專利名稱：：針對ErbB2的人抗體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗ErbB2抗體，特別是人抗體，以及用于制備和使用抗ErbB2抗體例如以治療癌癥的方法。
背景技術：
：受體酪氨酸激酶的ErbB家族是細胞生長、分化和存活的重要介質。受體家族包括4個不同成員，包括表皮生長因子受體(EGFR或ErbBl)、HER2(ErbB2或pl85neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。由erbBl基因編碼的EGFR已有原因地與人惡性腫瘤有牽連。特別地，EGFR增加的表達已在乳腺、膀胱、肺、頭、頸和胃癌以及成膠質細胞瘤中觀察到。增加的EGFR受體表達通常與EGFR配體——轉化生長因子a(TGF-a)經由相同肺瘤細胞增加的生產相關，導致經由自分泌刺激途徑的受體活化(Baselga和Mendelsohn,Pharmac.Ther.64:127-154(1994))。針對EGFR或其配體TGF-a和EGF的單克隆抗體已評估為此種惡性腫瘤治療中的治療劑。參見例如，Baselga和Mendelsohn,同上；Masui等人CancerResearch44:1002-1007(1984);和Wu等人J.Clin.Invest.95:1897-1905(1995)。ErbB家族的第二個成員pl85neu最初鑒定為來自用化學方法處理的大鼠的成神經細胞瘤的轉化基因的產物。激活型neu原癌基因起因于編碼蛋白質的跨膜區中的點突變(纈氨酸至谷氨酸)。neu的人同源物(homolog)的擴增在乳腺和卯巢癌中觀察到且與預后不良關聯(Slamon等人，Science,235:177-182(1987);Slamon等人，Science,244:707-712(1989);和美國專利號4,968,603)。迄今為止，對于人腫瘤尚未報道與neu原癌基因中的那種類似的點突變。ErbB2的超表達(通常但并非一致地由于基因擴增)也已在其他癌中觀察到，包括胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰和膀胱癌。其中參見King等人，Science,229:974(1985);Yokota等人，Lancet:1:765-767(1986);Fukushige等人,MolCellBiol.，6:955-958(1986);Guerin等人，OncogeneRes.，3:21-31(1988);Cohen等人，Oncogene,4:81-88(1989);Yonemura等人，CancerRes.，51:1034(1991);Borst等人，Gynecol.Oncol.,38:364(1990);Weiner等人，CancerRes.,50:421-425(1990);Kern等人，CancerRes.，50:5184(1990);Park等人，CancerRes.，49:6605(1989);Zhau等人，Mol.Carcinog.，3:254-257(1990);Aasland等人Br.J.Cancer57:358-363(1988);Williams等人Pathobiology59:46-52(1991);和McCann等人，Cancer,65:88-92(19卯)。ErbB2可能在前列腺癌中超表達(Gu等人CancerLett.99:185-9(1996);Ross等人Hum.Pathol.28:827-33(1997);Ross等人Cancer79:2162-70(1997);和Sadasivan等人J.Urol.150:126-31(1993))。針對大鼠pi85neu和人ErbB2蛋白質產物的抗體已得到描述。Drebin及同事已產生針對大鼠neu基因產物pl85neu的抗體。參見例如，Drebin等人，Cell41:695-706(1985);Myers等人，Meth.Enzym.198:277-290(1991);和W094/22478。Drebin等人Oncogene2:273-277(1988)報道與pl85neu的2個不同區域反應的抗體的混合物導致對植入棵鼠內的neu轉化的NIH-3T3細胞的抗腫瘤作用。還參見于1998年10月20日授權的美國專利號5,824，311。Hudziak等人,Mol.Cell.Biol.9(3):1165-1172(1989)描述了使用人乳腺腫瘤細胞系SK-BR-3進行表征的一組抗ErbB2抗體的產生。暴露于抗體后SK-BR-3細胞的相對細胞增殖通過72小時后單層的結晶紫染色來測定。使用這種測定，用稱為4D5的抗體獲得最大抑制，所述4D5使細胞增殖抑制56%。該組中的其他抗體在這個測定中使細胞增殖減少至較小的程度。進一步發現抗體4D5使ErbB2超表達乳腺肺瘤細胞系對TNF-a的細胞毒性作用變得敏感。還參見于1997年10月14日授權的美國專利號5,677,171。Hudziak等人中討論的抗ErbB2抗體在下述參考文獻中進一步得到表征Fendly等人CancerResearch50:1550-1558(1990);Kotts等人/"v"ra26(3):59A(1990);Sarup等人GrowthRegulation1:72-82(1991);Shepard等人J.Clin.Immunol.11(3):117-127(1991);Kumar等人Mol.Cell.Biol.11(2):979-986(1991);Lewis等人CancerImmunol.Immunother.37:255-263(1993);Pietras等人Oncogene9:1829-1838(1994);Vitetta等人CancerResearch54:5301-5309(1994);Sliwkowski等人J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994);Scott等人J.Biol.Chem.266:14300-5(1991);D'souza等人Proc.Natl.Acad.Sci.91:7202-7206(1994);Lewis等人CancerResearch56:1457-1465(1996);和Schaefer等人Oncogene15:1385-1394(1997)。鼠抗ErbB2抗體4D5的重組人源化形式(huMAb4D5-8、rhuMAbHER2或HERCEPTIN;美國專利號5,821,337)在具有ErbB2超表達轉移性乳腺癌的患者中是臨床活性的，所述患者已接受廣泛的先前抗癌治療(Baselga等人，J.Clin.Oncol.14:737-744(1996))。HERCEPTIN⑧接受1998年9月25日來自食品與藥物管理局(FoodandDrugAdministration)用于治療具有轉移性乳腺癌的患者的銷售批準，所述肺瘤超表達ErbB2蛋白質。Tagliabue等人Int.J.Cancer47'.933-937(1991);McKenzie等人Oncogene4:543-548(1989);Maier等人CancerRes.51:5361-5369(1991);Bacus等人MolecularCarcinogenesis3:350-362(1990);Stancovski等人PNAS(USA)88:8691-8695(1991);Bacus等人CancerResearch52:2580-2589(1992);Xu等人Int.J.Cancer53:401-408(1993);WO94/00136;Kasprzyk等人CancerResearch52:2771-2776(1992);Hancock等人CancerRes.54575-4580(1991);Shawver等人CancerRes.54:1367-1373(1994);Arteaga等人CancerRes.54:3758-3765(1994);Harwerth等人J.Biol.Chem.267:15160-15167(1992);美國專利號5,783,186;和Klapper等人Oncogene14:2099-2109(1997)。同源性篩選已導致2個其他ErbB受體家族成員的鑒定；ErbB3(美國專利號5,183,884和5,480,968以及Kraus等人PNAS(USA)86:9193-9197(1989))和ErbB4(EP專利申請號599,274;Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993);和Plowman等人，Nature,366:473-475(1993))。這2種受體在至少一些乳腺癌細胞系上展示出增加的表達。ErbB受體在細胞中一般以各種組合發現，并且異二聚化被認為增加對于多種ErbB配體的細胞應答的多樣性(Earp等人BreastCancerResearchandTreatment35:115-132(1995))。EGFR由至少6種不同配體結合；表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子a(TGF-a)、雙調蛋白、肝素結合性表皮生長因子(HB-EGF)、卩細胞素(betacellulin)和表皮調節素(Groenen等人GrowthFactors11:235-257(1994))。起因于單個基因的可變剪接的調蛋白(heregulin)蛋白質家族是關于ErbB3和ErbB4的配體。調蛋白家族包括a、卩和y調蛋白(Holmes等人，Science，256:1205-1210(1992);美國專利號5,641,869;和Schaefer等人Oncogene15:1385-1394(1997));neu分化因子(NDFs)、狡質生長因子(GGFs);乙酰膽石咸受體誘導活性(ARIA);以及感覺和運動神經元衍生因子(SMDF)。關于綜述，參見Groenen等人GrowthFactors11:235-257(1994);Lemke,G.Molec.&Cell.Neurosci.7:247-262(1996)和Lee等人Pharm.Rev.47:51-85(1995)。近來鑒定了3種另外的ErbB配體；報道與ErbB3或ErbB4結合的神經調節蛋白-2(NRG-2)(Chang等人Nature387509-512(1997);和Carraway等人Nature387:512-516(1997));結合ErbB4的神經調節蛋白-3(Zhang等人PNAS(USA)94(18):9562-7(1997));和結合ErbB4的神經調節蛋白-4(Haran等人Oncogene18:2681-89(1999))HB-EGF、(3細胞素和表皮調節素也與ErbB4結合。雖然EGF和TGFa不結合ErbB2,但EGF刺激EGFR和ErbB2以形成異二聚體，這激活EGFR且導致異二聚體中的ErbB2的轉磷酸作用。二聚化和/或轉磷酸作用看起來激活ErbB2酪氨酸激酶。參見Earp等人，同上。同樣，當ErbB3與ErbB2共表達時，形成活性信號傳導復合物且針對ErbB2的抗體能夠破壞這種復合物(Sliwkowski等人，丄Biol.Chem.，269(20):14661-14665(1994))。此外，當與ErbB2共表達時，ErbB3對于調蛋白(HRG)的親和力增加至更高的親和力狀態。關于ErbB2-ErbB3蛋白質復合物，還參見Levi等人，JournalofNeuroscience15:1329-1340(1995);Morrissey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:1431-1435(1995);和Lewis等人，CancerRes.,56:1457-1465(1996)。ErbB4如同ErbB3，與ErbB2形成活性信號傳導復合物(Carraway和Cantley,Cell78:5-8(1994))。HER-2/neu原癌基因的產物HER2是酪氨酸激酶受體的人表皮生長因子受體(HER)家族的第二個成員，且已提議為配體孤兒受體。HER2和另一種HER家族成員HER1、HER3或HER4之間的配體依賴性異二聚化，激活HER2信號傳導途徑。HER2的細胞內信號傳導途徑被認為涉及ras-MAPK和PI3K途徑，以及MAPK不依賴性S6激酶和磷脂酶C-y信號傳導途徑(Graus-Porta等人，MolCellBiol.1995March;15(3):1182—1191;Grant等人，FrontBiosci.2002Feb1;7:d376-89)。HER2信號傳導還影響促血管生成(proangiogenic)因子，血管內皮生長因子(VEGF)和白細胞介素-8(IL-8)以及抗血管生成因子，血小板反應蛋白-1(TSP-1)。內源性表達低水平的HER2的MCF-7和T-47D乳腺癌細胞中HER2的再表達導致VEGF和IL-8升高的表達以及TSP-1減少的表達。用人源化抗HER2抗體(司徒曼布或Herc印tin⑧)或針對HER2的逆轉錄病毒介導的小干擾RNA(siHER2)抑制HER2減少表達高水平的HER2的BT474乳腺癌細胞中的VEGF和IL-8表達，但增加TSP-1表達。HER2信號傳導因此經由不同的信號傳導途徑來影響促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡。司徒曼布至少部分通過HER2-p38-TSP-l途徑的活化和HER2-PI3K-AKT-VEGF/IL-8途徑的抑制來抑制血管生成和腫瘤生長(Wen等人，Oncogene.2006May22;Epub)。此外，ErbB2膜RTK通過直接使Cdc2磷酸化可以賦予對于紫杉醇誘導的凋亡的抗性(Tan等人，MolCell.2002May;9(5):993-1004)。發明概述本發明的某些實施方案在下文描述。在一個實施方案中，本發明包含與ErbB2特異性結合的靶向結合劑，例如人單克隆抗體或其抗原結合部分。靶向結合劑可以具有至少一種下述性質(a)與人細胞結合；(b)與表達獼猴ErbB2的細胞結合；(c)與Herceptin⑧部分竟爭但不與2C4竟爭；(d)以小于50ng/ml的EC50抑制MCF7細胞中的ErbB2磷酸化；(e)以小于50ng/ml的EC50抑制SKBR3細胞中的細胞增殖；(f)以13.5nM或更小的KD與ErbB2結合；或(g)具有關于ErbB2的2.14x10-4s-l或更小的解離速率(koff)。在另一個實施方案中，靶向結合劑以13.5nM或更小的KD結合ErbB2且抑制ErbB的活化。在另一個實施方案中，所述耙向結合劑是抗體。在一個實施方案中，所述抗體是人源化的、嵌合的或人單克隆抗體或其抗原結合部分。在另一個實施方案中，本發明包含與人ErbB2特異性結合且抑制人ErbB2的把向結合劑，例如人源化的、嵌合的或人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述靶向結合劑具有選自下述的至少一種性質(a)與選自下述的抗體竟爭與ErbB2的結合:1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、U8.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44,1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)與選自下述的抗體竟爭與ErbB2的結合:1,44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(c)與選自下述的抗體結合相同的ErbB2表位1.44.1、1.140、1.43、114.1、1.100.1、1.%、1.18.1、1.20、1.39、.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(d)以與選自下述的抗體基本上相同的KD與ErbB2結合1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71,31.44.1、1.140、1.43、.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;和(e)以與選自下述的抗體基本上相同的解離速率與ErbB2結合1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18,1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在另一個實施方案中，所述靶向結合劑是抗體。在另一個實施方案中，所迷抗體是人源化的、嵌合的或人單克隆抗體或其抗原結合部分。在另一個實施方案中，本發明包含特異性結合ErbB2的靶向結合劑，例如單克隆抗體或其抗原結合部分，其中(a)靶向結合劑包含選自下述的抗體的重鏈CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)靶向結合劑包含選自下述的抗體的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.%、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、].140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;和(c)靶向結合劑包含(a)的重鏈和(b)的輕鏈；或(c)的靶向結合劑，其中重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列選自相同抗體。在另一個實施方案中，所述靶向結合劑是抗體。在另一個實施方案中，所述抗體是人源化的、嵌合的或人單克隆抗體或其抗原結合部分。在另一個實施方案中，單克隆抗體或其抗原結合部分進一步包括SEQIDNO:46中所示的重鏈氨基酸序列、SEQIDNO:47中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者。在另一個實施方案中，本發明的單克隆抗體或其抗原結合部分可以來自任何同種型。在另一個實施方案中，本發明的人單克隆抗體或其抗原結合部分包括利用人VH3-21基因、人VH3-7基因、人VH4-31基因或人VH3-13基因的重鏈。在另一個實施方案中，本發明的人單克隆抗體或其抗原結合部分包括利用人VH3-21基因、人VH3-7基因、人VH4-31基因或人VH3-13基因的重鏈。在另一個實施方案中，本發明的人單克隆抗體或其抗原結合部分包括利用人VKB3基因、人VKL1基因、人VKA2基因或人VKAl基因的輕鏈。在另一個實施方案中，本發明的人單克隆抗體或其抗原結合部分包括進一步包含利用人VKB3基因、人VKL1基因、人VKA2基因或人VKAl基因的輕鏈的抗體或部分。在另一個實施方案中，本發明的人單克隆抗體或其抗原結合部分的VL結構域、VH結構域或兩者在氨基酸序列中與下述的單克隆抗體的VL結構域、VH結構域或兩者分別至少90%等同1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.441、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在另一個實施方案中，本發明包括特異性結合ErbB2的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體包含選自下述的抗體的FR1、FR2、FR3或FR4氨基酸序列中的一個或多個1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、l.訓.l、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在另一個實施方案中，本發明包括人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體包括(a)與下述的單克隆抗體的重鏈氨基酸序列至少90%等同的重鏈氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)與下述的單克隆抗體的輕鏈氨基酸序列至少90%等同的輕鏈氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;或(a)和(b)兩者。在另一個實施方案中，本發明包括本文描述的人單克隆抗體或抗原結合部分，其中所述抗原結合部分選自Fab、Fab，、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、和互補性決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv或scFv2)、嵌合抗體、雙抗體、雙特異性抗體和這樣的多肽，其包含足以賦予與多肽特異性抗原結合的抗體的至少部分。在另外一個實施方案中，本發明包括包含本文描述的靶向結合劑，例如抗體或抗原結合部分和藥學上可接受的載體的組合物。組合物可以進一步包含另外的治療或診斷劑。在一個實施方案中，組合物進一步包括特異性結合ErbB2的第二種抗體，其中所述第二種抗體不與選自下述的抗體竟爭與ErbB2的結合1.14.1、1.18.1、1.20.1、1.24.3、1.39.1、1.71.3、1.96.2、1.100.1和1.140.1。在另外一個實施方案中，本發明包括生產本文描述的靶向結合劑、抗體或抗原結合部分或者所述抗體或所述部分的重鏈或輕鏈的分離的細胞系。在另外一個實施方案中，本發明包括包含核苦酸序列的分離的核酸分子，所述核苷酸序列編碼重鏈或其抗原結合部分、輕鏈或其抗原結合部分或兩者。分離的核酸可以包括選自下述的核苷酸序列(a)SEQIDNO:1的核苦酸序列；(b)編碼SEQIDNO:2的核苦酸序列；(c)SEQIDNO:3的核苷酸序列；(d)編碼SEQIDNO:4的核苷酸序列；(e)SEQIDNO:5的核苦酸序列；(f)編碼SEQIDNO:6的核苷酸序列；(g)SEQIDNO:7的核苷酸序列；(h)編碼SEQIDNO:8的核苷酸序列；(i)SEQIDNO:9的核普酸序列；(j)編碼SEQIDNO:IO的核苷酸序列；(k)SEQIDNO:ll的核苷酸序列；(1)編碼SEQIDNO:12的核苷酸序列；(m)SEQIDNO:13的核普酸序列；(n)編碼SEQIDNO:14的核苦酸序列；(o)SEQIDNO:15的核苷酸序列；(p)編碼SEQIDNO:16的核苷酸序列；(q)SEQIDNO:17的核苷酸序列；(r)編碼SEQIDNO:18的核香酸序列；(s)SEQIDNO:19的核苷酸序列；(t)編碼SEQIDNO:20的核香酸序列；(u)SEQIDNO:21的核苦酸序列；(v)編碼SEQIDNO:22的核苷酸序列；(w)SEQIDNO:23的核苦酸序列；(x)編碼SEQIDNO:24的核苦酸序列；(y)SEQIDNO:25的核苷酸序列；(z)編碼SEQIDNO:26的核苷酸序列；(aa)SEQIDNO:27的核苷酸序列；(bb)編碼SEQIDNO:28的核普酸序列；(cc)SEQIDNO:29的核普酸序列；(dd)編碼SEQIDNO:30的核苷酸序列；(ee)SEQIDNO:31的核苷酸序列；(ff)編碼SEQIDNO:32的核苷酸序列；(gg)SEQIDNO:33的核普酸序列；(hh)編碼SEQIDNO:34的核普酸序列；(ii)SEQIDNO:35的核苦酸序列；(jj)編碼SEQIDNO:36的核苷酸序列；(kk)SEQIDNO:37的核苦酸序列；(11)編碼SEQIDNO:38的核香酸序列；(mm)SEQIDNO:39的核苷酸序列；(nn)編碼SEQIDNO:40的核苷酸序列；(00)SEQIDNO:41的核苦酸序列；(pp)編碼SEQIDNO:42的核普酸序列;(qq)SEQIDNO:43的核普酸序列;和(rr)編碼SEQIDNO:44的核苷酸序列。本發明進一步包括包含本文描述的核酸分子的載體，其中所述載體任選包含與核酸分子可操作地連接的表達控制序列。在另一個實施方案中，本發明包括包含本文描述的載體或核酸分子的宿主細胞。在另一個實施方案中，本發明包括用于生產本文描述的靶向結合劑、單克隆抗體或抗原結合部分的方法，其包括在合適的條件下培養本文描述的宿主細胞或細胞系和回收所述抗體或抗原結合部分的步驟。