQ ID NO: 3)mitflpiif—silVwtfvignfangfialv^stewvkrqkisfadqivtalavsrvgllwvlllnwystvlnpafcsvelrttayniwavtghfsnwpatslsifyllkianfsnliflrlkrrvksvilvmllgpllflachlfvvnmnqivwtkeyeg醒twkiklrramylsdttvtmlanlvpftvtlisflllvcslckhlk腿hlhgkgsqdpstkvhikvlqtvisflllcaiyfvsviisvwsfknlenkpvfmfcqaigfscssahpfiliwgnkklkqtylsvlwqmtywvkgekpssphT2R C-末端序列的比對hT2R50-KLKQTYLSVLWQMRY終止(SEOIDNO: 4) hT2R50L" KLKQTYLSVLWQMTYWVKGEKPSSP終止(SEQ ID NO: 5)hT2R61 — KLKQTFLSVFWQMRYWVKGEKTSSP ( SEQ ID NO: 6)hT2R64 - KLKQTFLSVLRQVRYWVKGEKPSSP ( SEQ ID NO: 7)hT2R75 - KLKQTFLSVLWHVRYWVKGEKPSSS ( SEQ IDNO: 8)雖然本說明書已描述了本發明的幾個實施方案，但應理解，以上描 述僅是例證性的，并不限制所公開的發明。本發明僅受下列權利要求的 限制。
權利要求
1. 編碼苦味受體hT2R50單體型的核酸序列或其變體，所述核酸序列編碼具有SEQ ID NO3所含序列的T2R多肽序列，所述變體編碼與所述T2R多肽序列具有至少90％序列同一性且在其羧基末端含與SEQID NO3所含hT2R50多肽相同的10個氨基酸的T2R多肽。
2. 核酸序列，其編碼SEQIDNO: 3所含多肽。
3. 權利要求2的核酸序列，其包含SEQIDNO: 2所含核酸序列。
4. 表達載體，其含權利要求l的核酸序列。
5. 表達載體，其含權利要求2的核酸序列。
6. 表達栽體，其含權利要求3的核酸序列。
7. 細胞，含權利要求l中任一項的表達載體。
8. 權利要求7的細胞，^選自哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞 和兩棲動物卵母細胞。
9. 權利要求8的哺乳動物細胞，其選自HEK-293細胞、HEK-293T 細月包、CHO細月包、Cos細月包和BHK細月包。
10. 權利要求9的哺乳動物細胞，其是HEK-293細胞。
11. 權利要求8的細胞，其還表達與所述hT2R多肽功能相關的G 蛋白。
12. 權利要求ll的細胞，其中所述G蛋白選自Gal6、 Gal6、味轉 導素、轉導蛋白或包含其部分的嵌合G蛋白。
13. 包含hT2R50單體型的多肽或其變體，所述多肽具有SEQID NO: 3所含多肽序列，所述變體與所述多肽具有至少卯％序列同一性且 特異性響應2-乙酰吡溱或乙基吡溱。
14. 權利要求13的多肽，其包含SEQIDNO: 3所含序列。
15. 測定法，其用于鑒定調節特異性響應2-乙酰吡喚或乙基吡溱的 人hT2R50苦味受體的化合物，所述受體選自SEQ ID NO: 3所含hT2R50 單體型多肽、或與所述hT2R50單體型具有相同的氨基酸序列但缺乏最 后10個羧基氨基酸的hT2R50多肽、或與所述序列具有至少90%序列同一性且特異性響應2-乙酰吡，秦或乙基吡，秦的hT2R50多肽變體，所述測 定法包括i. 篩選作用于2-乙酰吡嗪或乙基吡嗪或在結構上相關并誘導所述 hT2R多肽的活化的化合物，和ii. 確定所述化合物是否基于其對所述受體被所述吡溱或結構上相 關的化合物活化的作用而調節hT2R50相關的苦味。
16. 權利要求15的測定法，其中所述hT2R50味覺受體在分離的細 胞膜中表達。
17. 權利要求15的測定法，其中所述hT2R50味覺受體在完整的細 胞中表達。
18. 權利要求15的測定法，其中所述hT2R50味覺受體在真核細胞 中表達。
19. 權利要求15的測定法，其中所述hT2R50味覺受體由兩棲動物、 哺乳動物或昆蟲細胞表達。
20. 權利要求15的測定法，其中所述味覺受體在選自HEK293、 BHK、 COS、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母細胞的細胞中表達。
21. 權利要求15的測定法，其是熒光測定法。
22. 權利要求15的測定法，其是結合測定法。
23. 權利要求15的測定法，其通過測定所述化合物對胞內離子濃度 的作用來檢測對所述化合物的作用。
24. 權利要求23的測定法，其檢測所述化合物對胞內鈉或4丐的作用。