本發明進一步包括包含本文描述的核酸的非人轉基因動物或轉基因植物，其中所述非人轉基因動物或轉基因植物表達所述核酸。本發明還包括用于分離與人ErbB2特異性結合的抗體或其抗原結合部分的方法。該方法包括從非人轉基因動物或轉基因植物中分離抗體的步驟。在另一個實施方案中，本發明包括用于制備與ErbB2特異性結合的人單克隆抗體的方法，其包括下述步驟(1)用ErbB2、ErbB2的免疫原性部分或者表達ErbB2的細胞或組織免疫能夠生產人抗體的非人轉基因動物；(ii)允許轉基因動物發動(mount)針對ErbB2的免疫應答；和(iii)回收抗體。在另一個實施方案中，本發明包括用于治療、預防或減輕有此需要的受試者中ErbB2介導的病癥的癥狀的方法，其包括給所述受試者施用本文描述的靶向結合劑、抗體或抗原結合部分或組合物的步驟，其中所述靶向結合劑、抗體或抗原結合部分抑制ErbB2。在另外一個方面，本發明包括用與ErbB2特異性結合的靶向結合劑，例如抗體或其抗原結合部分用于治療、預防或減輕有此需要的受試者中ErbB2介導的病癥例如癌癥的癥狀的方法，其包4舌下述步驟(i)施用有效量的編碼重鏈或其抗原結合部分的分離的核酸分子，編碼靶向結合劑例如輕鏈或其抗原結合部分的分離的核酸分子，或編碼抗體的輕鏈和重鏈或其抗原結合部分的核酸分子兩者；和(b)表達核酸分子。ErbB2介導的病癥可以選自乳腺、膀胱、肺、頭、頸、前列腺、胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、曱狀腺、胰癌和成膠質細胞瘤。在另一個實施方案中，本發明包括抑制有此需要的受試者中表達ErbB2的癌細胞增殖的方法，所述方法包括給所述受試者施用本文描述的耙向結合劑，例如抗體或抗原結合部分或組合物的步驟，其中所述靶向結合劑抑制ErbB2。在另一個實施方案中，所述結合靶向劑是抗體。在另一個實施方案中，所述抗體是人源化的、嵌合的或人單克隆抗體或其抗原結合部分。在另一個實施方案中，本發明包括用于抑制表達ErbB2的例如受試者的細胞或癌細胞中的ErbB2活性的方法，其包括使細胞與本文描述的把向結合劑或組合物接觸，其中細胞中的ErbB2活性選自(a)ErbB2的磷酸化；(b)MAPK途徑的活化；(c)PI3K途徑的活化；(d)CDC2的抑制；和(e)其組合。在一個實施方案中，ErbB2的磷酸化(phophorylation)#皮抑制48小時。在另一個實施方案中，所述靶向結合劑是抗體。在另一個實施方案中，所述抗體是人源化的、嵌合的或人單克隆抗體或其抗原結合部分。在另一個實施方案中，本發明包括用于調節表達ErbB2的細^^中的ErbB2活性的方法，其包括使細胞與本文描述的抗體或抗原結合部分或組合物接觸，其中細胞中的ErbB2活性是p38-TSP-l途徑的活化。在一個實施方案中，抗原結合部位可以包含在所7>開的CDRs內具有多至20、16、10、9或更少，例如1、2、3、4或5個氨基酸添加、置換、缺失和/或插入的抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的任何一個的重鏈CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2和CDR3。此種修飾可以在CDRs內的任何殘基處潛在地進行制備。在另一個實施方案中，靶向結合劑或抗體可以包括包含如表4、4(a)和/或表5中所示的CDR1、CDR2或CDR3序列的任何1、2、3、4、5或6個的序列。在另一個實施方案中，靶向結合劑或抗體可以包括包含如表4和/或4(a)中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一個實施方案中，靶向結合劑或抗體可以包括包含如表5中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一個實施方案中，靶向結合劑或抗體可以包括包含如表4或3(a)中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列以及如表5中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。注意到本領域普通技術人員可以容易地實現CDR測定。參見例如，Kabat等人，iSe《we/7c'es。/尸n9"/"5o/7wwwo/og7ca//"&r^st,第5片反,NIHPublication91-3242，BethesdaMD(1991),第l陽3巻，或如本文定義的。在另一個實施方案中，靶向結合劑或抗體可以包括包含如表4、4(a)或表5中所示的，全人單克隆抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的任何一個的CDR1、CDR2和CDR3序列的任何1、2、3、4、5或6個的序列。在一個實施方案中，靶向結合劑或抗體可以包括包含如表4和4(a)中所示的，全人單克隆抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一個實施方案中，耙向結合劑或抗體可以包括包含如表5中所示的，全人單克隆抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一個實施方案中，靶向結合劑或抗體可以包括包含如表4和4(a)中所示的全人單克隆抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及如表5中所示的全人單克隆抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1,71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、UOO.l、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。附圖簡述圖1是描述在1小時(Y軸)和24小時(X軸)預溫育后，在MCF7細胞中152雜交瘤上清液對調蛋白誘導的ErbB2磷酸化的作用的相關性的圖。圖2是LA/HAELISA分析的數據圖。Y軸指出當31ng/mlhErbB2(ECD)/cMyc-His包被在ELISA板上時，OD值中的結合信號。X軸指出當10pg/mlErbB2(ECD)/cMyc-His包被在ELISA板上時，衍生自HAELISA的雜交瘤上清液中ErbB2特異性抗體的濃度。圖3A-3C顯示在MCF7細胞中調蛋白誘導的ErbB2磷酸化中關于本發明的10種抗ErbB2單克隆抗體(B和C)和對照抗體(A)的劑量應答曲線。圖4A-4C顯示在MCF7細胞的調蛋白誘導的增殖中關于本發明的10種抗ErbB2單克隆抗體(B和C)和對照抗體(A)的劑量應答曲線。圖5A和5B顯示在BT474細胞增殖測定中關于本發明的8種抗ErbB2單克隆抗體(B)和對照抗體(A)的劑量應答曲線。圖6A和6B顯示在SKBR3細胞增殖測定中關于本發明的8種抗ErbB2單克隆抗體(B)和對照抗體(A)的劑量應答曲線。圖7A-7C顯示在使細胞與mAbs溫育24、48、72或96小時后，總ErbB2磷酸化對mAb1.18.1(A)、Herceptin(B)和2C4(C)的劑量依賴性應答。圖8A-8C顯示在使細胞與mAbs溫育24、48、72或96小時后，標準化ErbB2磷酸化對mAb1.18.1(A)、Herceptin(B)和2C4(C)的劑量依賴性應答。圖9A和9B顯示指出在ELISA中本發明的測試抗體不與2C4(B)或Herceptin(A)竟爭ErbB2結合的竟爭裝箱(binning)的結果。發明詳述定乂和一襲戎術除非本文另有定義，與本發明結合使用的科學和技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括復數，并且復數術語應包括單數。一般地，與本文描述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質和核用的那些。除非另有說明，本發明的方法和技術一般根據本發明眾所周知的以及如本說明書自始至終引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻中描述的常規方法來進行。參見例如，引入本文作為參考的Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和A腿bel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992)和Harlow和LaneAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990)。酶促反應和純化技術根據制造商的說明書、如本領域通常完成或如本文描述的來進行。與本文描述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學結合使用的術語以及其實驗室程序和技術是本領域眾所周知且通常使用的那些。標準技術用于化學合成、化學分析、藥物制備、配制和遞送以及受試者的治療。每種抗體都已給予包括由1個或2個小數點分開的2個或3個數字的識別號碼。在一些情況下，制備一種抗體的幾個克隆。許多克隆具有不同的識別號碼，盡管它們具有與親本序列相同的核酸和氨基酸序列，它們也可以分開列舉。因此，例如關于下迷的核酸和氨基酸序列是相同的1.44.1=1.44.2=1.44.3=1.44;1.124=1.148=1.140=1.140.1;1.41=1.43=143.1=143.2=1.22.1;1.14.1=1.4.2=.4.3=1.14;1.100.1=1.100.2=1.100.3-1.100;1.107=1.104=].128—.96-1.99=1.96.2;1.18.1=1.18.2=1.18.3=1.18;1.20=1.19=1.20.1;1.39=1.39.1=1.39.2=1.39.3;1.24=1.22.2=1,71.1=1.24.3;1.71.2=1.71.3。除非另有說明，下述術語應理解為具有下述含義術語"多肽"包含天然或人工蛋白質、蛋白質片段和蛋白質序列的多肽類似物。多肽可以是單體或聚合的。術語"分離的蛋白質"、"分離的多肽"或"分離的抗體"是這樣的蛋白質、多肽或抗體，其由于其起源或衍生來源(1)不與在其天然狀態中伴隨其的天然結合組分結合，(2)不含來自相同物種的其他蛋白質，(3)由來自不同物種的細胞表達，或(4)在自然界中不存在。因此，與其天然4合的組分";離;的"。蛋白質k可以通過使用本領域眾所周知的蛋白質純化技術分離而使得基本上不含天然結合的組分。分離的抗體的例子包括已使用ErbB2親和純化的抗ErbB2抗體、已通過雜交瘤或其他細胞系體外合成的抗ErbB2抗體、和衍生自轉基因小鼠的人抗ErbB2抗體。靶向結合劑還可以使用本文描述的類似技術進行純化。如本文所使用的，術語"多肽片段"指具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但其中剩余氨基酸序列等同于天然存在的序列中的相應位置的多肽。在一些實施方案中，片段長至少5、6、8或10個氨基酸。在其他實施方案中，片,殳長至少14,至少20，至少50,或至少70、80、90、100、150或200個氨基酸。如本文所使用的，術語"調節"指途徑的任何量的抑制或活化。在某些實施方案中，關于抗ErbB2抗體或其抗原結合部分的氨基酸置換是這樣的，其(1)減少對于蛋白酶解的易感性，(2)減少對于氧化的易感性，(3)改變用于形成蛋白質復合物的結合親和力，和(4)賦予或修飾此種類似物的其他物理化學或功能性質，但仍保留與ErbB2變蛋白質。例如，單個;多個氨基酸置換，優選地保守氨基酸置換可以在天然存在的序列，優選在形成分子間接觸的一個或多個結構域外的多肽部分中進行。保守氨基酸置換不應相當大地改變親本序列的結構特征；例如，替代氨基酸不應改變構成親本序列中存在的免疫球蛋白結合結構域的反平行p折疊、或破壞表征親本序列的其他類型的二級結構。一般而言，甘氨酸和脯氨酸將不在反平行p折疊中使用。領域公認的多肽二級和三級結構的例子在引入本文作為參考的Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton,編輯,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C.Branden和J.Tooze，編輯，GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));和Thornton等人，Nature354:105(1991)中得到描述。非肽類似物在制藥工業中通常作為具有與模板肽的那些類似的性質的藥物使用。這些類型的非肽化合物稱為"肽才莫擬物(peptidemimetics)"或"擬肽(peptidomimetics)"。Fauchere，J.Adv.DrugRes.15:29(1986);Veber和Freidinger,TINS第392頁(1985);和Evans等人，J.Med.Chem.30:1229(1987),引入本文作為參考。此種化合物通常借助于計算機化的分子建模來開發。在結構上類似于治療上有用的肽的肽模擬物可以用于產生等價治療或預防作用。一般地，擬肽在結構上類似于范例多肽(即，具有所需生物化學性質或藥理學活性的多肽)，例如人抗體，但具有通過本領域眾所周知的方法任選由選自下述的鍵替代的一個或多個肽鍵—CH2NH.....CH2S.....CH2-CH2.....CH=CH—(順式和反式)、—COCH2.....CH(〇H)CH2—和一CH2SO—。用相同類型的D-氨基酸系統置換共有序列的一個或多個氨基酸(例如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)還可以用于產生更穩定的肽。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列變異的限制肽可以通過本領域已知的方法來產生(Rizo和G跳sch,Ann.Rev.Biochem.61:387(1992),引入本文作為參考)；例如，通過添加能夠形成使肽環化的分子內二石克4定的內部半胱氨酸殘基。當就本發明而言在本文中提及"抗體"時，通常認為還可以使用其抗原結合部分。抗原結合部分與完整抗體竟爭特異性結合。一般參見，FundamentalImmunology,第7章(Paul，W.，編輯，第2版RavenPress,N.Y.(1989))(為了所有目的整體引入作為參考)。抗原結合部分可以通過重組DNA技術或者通過完整抗體的酶促或化學切割來產生。在一些實施方案中，抗原結合部分包括Fab、Fab，、F(ab，)2、Fd、Fv、dAb、和互補性決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv或scFv2)、嵌合抗體、雙抗體、雙特異性抗體和這樣的多肽，其包含足以賦予與多肽特異性抗原結合的抗體的至少部分。從N末端到C末端，成熟的輕和重鏈可變結構域都包含區域FRl、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。關于本文每個結構域的氨基酸的指定依月氛Kabat,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987和1991)),Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia等人，Nature342:878-883(1989)的定義。如本文所使用的，由數字提及的抗體與得自相同數字的雜交瘤的單克隆抗體相同。例如，單克隆抗體1.18是與得自雜交瘤1*18,或其亞克隆的那種相同的抗體。亞克隆由進一步的小數鑒定，例如1.18.1。如本文所使用的，Fd片段意指由VH和CHI組成的抗體片段；Fv片段由抗體的單臂的VL和VH結構域組成；并且dAb片段(Ward等人，Nature341'.544-546(1989))由VH結構域組成。在一些實施方案中，抗體是其中VL和VH結構域經由合成接頭配對以形成單價分子的單鏈抗體(scFv),所述合成接頭使得其能夠作為單條蛋白質鏈制備。(Bird等人，Science242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988).)在一些實施方案中，抗體是雙抗體，即這樣的二價抗體，其中VH和VL結構域在單條多肽鏈上表達，但使用太短以致于不允許相同鏈上的2個結構域之間配對的接頭，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對且產生2個抗原結合部位。(參見例如，HolligerP.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯6444-6448(1993)和PoljakR.J.等人，Structure2:1121-1123(1994)。)在一些實施方案中，來自本發明的抗體的一個或多個CDRs可以共價或非共價摻入分子內，以使得它成為與ErbB2特異性結合的免疫粘附素。在此種實施方案中，一個或多個CDR可以作為較大的多肽鏈的部分摻入，可以與另一條多肽鏈共價連接，或可以非共價摻入。在具有一個或多個結合部位的實施方案中，結合部位可以彼此相同或可以是不同的。如本文所使用的，術語"人抗體"意指其中可變和恒定結構域序列是人序列的任何抗體。該術語包含具有衍生自人基因的序列的抗體，但其已改變例如以減少可能的免疫原性、增加親和力、消除可能引起不希望的折疊的半胱氨酸等。該術語包含在非人細胞中重組生產的此種抗體，其可能賦予非人細胞特有的糖基化。如下文描述的，這些抗體可以以多種方式進行制備。如本文所使用的，術語"嵌合抗體"意指包含來自2種或更多不同抗體的區域的抗體。在一個實施方案中，嵌合抗體的一個或多個CDRs衍生自人抗ErbB2抗體。在另一個實施方案中，所有CDRs衍生自人抗ErbB2抗體。在另一個實施方案中，來自超過一種人抗ErbB2抗體的CDRs在嵌合抗體中進行組合。例如，嵌合抗體可以包含來自第一種人抗ErbB2抗體的輕鏈的CDR1、來自第二種人抗ErbB2抗體的輕鏈的CDR2和來自第三種人抗ErbB2抗體的輕鏈的CDR3,并且來自重鏈的CDRs可以衍生自一種或多種其他抗ErbB2抗體。此外，構架區可以衍生自從其中獲取一個或多個CDRs的抗ErbB2抗體之一或者衍生自一種或多種不同的人抗體。在一些實施方案中，本發明的嵌合抗體是人源化的抗ErbB2抗體。本發明的人源化的抗ErbB2抗體包含一個或多個構架區的氨基酸序列和/或來自本發明的一種或多種人抗ErbB2抗體的恒定區的至少部分的氨基酸序列和衍生自非人抗ErbB2抗體的CDRs。如本文所使用的，"抑制抗體"(在本文中也稱為"拮抗抗體")意指當加入表達ErbB2的細胞、組織或生物中時，使一種或多種ErbB2活性抑制至少約30%的抗體。在一些實施方案中，抗體使ErbB2活性抑制至少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或超過100%。在一些實施方案中，抑制抗體在配體例如調蛋白的存在下加入。在一些實施方案中，本發明的拮抗抗體使ErbB2的至少一種活性減少5倍。抗體的"結合片段"通過重組DNA技術或者通過完整抗體的酶促或化學切割來產生。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab，)2、Fv、dAb和單鏈抗體。除"雙特異性"或"雙功能"抗體外的抗體被理解為其結合部位的每一個相同。當過量抗體使與反受體結合的受體量減少至少約20%、40%、60%或80%,并且更通常超過約85%時(如在體外竟爭結合測定中測量的)，抗體相當大地抑制受體與反受體的粘附。抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物可以由本領域普通技術人員根據本說明書的教導容易地制備。片段或類似物優選的氨基和羧基末端存在于功能結構域的邊界附近。結構和功能結構域可以通過核苷酸和/或氨基酸序列數據與公開的或私有的序列數據庫比較進行鑒定。優選地，計算機化的比較法用于鑒定存在于已知結構和/或功能的其他蛋白質中的序列基序或預測的蛋白質構象結構域。鑒定折疊成已知三維結構的蛋白質序列的方法是已知的。參見Bowie等人，Science253.'164(1991)。已顯示整個抗體的片段可以執行結合抗原的功能。結合片段的例子是(Ward,E.S.等人，(1989)Nature341,544-546)由VL、VH、CL和CH1結構域組成的Fab片段；(McCafferty等人(1990)Nature,348，552-554)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(Holt等人(2003)TrendsinBiotechnology21,484-490)由單個抗體的VL和VH結構域組成的Fv片段；(iv)由VH或VL結構域組成的dAb片段(Ward,E.S.等人，Nature341,544-546(1989)，McCafferty等人(1990)Nature,348,552-554,Holt等人(2003)TrendsinBiotechnology21,484-490];(v)分離的CDR區；(vi)F(ab')2片段——包含2個連接的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中VH結構域和VL結構域由允許2個結構域結合以形成抗原結合部位的肽接頭連接(Bird等人,(1988)Science,242，423-426,,Huston等人，(1988)PNASUSA,85，5879-5883);(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)通過基因融合構建的"雙抗體"，多價或多特異性片段(WO94/13804;Holliger，P.(1993)等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,)。Fv、scFv或雙抗體分子可以通過摻入連接VH和VL結構域的二硫鍵得到穩定(Reiter,Y.等人,NatureBiotech,14，1239-1245,1996)。還可以制備包含與CH3結構域連接的scFv的微型抗體(minibodies)(Hu,S.等人，(1996)CancerRes.,56,3055-3061)。結合片段的其他例子是Fab，，其通過在重鏈CHI結構域的羧基末端處添加少數殘基而不同于Fab片段，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸，和Fab，-SH,這是其中恒定結構域的一個或多個半胱氨酸殘基具有游離巰基的Fab，片段。如本文所使用的，"抑制性靶向結合劑"意指當加入表達ErbB2的細胞、組織或生物中時，使一種或多種ErbB2活性抑制至少約30。/。的靶向結合劑。在一些實施方案中，靶向結合劑使ErbB2活性抑制至少約40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或超過100%。在一些實施方案中，抑制性靶向結合劑在配體例如調蛋白的存在下加入。在一些實施方案中，本發明的靶向結合劑使ErbB2的至少一種活性減少5倍。如本文所使用的，術語"表面等離振子共振"指通過檢測生物傳感器基質內的蛋白質濃度中的改變而允許分析實時雙特異性相互作用的光學現象，例如使用BIACORETM系統(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N.J.)。關于進一步的描述,參見JonssonU.等人，Ann.Biol.Clin.51:19-26(1993);JonssonU.等人，Biotechmques11:620-627(1991);Jo賜onB.等人，J.Mol.Recognit.8:125-131(1995);和JohnssonB.等人,Anal.Biochem.198:268-277(1991)。術語"KD"指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。術語"表位"包括能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合或者以其他方式與分子相互作用的任何蛋白質決定簇。表位決定簇一般由分子的化學活性表面原子團(groupings)例如氨基酸或碳水化合物或糖側鏈組成，且一般具有特定三維結構特征以及特定電荷特征。表位可以是"線性的"或"構象的"。在線性表位中，蛋白質和相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用點沿著蛋白質的一級氨基酸序列線性發生。在構象表位中，相互作用的點跨越彼此分開的蛋白質上的氨基酸殘基發生。當解離常數^lmM、優選Sl00nM且最優選^10nM時，抗體^皮說成特異性結合抗原。在某些實施方案中，KD是lpM-500pM。在其他實施方案中，KD是500pM-lnM。在其他實施方案中，KD是1pM-lOOnM在其他實施方案中，KD是100mM-10nM。一旦測定抗原上的所需表位，就可能產生針對那個表位的抗體，例如使用本發明中描述的技術。可替代地，在開發過程期間，抗體的產生和表征可以闡明關于所需表位的信息。根據這個信息，隨后可能竟爭性篩選與相同表位結合的抗體。實現這點的方法是進行交叉竟爭研究以發現彼此竟爭結合的抗體，例如竟爭與抗原的結合的抗體。用于基于其交叉竟爭"裝箱"抗體的高通量方法在國際專利申請號WO03/48731中得到描述。如本文所使用的，20種常規氨基酸及其縮寫遵循常規用法。參見引入本文作為參考的Immunology-ASynthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren,編輯，SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))。如本文提及的，術語"多核苷酸"意指長度至少10個堿基的聚合形式的核苦酸，其為核糖核苷酸或脫氧核苷酸，或經修飾形式的任一類型的核苷酸。該術語包括單鏈和雙鏈形式。如本文所使用的，術語"分離的多核苦酸"意指基因組、cDNA或合成起源或其一些組合的多核苷酸，其由于其起源"分離的多核苷酸"(1)不與"分離的多核苷酸"在自然界中與之一起發現的多核苷酸的全部或部分結合，(2)與其在自然界中不與之連接的多核苷酸可操作地連接，或(3)在自然界中不作為較大序列的部分存在。如本文所使用的，術語"天然存在的核苷酸"包括脫氧核糖核普酸和核糖核苷酸。如本文所使用的，術語"經修飾的核苷酸"包括具有經修飾的或取代的糖基等的核苷酸。本文提及的術語"寡核普酸鍵"包括這樣的寡核苷酸鍵，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二竭代磷酸酉旨(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基碌酸酉旨(phosphoroamidate)等。參見例如，LaPlanche等人,Nucl.AcidsRes.14:9081(1986);Stec等人，J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984);Stem等人，Nucl.AcidsRes.16:3209(1988);Zon等人，Anti-CancerDrugDesign6:539(1991);Zon等人，OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,第87-108頁(F.Eckstein,編輯，OxfordUniversityPress,OxfordEngland(1991));美國專利號5,151,510;Uhlmann和Peyman,ChemicalReviews90:543(1990),其的公開內容在此引入作為參考。若需要，寡核苷酸可以包括用于檢測的標記。"可操作地連接的"序列包括與目的基因鄰接的表達控制序列和反式或隔開一段距離起作用以控制目的基因的表達控制序列。如本文所使用的，術語"表達控制序列"意指實現它們與之連接的編碼序列的表達和加工所必需的多核普酸序列。表達控制序列包括合適的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號例如剪接和多腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(即Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；以及需要時，增強蛋白質分泌的序列。此種控制序列的性質依賴于宿主生物而不同；在原核生物中，此種控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中，一般地，此種控制序列包括啟動子和轉錄終止序列。術語"控制序列，，意欲最低限度包括其存在是表達和加工所必需的所有組分，并且還可以包括其存在是有利的另外組分，例如前導序列和融合配偶體序列。如本文所使用的，術語"載體"意指能夠轉運它已與之連接的另一種核酸的核酸分子。在一些實施方案中，載體是質粒，即另外的DNA區段可以連接到其中的DNA的環狀雙鏈部分。在一些實施方案中，載體是病毒載體，其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組內。在一些實施方案中，載體能夠在它們引入其內的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。在其他實施方案中，載體(例如非附加型哺乳動物載體)在引入宿主細胞內后可以整合到宿主細胞的基因組內，并且因此連同宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導它們與之可操作地連接的基因的表達。此種載體在本文中稱為"重組表達載體"(或簡單地"表達載體")。如本文所使用的，術語"重組宿主細胞"(或簡單地"宿主細胞")意指重組表達載體已引入其內的細胞。應當理解"重組宿主細胞"和"宿主細胞"不僅意指特定受試細胞，還意指此種細胞的后代。因為由于突變或環境影響某些修飾可能在隨后的世代中發生，所以此種后代事實上可能不等同于親本細胞，但仍包括在如本文所使用的術語"宿主細胞"的范圍內。本文提及的術語"選擇性雜交"意指可檢測地且特異性地結合。依照本發明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在這樣的雜交和洗滌條件下與核酸鏈選擇性雜交，所述雜交和洗滌條件使與非特異性核酸的可檢測結合的可估計量降到最低。如本領域已知的和本文討論的，"高嚴格性"或"高度嚴格，，條件可以用于達到選擇性雜交條件。"高嚴格性"或"高度嚴格"條件的一個例子是多核苷酸與另一種多核苷酸的溫育，其中一種多核苷酸可以與固體表面例如膜附著，在6XSSPE或SSC、50%曱酰胺、5XDenhardt，s試劑、0.5%SDS、100嗎/ml變性的、斷裂的鮭精DNA的雜交緩沖液中在42。C的雜交溫度下12-16小時，隨后為于55。C使用IXSSC、0.5%SDS的洗滌緩沖液洗滌2次。還參見Sambrook等人，同上，第9.50-9.55頁。術語"CDR區"或"CDR"意指免疫球蛋白的重和輕鏈的高變區，如由Kabat等人1991(Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.USDepartmentofHealthandHumanServices,PublicService,NIH，Washington)和隨后版本定義的或如本文定義的。抗體一般包含3個重鏈CDRs和3個輕鏈CDRs。根據情況，術語CDR或CDRs在本文中用于指這些區域之一，或這些區域中的幾個或甚至全部，其包含通過抗體對于它識別的抗原或表位的親和力負責結合的大多數氨基酸殘基。在6個短CDR序列中，重鏈的第3個CDR(HCDR3)具有更大的尺寸變異性(基本上由于產生其的基因的排列機制更大的多樣性)。它可以短至2個氨基酸，盡管已知的最大尺寸是26。CDR長度還可以根據可以由特定潛在構架容納的長度而變。在功能上，HCDR3在抗體的特異性的決定中部分起作用(Segal等人，PNAS,71:4298-4302,1974,Amit等人,Science,233:747-753,1986，Chothm等人,J.Mol.Biol.，1%:901-917，1987,Chothm等人，Nature,342:877-883，1989,Caton等人，J.Immunol.,144:1965-1968,1990，Sharon等人，PNAS，87:4814-4817,1990，Sharon等人，J.Immunol.,144:4863-4869，1990，Kabat等人，丄Immunol.,147:1709-1719，1991)。在本文中提及的術語"CDRs組"包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDRs組指HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且LCDRs組指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有說明，"CDRs組"包括HCDRs和LCDRs。在核苷酸序列的背景中的術語"百分比序列同一性"意指當就最大對應比對時2個序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度可以在至少約9個核苷酸的序列段(stretch)上，通常至少約18個核苷酸，更通常至少約24個核苷酸，一般至少約28個核苦酸，更一般至少約32個核苦酸，且優選至少約36、48或更多核苷酸。存在可以用于測量核苦酸序列同一性的本領域已知的許多不同算法。例如，多核苷酸序列可以使用FASTA、Gap或Bestfit進行比4交，其是WisconsinPackageVersion10.0，GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wisconsin中的程序。包括例如程序FASTA2和FASTA3的FASTA提供查詢和搜索序列之間的最佳重疊區域的比對和百分比序列同一性(Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990);Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000);Pearson,MethodsEnzymol.266:227-258(1996);Pearson,J.Mol.Biol.276:71-84(1998);引入本文作為參考)。除非另有說明，使用關于特定程序或算法的缺省參數。例如，核苷酸序列之間的百分比序列同一性可以使用FASTA與其缺省參數(字長6和NOPAM因子用于評分矩陣)或使用Gap與其缺省參數進行測定，如引入本文作為參考的GCGVersion6.1中提供的。除非另有說明，提及核苷酸序列包含其互補物。因此，提及具有特定序列的核酸應理解為包含其互補鏈，與其互補序列。如本文所使用的，術語"百分比序列同一性"和"百分比序列同源性"可互換使用。當提及核酸或其片段時，術語"相當大相似性"或"相當大序列相似性"意指當以合適的核苦酸插入或缺失與另一種核酸(或其互補鏈)最佳比對時，存在至少約85%，優選至少約90%,和更優選至少約95%、96%、97%、98%或99%核普酸堿基的核苷酸序列同一性，如通過序列同一性的任何眾所周知的算法測量的，例如FASTA、BLAST或Gap,如上文討i侖的。當應用于多肽時，術語"相當大同一性"意指當例如通過程序GAP或BESTFIT使用如由程序提供的缺省缺口權重最佳比對時，2個肽序列共享至少70%、75%或80%序列同一性，優選至少90%或95%序列同一性，且更優選至少97%、98%或99%序列同一性。在某些實施方案中，不同的殘基位置由于保守氨基酸置換而不同。"保守氨基酸置換"是其中氨基酸殘基由具有帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)的側鏈R基團的另一個氨基酸殘基置換的那種。一般而言，保守氨基酸置換將基本上不改變蛋白質的功能性質。在其中2個或更多氨基酸序列由于保守置換而彼此不同的情況下，百分比序列同一性可以向上調整以校正置換的保守性質。用于進行這種調整的方法是本領域技術人員眾所周知的。參見，例如Pearson,MethodsMol.Biol.243:307-31(1994)。具有帶有類似化學性質的側鏈的氨基酸基團的例子包括1)脂族側鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂族-羥基側鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺側鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族側鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側鏈天冬氨酸和谷氨酸；和7)含石克側鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置換基團是綴氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守置換是在引入本文作為參考的Gonnet等人，Science256:1443-45(1992)中公開的PAM250對數似然矩陣中具有陽性值的任何改變。"適度保守"置換是在PAM250對數似然矩陣中具有非負值的任何改變。關于多肽的序列同一性一般使用序列分析軟件進行測量。蛋白質分析軟件使用對于各種置換、缺失和其他修飾包括保守氨基酸置換指定的相似性測量來匹配序列。例如，GCG包含程序例如"Gap"和"Bestfit",其可以與如由程序指定的缺省參數一起使用，以測定緊密相關多肽例如來自不同生物物種的同源多肽之間或野生型蛋白質及其突變蛋白質之間的序列同源性或序列同一性。參見，例如，GCGVersion6.1(UniversityofWisconsin,WI)。多肽序列還可以使用FASTA使用缺省或推薦參數進行比較，參見GCGVersion6.1。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢和搜索序列之間的最佳重疊區域的比對和百分比序列同一性(Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990);Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000))。當比較本發明的序列與包含來自不同生物的大量序列的數據庫時，另一種優選算法是計算機程序BLAST,特別是blastp或tblastn,其使用如由程序提供的缺省參數。參見，例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990);Altschul等人，NucldcAcidsRes.25:3389-402(1997)。就同源性進行比較的多肽序列的長度一般將是至少約16個氨基酸殘基，通常至少約20個殘基，更通常至少約24個殘基，一般至少約28個殘基，且優選超過約35個殘基。當搜索包含來自大量不同生物的序列的數據庫時，優選比較氨基酸序列。如本文討論的，抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的較少變異預期由本發明包含，前提是氨基酸序列中的變異維持與本文描述的抗體或免疫球蛋白分子至少75%，更優選至少80%、90%、95%,且最優選99%的序列同一性。特別地，預期保守氨基酸置換。保守置換是在具有相關側鏈的氨基酸家族內發生的那些。遺傳編碼的氨基酸一般分成下述家族(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電極性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優選的家族是絲氨酸和蘇氨酸是脂族-輕基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂族家族；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族家族。例如，預期亮氨酸由異亮氨酸或纈氨酸、天冬氨酸由谷氨酸、蘇氨酸由絲氨酸獨立的置換，或氨基酸由結構上相關的氨基酸的相似置換對所得到的分子的結合功能或性質將沒有較大的作用是合理的，特別是若置換不涉及構架位點內的氨基酸的話。氨基酸改變是否導致功能肽可以通過測定多肽衍生物的比活性容易地進行測定。測定在本文中詳細描述。抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物可以由本領域普通技術人員容易地制備。片段或類似物優選的氨基和羧基末端存在于功能結構域的邊界附近。結構和功能結構域可以通過核苷酸和/或氨基酸序列數據與公開的或私有的序列數據庫比較進行鑒定。優選地，計算機化的比較法用于鑒定存在于已知結構和/或功能的其他蛋白質中的序列基序或預測的蛋白質構象結構域。鑒定折疊成已知三維結構的蛋白質序列的方法是已知的。Bowie等人，Science253:164(1991)。因此，前述例子證實本領域技術人員可以識別可以用于限定與本文描述的抗體一致的結構和功能結構域的序列基序和結構構象。抗原結合部位一般由可變重(VH)和可變輕(VL)免疫球蛋白結構域形成，具有由6個表面多肽環形成的抗原結合界面，稱為互補性決定區(CDRs)。在每個VH(HCDR1,HCDR2,HCDR3)和每個VLLCDR1,LCDR2，LCDR3)中存在3個CDRs,連同構架區(FRs)。一般地，VH結構域與VL結構域配對以提供抗體抗原結合部位，盡管VH或VL結構域單獨可以用于結合抗原。VH結構域(參見表4)可以與VL結構域(參見表5)配對，從而使得形成包含VH和VL結構域兩者的抗體抗原結合部位。提供了關于本文公開的其他VH和VL結構域的類似實施方案。在其他實施方案中，表4中的VH鏈與表5中的異源VL結構域配對。輕鏈混亂是本領域非常確定的。此外，本發明提供了關于本文公開的其他VH和VL結構域的類似實施方案。因此，親本或表4上的任何抗體鏈的VH可以與親本或表5上的任何抗體或者其他抗體的VL配對。抗原結合部位可以包含在所公開的H和/或LCDRs組內具有多至20、16、10、9或更少，例如l、2、3、4或5個氨基酸添加、置換、缺失和/或插入的親本抗體或表1中的任何抗體的H和/或LCDRs組。可替代地，抗原結合部位可以包含在所公開的H和/或LCDRs組內具有多至20、16、10、9或更少，例如l、2、3、4或5個氨基酸置換的親本抗體或表1中的任何抗體的H和/或LCDRs組。此種修飾可以在CDRs組內的任何殘基處潛在地進行制備。優選的氨基酸置換是這樣的，其(1)減少對于蛋白酶解的易感性，(2)減少對于氧化的易感性，(3)改變用于形成蛋白質復合物的結合親和力，(4)改變結合親和力，和(4)賦予或修飾此種類似物的其他物理化學或功能性質。類似物可以包括除天然存在的肽序列外的序列的各種突變蛋白質。例如，單個或多個氨基酸置換(優選地保守氨基酸置換)可以在天然存在的序列(優選在形成分子間接觸的一個或多個結構域外的多肽部分中進行。保守氨基酸置換不應相當大地改變親本序列的結構特征(例如，替代氨基酸不應傾向于斷裂親本序列中存在的螺旋、或破壞表征親本序列的其他類型的二級結構)。領域公認的多肽二級和三級結構的例子在引入本文作為參考的Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton,編輯,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C.Branden牙口J.Tooze，編輯，GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));和Thornton等人，Nature354:105(1991)中得到描述。本發明的進一步方面是包含VH結構域的抗體分子，所述VH結構域與表1中列出的任何抗體、附加序列表、本文描述的抗體的VH結構域或者與表4或表4(a)中所示的HCDR(例如HCDR1、HCDR2或HCDR3)具有至少約60、70、80、85、90、95、98或約99%氨基酸序列同一性。抗體分子可以任選還包含與表1中列出的任何抗體、附加序列表、本文描述的抗體的VL結構域或者與表5中所示的LCDR(例如LCDR1、LCDR2或LCDR3)具有至少約60、70、80、85、90、95、98或約99%氨基酸序列同一性的VL結構域。可以用于計算2個氨基酸序列的％同一性的算法包含例如BLAST(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:405-410),FASTA(Pearson和Lipman(1988)PNASUSA85:2444-2448),或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.MolBiol.147:195-197),例如使用缺省參數。此外，本發明的VH和VL結構域以及CDRs的變體，包括關于其在本文中列出氨基酸序列且可以在關于ErbB2的耙向結合劑和抗體中使用的那些，可以借助于序列改變或突變的方法且篩選具有所需特征的抗原靶向來獲得。所需特征的例子包括但不限于相對于對于抗原特異的已知抗體增加的關于抗原的結合親和力；相對于對于抗原特異的已知抗體增加的抗原活性中和，如果活性已知的話；以特定摩爾比與已知抗體或配體對抗原特定的竟爭能力；免疫沉淀復合物的能力；與特定表位結合的能力；線性表位，例如使用如本文描述的肽結合掃描鑒定的肽序列，例如使用以線性和/或限定構象篩選的肽；由不連續殘基形成的構象表位；調節ErbB2或下游分子的新生物活性的能力。此種方法也在本文中提供。，、二乂、。、、，、、f,'量數據分析技術應用于結構/性質-活性關系中的計算化學的引導下(Wold,等人Multivariatedataanalysisinchemistry.Chemometrics—MathematicsandStatisticsinChemistry(鄉扁壽專B.Kowalski),D,ReidelPublishingCompany,Dordrecht,Holland,1984),抗體的定量活性-性質關系可以使用眾所周知的數學技術來獲得，例如統計學回歸、模式識另'J和分類(Norman等人AppliedRegressionAnalysis.Wiley-Interscience;第3版(April1998);Kandel,Abraham&Backer,Eric.Computer-AssistedReasoninginClusterAnalysis.PrenticeHallPTR,(Mayll,1995);Krzanowski,Wojtek.PrinciplesofMultivariateAnalysis:AUser'sPerspective(OxfordStatisticalScienceSeries,No22(Paper)).OxfordUniversityPress;(December2000);Witten,IanH.&Frank,Eibe.DataMining:PracticalMachineLearningToolsandTechniqueswithJavaImplementations.MorganKaufmann;(October11,1999);DenisonDavidG.T.(編輯)，ChristopherC.Holmes,BaniK.Mallick,AdrianF.M.Smith.BayesianMethodsforNonlinearClassificationandRegression(WileySeriesinProbabilityandStatistics).JohnWiley&Sons;(July2002);Ghose,Ar叩K.