25. 權利要求15的測定法，其檢測所述化合物對細胞膜電位的作用。
26. 權利要求15的測定法，其檢測所述化合物對所述味覺受體轉錄 的作用。
27. 權利要求15的測定法，其中所述化合物是根據其阻斷所述吡溱 化合物對所述hT2R50味覺受體的活化或與其相互作用的能力篩選的。
28. 4又利要求15的測定法，其檢測所述化合物對胞內cAMP、 cGMP 或IP3的作用。
29. 權利要求15的測定法，其中所述hT2R味覺受體包含所述hT2R味覺受體的胞外結構域或跨膜區。
30. 權利要求15的測定法，其中所述測定法使用鈣特異性熒光染料 檢測釣的變化。
31. 庫又利要求15的測定法，其中所述測定法^使用選自Fluo-3、 Fhio-4 和Fura-2的染料檢測胞內鉀的變化。
32. 權利要求15的測定法，其中所述味覺受體是在溶液中。
33. 權利要求15的測定法，其是檢測光譜特征、流體動力學特征或 溶解度的變化的結合測定法。
34. 權利要求15的測定法，其檢測所述化合物對所述hT2R50味覺 受體與G蛋白的復合的作用。
35. 權利要求15的測定法，其檢測所述化合物對所述味覺受體與選自轉導蛋白、味轉導素、Gw5和Goa6的G蛋白的復合的作用。
36. 權利要求15的測定法，其是熒光偏振測定法。
37. 權利要求15的測定法，其中所述hT2R50味覺受體多肽附著于 固相基質。
38. 權利要求15的測定法，其是高通量測定法。
39. 權利要求15的測定法，其中所述hT2R50味覺受體多肽由 HEK293細胞表達。
40. 權利要求30的測定法，其中所述測定法使用選自Fluo-3、 Fluo-4 和Fura-2的染料檢測胞內4丐的變化。
41. 權利要求30的測定法，其中所述味覺受體是在溶液中。
42. 權利要求30的測定法，其是檢測光鐠特征、流體動力學特征或 溶解度的變化的結合測定法。
43. 權利要求30的測定法，其檢測所述化合物對所述味覺受體與G 蛋白的復合的作用。
44. 權利要求30的測定法，其檢測所述化合物對所述味覺受體與選自轉導蛋白、味轉導素、Gw5和Ga,6的G蛋白的復合的作用。
45. 權利要求30的測定法，其是熒光偏振測定法。
46. 權利要求30的測定法，其中所述味覺受體附著于固相基質。
47. 權利要求30的測定法，其是高通量測定法。
48. 權利要求30的測定法，其中所述味覺受體由HEK293細胞表達。
49. 分離的味覺或胃腸細胞，其表達具有在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 2所含DNA序列特異性雜交的核酸序列的T2R單體型多肽，且 所述T2R單體型多肽結合于特異性地與SEQ ID NO: 3所含T2R50單 體型肽相結合的苦味配體。
50. 權利要求49的分離的味覺或胃腸細胞，其中所述細胞包含SEQ ID: NO: 2所含DNA序列。
51. 鑒定調節人T2R50單體型多肽的活性的化合物的方法，所述方 法包括使權利要求49或50的味覺或胃腸細胞與潛在的T2R調節化合物T2R的活性，和/或通過另一種化合物影響所述人T2R的特異性結合或 活化。
52. 篩選具有T2R50單體型的個體的方法，所述方法包括對個體進 行基因檢測，并測定所述個體是否包含SEQ ID NO: 2所含hT2R50序列。
53. 篩選測定法，其包括使表達如SEQ ID NO: 3所示的hT2R50 單體型多肽序列的細胞與推定的調節化合物接觸，并檢測調節所述 T2R50單體型的活性的化合物。
54. 檢測與T2R50單體型表達相關的差異的方法，所述方法包括鑒 定特異性結合和/或活化hT2R50但不特異性結合和/或活化其他hT2R50 單體型的化合物。
55. T2R配體篩選測定法，所述測定法包括接觸表達SEQIDNO: 3所含任一種hT2R50單體型多肽的細胞，并鑒定特異性活化所述 hT2R50序列的化合物。
56. 權利要求55的測定法，所述測定法進一步包括檢驗所述配體對 涉及舌或胃腸系統中表達T2R的細胞的味覺和/或胃腸或消化功能的作 用。
全文摘要
本發明涉及T2R味覺受體家族中響應特定苦味配體即2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪的人味覺受體hT2R50的新單體型的發現。本發明還涉及此新單體型在用于鑒定調節hT2R50味覺受體活化的配體的測定中的用途。這些化合物潛在地可用作食品、飲料和藥品中的添加劑，以改變(阻斷)hT2R50相關的苦味。
文檔編號C07H21/04GK101522702SQ200780038215
公開日2009年9月2日 申請日期2007年9月5日 優先權日2006年9月5日
發明者A·普洛寧, 宏 徐, 李曉東 申請人:塞諾米克斯公司