&Viswanadhan,VellarkadN.CombinatorialLibraryDesignandEvaluationPrinciples,Software,Tools,andApplicationsinDrugDiscovery)。抗體的性質可以衍生自抗體序列的經驗和理論模型(例如，可能接觸的殘基的分析或計算的物理化學性質)、功能和三維結構，并且這些性質可以單獨和組合加以考慮。序列-結構關系的這種研究可以用于預測具有已知序列但是三維結構未知的抗體中的那些殘基，所述殘基在維持其CDR環的三維結構且因此維持結合特異性中是重要的。這些預測可以通過比較預測與來自前導最優化實驗的結果得到支持。在結構方法中，使用任何免費可用或商業包例如WAM可以制備抗體分子的模型。蛋白質顯現和分析軟件包例如InsightII(Accelrys,Inc.)或DeepView隨后可以用于評估在CDR中每個位置上的可能置換。這種信息隨后可以用于制備對活性可能具有最低限度或有利作用的置換。在CDRs、抗體VH或VL結構域和/或靶向結合劑的氨基酸序列內制備置換所需的技術通常是本領域可用的。可以制備具有可能預期對活性具有或不具有最低限度或有利作用的置換的變體序列，且就結合靶和/或中和靶的能力和/或就任何其他所需性質進行測試。其序列在本文中具體公開的任何VH和VL結構域的可變結構域氨基酸序列變體可以依照本發明而使用，如討論的。如本文所使用的，術語"標記"或"標記的"指在抗體或靶向結合劑上摻入另一種分子。在一個實施方案中，標記是可檢測標記，例如摻入放射性標記的氨基酸或與可以通過標記的抗生物素蛋白(例如包含可以通過光學或比色法進行檢測的熒光標記或酶促活性的鏈霉抗生物素蛋白)進行檢測的生物素化部分的多肽附著。在另一個實施方案中，標記或標志可以是治療性的，例如藥物綴合物或毒素。標記多肽和糖蛋白的各種方法是本領域已知的且可以使用。用于多肽的標記的例子包括但不限于下述放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、32P、33P、35S、90Y、99Tc、lllln、1251、1311),熒光標記(例如，FITC、羅丹明、鑭系元素磷光體)，酶促標記(例如，辣根過氧化物酶、(3-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)，化學發光標記，生物素化基團，由次級報道分子識別的預定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、關于第二抗體的結合部位、金屬結合結構域、附加表位)，磁性試劑，例如釓螯合物，毒素例如百日咳毒素，紫杉醇，細胞松弛素B,短桿菌肽D,溴化乙錠，依米丁，絲裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷(tenoposide),長春新堿，長春堿，秋水仙堿，阿霉素，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)，米托蒽醌，光輝霉素，放線菌素D，1-去氬睪酮，糖皮質激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同源物。在一些實施方案中，標記通過各種長度的間隔臂進行附著以減少可能的位阻。如本文所使用的，"耙向結合劑"是與耙位點優先結合的試劑，例如抗體或其結合片段。在一個實施方案中，耙向結合劑對唯——個靶位點特異。在其他實施方案中，靶向結合劑對于超過一個靶位點特異。在一個實施方案中，耙向結合劑可以是單克隆抗體且靶位點可以是表位。如下文描述的，粑向結合劑可以包含抗體的至少一個抗原結合結構域，其中所述結構域與異源蛋白質支架融合或包含在異源蛋白質支架內，所述異源蛋白質支架例如非抗體蛋白質支架。在本說明書和權利要求自始至終，單詞"包含"或其變體應當理解為暗示包括所述的整數或整數組但不排除任何其他整數或整數組。人抗ErbB2抗體及其表征在一個實施方案中，本發明提供了抗ErbB2靶向結合劑。在另一個實施方案中，本發明提供了抗ErbB2抗體。在一些實施方案中，抗ErbB2抗體是人抗體。在一些實施方案中，本發明提供了不含信號序列氨基酸l-22與人ErbB2結合的抗ErbB2抗體(GenbanklD:P04626)(SEQIDNO:45)。在一些實施方案中，人抗ErbB2抗體通過免疫非人轉基因動物例如嚙齒類動物來產生，所述非人轉基因動物的基因組包含人免疫球蛋白基因，從而使得轉基因動物生產人抗體。本發明的抗ErbB2抗體可以包含人k或人X輕鏈或由其衍生的氨基酸序列。在包含k輕鏈的一些實施方案中，輕鏈可變結構域(VL)部分由人VK1、VK2或VK4家族基因編碼。在某些實施方案中，輕鏈利用人VKA1、VKA2、VKB3或VKL1基因。在各種實施方案中，輕鏈可變結構域利用人A2基因和人JK1基因；人L1基因和人JK5基因；人B3基因和人JK3基因；或人A1基因和人JK4基因。在一些實施方案中，ErbB2抗體的VL包含相對于人基因的種系氨基酸序列的一個或多個氨基酸置換。在一些實施方案中，抗ErbB2抗體的VL包含相對于種系氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個氨基酸置換。在一些實施方案中，抗ErbB2抗體的VL包含相對于種系氨基酸序列的0、1或2個氨基酸插入。在一些實施方案中，來自種系的那些置換中的一個或多個在輕鏈的CDR區中。在一些實施方案中，相對于種系的氨基酸置換在一個或多個與下述抗體的VL中的任何一個或多個中相對于種系的置換相同的位置處1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。例如，本發明的抗ErbB2抗體的VL可以包含與抗體1.14的VL中發現的種系相比較的一個或多個氨基酸置換，或與抗體1.18的VL中發現的種系相比較可以存在一個或多個氨基酸置換。在一些實施方案中，氨基酸改變在一個或多個相同位置處，但涉及與參考抗體中不同的置換。在一些實施方案中，相對于種系的氨基酸改變在與下述抗體的任何VL中相同的位置中的一個或多個處發生1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3,但改變可以表示相對于參考抗體中的氨基酸在此種位置處的保守氨基酸置換。例如，如果這些抗體之一中的特定位置相對于種系改變且是谷氨酸，那么人們可以在那個位置處置換天冬氨酸。類似地，如果與種系相比較的氨基酸置換是絲氨酸，那么人們可以用蘇氨酸保守地置換那個位置處的絲氨酸。保守氨基酸置換在上文進行討論。在一些實施方案中，人抗ErbB2抗體的輕鏈包含抗體1.44.l(SEQIDNO:4)、1.140(SEQIDNO:8)、1.43.1(SEQIDNO:12)、1.14.1(SEQIDNO:16)、1.100.1(SEQIDNO:20)、1.96.2(SEQIDNO:24)、1.18.1(SEQIDNO:28)、1.20.1(SEQIDNO:32)、1.39.1(SEQIDNO:36)、1.24.3(SEQIDNO:40)、1.71.3(SEQIDNO:44)的VL氨基酸序列，或具有最高達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個保守氨基酸置換和/或總共最高達3個非保守氨基酸置換的所述氨基酸序列。在某些實施方案中，抗ErbB2抗體的輕鏈包含抗體的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，所述抗體包含選自抗體1.44.1(SEQIDNO:4)、1.140(SEQIDNO:8)、1.43.KSEQIDNO:12)、1.14.KSEQIDNO:16)、1.100.1(SEQIDNO:20)、1.96.2(SEQIDNO:24)、1,18.1(SEQIDNO:28)、1.20.1(SEQIDNO:32)、1.39.1(SEQIDNO:36)、1.24.3(SEQIDNO:40)、1.71.3(SEQIDNO:44)的抗體的VL區的氨基酸序列，或各自具有小于4個或小于3個保守氨基酸置換和/或總共3個或更少的非保守氨基酸置換的所述CDR區。就重鏈而言，在一些實施方案中，可變結構域(VH)部分由人VH3或VH4家族基因編碼。在某些實施方案中，重鏈VH利用人VH3-21、VH3-13、VH4-31或VH3-7基因。在各種實施方案中，重鏈VH利用人VH3-21基因、人D5-24基因和人JH4B基因。在其他實施方案中，重鏈VH利用人VH3-7基因和人JH6;人VH4-31基因、人D3-10基因和人JH6B基因；或人VH3-13基因、人D6-19基因和人JH6B基因。在一些實施方案中，抗ErbB2抗體的VH序列包含相對于種系氨基酸序列的一個或多個氨基酸置換、缺失或插入(添加)。在一些實施方案中，重鏈的可變結構域包含來自種系氨基酸序列的1、2、3、4、5、6或7個突變；其中的0、1、2或3個可以是置換。在一些實施方案中，重鏈的可變結構域包含與種系氨基酸序列相比較的0、1、2或3個添加。在一些實施方案中，一個或多個突變是與種系氨基酸序列相比較的非保守置換。在一些實施方案中，突變在重鏈的CDR區中。在一些實施方案中，氨基酸改變在與下述抗體的VH中的任何一個或多個中來自種系的突變相同的位置中的一個或多個處進行1.14.1、1.18.1、U9、1.20.1、1.22.1、1.22.2、1.24.3、1.41、1.43.1、143.2、1.44.1、1.39.1、1.71.1、1.71.3、1.96.2、1.99、1.100.1、1.104、1.107、1.124、1.128、1.140.1或1.148。在其他實施方案中，氨基酸改變在一個或多個相同位置處，但涉及與參考抗體中不同的突變。在一些實施方案中，重鏈包含抗體144.1(SEQIDNO:2)、1.140.1(SEQIDNO:6)、1.43.1(SEQIDNO:10)、1.14.1(SEQIDNO:14)、1.100.1(SEQIDNO:18)、1.96.2(SEQIDNO:22)、1.18.1(SEQIDNO:26)、1.20.1(SEQIDNO:30)、1.39.1(SEQIDNO:34)、1.24.3(SEQIDNO:38)、1.71.3(SEQIDNO:42)的VH氨基酸序列；或具有最高達l、2、3、4、6、8或IO個保守氨基酸置換和/或總共最高達3個非保守氨基酸置換的所述VH氨基酸序列。在一些實施方案中，重鏈包含抗體1.14.1、1.18.1、1.19、1.20.1、1.22.1、1.22.2、1.24.3、1.41、1.43.1、143.2、1.44.1、1.39.1、1.71.1、1.71.3、1.96.2、1.99、1.100.1、1.104、1.107、1.124、1.128、1.140.1或1.148的重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或各自具有小于5個、小于4個、小于3個或小于2個保守氨基酸置換和/或總共3個或更少的非保守氨基酸置換的所述CDR區。在另一個實施方案中，抗體包含如上文公開的輕鏈和如上文公開的重鏈。在進一步的實施方案中，輕鏈CDRs和重鏈CDRs來自相同抗體。可以進行的一種類型的氨基酸置換是改變抗體中的一個或多個半胱氨酸，其可以與另一種殘基例如但不限于丙氨酸或絲氨酸化學反應。在一個實施方案中，存在非規范半胱氨酸的置換。置換可以在抗體的可變結構域的CDR或構架區或恒定結構域中進行。在一些實施方案中，半胱氨酸是經典的。可以進行的另一種類型的氨基酸置換是改變抗體中的任何潛在的蛋白酶解位點。此種位點可以存在于抗體的可變結構域的CDR或構架區中或恒定結構域中。半胱氨酸殘基的置換和蛋白酶解位點的去除可以減少抗體產物中的任何異質性的危險且因此增加其同質性。另一種類型的氨基酸置換是通過改變一個或兩個殘基而消除天冬酰胺-甘氨酸對，其形成潛在的脫酰胺作用位點。另外一種類型的氨基酸置換在曱硫氨酸殘基處以消除氧化位點。在一些實施方案中，切割本發明的抗ErbB2抗體的重鏈的C末端賴氨酸。在本發明的各種實施方案中，抗ErbB2抗體的重和輕鏈可以任選包括信號序列。在一個方面，本發明涉及抑制性人抗ErbB2單克隆抗體和生產其的雜交瘤細胞系。表l列出了編碼重和輕鏈的可變結構域的核酸的序列標識符(SEQIDNO:)，以及相應推導的氨基酸序列。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>抗ErbB2抗體的種類和亞類抗ErbB2抗體的種類和亞類可以通過本領域已知的任何方法進行測定。一般而言，抗體的種類和亞類可以使用對于抗體的特定種類和亞類特異的抗體進行測定。此種抗體是商購可得的。種類和亞類可以通過ELISA、或蛋白質印跡以及其他技術進行測定。可替代地，種類和亞類可以通過下述進行測定測序抗體的重和/或輕鏈的恒定結構域的全部或部分，比較它們的氨基酸序列與免疫球蛋白的各個種類和亞類的已知氨基酸序列，且測定抗體的種類和亞類。在一些實施方案中，抗ErbB2抗體是單克隆抗體。抗ErbB2抗體可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在另一個實施方案中，抗ErbB2抗體是IgG且是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4亞類。在另一個優選實施方案中，抗體是亞類IgG2(參見Kabat等人，(1991)Se^ewc"。/尸ra^,rao//m應脂/og/co//&潛/，第5版.USDepartmentofHealthandHumanServices,Washington,DC)。抗ErbB2靶向結合劑和抗體對于ErbB2的結合親和力在本發明的一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體以高親和力與ErbB2結合。在一些實施方案中，使用高分辨率biocore分析，耙向結合劑和/或抗ErbB2抗體以13.5l(T9M或更小的Kd與ErbB2結合。在另外其他的實施方案中，使用高分辨率biocore分析，靶向結合劑和/或抗體以13.x1CT9M、13.xl(T9M、11.xl(T9M、12.x1(T9M、10.x10.9M、5.xlO力M、3xlCT9、2x10-9、1xl(T9M或5x10"。M或更小的kd與ErbB2結合。在某些實施方案中，靶向結合劑和/或抗體以與選自下述的抗體基本上相同的Kd與ErbB2結合1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在另外一個優選實施方案中，靶向結合劑和/或抗體以與抗體基本上相同的KD與ErbB2結合，所述抗體包含具有SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42中發現的vh區的氨基酸序列的重鏈可變結構域，具有SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44中發現的VL區的氨基酸序列的輕鏈可變結構域，或兩者。在另一個優選實施方案中，抗體以與靶向結合劑和/或抗體基本上相同的KD與ErbB2結合，所述把向結合劑和/或抗體包含具有SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44中發現的VL區的氨基酸序列的輕鏈可變結構域的CDR區，或包含具有SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42中發現的vh區的氨基酸序列的重鏈可變結構域的CDR區，或兩者。在一些實施方案中，把向結合劑和/或抗ErbB2抗體具有低解離速率常數(K。ff)。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體具有l.Oxl(T3s-l或更低的k。ff或者5.0x10-、"或更低的k。ff。在其他優選實施方案中，抗體以2x10"s"或更低的k。ff與ErbB2結合。在一些實施方案中，k。ff與本文描述的抗體基本上相同，包括選自1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的抗體。在一些實施方案中，耙向結合劑和/或抗體以與抗體基本上相同的k。ff與ErbB2結合，所述抗體包含來自選自下述的抗體的重鏈的CDR區，或輕鏈的CDR區，或兩者1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗體以與抗體基本上相同的k。ff與ErbB2結合，所述抗體包含具有SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42中發現的VH區的氨基酸序列的重鏈可變結構域，具有SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44中發現的VL區的氨基酸序列的輕鏈可變結構域，或兩者。耙向結合劑和抗ErbB2抗體與ErbB2的結合親和力和解離速率可以通過本領域已知的方法進行測定。結合親和力可以通過ELISAs、RIAs、流式細胞術、表面等離振子共振例如BIACORETM進行測量。解離速率可以通過表面等離振子共振進行測量。優選地，結合親和力和解離速率通過表面等離振子共振進行測量。更優選地，結合親和力和解離速率使用BIACORETM進行測量。人們可以通過使用本領域已知的方法測定抗體是否具有與抗ErbB2抗體基本上相同的KD。實施例12例示了用于通過流式細胞術測定抗ErbB2單克隆抗體的親和常數的方法。由抗ErbB2抗體識別的ErbB2表位的鑒定本發明提供了靶向結合劑和/或人抗ErbB2單克隆抗體，其與ErbB2結合且竟爭或與下述竟爭和/或結合相同的表位(a)選自1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的抗體；(b)包含具有SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42的可變結構域的氨基酸序列的重鏈可變結構域的抗體，(c)包含具有SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44的可變結構域的氨基酸序列的輕鏈可變結構域的抗體，或(d)包含如(b)中定義的重鏈可變結構域和如(c)中定義的輕鏈可變結構域兩者的抗體。如杲2種抗體彼此相互地竟爭與ErbB2的結合，那么它們被說成竟爭。人們可以通過使用本領域已知的方法測定靶向結合劑和/或抗體是否與抗ErbB2抗體結合相同的表位或竟爭結合。在一個實施方案中，人們允許本發明的抗ErbB2抗體在飽和條件下與ErbB2結合，且隨后測量測試抗體與ErbB2結合的能力。如果測試抗體能夠與抗ErbB2抗體同時與ErbB2結合，那么測試抗體與抗ErbB2抗體結合不同的表位。然而，如果測試抗體不能同時與ErbB2結合，那么測試抗體與相同表位、重疊表位、或與由人抗ErbB2抗體結合的表位緊密接近的表位結合。這個實驗可以使用ELISA、RIA、BIACORETM或流式細胞術來進行。為了測試靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體是否與另一種抗ErbB2抗體竟爭，人們可以以2個方向使用上文描述的竟爭法，即測定參考抗體是否阻斷測試抗體且反之亦然。在另一個實施方案中，實驗使用ELISA來進行。測定Ko的方法在下文進一步討論。ErbB2活性經由抗ErbB2抗體的抑制在各種實施方案中，本發明提供了抑制經由ErbB2的信號傳導的靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體。在一個實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體抑制ErbB2的配體資導的信號傳導。在一個實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體抑制ErbB2的配體誘導的信號傳導而不阻斷配體與ErbB2的結合。在另一個實施方案中，ErbB2是人的。在另一個實施方案中，抗ErbB2抗體是人抗體。在一些實施方案中，配體是調蛋白-p。靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體的EC5o可以通過在經由ELISA或RIA監控的直接結合測定中，或經由基于細胞的測定例如下文描述的那些檢測抗體與抗原的結合進行測量。在一個實施方案中，耙向結合劑和/或抗體或其部分以^又僅50ng/ml的EC5o抑制經由ErbB2受體的配體誘導的信號傳導，優選僅僅25ng/ml，更優選僅僅10ng/ml，甚至更優選僅僅5ng/ml。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體使ErbB2的配體誘導的信號傳導抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。測量抑制可以通過本領域已知的任何方法來完成。在另一個實施方案中，本發明提供了抑制ErbB2的磷酸化的靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體。在各種實施方案中，耙向結合劑和/或抗體的EC5o為僅僅50ng/ml,優選僅僅25ng/ml,更優選僅僅10ng/ml，甚至更優選僅僅5ng/ml。在一些實施方案中，耙向結合劑和/或抗ErbB2抗體使ErbB2的磷酸化抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。實施例4、9和11例示了ErbB2磷酸化測定。在另一個實施方案中，本發明提供了抑制MAPK途徑的活化的靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體。在各種實施方案中，耙向結合劑和/或抗體的ECso為僅僅50ng/ml，優選僅僅25ng/ml,更優選僅僅10ng/ml,甚45至更優選僅僅5ng/ml。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體<吏ErbB2的石舞酸4匕抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。用于監控細胞中的MAPK途徑活化的測定是本領域已知的(參見為了所有目的整體51入本文作為參考的美國專利申請號20030186382和20030096333)。在另一個實施方案中，本發明提供了調節p38-TSP-l途徑的活性的把向結合劑和/或抗ErbB2抗體。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗體活化p38-TSP-l途徑。在其他實施方案中，靶向結合劑和/或抗體抑制p38-TSP-l途徑。在各種實施方案中，靶向結合劑和/或抗體的EC50為僅僅50ng/ml,優選僅僅25ng/ml，更優選僅僅10ng/ml,甚至更優選僅僅5ng/ml。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體使ErbB2的磷酸化抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。用于監控細胞中的p38-TSP-l途徑活化的測定是本領域已知的(參見為了所有目的整體引入本文作為參考的美國專利申請號20060089393和20020103253)。在另一個實施方案中，本發明提供了抑制PI3K途徑的活化的靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體。在各種實施方案中，耙向結合劑和/或抗體的EC5。為僅僅50ng/ml,優選僅僅25ng/ml,更優選僅僅10ng/ml，甚至更優選僅僅5ng/ml。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體使ErbB2的磷酸化抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。用于監控細胞中的PI3K途徑活化的測定是本領域已知的(參見為了所有目的整體51入本文作為參考的美國專利申請號20020037276和20040176385)。在另一個實施方案中，本發明提供了抑制CDC2的抑制的靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體。在各種實施方案中，靶向結合劑和/或抗體的EC50為虧又僅50ng/ml，優選4又僅25ng/ml，更優選4叉僅10ng/ml,甚至更優選僅僅5ng/ml。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體使ErbB2的磷酸化抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。用于監控細胞中的CDC2的抑制的測定是本領域已知的(參見為了所有目的整體引入本文作為參考的美國專利申請號20030225098和20040110775)。用抗ErbB2抗體抑制細胞增殖根據一些實施方案，本發明提供了在體內或在體外或兩者抑制癌或轉化細胞的增殖的靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體。在另一個實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體使增殖抑制至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一個實施方案中，磷酸化在動物已開始用抗體治療后至少1天進行測量，并且增殖在動物已開始用抗體治療后3天進行測量。在另一個實施方案中，在動物已開始用抗體治療后至少1小時測量抑制。在各種實施方案中，如通過細胞滴度或增殖標記測量的，靶向結合劑和/或抗體的EC50為僅僅3.5昭/ml,優選僅僅300ng/ml,更優選僅僅100ng/ml,甚至更優選僅僅50ng/ml。實施例9和10例示了增殖測定。物種和分子選擇性在本發明的另一個方面，^^向結合劑和/或抗ErbB2抗體證實了物種和分子選擇性。在一些實施方案中，耙向結合劑和/或抗ErbB2抗體與人(SEQIDNO:45)和獼猴ErbB2結合。根據本說明書的教導，人們可以使用本領域眾所周知的方法測定關于靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體的物種選才奪性。例如，人們可以使用蛋白質印跡、流式細胞術、ELISA、免疫沉淀或RIA測定物種選4奪性。在另一個實施方案中，人們可以使用流式細胞術測定物種選4奪性。在一些實施方案中，靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體不顯示與除ErbB2外的任何其他蛋白質的任何可估計的特異性結合。人們可以使用本領域眾所周知的方法根據本說明書的教導測定靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體對ErbB2的選擇性。例如人們可以使用蛋白質印跡、流式細胞術、ELISA、免疫沉淀或RIA測定選擇性。產生抗體和抗體產生性細胞系的方法在一些實施方案中，人抗體通過用ErbB2抗原免疫在其基因組內包含一些或全部人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座的非人、轉基因動物來生產。在另一個實施方案中，非人動物是XENOMOUSETM動物(AmgenFremont,Inc.,Fremont,CA)。XENOMOUSE小鼠是包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座的大片段且在小鼠抗體生產中有缺陷的人工改造的小鼠品系。參見，例如，Green等人，NatureGenetics7:13-21(1994)以及美國專利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963和6,150,584。還參見WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735、WO98/16654、WO98/24893、WO98/50433、WO99/45031、WO99/53049、WO00/09560和WO00/037504。在另一個方面，本發明提供了通過用ErbB2抗原免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人轉基因動物用于制備來自非人、非小鼠動物的抗ErbB2抗體的方法。人們可以使用上文引用的文件中描述的方法生產此種動物。這些文件中7>開的方法可以如美國專利5,994,619中描述的進行修飾，所述專利在此引入作為參考。美國專利5,994,619描述了用于生產衍生自豬和牛的新培養的內細胞群(CICM)細胞和細胞系的方法，以及異源DNA已插入其內的轉基因CICM細胞。CICM轉基因細胞可以用于生產克隆的轉基因胚胎、胎兒和后代。'619專利還描述了生產能夠將異源DNA傳遞給其后代的轉基因動物的方法。在本發明的優選實施方案中，非人動物是哺乳動物，優選大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬。XENOMOUSE小鼠生產全人抗體的成體樣人i普(repertoire)且產生抗原特異性人抗體。在一些實施方案中，XENOMOUSE小鼠通過在酵母人工染色體(YAC)中引入人重鏈基因座和k輕鏈基因座的種系構型片段包含約80%的人抗體V基因語。在其他實施方案中，XENOMOUSETM小鼠進一步包含約全部人人輕鏈基因座。參見Mendez等人，iV幽reGeweto15:146-156(1997)，Green和Jakobovits,j5"平iUet/.188:483-495(1998)和WO98/24893,其7^開內容在此引入作為參考。在其他實施方案中，抗體在人轉染色體(trans-chromosomic)小鼠中產生(參見在此引入作為參考的WO02/43478和WO02/092812)。在一些實施方案中，包含人免疫球蛋白基因的非人動物是具有人免疫球蛋白"微小基因座(minilocus)"的動物。在微小基因座方法中，外源Ig基因座通過包括來自Ig基因座的個別基因進行模擬。因此，一種或多種VH基因、一種或多種DH基因、一種或多種JH基因、p恒定結構域和第二種恒定結構域(優選Y恒定結構域)形成構建體用于插入動物內。這種方法尤其在在此引入作為參考的美國專利號5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中得到描述。在另一個方面，本發明提供了用于制備人源化的抗ErbB2抗體的方法。在一些實施方案中，非人動物如下文描述的在允許抗體生產的條件下用ErbB2抗原進行免疫。從動物中分離出抗體產生性細胞，將其與骨髓瘤融合以產生雜交瘤，并且分離編碼目的抗ErbB2抗體的重和輕鏈的核酸。這些核酸使用本領域技術人員已知的技術且如下文進一步描述的進行后續人工改造，以減少非人序列的量，即使抗體人源化以減少人中的免疫應答。在一些實施方案中，ErbB2抗原是分離的和/或純化的ErbB2。在另一個實施方案中，ErbB2抗原是人ErbB2。在一些實施方案中，ErbB2抗原是ErbB2的片段。在一些實施方案中，ErbB2片段是ErbB2的細胞外結構域。在一些實施方案中，ErbB2片段是ErbB2的細胞外環(參見在此引入作為參考的Cho等人，Nature.2003Feb13;421(6924):756-60)。在一些實施方案中，ErbB2片段包含ErbB2的至少一個表位。在其他實施方案中，ErbB2抗原是在其表面上表達或超表達ErbB2或其免疫原性片段的細胞。在一些實施方案中，ErbB2抗原是ErbB2融合蛋白。在一些實施方案中，ErbB2是合成肽免疫原。動物的免疫接種可以通過本領域已知的任何方法進行。參見，例如，Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1990。用于免疫非人動物例如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛和馬的方法是本領域眾所周知的。參見，例如，Harlow和Lane,同上和美國專利5，994,619。在另一個實施方案中，ErbB2抗原與佐劑一起施用以刺激免疫應答。示例性佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激復合物)。此種佐劑可以通過使多肽隔絕在局部沉積物中保護多肽不受快速分散，或它們可以包含刺激宿主以分泌對于巨噬細胞趨化性的因子和免疫系統的其他組分的物質。優選地，如果多肽被施用，那么免疫接種時間表將涉及在幾周內展開的多肽的2次或更多次施用。實施例1例示了用于在XenoMouseTM小鼠中生產抗ErbB2單克隆抗體的方法。祐傳和^傳Z^:^勿^敏,秀的Z^:用ErbB2抗原免疫接種動物后，可以從動物獲得抗體和/或抗體產生性細胞。在一些實施方案中，通過使動物出血或處死動物從動物獲得包含抗ErbB2抗體的血清。血清可以在它得自動物時使用，可以從血清獲得免疫球蛋白級分，或可以從血清純化抗ErbB2抗體。在一些實施方案中，由從免疫動物中分離的細胞制備抗體產生性無限增殖化細胞系。免疫接種后，處死動物且通過本領域已知的任何方法使淋巴結和/或脾B細胞無限增殖化。使細胞無限增殖化的方法包括但不限于用癌基因轉染它們，用致癌病毒感染它們且在選擇無限增殖化細胞的條件下培養它們，對它們實施致癌或突變化合物，使它們與無限增殖化細胞例如骨髓瘤細胞融合，和滅活腫瘤抑制基因。參見，例如Harlow和Lane,同上。如果使用與骨髓瘤細胞的融合，那么骨髓瘤細胞優選不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌細胞系)。無限增殖化細胞使用ErbB2、其部分或表達ErbB2的細胞進行篩選。在另一個實施方案中，起始篩選使用酶聯免疫測定(ELISA)或放射免疫測定來進行。ELISA篩選的例子在引入本文作為參考的WO00/37504中提供。選擇抗ErbB2抗體產生性細胞例如雜交瘤、克隆且就所需特征進一步篩選，包括強生長、高抗體產生和所需抗體特征，如下文進一步討論的。雜交瘤可以在同基因動物中、在缺乏免疫系統的動物例如棵鼠中體內或在細胞培養中體外進行擴增。選擇、克隆和擴增雜交瘤的方法是本領域普通技術人員眾所周知的。在一個實施方案中，免疫動物是表達人免疫球蛋白基因的非人動物，且脾B細胞與來自與非人動物相同的物種的骨髓瘤細胞系融合。在更優選的實施方案中，免疫動物是XENOMOUSETM小鼠，并且骨髓瘤細胞系是非分泌小鼠骨髓瘤。在甚至更加優選的實施方案中，骨髓瘤細胞系是P3-X63-Ag8.653(美國典型培養物保藏中心)。參見，例如實施例2。因此，在一個實施方案中，本發明提供了用于產生細胞系的方法，所述細胞系產生針對ErbB2的人單克隆抗體或其片段，所述方法包括(a)用ErbB2、ErbB2的部分或者表達ErbB2的細胞或組織免疫本文描述的非人轉基因動物；(b)允許轉基因動物發動針對ErbB2的免疫應答；(c)從轉基因動物中分離抗體產生性細胞；(d)使抗體產生性細胞無限增殖化；(e)生成無限增殖化抗體產生性細胞的個別單克隆群體；和(f)篩選無限增殖化抗體產生性細胞以鑒定針對ErbB2的抗體。在另一個方面，本發明提供了產生人抗ErbB2抗體的雜交瘤。在另一個實施方案中，如上所述，雜交瘤是小鼠雜交瘤。在其他實施方案中，雜交瘤在非人、非小鼠物種例如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬中產生。在另一個實施方案中，雜交瘤是人雜交瘤。在本發明的一個實施方案中，抗體產生性細胞得到分離且在宿主細胞中進行表達，例如骨髓瘤細胞。在另一個優選實施方案中，轉基因動物用ErbB2進行免疫，從免疫的轉基因動物中分離原代細胞例如脾或外周血細胞，并且鑒定產生對于所需抗原特異的抗體的個別細胞。分離來自每個個別細胞的聚腺苷酸化mRNA,并且使用與可變區序列退火的有義引物(例如識別人重和輕鏈可變區基因的大部分或全部FR1區的簡并引物)和與恒定或連接區序列退火的反義引物進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。重和輕鏈可變結構域的cDNAs隨后進行克隆，且在任何合適的宿主細胞中作為具有分別的免疫球蛋白恒定區，例如重鏈和k或X輕鏈恒定結構域的嵌合抗體進行表達。參見引入本文作為參考的Babcook,J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-48,1996。抗ErbB2抗體隨后可以如本文描述的進行鑒定和分離。在另一個實施方案中，噬菌體展示技術可以用于提供包含對于ErbB2具有不同親和力的抗體謙的文庫。對于此種鐠的產生，無需使來自免疫動物的B細胞無限增殖化。相反，原代B細胞可以作為DNA的來源直接使用。得自B細胞例如衍生自血液或脾的cDNAs的混合物用于制備表達文庫，例如轉染到大腸桿菌co//)內的人噬菌體展示文庫。所得到的細胞就與ErbB2的免疫反應性進行測試。用于鑒定來自此種文庫的高親和力人抗體的技術由Griffiths等人，￡71^(913:3245-3260(1994);Nissim等人,同前，第692-698頁和Griffiths等人，同前12:725-734進行描述，所述參考文獻引入作為參考。最后，從文庫中鑒定產生對于抗原的所需量級結合親和力的克隆，且回收編碼負責此種結合的產物的DNA且對其進行處理用于標準重組表達。噬菌體展示文庫還可以使用先前處理的核苷酸序列進行構建且以類似方式進行篩選。一般而言，編碼重和輕鏈的cDNAs獨立地提供或連接，以形成Fv類似物用于在噬菌體文庫中生產。在某些實施方案中，可以利用鏈改組(參見在此引入作為參考的Kang等人,PNAS(1991)Dec15;88(24):11120-3)。噬菌體文庫隨后就對于ErbB2具有最高親和力的抗體進行篩選，且從合適的克隆中回收遺傳材料。進一步的篩選循環可以增加分離的原始抗體的親和力。核酸、載體、宿主細胞和制備抗體的重組法#凝一些實施方案中，不同的核酸分子編碼抗ErbB2免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。在其他實施方案中，相同的核酸分子編碼抗ErbB2免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。在一個實施方案中，核酸編碼本發明的ErbB2抗體。在一些實施方案中，編碼輕鏈的可變結構域(VO的核酸分子利用人VkB3、VkL1、VkA2或VkAl基因和Jk1、Jk3、jK4或Jk5基因，含或不含來自種系的突變。在一些實施方案中，編碼輕鏈的核酸分子編碼相對于種系氨基酸序列包含l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個置換和/或0、1或2個插入的氨基酸序列。在一些實施方案中，核酸分子包含編碼VL氨基酸序列的核苷酸序列，所述VL氨基酸序列與種系VK和JK序列相比較包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個保守氨基酸置換和/或總共最高達3個非保守置換。置換可以在CDR區、構架區或在恒定結構域中。在一些實施方案中，核酸分子編碼與種系序列相比專交包含一種或多種變體的VL氨基酸序列，其等同于抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的任何一種的V^中發現的變異。在一些實施方案中，與抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3之一的VL中發現的種系序列相比較，核酸分子編碼至少3個氨基酸置換。在一些實施方案中，核酸分子包含核普酸序列，其編碼單克隆抗體1.44.1(SEQIDNO:4)、1.140(SEQIDNO:8)、1.43.1(SEQIDNO:12)、1.14.1(SEQIDNO:16)、1.100.1(SEQIDNO:20)、1.96.2(SEQIDNO:24)、1.18.1(SEQIDNO:28)、1.20.1(SEQIDNO:32)、1.39.1(SEQIDNO:36)、1.24.3(SEQIDNO:40)、1.71.3(SEQIDNO:44)的Vt氨基酸序列，或其變體或部分。在一些實施方案中，核酸編碼包含所述上文列出的抗體之一的輕鏈CDRs的氨基酸序列。在一些實施方案中，核酸分子包含核苷酸序列，其編碼SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40或44之一的氨基酸序列。在一些優選實施方案中，核酸分子包含SEQIDNO:3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43的核苷酸序列，或其部分。在一些實施方案中，核酸編碼所述抗體的輕鏈CDRs的氨基酸序列。在一些實施方案中，核酸分子編碼V^氨基酸序列，其與抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、I.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的任何一種的Vl區的VL氨基酸序列，或SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40或44中的任何一個的氨基酸序列至少70%、750/。、80%、85%、90%、95%、97。/o、98%或99%等同。本發明的核酸分子包括核酸，所述核酸在高度嚴格條件例如上文描迷的那些下與編碼SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44中發現的V^區的氨基酸序列的核苷酸序列雜交，或具有編碼SEQIDNO:3、7、II、15、19、23、27、31、35、39或43中發現的VL區的核酸分子的核苦酸序列。在另一個實施方案中，核酸編碼選自1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的抗體的全長輕鏈。在另一個優選實施方案中，核酸分子編碼重鏈的可變結構域(VH),其包含人Vh3-21、人Vh3-7、人Vh4-31或人Vh3-13基因序列或由其衍生的序列。在各種實施方案中，核酸分子利用人Vh3-7基因和人JH6;人Vh4-31基因、人D3-10基因和人JH6B基因；或人Vh3-13基因、人D6-19基因和人Jh6B基因。在一些實施方案中，核酸分子編碼與人V、D和J基因的種系氨基酸序列相比較包含l、2、3、4、5、6或7個突變的氨基酸序列；其中的0、1、2或3個可以是置換。在一些實施方案中，所述突變在VH區中。在一些實施方案中，所述突變在CDR區中。在一些實施方案中，與種系序列相比較核酸分子編碼一個或多個氨基酸突變，其與單克隆抗體1.14.1、1.18.1、1.19、1.20.1、1.22.1、1.22.2、1.24.3、1.41、1.43.1、143.2、1.44.1、1.39.1、1.71.1、1.71.3、1.96.2、1.99、1.100.1、1.104、1.107、1.124、1.128、1.140.1或1.148的VH中發現的氨基酸突變等同。在一些實施方案中，與種系序列相比較核酸編碼至少3個氨基酸突變，其與上文列出的單克隆抗體之一中發現的至少3個氨基酸突變等同。在一些實施方案中，核酸分子包含核苷酸序列，其編碼選自1.44.1(SEQIDNO:2)、1.140.1(SEQIDNO:6)、1.43.1(SEQIDNO:10)、1.14.1(SEQIDNO:14)、1.100.1(SEQIDNO:18)、1.96.2(SEQIDNO:22)、1.18.1(SEQIDNO:26)、1.20.1(SEQIDNO:30)、1.39.1(SEQIDNO:34)、1.24.3(SEQIDNO:38)、1.71.3(SEQIDNO:42)的抗體的VH氨基酸序列的至少部分，其變體，或具有保守氨基酸突變和/或總共3個或更少非保守氨基酸置換的所述序列。在各種實施方案中，序列編碼一個或多個CDR區，優選CDR3區，所有3個CDR區，或整個Vh區。在一些實施方案中，核酸分子包含編碼SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38和42之一的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些優選實施方案中，核酸分子包含SEQIDNO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41的核苷酸序列的至少部分。在一些實施方案中，所述部分編碼vh區、CDR3區或所有3個CDR區。在一些實施方案中，核酸分子編碼vh氨基酸序列，其與SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42中的任何一個的Vh氛基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%等同。本發明的核酸分子包括核酸，所述核酸在高度嚴格條件例如上文描述的那些下與編碼SEQIDNO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41的氨基酸序列的核苷酸序列，或與其vh區雜交，或具有SEQIDNO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41的核普酸序列，或編碼其Vn區。在另一個實施方案中，核酸編碼選自1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的抗體的全長重鏈。編碼抗ErbB2抗體或其部分的重或輕鏈的核酸分子可以從產生此種抗體的任何來源中分離。在各種實施方案中，從由用ErbB2免疫的動物分離的B細胞、從衍生自表達抗ErbB2抗體的此種B細胞的無限增殖化細胞、或從噬菌體分離核酸分子。分離編碼抗體的mRNA的方法是本領域眾所周知的。參見，例如Sambrook等人。mRNA可以用于產生cDNA用于在聚合酶鏈反應(PCR)或抗體基因的cDNA克隆中使用。在一個實施方案中，核酸分子從具有作為其融合配偶體之一來自非人轉基因動物的人免疫球蛋白產生性細胞的雜交瘤中分離。在另一個實施方案中，人免疫球蛋白產生性細胞從XENOMOUSETM動物中分離。在另一個實施方案中，如上所述，人免疫球蛋白產生性細胞來自非人、非小鼠轉基因動物。在另一個實施方案中，核酸從非人、非轉基因動物中分離。從非人、非轉基因動物中分離的核酸分子可以用于例如人源化抗體。在另一個實施方案中，核酸從細菌或噬菌體中分離。在一些實施方案中，編碼本發明的抗ErbB2抗體的重鏈的核酸可以包含與編碼來自任何來源的重鏈恒定結構域的核苷酸序列框內連接的編碼本發明的vh結構域的核苷酸序列。類似地，編碼本發明的抗ErbB2抗體的輕鏈的核酸分子可以包含與編碼來自任何來源的輕鏈恒定結構域的核香酸序列框內連接的編碼本發明的VL結構域的核苷酸序列。在本發明的進一步方面，將編碼重(Vh)和/或輕(VJ鏈的可變結構域的核酸分子"轉變成"全長抗體基因。在一個實施方案中，通過插入已分別編碼重鏈恒定(Ch)或輕鏈恒定(CJ結構域的表達載體內，從而使得VH區段與載體內的Ch區段可操作地連接，和/或VL區段與載體內的Cl區段可操作地連接，將編碼Vh或Vi結構域的核酸分子轉變成全長抗體基因。在另一個實施方案中，使用標準分子生物學技術通過使編碼Vh和/或Vi^結構域的核酸分子與編碼Ch和/或CL結構域的核酸分子相聯例如連接，將編碼Vh和/或Vt結構域的核酸分子轉變成全長抗體基因。人重和輕鏈免疫球蛋白恒定結構域的核苷酸序列是本領域已知的。參見,例如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，NIHPubl.No.91-3242,1991。編碼全長重和/或輕鏈的核酸分子隨后可以由它們已引入其內的細胞進行表達，且分離抗ErbB2抗體。核酸分子可以用于重組表達大量抗ErbB2抗體。核酸分子還可以用于產生嵌合抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體、免疫粘附素、雙抗體、突變抗體和抗體衍生物，如下文進一步描述的。如果核酸分子衍生自非人、非轉基因動物，那么核酸分子可以用于抗體人源化，也如下文描述的。在另一個實施方案中，本發明的核酸分子用作探針或PCR引物用于特定抗體序列。例如，核酸可以在診斷法中用作探針或用作PCR引物以擴增DNA的區域，所述DNA的區域可以尤其用于分離編碼抗ErbB2抗體的可變結構域的另外核酸分子。在一些實施方案中，核酸分子是寡核普酸。在一些實施方案中，寡核苷酸來自目的抗體的重和輕鏈的高度可變結構域。在一些實施方案中，寡核苷酸編碼抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3(或如本文描述的其變體)的一個或多個CDRs的全部或部分。郝本發明提供了載體，所述載體包含編碼本發明的抗ErbB2抗體的重鏈或其抗原結合部分的核酸分子，編碼此種抗體的輕鏈或其抗原結合部分的核酸分子，或兩者或耙向結合劑。本發明進一步提供了包含編碼融合蛋白、經修飾的抗體、抗體片段及其探針的核酸分子的載體。如上所述獲得的編碼部分或全長輕和/或重鏈的DNAs插入表達載體內，從而使得基因與必需的表達控制序列例如轉錄和翻譯控制序列可操作地連接，來進行表達。表達載體包括質粒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、植物病毒例如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒、粘粒、YACs、EBV衍生的附加體等。將抗體基因連接到載體內，從而使得載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮其調節抗體基因轉錄和翻譯的預期功能。選擇與使用的表達宿主細胞相容的表達載體和表達控制序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入分開的載體內。在一些實施方案中，將2種基因插入相同的表達載體內。抗體基因通過標準方法插入表達載體內(例如，在抗體基因片段和載體上的互補限制位點的連接，或如果不存在限制位點，那么平端連接)。方便的載體是編碼在功能上完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的那種，具有人工改造的合適的限制位點，從而使得任何Vh或Vl序列可以容易地插入且表達，如上所述。在此種載體中，剪接通常在插入的J區中的剪接供體位點和人C結構域前的剪接受體位點之間發生，并且還在人CH外顯子內存在的剪接區域處發生。多腺苷酸化和轉錄終止在編碼區下游的天然染色體位點處發生。重組表達載體也可以編碼促進抗體鏈從宿主細胞分泌的信號肽。抗體鏈基因可以克隆到載體內，從而使得信號肽與免疫球蛋白鏈的氨基末端框內連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質的信號肽)。除了抗體鏈基因外，本發明的重組表達載體攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中的表達的調節序列。本領域技術人員將理解表達載體的設計，包括調節序列的選擇可以依賴于此種因素，如待轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白質表達水平等。用于哺乳動物宿主細胞表達的優選調節序列包括指導哺乳動物細胞中的高水平蛋白質表達的病毒元件，例如衍生自逆轉錄病毒LTRs、巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子和/或增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤和強哺乳動物啟動子例如天然免疫球蛋白和肌動蛋白啟動子的啟動子和/或增強子。關于病毒調節元件及其序列的進一步描述，參見，例如美國專利號5,168,062、美國專利號4,510,245和美國專利號4,968,615。用于在植物中表達抗體的方法，包括啟動子和栽體的描述，以及植物的轉化是本領域已知的。參見，例如，引入本文作為參考的美國專利6,517,529。在細菌細胞或真菌細胞例如酵母細胞中表達多肽的方法也是本領域眾所周知的。除了抗體鏈基因和調節序列外，本發明的重組表達載體可以攜帶另外的序列，例如調節載體在宿主細胞中的復制的序列(例如復制起點)和選擇標記基因。選擇標記基因促進載體已？1入其內的宿主細胞的選擇(參見例如，引入本文作為參考的美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，一般地選才奪標記基因在載體已引入其內的宿主細胞上賦予對于藥物例如G418、潮霉素或氨曱蝶呤的抗性。優選的選擇標記基因包括二氬葉酸還原酶(DHFR)基因(用于利用氨曱蝶呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞中使用)、neo基因(用于G418選擇)和谷氨酸合成酶基因。車染Jt身荷2勿應和,逸iZf.編碼靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體的核酸分子和包含這些核酸分子的載體可以用于轉染合適的哺乳動物、植物、細菌或酵母宿主細胞。轉化可以通過用于將多核苷酸引入宿主細胞內的任何已知方法進行。用于將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞內的方法是本領域眾所周知的，且包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、多核苷酸封裝在脂質體中、和DNA直接顯微注射到核內。此外，核酸分子可以通過病毒載體引入哺乳動物細胞內。轉化細胞的方法是本領域眾所周知的。參見，例如引入本文作為參考的美國專利號4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455)。轉化植物細胞的方法是本領域眾所周知的，包括例如土壤桿菌屬(Agrobactenum)介導的轉化、生物射彈(biolistic)轉化、直接注射、電穿孔和病毒轉化。轉化細菌和酵母細胞的方法也是本領域眾所周知的。可用作宿主用于表達的哺乳動物細胞系是本領域眾所周知的，且包括可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的許多無限增殖化細胞系。這些尤其包括中國倉鼠卯巢(CHO)細胞、N50細胞、SP2纟田胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如HepG2)、A549細胞和許多其他細胞系。特別優先的細胞系通過測定哪種細胞系具有高表達水平進行選擇。可以使用的其他細胞系是昆蟲細胞系，例如Sf9或Sf21細胞。當編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞內時，抗體通過使宿主細胞培養足以允許抗體在宿主細胞中表達，或更優選地，抗體分泌到其中宿主細胞生長的培養基內的時間段來產生。抗體可以使用標準蛋白質純化法從培養基中回收。植物宿主細胞包括例如煙草屬(Nicotiana)、鼠耳芥屬(Arabid叩sis)、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌宿主細胞包括大腸桿菌和鏈霉菌屬(&M/^omyc^)物種。酵母宿主細胞包括粟酒裂殖糖酵母(Sc/n'zoracc/zaram;/c^戶om6e)、啤酒糖酵母(S"cc/z"rowj^^yc'erevz's/"e)和巴其斤《急畢赤氏酵母(尸z.c力/'"/9"s/orw)。此外，本發明的抗體從生產細胞系的表達可以使用許多已知技術得到增強。另外，谷氨酰胺合成酶基因表達系統(GS系統)是用于增強在某些條件下的表達的常用方法。GS系統與歐洲專利號0216846、0256055、0323997和0338841結合整體或與部分進行討論。可能由不同細胞系或在轉基因動物中表達的抗體將具有彼此不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸分子編碼，或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗體是本發明的部分，與抗體的糖基化無關。脊差^^，弄茲參.'"、，、、，力,、、口回收方式產生抗體來轉基因地產生，所述哺乳動物或植物對于目的免疫球蛋白重和輕鏈序列是轉基因的。在哺乳動物中的轉基因產生方面，抗ErbB2抗體可以在山羊、牛或其他哺乳動物的乳中產生且回收。參見，例如，引入本文作為參考的美國專利號5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。在一些實施方案中，包含人免疫球蛋白基因座的非人轉基因動物用ErbB2或其免疫原性部分進行免疫，如上所述。用于在植物中制備抗體的方法在例如引入本文作為參考的美國專利6,046,037和5,959,177中得到描述。在一些實施方案中，非人轉基因動物或植物經由標準轉基因技術通過將編碼本發明的抗ErbB2抗體的一種或多種核酸分子引入動物或植物內來產生。參見Hogan和美國專利6，417,429,同上。用于制備轉基因動物的轉基因細胞可以是胚胎干細胞或體細胞或受精卵。轉基因非人生物可以是嵌合的、非嵌合雜合子和非嵌合純合子。參見，例如，Hogan等人,ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual第2版，ColdSpringHarborPress(1999);Jackson等人，MouseGeneticsandTransgenics:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(2000);和Pinkert,TransgenicAnimalTechnology:ALaboratoryHandbook,AcademicPress(1999),全部引入本文作為參考。在一些實施方案中，轉基因非人動物通過編碼目的重鏈和/或輕鏈的靶向構建體而具有靶向的破壞和置換。在另一個實施方案中，轉基因動物包含且表達編碼與ErbB2優選人ErbB2特異性結合的重和輕鏈的核酸分子。在一些實施方案中，轉基因動物包含編碼經修飾的抗體例如單鏈抗體、嵌合抗體或人源化抗體的核酸分子。抗ErbB2抗體可以在任何轉基因動物中進行制備。在另一個實施方案中，非人動物是小鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬。非人轉基因動物在血液、乳、尿、唾液、淚、粘液和其他體液中表達所述編碼的多肽。^義岸包括下述步驟在噬菌體上合成人抗體的文庫、用ErbB2或其部分篩選文庫、分離結合ErbB2的噬菌體、和從噬菌體中獲得抗體。例如，用于制備用于在噬菌體展示技術中使用的抗體文庫的一種方法包括下述步驟用ErbB2或其抗原部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人動物以產生免疫應答，從免疫動物中提取抗體產生性細胞；從提取的細胞中分離編碼本發明的抗體的重和輕鏈的RNA,使RNA逆轉錄以產生cDNA,使用引物擴增cDNA,且將cDNA插入噬菌體展示載體內，從而使得抗體在噬菌體上表達。本發明的重組抗ErbB2抗體可以以這種方式獲得。本發明的重組抗ErbB2人抗體可以通過篩選重組組合抗體文庫得到分離。優選地文庫是scFv噬菌體展示文庫，使用由B細胞分離的mRNA制備的人VL和VHcDNAs產生。用于制備和篩選此種文庫的方法是本領域已知的。用于產生噬菌體展示文庫的試劑盒是商購可得的(例如，PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,目錄號27-9400-01;和StratageneSurfZApTM噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)。還存在可以在產生和篩選抗體展示文庫中使用的其他方法和試劑(參見，例如，美國專利號5,223,409;PCT公開號WO92/18619，WO91/17271，WO92/20791,WO92/15679,WO93/01288,WO92/01047，WO92/09690;Fuchs等人，^o/Tec/wo/og少9:1370-1372(1991);Hay等人，/Zwm.J""k>￡/.〃少6m/ow似3:81-85(1992);Huse等人，S"'e"ce246:1275-1281(1989);McCafferty等人，A^w"348:552-554(1990);Griffiths等人，五Affl(9J.12:725-734(1993);Hawkins等人，丄Afo/.Ao/.226:889-8%(1992);Clackson等人，to訓352:624-628(1991);Gram等人，尸toc.淑/.Sc.園89:3576-3580(1992);Garrad等人，S/o/rec/z"o/ogy9:1373-1377(1991);Hoogenboom等人,iVwc.Jc/t/iRe《.19:4133-4137(1991);和Barbas等人，尸rac.Ato/.Jcad園88:7978-7982(1991),全部引入本文作為參考。在一個實施方案中，為了分離和產生具有所需特征的人抗ErbB2抗體，如本文描述的人抗ErbB2抗體首先用于選4奪具有針對ErbB2的類似結合活性的人重和輕鏈序列，使用引入本文作為參考的PCT公開號WO93/06213中描述的表位印記法。這種方法中4吏用的抗體文庫是優選地如PCT公開號WOWO92/01047,McCafferty等人，A^w"348:552-554(1990);和Griffiths等人，12:725-734(1993)中描述制備和篩選的scFv文庫，全部引入本文作為參考。scFv抗體文庫優選使用人ErbB2作為抗原進行篩選。一旦選擇了起始人Vl和VH結構域，就進行"混合和匹配"實驗，其中不同對的起始選擇的VL和VH區段就ErbB2結合進行篩選，以選擇優選的V:7VH對組合。此外，為了進一步改善抗體的質量，優選的VL/VH對的Vl和VH區段可以進行隨機突變，優選在Vh和/或Vl的CDR3區中，在類似于在天然免疫應答過程中負責抗體的親和力成熟的體內體細胞突變過程的過程中。這種體外親和力成熟可以通過使用分別與VHCDR3或VLCDR3互補的PCR引物擴增Vh和VL結構域來完成，所述引物已在某些位置處用4種核苷酸堿基的隨機混合物"摻料"，從而使得所得到的PCR產物編碼隨機突變已引入Vh和/或VLCDR3區內的Vh和Vi^區段。這些隨機突變的Vh和V^區段可以就與ErbB2的結合進行重新篩選。從重組免疫球蛋白展示文庫中篩選和分離本發明的抗ErbB2抗體后，可以從展示包中(例如從噬菌體基因組中)回收編碼所選擇的抗體的核酸，且通過標準重組DNA技術亞克隆到其他表達載體內。若需要，那么核酸可以進一步進行處理以生成本發明的其他抗體形式，如下所述。為了表達通過篩選組合文庫分離的重組人抗體，將編碼抗體的DNA克隆到重組表達載體內且引入哺乳動物宿主細胞內，如上所述。本發明的另一個方面提供了用于將抗ErbB2抗體的種類或亞類轉變成另一個種類或亞類的方法。在一些實施方案中，不包括編碼CL或CH的序列的編碼V^或VH的核酸分子使用本領域眾所周知的方法進行分離。隨后使核酸分子與編碼來自所需免疫球蛋白種類或亞類的Cl或Ch的核苷酸序列可操作地連接。這可以使用包含Cl或CH鏈的載體或核酸分子來實現，如上所述。例如，最初為IgM的抗ErbB2抗體可以類別轉換成IgG。此外，類別轉換可以用于將一個IgG亞類轉變成另一個，例如從IgGl到IgG2。用于產生包含所需同種型的本發明的抗體的另一種方法包括下述步驟分離編碼抗ErbB2抗體的重鏈的核酸和編碼抗ErbB2抗體的輕鏈的核酸，分離編碼VH區的序列，使VH序列與編碼所需同種型的重鏈恒定結構域的序列連接，在細胞中表達輕鏈基因和重鏈構建體，和收集具有所需同種型的抗ErbB2抗體。炎戎謬應^i^ft/ez'wmwm'zec/J在本發明的另一個方面，抗體可以使用例如PCT公開號W098/52976和WO00/34317(引入本文作為參考)中描述的技術進行脫免疫以減少其免疫原性。爽fW拔傳在另一個實施方案中，核酸分子、載體和宿主細胞可以用于制備突變的抗ErbB2抗體。抗體可以例如在重和/或輕鏈的可變結構域中進行突變，以改變抗體的結合性質。例如，突變可以在一個或多個CDR區中進行，以增加或減少抗體對于ErbB2的KD,以增加或減少k。ff,或改變抗體的結合特異性。位點定向誘變中的技術是本領域眾所周知的。參見，例如Sambrook等人和Ausubel等人，同上。在另一個實施方案中，一個或多個突變在這樣的氨基酸殘基處進行，所述氨基酸殘基與抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的種系相比較已知是改變的。突變可以在可變結構域的CDR區或構架區或恒定結構域中進行。在另一個實施方案中，突變在可變結構域中進行。在一些實施方案中，一個或多個突變在這樣的氨基酸殘基處進行，所述氨基酸殘基與選自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和44的或其核苷酸序列呈現在SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43中的氨基酸序列的可變結構域的CDR區或構架區中的種系相比較已知是改變的。在另一個實施方案中，構架區這樣突變，從而使得所得到的構架區具有相應的種系基因的氨基酸序列。突變可以在構架區或恒定結構域中進行，以增加抗ErbB2抗體的半衰期。參見，例如，引入本文作為參考的PCT公開號WO00/09560。還可以進行構架區或恒定結構域中的突變，以改變抗體的免疫原性，提供用于與另一種分子共價或非共價結合的位點，或改變諸如補體結合、FcR結合和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)的性質。根據本發明，單個抗體可以具有在可變結構域的任何一個或多個CDRs或構架區或恒定結構域中的突變。在一些實施方案中，與突變前的抗ErbB2抗體相比較，在突變的抗ErbB2抗體的Vh或ViJ吉構域中存在1-8個，包括其中的任何數目的氨基酸突變。在上述的任何一種中，突變可以在一個或多個CDR區中發生。此外，任何突變都可以是保守氨基酸置換。在一些實施方案中，在恒定結構域中存在僅僅5、4、3、2或1個氨基酸改變。經修謬的我#在另一個實施方案中，可以制備包含與另一種多肽連接的本發明抗ErbB2抗體的全部或部分的融合抗體或免疫粘附素。在另一個實施方案中，僅抗ErbB2抗體的可變結構域與多肽連接。在另一個優選實施方案中，抗ErbB2抗體的VH結構域與第一種多肽連接，而抗ErbB2抗體的VL結構域與第二種多肽連接，所述第二種多肽以這樣的方式與第一種多肽結合，從而使得Vh和VL結構域可以彼此相互作用以形成抗原結合部位。在另一個優選實施方案中，VH結構域通過接頭與VL結構域分開，從而使得Vh和VL結構域可以彼此相互作用(參見下文單鏈抗體下)。VH-接頭-VL抗體隨后與目的多肽連接。融合抗體用于將多肽導向ErbB2表達細胞或組織。多肽可以是治療劑，例如毒素、生長因子或其他調節蛋白質，或可以是診斷劑，例如可以容易顯現的酶，例如辣根過氧化物酶。此外，可以生成其中2個(或更多)單鏈抗體彼此連接的融合抗體。如果人們希望在單條多肽鏈上生成二價或多價抗體，或如果人們希望生成雙特異性抗體，那么這是有用的。為了生成單鏈抗體(scFv)，使編碼Vh和Vl的DNA片段與編碼柔性接頭例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一個片段可操作地連接，從而使得Vh和VL序列可以作為鄰接的單鏈蛋白質進行表達，其中VL和VH結構域由柔性接頭連接。參見，例如，Bird等人，242:423-426(1988);Huston等人，A^/.爿cadV&485:5879-5883(1988);McCafferty等人，A^wre348:552-554(1990)。單鏈抗體可以是單價的，如果僅使用單個Vh和Vt的話，二價的，如果使用2個VH和VL的話，或多價的，如果使用超過2個Vh和V^的話。可以產生與ErbB2和另一種分子特異性結合的雙特異性或多價抗體。在其他實施方案中，使用抗ErbB2抗體編碼核酸分子可以制備其他經修飾的抗體。例如，"k體(Kappabodies)"(Ill等人,尸她w10:949隱57(1997))、"微型抗體"(Martin等人，EM5(9,/.13:5303-9(1994))、"雙抗體，，(Holliger等人，TVoc.A^/.爿cad"&490:6444-6448(1993))、或"Janusins"(Traunecker等人，五A/B(9丄10:3655-3659(1991)和Traunecker等人，丄C"膨r(Suppl.)7:51-52(1992))雙特異性抗體或抗原結合片段可以通過多種方法來產生，包括雜交瘤的融合或Fab，片l殳的連4妾。參見，例如，Songsivilai&Lachmann，C/,'".￡jcp./mwwwo/.79:315-321(1990),Kostelny等人，丄/mwwo/.148:1547-1553(1992)。此外，雙特異性抗體可以作為"雙抗體"或"Janusins"形成。在一些實施方案中，雙特異性抗體與ErbB2的2個不同表位結合。在一些實施方案中，雙特異性抗體具有來自抗體1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1,20、1.39、1.24和1.71.3的第一種重鏈和第一種輕鏈以及另外的抗體重鏈和輕鏈。在一些實施方案中，另外的輕鏈和重鏈也來自上文鑒定的單克隆抗體之一，但不同于第一種重和輕鏈。在一些實施方案中，使用來自本文提供的人抗ErbB2單克隆抗體的一個或多個可變結構域或CDR區制備上文描述的經修飾的抗體。本發明的抗體還包含在哺乳動物優選人中具有超過未經修飾的抗體的那種的半衰期(例如血清半衰期)的抗體。在一個實施方案中，所述抗體半衰期超過約15天，超過約20天，超過約25天，超過約30天，超過約35天，超過約40天，超過約45天，超過約2個月，超過約3個月，超過約4個月，或超過約5個月。本發明的抗體或其片段在哺乳動物優選人中增加的半衰期導致所述抗體或抗體片段在哺乳動物中更高的血清滴度，且因此減少所述抗體或抗體片段的施用頻率和/或減少待施用的所述抗體或抗體片段的濃度。具有增加的體內半衰期的抗體或其片段可以通過本領域技術人員已知的技術來產生。例如，具有增加的體內半衰期的抗體或其片段可以通過修飾(例如，置換、缺失或添加)氨基酸殘基來產生，所述氨基酸殘基鑒定為涉及Fc結構域和FcRn受體之間的相互作用(參見，例如，國際公開號WO97/34631和WO02/060919,其整體引入本文作為參考)。具有增加的體內半衰期的抗體或其片段可以通過使所述抗體或抗體片段附著聚合分子例如高分子量聚乙二醇(PEG)來產生。PEG可以與含或不含多功能接頭的所述抗體或抗體片段附著，其通過PEG與所述抗體或抗體片段的N或C末端的位點特異性綴合或經由賴氨酸殘基上存在的s-氨基。將使用導致生物活性最低限度的喪失的線性或分支聚合物衍生。綴合程度將通過SDS-PAGE和質譜分析法緊密監控，以確保PEG分子與抗體的正確綴合。未反應的PEG可以通過例如大小排阻或離子交換層析與抗體-PEG綴合物分開。抗原結合部位可以借助于下述來提供在非抗體蛋白質支架例如纖連蛋白或細胞色素B等上安排CDRs(Haan&Maggos(2004)BioCentury,12(5):Al-A6;Koide等人(1998)JournalofMolecularBiology,284:1141-1151;Nygren等人(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,7:463-469),或通過使蛋白質支架內的環的氨基酸殘基隨機化或突變以賦予對于所需靶的結合特異性。用于人工改造蛋白質中的新結合位點的支架已由Nygren等人(Nygren等人(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,7:463-469)詳細綜述。用于抗體模擬物的蛋白質支架公開于WO/0034784中，所述文獻整體引入本文作為參考，其中發明人描述了包括具有至少1個隨機化環的纖連蛋白III型結構域的蛋白質(抗體^t擬物)。在其內嫁接一個或多個CDRs例如HCDRs組的合適的支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任何結構域成員提供。支架可以是人或非人蛋白質。非抗體蛋白質支架的優點是它可以提供支架分子中比至少一些抗體分子更小和/或更易于制備的抗原結合部位。結合成員的小尺寸可以賦予有用的生理學性質，例如進入細胞、深度透入組織內或達到其他結構內的耙，或在耙抗原的蛋白質腔內結合的能力。抗原結合部位在非抗體蛋白質支架中的使用在Wess,2004(Wess,L.In:BioCentury，TheBernsteinReportonBioBusiness,12(42),Al-A7，2004)中綜述。一般是具有穩定的主鏈和一個或多個可變環的蛋白質，其中一個或多個環的氨基酸序列特異性或隨機突變，以生成結合把抗原的抗原結合部位。此種蛋白質包括來自金黃色葡萄球菌(S.aureus)的A蛋白的IgG-結合結構域、運鐵蛋白、清蛋白、四連蛋白、纖連蛋白(例如第10個纖連蛋白III型結構域)、脂質運載蛋白以及"結晶和其他AffilinTM支架(ScilProteins)。其他方法的例子包括基于大環寡肽(cyclotide)的合成"微體"-具有分子內二硫鍵的小蛋白質、微量蛋白(Microproteins)(VersabodiesTM,Amunix)和4苗蛋白重復蛋白質(DARPins,MolecularPartners)。除了抗體序列和/或抗原結合部位外，根據本發明的靶向結合劑可以包含其他氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折疊結構域，或賦予分子除結合抗原的能力外的另一種功能特征。本發明的靶向結合劑可以攜帶可檢測標記，或可以與毒素或靶向部分或酶綴合(例如經由肽基鍵或接頭)。例如，耙向結合劑可以包含催化位點(例如，在酶結構域中)以及抗原結合部位，其中抗原結合部位與抗原結合且因此使催化位點靶向抗原。催化位點可以抑制抗原的生物功能，例如通過切割。衍々標記^拔#本發明的抗ErbB2抗體或抗原結合部分可以衍生或與另一種分子(例如另一種肽或蛋白質)連接。一般而言，抗體或其部分這樣衍生，從而使得ErbB2結合不受衍生或標記不利地影響。因此，本發明的抗體和抗體部分預期包括本文描述的完整和經修飾形式的人抗ErbB2抗體。例如，本發明的抗體或抗體部分可以與一種或多種其他分子實體功能連接(通過化學偶聯、遺傳融合、非共價結合或其他方式)，所述分子實體例如另一種抗體(例如，雙特異性抗體或雙抗體)、檢測試劑、細胞毒劑、藥物試劑和/或可以介導抗體或抗體部分與另一種分子的結合的蛋白質或肽(例如鏈霉抗生物素蛋白核心區或多組氨酸標記)。一種類型的衍生抗體通過使2種或更多抗體(相同類型或不同類型，例如以制備雙特異性抗體)交聯來產生。合適的交聯劑包括異雙功能、具有由合適的間隔基分開的2個不同的反應基團(例如間馬來酰亞胺苯曱酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同雙功能(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)的那些。此種接頭可從PierceChemicalCompany,Rockford，Il獲得。另一種類型的衍生抗體是標記的抗體。本發明的抗體或抗原結合部分可以由其衍生的有用的檢測劑包括熒光化合物，包括焚光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二曱胺-l-萘(napthalene)磺酰氯、藻紅蛋白、鑭系元素磷光體等。抗體還可以用對于檢測有用的酶進行標記，例如辣根過氧化物酶、p-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶等。當抗體用可斥全測的酶進行標記時，它通過添加酶用于產生可以分辨的反應產物的另外試劑進行檢測。例如，當試劑辣根過氧化物酶存在時，過氧化氬和二氨基聯苯胺的添加導致可檢測的有色的反應產物。抗體還可以用生物素進行標記，并且通過抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結合的間接測量進行檢測。抗體還可以用由次級報道分子識別的預定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、關于第二抗體的結合部位、金屬結合結構域、附加表位)進行標記。在一些實施方案中，標記通過各種長度的間隔臂進行附著以減少潛在的位阻。抗ErbB2抗體還可以用放射性標記的氨基酸進行標記。放射性標記可以用于診斷和治療用途。例如，放射性標記可以通過x射線或其他診斷技術用于檢測ErbB2表達細胞。此外，放射性標記可以在治療上用作毒素用于ErbB2表達細胞，例如引起不希望有的免疫應答的那些。用于多肽的標記的例子包括但不限于，下述放射性同位素或放射性核素3H、14C、15N、35S、90Y、"Tc、川In、125I和131I。在一些實施方案中，抗ErbB2抗體可以用在成^^后可^f企測的順^磁、放射性或熒光離子進行標記。在一些實施方案中，順磁離子是鉻(m)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、禮(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)或餌(III)。在其他實施方案中，放射性離子是碘123、锝99、銦111、錸188、錸186、銅67、碘131、釔90、碘125、砹211和鎵67。在其他實施方案中，抗ErbB2抗體用X射線顯像劑例如鑭(III)、金(III)、鉛(II)和鉍(III)進行標記。抗ErbB2抗體還可以用化學基團例如聚乙二醇(PEG)、曱基或乙基、或碳水化合物基團進行衍生。這些基團用于改善抗體的生物學特征，例如增加血清半衰期或增加組織結合。藥物組合物和試劑盒本發明涉及用于治療需要治療程序的受試者的包含具有拮抗劑性質的耙向結合劑和/或人抗ErbB2抗體的組合物，所述受試者包括但不限于被癌癥折磨的那些。在一些實施方案中，治療的受試者是人。在其他實施方案中，受試者是獸醫學受試者。治療可以涉及單獨或連同藥學上可接受的載體的本發明的一種或多種抑制性抗ErbB2單克隆抗體、或其抗原結合片段的施用。本發明的抑制性抗ErbB2抗體和包含其的組合物可以與一種或多種其他治療、診斷或預防試劑組合使用。在某些實施方案中，公開的治療劑可以包括抗腫瘤劑。抗腫瘤劑包括但不限于基于柏的試劑，例如卡柏和順輛；氮芥烷化劑；亞硝基脲烷化劑，例如卡莫司汀(BCNU)和其他烷化劑；抗代謝物，例如氨曱蝶呤；噪呤類似物抗代謝物；嘧啶類似物抗代謝物，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他濱；激素抗胂瘤劑，例如性瑞林、醋酸亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗腫瘤劑，例如紫杉烷(例如多西他賽和紫杉醇)、阿地白介素、白細胞介素-2、依托泊苷(VP-16)、干擾素a和維曱酸(ATRA);抗生素天然抗腫瘤劑，例如博來霉素、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素和絲裂霉素；和長春花生物堿天然抗肺瘤劑，例如長春堿和長春新堿。在各種實施方案中，抗腫瘤劑是5-氟尿嘧啶、6-巰基。票呤(6-mercatopurine)、放線菌素、Adriamycin、Adrucil、氨魯米特、阿那曲。坐、Aredia、Arimidex、Aromasin、Bonefos、十專來霉素、卡鉑、放線菌素C(Cactinomycin)、卡培他濱、順鉑、骨膦、環磷酰胺、Cytadren、Cytoxan、放線菌素D、多西他賽、Doxyl、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、依西美坦、Femam、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、Halotestin、Herceptin、來曲唑、亞葉酸鈣、Megace⑧、醋酸曱地孕酮、氨曱蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、Mutamycin、Navelbine⑧、Nolvadex、No穆trone⑧、Oncovin、Ostac⑧、紫杉醇、氨輕二磷酸二鈉、Pharmorubicin、Platinol、潑尼松、Procytox⑧、Tamofen、Tamone、Tamoplex、他莫昔芬、Taxol、Taxotere⑧、司待曼布、遂替哌、Velbe⑧、Vepesid⑧、長春堿、長春新堿、長春烯堿、Xdoda⑧或其組合。在一些實施方案中，抗肺瘤劑包含單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或抗體的片段。示例性抗體包括但不限于，Rituxan、IDEC-C2B8、抗-CD20Mab、Panorex、3622W94、在腺癌上的抗-EGP40(17-1A)泛癌抗原(pancarcinomaantigen)Herceptin、Erbitux、抗-Her2、抗-EGFr、BEC2、抗-獨特型-GD3表位、Ovarex、B43.13、抗-獨特型CA125、4B5、抗-VEGF、RhuMAb、MDX-210、抗-HER2、MDX-22、MDX-220、MDX-447、MDX誦260、抗-GD-2、Quadramet、CYT畫424、IDEC-Y2B8、Oncolym、Lym-l、SMARTM195、ATRAGEN、LDP-03、抗-CAMPATH、iort6、抗CD6、MDX-ll、OV103、Zenapax、抗-Tac、抗-IL-2受體、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、抗-組蛋白、Gliomab誦H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA676、Monopharm-C、抗陽FLK-2、SMART1D10、SMARTABL364、ImmuRAIT-CEA或其組合。在另外一個實施方案中，抗腫瘤劑包含另外類型的腫瘤細胞。在具體實施方案中，另外類型的腫瘤細胞是MCF-10A、MCF-10F、MCF-10-2A、MCF-12A、MCF-12F、ZR-75-l、ZR-75-30、UACC曙812、UACC-893、HCC38、HCC70、HCC202、HCC1007BL、HCC1008、HCC1143、HCC1187、HCC1187BL、HCC1395、HCC1569、HCC1599、HCC1599BL、HCC1806、HCC1937、HCC1937BL、HCC1954、HCC1954BL、HCC2157、Hs274.T、Hs281.T、Hs343.T、Hs362.T、Hs574.T、Hs579.Mg、Hs605.T、Hs742.T、Hs748.T、Hs875.T、MB〗57、SW527、184A1、184B5、MDA-MB-330、MDA-MB-415、MDA-MB-435S、MDA-MB-436、MDA畫MB-453、MDA-MB-468RT4、BT-474、CAMA-1、MCF7[MCF-7]、MDA-MB-134畫VI、MDA-MB-157、MDA-MB-175-VIIHTB-27MDA-MB-361、SK-BR-3或ME-180纟田胞，所有這些可從ATCC獲得。在再進一步的實施方案中，抗腫瘤劑包含反義試劑，例如siRNA或發夾RNA分子，其減少在癌細胞中表達的基因的表達或功能。可以使用的示例性反義試劑包括針對粘蛋白、Ha-ras、VEGFR1或BRCA1的那些。此種試劑在美國專利號6,716,627(粘蛋白)、6,723,706(Ha-ras)、6,710,174(VEGFR1)以及美國專利公開號2004/0014051(BRCA1)中得到描述。在進一步的實施方案中，抗腫瘤劑包含受試者自體的細胞，例如免疫系統的細胞例如巨噬細胞、T細胞或樹突。在一些實施方案中，細胞已用抗原例如肽或癌抗原進行處理，或已與來自患者的腫瘤細胞進行溫育。在一個實施方案中，自體外周血淋巴細胞可以與SV-BR-1細胞混合且施用于受試者。此種淋巴細胞可以通過白細胞提取法(leukaphoresis)進行分離。可以使用的合適的自體細胞、關于其分離的方法、修飾所述細胞以改善其效力的方法和包含所述細胞的制劑在美國專利號6,277,368、6,451,316、5,843,435、5,928,639、6,368，593和6,207,147中以及國際PCT公開號WO04/021995和WO00/57705中得到描述。在本文描述的涉及癌癥治療的方法的一些實施方案中，受試者在用本發明的細胞治療之前、同時或之后用針對癌癥的輔助療法進行治療，所述輔助療法例如外科手術、化學療法、放射療法或激素療法或其組合。在其中癌癥是乳腺癌的具體實施方案中，輔助療法可以包含乳房保留外科手術(breast-sparingsurgery)，即去除癌癥而不是乳房的手術，也稱為乳房保留外科手術、乳房保存外科手術、乳房腫瘤切除術、乳房部分切除術、或部分乳房切除術。在另一個實施方案中，它包含乳房切除術。乳房切除術是去除乳房或盡可能多的乳房組織，并且在一些情況下還去除腋下的淋巴結的手術。在另外一個實施方案中，外科手術包含警戒淋巴結活組織檢查，其中去除僅一個或少數淋巴結(警戒淋巴結)而不是去除更大量的腋下淋巴結。外科手術還可以包含改良徹底乳房切除術，其中外科醫生去除整個乳房、腋下的大多數或所有淋巴結、和通常胸肌上的襯里。還可以去掉2個胸肌中的較小的以使得易于去除淋巴結。在具體實施方案中，輔助療法包含放射療法。放射療法可以包含外照射，其中放射來自機器，或來自內照射(植入放射，其中放射源自直接放入乳房中的薄塑料管中放置的放射性材料。在另一個具體實施方案中，輔助療法包含化學療法。發現在腫瘤抑制中有幫助的化學治療劑包括但不限于烷化劑(例如氮芥)、抗代謝物(例如嘧咬類似物)、放射性同位素(例如磷和碘)、混雜試劑(例如取代尿素)和自然產物(例如長春花生物堿和抗生素)。在具體實施方案中，化學治療劑選自別嘌醇鈉、甲磺酸多拉司瓊、帕米膦酸鈉、依替膦酸鈉、氯康唑、阿法依伯汀、鹽酸左旋咪唑、氨磷丁、鹽酸格雷西隆、亞葉酸鈣、沙格司亭、屈大麻酚、美司鈉、非格司亭、鹽酸匹魯卡品、乙酸善锝定、右雷佐生、鹽酸奧丹西隆、奧丹西隆、白消安、卡鉑、順鉑、P塞替哌、鹽酸美法侖、美法侖、環磷酰胺、異環磷酰胺、笨丁酸氮芥、鹽酸氮芥、卡莫司汀、羅莫司丁、具有卡莫司汀植入的聚苯丙生20(polifeprosan20)、鏈脲霉素、鹽酸阿霉素、硫酸博來霉素、鹽酸柔紅霉素、放線菌素D、檸檬酸柔紅霉素(daunorucbicincitrate)、鹽酸去甲柔毛霉素、plimycin、絲裂霉素、噴司他丁、米托蒽醌、戊柔比星、阿糖胞苷、磷酸氟達拉濱、氟尿苷、克拉屈濱、氨曱蝶呤、巰基嘌呤(mercaptipurine)、硫鳥嘌呤、卡培他濱、曱基睪酮、尼魯米特、睪內酯、比卡魯胺、氟他胺、阿那曲唑、檸檬酸托瑞米芬、雌氮芥磷酸鈉、炔雌醇、雌二醇、酯化雌激素、綴合雌激素、醋酸亮丙瑞林、醋酸性瑞林、醋酸曱羥孕酮、醋酸甲地孕酮、鹽酸左旋咪唑、阿地白介素、鹽酸依立替康、達卡巴溱、天冬酰胺酶、磷酸依托泊芬、鹽酸吉西他濱、六甲密胺、鹽酸拓樸替康、羥基脲、干擾素a-2b、米托坦、鹽酸丙卡巴肼、長春瑞賓、大腸桿菌L-天冬酰胺酶、歐文氏菌屬(Erwinia)L-天冬酰胺酶、石克酸長春新石咸、地尼白介素(denileukindiftitox)、阿地白介素、利妥希瑪、干擾素a-2a、紫杉醇、多西他賽、活BCG(膀胱內的)、硫酸長春堿、依托泊苷、維曱酸、替尼泊苷、卟吩姆鈉、氟尿嘧啶、倍他米松磷酸酯鈉和醋酸倍他米松、來曲唑、依托泊苷亞葉酸鈣(citrororumfactor)、亞葉酸、亞葉酸4丐(calciumleucouorin)、5畫氟尿嘧。定(5-fluorouncil)、亞得里亞霉素、環磷酰胺和雙氯雙氨鉑(diaminodichloroplatinum),所述化學治療劑與胸腺素al組合以有效減少所述患者中的化學療法的所述副作用的量施用。在另一個具體實施方案中，輔助療法包含激素療法。激素療法可以包含藥物例如他莫昔芬的使用，其可以阻斷天然激素如雌激素或可以包含阻止雌二醇合成的芳香酶抑制劑。可替代的，激素療法可以包含去除受試者的卵巢，特別是如果受試者是仍未經歷絕經的女性的話。如本文所使用的，"藥學上可接受的載體"意指生理學相容的任何和所有溶劑、分散介質、涂層、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。藥學上可接受的載體的一些例子是水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。在許多情況下，將優選在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉。藥學上可接受的物質的另外例子是濕潤劑或小量輔助物質例如濕潤或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，其增強抗體的貯存期限或效力。本發明的組合物可以為多種形式，例如液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液(例如可注射和可輸注溶液)、分散體或懸浮液、片劑、丸劑、粉末、脂質體和栓劑。優選形式依賴于預期的施用方式和治療應用。一般優選的組合物是可注射或可輸注溶液的形式，例如類似于用于人的被動免疫接種的那些的組合物。優選的施用方式是腸胃外的(例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌內)。在另一個實施方案中，抗體經由靜脈內輸注或注射進行施用。在另一個優選實施方案中，抗體經由肌內或皮下注射進行施用。治療組合物一般必須在制備和貯存條件下是無菌的且是穩定的。組合物可以配制為溶液、微乳、分散體、脂質體或適合于高藥濃度的其他有序結構。無菌可注射溶液可以根據需要通過將所需量的抗ErbB2抗體摻入具有上文列舉的成分之一或組合的合適溶劑中進行制備，隨后過濾滅菌。一般地，分散體通過將活性化合物摻入無菌媒介物內進行制備，所述無菌媒介物包含基本分散介質和來自上文列出的那些的所需其他成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液的任何另外所需成分的粉末。溶液的正確的流動性可以通過下述得到維持，例如使用涂層例如卵磷脂，在分散體的情況下維持所需顆粒大小和使用表面活性劑。可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中包括延遲吸收的試劑來達到，所述試劑例如單硬脂酸鹽和明膠。本發明的抗體可以通過本領域已知的多種方法進行施用，盡管對于許多治療應用，優選的施用途徑/方式是皮下、肌內或靜脈內輸注。如本領域技術人員將理解的，施用途徑和/或方式將依賴于所需結果而變。在某些實施方案中，抗體組合物活性化合物可以用載體進行制備，所述載體將保護抗體免于快速釋放，例如控制釋放制劑，包括植入片、經皮貼劑和微嚢化遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚肝、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸、殼聚糖和藻酸鹽。用于制備此種制劑的許多方法是受專利保護的或本領域技術人員一般已知的。參見，例如，SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems(J.R.Robinson,編輯,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978)。抗ErbB2抗體。抗ErbB2抗體可以以來自加壓包或噴霧器的氣溶膠噴霧呈遞的形式方便地遞送給受試者，其借助于合適的推進劑，例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供閥以遞送計量的量來測定。可以配制包含化合物和合適的粉末基質例如乳糖或淀粉的粉末混合物的用于在吸入器或吹入器中使用的例如明膠的膠嚢和藥液筒。Dellamary等人，(2004)./Co",ra/;95(3):489-500描述了用于抗體的肺遞送的制劑。本發明還提供了適合于通過口部粘膜施用的組合物，其包含本文描述的抗ErbB2抗體。口部跨粘膜遞送指遞送纟某介物跨過口腔、咽腔或食管中的粘膜的遞送，且可以例如與其中藥物的吸收在小腸中發生的傳統的口部遞送形成對比。因此，其中抗ErbB2抗體通過口、舌下、牙齦、咽和/或食管粘膜吸收的施用途徑全都包含在"口部跨粘膜遞送"內，如那個術語在本文使用的。對于通過跨粘膜粘膜施用，抗ErbB2抗體可以例如配制成口香糖(參見美國專利號5,711,961)或口腔含化片劑(參見例如美國專利號5,298,256)。本發明還提供了適合于通過陰道粘膜施用的組合物，其包含本文描述的抗ErbB2抗體。本發明的抗ErbB2抗體可以配制成陰道栓劑、泡沫、乳膏、片劑、膠囊、軟膏或凝膠。在某些實施方案中，包含抗ErbB2抗體的藥物組合物用適合于待滲透的跨粘膜屏障的滲透劑進行配制。此種滲透劑是本領域一般已知的，且包括例如用于跨粘膜施用膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。在某些實施方案中，本發明的抗ErbB2抗體例如與惰性稀釋劑或可同化的可食用載體口部施用。化合物(若需要則和其他成分)還可以封入硬或軟殼明膠膠嚢中，壓縮成片劑，或直接摻入受試者的飲食內。對于口部治療施用，抗ErbB2抗體可以與賦形劑一起摻入，且以可攝取片劑、口腔含化片劑、錠劑、膠嚢、酏劑、懸浮液、糖漿、薄片(wafer)等的形式使用。為了通過除腸胃外施用外施用本發明的化合物，可能必須用阻止其失活的材料包被化合物，或使化合物與阻止其失活的材料共施用。另外的活性化合物也可以摻入組合物內。在某些實施方案中，本發明的抑制性抗ErbB2抗體與一種或多種另外的治療劑共配制和/或共施用，所述治療劑例如上文列出的那些。此種組合療法可能需要較低劑量的抑制性抗ErbB2抗體以及共施用的試劑，從而避免可能的毒性或與各種單一療法相關的并發癥。本發明的抑制性抗ErbB2抗體和包含其的組合物還可以與其他治療方案組合施用，特別是與外科放射學和/或化學療法處理組合。本發明的組合物可以包括"治療有效量"或"預防有效量"的本發明的抗體或抗原結合部分。"治療有效量"指在所需劑量和時間段有效達到所需治療結果的量。抗體或抗體部分的治療有效量可以根據諸如受試者的疾病狀態、年齡、性別和重量以及抗體或抗體部分在受試者中引發所需應答的能力的因素而變。治療有效量還是其中治療有利作用超過抗體或抗體部分的任何毒性或有害作用的量。"預防有效量"指在所需劑量和時間段有效達到所需預防結果的量。一般地，因為預防劑量在疾病前或在疾病的較早階段時在受試者中使用，所以預防有效量可以小于治療有效量。劑量方案可以進行調整以提供最佳所需應答(例如治療或預防應答)。例如，可以施用快速灌注劑，或可以隨著時間過去施用幾次分份劑量，或可以如由治療狀況的緊急指出的按比例減少或增加劑量。為了易于施用和劑量的一致性，以單位劑型配制腸胃外組合物是特別有利的。如本文所使用的，單位劑型指作為用于待治療的哺乳動物受試者的單位劑量適合的物理上不連續的單位；每個單位包含經計算以與所需藥物載體結合產生所需療效的預定量的活性化合物。關于本發明的單位劑型的規格由下述指出且直接依賴下迷(a)抗ErbB2抗體或其部分的獨特特征和待達到的特定治療或預防作用，和(b)配制這種抗體用于處理受試者中的敏感性的領域中固有的限制。制性范圍是0.025-50mg/kg,更優選0.1-50mg/kg,更優選0.1-25、0.1-10或0.1-3mg/kg。在一些實施方案中，制劑包含在20mM檸檬酸鈉，pH5.5、140mMNaCl和0.2mg/ml聚山梨醇酯80的緩沖液中的5mg/ml抗體。應當指出劑量值可以依賴于待緩和的狀況的類型和嚴重度而變。應進一步理解對于任何特定受試者，特定劑量方案應根據個體需要和個人施用或監督組合物的施用的專業判斷隨著時間過去進行調整，并且本文闡述的劑量范圍僅是示例性的且不意欲限制所要求保護的組合物的范圍或實踐。或包含此種抗體的組合物的試劑盒。除抗體或組合物外，試劑盒可以包括診斷或治療劑。試劑盒還可以包括用于在診斷或治療法中使用的說明書。在另一個實施方案中，試劑盒包括抗體或包含其的組合物和可以在下文描述的方法中使用的診斷劑。在另一個優選實施方案中，試劑盒包括抗體或包含其的組合物和可以在下文描述的方法中使用的一種或多種治療劑。使用的診斷法在另一個方面，本發明提供了診斷法。抗ErbB2抗體可以用于在體外或體內檢測生物樣品中的ErbB2。在一個實施方案中，本發明提供了用于診斷有此需要的受試者中ErbB2表達細胞的存在或位置的方法，其包括下述步驟將抗體施用到受試者內，通過定位抗體結合于何處來測定ErbB2在受試者中的表達，使受試者中的表達與正常參考受試者或標準的那種比較，且診斷細胞的存在或定位。抗ErbB2抗體還可以用作增歹直才示^己。抗ErbB2抗體可以在常規免疫測定中使用，包括但不限于ELISA、RIA、流式細胞術、組織免疫組織化學、蛋白質印跡或免疫沉淀。本發明的抗ErbB2抗體可以用于檢測來自人的ErbB2。在另一個實施方案中，抗ErbB2抗體可以用于檢測來自獼猴或恒河猴的ErbB2。在另一個實施方案中，抗ErbB2抗體可以用于檢測來自嚙齒類動物例如小鼠和大鼠的ErbB2。本發明提供了用于檢測生物樣品中的ErbB2的方法，其包括使生物樣品與本發明的抗ErbB2抗體接觸且檢測結合的抗體。在一個實施方案中，抗ErbB2抗體用可^r測標記直接進行標記。在另一個實施方案中，抗ErbB2抗體(第一種抗體)是未標記的且可以結合抗ErbB2抗體的第二種抗體或其他分子是標記的。如本領域技術人員眾所周知的，選擇能夠特異性結合特定物種和種類的第一種抗體的第二種抗體。例如，如果抗ErbB2抗體是人IgG，那么第二種抗體可以是抗人-IgG。可以與抗體結合的其他分子包括但不限于A蛋白和G蛋白，這兩者都例如從PierceChemicalCo商購可得。關于抗體或第二抗體的合適的標記已在上文公開，且包括各種酶、輔基、熒光材料、發光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三漆基胺(dichlorotnazinylamine)熒光素、丹石黃酰氯或藻紅蛋白；發光材料的例子包括魯米諾；且合適的放射性材料的例子包括1251、1311、"S和3h。在其他實施方案中，ErbB2可以在生物樣品中通過竟爭免疫測定進行測定，其中利用用可檢測物質標記的ErbB2標準和未標記的抗ErbB2抗體。在這種測定中，將生物樣品、標記的ErbB2標準和抗ErbB2抗體組合，且測定與未標記的抗體結合的標記的ErbB2標準的量。生物樣品中的ErbB2的量和與抗ErbB2抗體結合的標記的ErbB2標準的量成反比。人們可以使用上文公開的免疫測定用于許多目的。例如，抗ErbB2抗體可以用于4企測培養細胞中的ErbB2。在另一個實施方案中，抗ErbB2法可以用于鑒定調節ErbB2蛋白質水平的化合物。根據這種方法，一種細胞樣品用測試化合物處理一段時間，而另一種樣品不予處理。如果測量ErbB2的總水平，那么將細胞裂解且使用上文描述的免疫測定之一測量總ErbB2水平。比較處理對未處理細胞中的ErbB2的總水平以測定測試化合物的作用。用于測量總ErbB2水平的優選免疫測定是流式細胞術或免疫組織化學。如果測量ErbB2的細胞表面水平，那么細胞不被裂解，且使用上文描述的免疫測定之一測量ErbB2的細胞表面水平。用于測定ErbB2的細胞表面水平的優選免疫測定包括下述步驟用可^r測標記例如生物素或1251標記細胞表面蛋白質，用抗ErbB2抗體使ErbB2免疫沉淀且隨后檢測標記的ErbB2。用于測定ErbB2的定位例如細胞表面水平的另一種優選免疫測定是通過使用免疫組織化學。檢測ErbB2的細胞表面水平的優選免疫測定包括用合適的熒光團例如熒光素或藻紅蛋白標記的抗ErbB2抗體的結合，且使用流式細胞術檢測第一抗體。在另一個實施方案中，抗ErbB2抗體是未標記的且可以結合抗ErbB2抗體的第二抗體或其他分子是標記的。方法例如ELISA、RIA、流式細胞術、蛋白質印跡、免疫組織化學、整合膜蛋白質的細胞表面標記和免疫沉淀是本領域眾所周知的。參見，例如Harlow和Lane,同上。此外，免疫測定可以按比例擴大用于高通量篩選以就ErbB2的活化或抑制測試大量化合物。本發明的抗ErbB2抗體還可以用于測定組織或衍生自組織的細胞中的ErbB2的水平。在一個實施方案中，抗ErbB2抗體用于測定ErbB2表達細胞向組織內的浸潤，所述組織不表達ErbB2或與浸潤細胞相比較以減少水平表達其。在一些實施方案中，組織是患病組織。在一些實施方案中，組織是組織活組織檢查。在該方法的一些實施方案中，從受試者中切除組織或其活組織檢查。組織或活組織檢查隨后在免疫測定中用于通過上文討論的方法測定例如總ErbB2水平、ErbB2的細胞表面水平或ErbB2的定位。此種方法可以用于測定組織是否表達高水平的ErbB2，這可以指示組織是用抗ErbB2抗體治療的耙。一些實施方案中，抗ErbB2抗體用于鑒定ErbB2表達細胞。使用本發明的人抗ErbB2抗體的一個優點是它們可以在體內安全地使用，而不在施用后引發針對抗體的相當大免疫應答，這與非人起源的抗體或與人源化或嵌合抗體不同。該方法包括下述步驟給需要此種診斷測試的受試者施用可4企測標記的抗ErbB2抗體或包含其的組合物，且對受試者實施成像分析以測定ErbB2表達組織的位置。成像分析是醫學領域眾所周知的，且包括但不限于x射線分析、磁共振成像(MRI)或計算機斷層攝影術(CT)。抗體可以用適合于體內成像的任何試劑進行標記，例如造影劑，例如鋇，其可以用于x射線分析，或磁造影劑，例如釓螯合物，其可以用于MRI或CT。其他標記試劑包括但不限于放射性同位素例如"Tc。在另一個實施方案中，抗ErbB2抗體將是未標記的，且將通過施用可才企測且可以結合抗ErbB2抗體的第二種抗體或其他分子進行成像。在另一個實施方案中，從受試者獲得活組織檢查以測定目的組織是否表達ErbB2。在一些實施方案中，可檢測標記的抗ErbB2抗體包含熒光團。在某些實施方案中，熒光團選自近紅外線熒光染料、二硝基苯基、熒光素及其衍生物、羅丹明、羅丹明的衍生物、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二醛(o-phthaldehyde)和熒光胺、德克薩斯紅、羅丹明綠(RhodamineGreen)、Oregon綠、Cascade藍(CascadeBlue)、藻紅蛋白、CY3、CY5、CY2、CY7、香豆素、紅外線40、MR200、IRD40、AlexaFluor、Cascade藍、四曱基羅丹明(Tetmmethylrhodamine)、太平洋藍(PacificBlue)、SYBR和BODIPY。在另一個實施方案中，熒光團包括下述化合物之一，其最大發射在括號中以nm指出，Cy2(506)、GFP(紅移的(RedShifted))(507)、YO-PRO-l(509)、YOYO-l(509)、Calcein(517)、FITC(518)、FluorX(519)、Alexa(520)、羅丹明110(520)、5畫FAM(522)、OregonGreen500(522)、OregonGreen488(524)、RiboGreen(525)、RhodamineGreen(527)、羅丹明123(529)、MagnesiumGreen(531)、CalciumGreen(533)、T〇-PRO-l(533)、TOTO-l(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPY(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3(570)、Alexa546(570)、TRITC(572)、MagnesiumOrange(575)、藻紅蛋白R&B(575)、羅丹明鬼筆環肽(RhodaminePhalloidin)(575)、CalciumOrange(576)、PyroninY(580)、羅丹明B(580)、TAMRA(582)、RhodamineRed(590)、Cy3.5(596)、ROX(608)、CalciumCrimson(615)、Alexa594(615)、TexasRed(615)、尼羅紅(NileRed)(628)、YO-PRO-3(631)、YOYO⑧醫3(631)、R-藻藍蛋白(642)、C-藻藍蛋白(648)、TO-PRO-3(660)、TOTO-3(660)、DiDDilC(5)(665)、Cy5TM(670)、Thiadicarbocyanine(671)和Cy5.5(694)。使用的治療方法在另一個實施方案中，本發明提供了通過給有此需要的受試者施用把向結合劑和/或抗ErbB2抗體用于抑制ErbB2活性的方法。在另一個實施方案中，抗ErbB2抗體是人、嵌合或人源化抗體。在另一個優選實施方案中，ErbB2是人的且受試者是人受試者。可替代地，受試者可以是表達耙向結合劑和/或抗ErbB2抗體與之交叉反應的ErbB2的哺乳動物。靶向結合劑和/或抗體可以施用于表達抗體與之交叉反應的ErbB2的非人哺乳動物(即獼猴)，用于獸醫學目的或作為人疾病的動物模型。此種動物^t型可以用于評估本發明的抗體的治療功效。在一個實施方案中，本發明提供了通過給受試者施用治療有效量的本發明的靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體來治療或預防受試者中ErbB2介導的病癥的方法。如本文所使用的，術語"ErbB2介導的病癥"意欲包括這樣的疾病和其他病癥，其中患有病癥的受試者中高或增加水平的ErbB2表達或活性的存在已顯示負責病癥的病理生理學，或懷疑負責病癥的病理生理學，或是或懷疑是有助于病癥惡化的因素。此種病癥可以通過例如下述得到證明在患有病癥的受試者的受累細胞或組織中在細胞表面上ErbB2表達或水平中的增加，或有助于病癥的病理學或有助于病癥的惡化的細胞類型例如癌細胞中ErbB2介導的活性中的增加。ErbB2水平中的增加可以例如使用抗ErbB2抗體進行沖企測。ErbB2活性中的增加可以通過增加的ErbB2磷酸化、MAPK途徑的活化、p38-TSP-l途徑的活化、PI3K途徑的活化、CDC2的抑制及其組合進行檢測。本發明的另一個方面提供了用于抑制有此需要的受試者中表達ErbB2的癌細胞的增殖的方法，該方法包括給所述受試者施用耙向結合劑和/或抗ErbB2抗體或其抗原結合部分的步驟，其中所述靶向結合劑或抗體或部分抑制ErbB2。另一個方面提供了用于抑制表達ErbB2的細胞中的ErbB2活性的方法，其包括使細胞與耙向結合劑、抗ErbB2抗體或其抗原結合部分接觸，其中細胞中的ErbB2活性選自(a)ErbB2的磷酸化；(b)MAPK途徑的活化；(c)p38-TSP-l途徑的活化；(d)PI3K途徑的活化；(e)CDC2的抑制；和(f)其組合。在另一個實施方案中，細胞在受試者中。靶向結合劑和/或抗體可以施用l次，但更優選施用多次。耙向結合劑和/或抗體可以從每天施用3次到每6個月或更長時間施用1次。施用可以在下述時間表上，例如每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每3天1次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2月1次、每3月l次和每6月1次。靶向結合劑和/或抗體還可以經由微泵連續施用。靶向結合劑和/或抗體可以經由口部、粘膜、口腔、鼻內、吸入、靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、目艮內、脊柱內、腸胃外、粘膜內或局部途徑進行施用。靶向結合劑和/或抗體可以局部或全身施用。包含靶向結合劑和/或抗ErbB2抗體的治療組合物可以例如口部、經鼻、陰道、口腔、直腸、經由眼或經由肺途徑以多種藥學上可接受的給藥形式施用于受試者，這將是本領域技術人員熟悉的。例如，抗ErbB2抗體可以經由鼻途徑使用鼻吹入器裝置進行施用。這些的例子已用于預期用于鼻應用的商業粉末系統(例如FisonsLomudalSystem)。其他設備的細節可以在藥學文獻中找到(參見例如Bell,A.IntranasalDeliverydevices，inDrugDeliveryDevicesFundamentalsandApplications,TyleP.(編輯)，Dekker,NewYork,1988)。抗ErbB2抗體可以在冷凍干燥粉末制劑中施用于陰道。抗ErbB2抗體可以在陰道敷料器中施用，且一旦在陰道中，包含抗ErbB2抗體的制劑就通過按壓敷料器上的注射器型活塞或類似釋放機制得到釋放。可替代地，抗ErbB2抗體可以使用粉末設備配制成粉末，配制成陰道栓劑或陰道環或陰道片劑或陰道凝膠。抗ErbB2抗體還可以在凝膠制劑中施用于眼。例如，在施用前，包含抗ErbB2抗體的制劑可以方便地包含在2區室單位劑量容器中，一個區室包含冷凍干燥的抗ErbB2抗體制劑且另一個區室包含生理鹽水。在應用前，使2個區室混合且形成凝膠，這隨后施用于眼。吸入器經由肺途徑，經由配制成片劑或口腔含化貼劑的口腔途徑，經由配制成栓劑的直腸途徑；和以片劑、膠嚢或小丸的形式經由口部途徑(所述組合物可以經由胃、小腸或結腸施用試劑)，所有這些都可以依照本領域技術人員眾所周知的技術進行配制。抗體一般將如上所述作為藥物組合物的部分進行施用。抗體的劑量一般將是0.1-100mg/kg,更優選0.5-50mg/kg,更優選1-20mg/kg,且甚至更優選l-10mg/kg。抗體的血清濃度可以通過本領域已知的任何方法進行測量。抗體與另外的治療劑的共施用(組合療法)包含施用包含抗ErbB2抗體和另外的治療劑的藥物組合物以及施用2種或更多分開的藥物組合物，一種包含抗ErbB2抗體且另一種或多種包含另外的治療劑。此外，盡管共施用或組合療法一般意指抗體和另外的治療劑彼此同時使用，但它還包含其中抗體和另外的治療劑在不同時候施用的情況。例如，抗體可以每3天施用l次，而另外的治療劑每天施用1次。可替代地，抗體可以在用另外的治療劑治療病癥之前或之后進行施用，例如在受試者具有用另外的試劑失敗的療法后。類似地，抗ErbB2抗體的施用可以在其j也療法如免疫療法之前或之后進4亍施用。抗體和一種或多種另外的治療劑(組合療法)可以施用1次、2次或至少直至狀況被治療、減輕或治愈的時間段。優選地，組合療法施用多次。組合療法可以從每天施用3次到每6個月施用l次。施用可以在下述時間表上，例如每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每3天1次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2月1次、每3月1次和每6月l次，或可以經由微泵連續施用。組合療法可以經由口部、粘膜、口腔、鼻內、吸入、靜脈內、皮下、眼內、脊柱內、腹膜內、肌內、腸胃外、粘膜內或局部途徑進行施用。在再進一步的實施方案中，抗ErbB2抗體用放射性標記、免疫毒素或毒素進行標記，或是包含毒性肽的融合蛋白。抗ErbB2抗體或抗ErbB2抗體融合蛋白使放射性標記、免疫毒素、毒素或毒性肽導向ErbB2表達細胞。在另一個實施方案中，放射性標記、免疫毒素、毒素或毒性肽在抗ErbB2抗體與細胞表面上的ErbB2結合后內在化。基因療法本發明的核酸分子可以經由基因療法施用于有此需要的受試者。療法可以在體內或先體外后體內。在另一個實施方案中，編碼重鏈和輕鏈的核酸分子施用于受試者。在更優選的實施方案中，核酸分子這樣施用，從而使得它們穩定整合到B細胞的染色體內，因為這些細胞特化用于產生抗體。在另一個實施方案中，前體B細胞先體外后體內進行轉染或感染且重新移植入有此需要的受試者內。在另一個實施方案中，前體B細胞或其他細胞使用已知感染目的細胞類型的病毒在體內進行感染。用于基因療法的一般載體包括脂質體、質粒和病毒載體。示例性病毒載體是逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。在體內或先體外后體內感染后，抗體表達水平可以通過從處理的受試者中獲取樣品和使用本領域已知的或本文討論的任何免疫測定進行監控。在另一個實施方案中，基因治療方法包括施用編碼抗ErbB2抗體的重鏈或其抗原結合部分的分離的核酸分子和表達核酸分子的步驟。在另一個實施方案中，基因治療方法包括施用編碼抗ErbB2抗體的輕鏈或其抗原結合部分的分離的核酸分子和表達核酸分子的步驟。在更優選的方法中，基因治療方法包括施用編碼本發明的抗ErbB2抗體的重鏈或其抗原結合部分的分離的核酸分子和編碼本發明的抗ErbB2抗體的輕鏈或其抗原結合部分的分離的核酸分子和表達核酸分子的步驟。基因治療方法還可以包括施用另一種治療劑例如抗癌劑的步驟。為了使本發明可以更好地理解，闡述了下述實施例。這些實施例僅為了舉例說明的目的且不應解釋為以任何方式限制本發明的范圍。實施例1免疫接種和滴定免疫接種包含人ErbB2的細胞外結構域和人IgGl的Fc區的重組人ErbB2-ECD/Fcryl融合蛋白4尋自R&DSystems,Inc.(Minneapolis,顧目錄弁1129-ER/CF)用于作為免疫原使用。針對ErbB2的單克隆抗體通過經由足墊途徑注射順次免疫XenoMouse小鼠(XenoMousestrainXM3B-3,Abgemx，Inc.Fremont,CA)得到開發。第一次注射用每只小鼠在TitermaxGold(Sigma,目錄#T2684,批次#K1599)中的10重組人ErbB2-ECD/Fcyl。隨后的10次加強用每只小鼠在15^1qCpG(ImmunEasyMouseAdjuvant,目錄#303101;Qiagen)中的10fxg重組人ErbB2-ECD/Fcyl,與5|xlAdju-Phos(磷酸鋁凝膠，目錄#1452-250,HCIBiosector)混合。每次注射的總體積是50inl/小鼠，25pl/足墊。小鼠每周免疫2次進行5周且在第39天時進行融合。通過滴度選擇動物用于收獲免疫的XenoMouse小鼠在第8次加強后放血，且通過FACS(熒光激活細胞分選儀)分析測定血清中的抗ErbB2抗體滴度。為了這個目的，構建人ErbB2表達載體且轉染小鼠前BB300.19細胞以表達人ErbB2蛋白質。人ErbB2cDNA通過RT-PCR衍生自人表皮樣癌A431細胞(ATCC,目錄弁CRL-1555),且通過HindIII和Notl內切核酸酶限制切割位點克隆到pCR3.1表達載體(Invitrogen，目錄#K3000)內。表達載體包含編碼全長人ErbB2的3768bp的插入片段。使用電穿孔法將上述質粒轉染到B300.19細胞內。表達hErbB2蛋白質的穩定的B300.19克隆在。票呤霉素(2.5ug/ml)的存在下進行選擇，且然后通過FACS用嵌合抗-hErbB2抗體(在本文中稱為2C4，如CancerImmunol.Immunotherapy(2006)55:717-727中詳述制備，名稱為"HumanizationofarecombinantmonoclonalantibodytoproduceatherapeuticHERdimenzationinhibitor,pertuzumab")隨后為山羊4元小鼠IgGPE(Caltag,目錄存M30004-4)進行篩選。選擇在FACS中給出最高Geomean的B300.19/hErbB2克隆#44用于血清滴度測定。來自免疫和放血小鼠的血清在FACS緩沖液(含2%FBS的PBS)中以1:50、1:250或1:1250稀度進行滴定。B300.19/hErbB2克隆弁44細胞(陽性細胞)和B300.19親本細胞(陰性細胞)與連續稀釋的血清溫育1小時，且隨后與Cy5-綴合的山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLabs/JIR,目錄#109-176-098)溫育另夕卜30分鐘。抗ErbB2mAb2C4用作陽性對照，而內部(Gmix)產生的抗KLHGl抗體用作G1同種型對照。徹底洗滌后，將細胞重懸浮于FACS緩沖液中且在BDFACS儀器上進行分析。每種樣品的Geomean在數據分析后進行測定且顯示于下表2中。關于ErbB2陽性細胞的Geomean超過關于ErbB2陰性細胞的Geomean的比與針對ErbB2的特異性結合能力關聯。陰性對照包括單獨的Gl同種型對照抗KLHGmix、第二對照抗體山羊抗小鼠IgGCy5(JIR,目錄#115-176-071)和山羊抗人IgGPE，給出小于1的Geomean比。然而陽性對照mAb2C4和來自所有10只免疫小鼠的血清給出2.98-7.55的比，因此所有小鼠都發展出針對人ErbB2的體液免疫應答。表2.血清滴度10只小鼠(XM3B-3品系)<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>實施例2淋巴細胞的回收、B細胞分離、融合和雜交瘤的產生從免疫小鼠中收獲淋巴結(LN)且加工入3ml無菌FASC緩沖液(PBS,2%FBS)中。使LN細胞通過40nm細胞濾器過濾，以400g向下旋轉(spindown)3分鐘且重懸浮于3ml新鮮的FACS緩沖液中。計數細胞，且隨后添加針對CD90(Pharmmgen,目錄#553002)、CD4(Pharmingen,目錄#553728)、CD8(Pharmingen,目錄#553029)和IgM(Pharmingen，目錄#555781)的生物素化的抗體。將細胞和上述抗體輕輕混合且在水上溫育IO分鐘。使細胞再次向下旋轉且用FACS緩沖液洗滌1次。以4:1珠與靶細胞的比向細胞加入SADynal珠(M-280),且在室溫下伴隨旋轉溫育12分鐘。將15ml管中的細胞/珠置于Dynal磁體的磁場中2分鐘。將包含IgM-級分的上清液轉移至新鮮管且將磁體步驟再重復1次。將細胞上清液轉移至最后的管且計數IgM細胞且等分試樣用于融合。融合通過使來自上文的洗滌的富集的B細胞和購自ATCC的非分泌骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞(目錄#CRL1580)(Kearney等人，J.Immunol.123，1979,1548-1550)以1:1的比混合來進行。細胞混合物通過在800xg下離心輕輕形成沉淀。完全取出上清液后，細胞用2-4ml鏈霉蛋白酶(Pronase)溶液(Ca舊iochem,目錄#53702;在PBS中0.5mg/ml)處理僅僅2分鐘。隨后加入3-5mlFBS以終止酶活性，且使用電促細胞融合溶液(ECFS:0.3M蔗糖、O.lmM乙酸鎂、O.lmM乙酸鈣，全部來自Sigma)將上清液調整至40ml總體積。離心后取出上清液且將細胞重懸浮于40mlECFS中。重復這個洗滌步驟且將細胞再次重懸浮于ECFS中至2xl06纟田胞/ml的濃度。4吏用融合發生器(型號ECM2001,Genetronic，Inc.，SanDiego，CA)根據標準儀器設置進行電促細胞融合。ECF后，從融合室中小心地取出細胞懸浮液且轉移至包含相同體積的雜交瘤培養基的無菌管內，所述雜交瘤培養基包含DMEM(JRHBiosciences)、15%FBS(Hyclone)，補加有L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、OPI(草酰乙酸、丙酮酸、牛胰島素)(全部來自Sigma)和IL-6(BoehringerMannheim)。細胞于37°C溫育15-30分鐘，且隨后在400xg(1000rpm)下離心5分鐘。隨后將細胞輕輕重懸浮于雜交瘤選擇培養基(補加有0.5xHA(Sigma,目錄#A9666)的雜交瘤培養基)中,其基于總共2xl05B細胞/96孔板和200孔的最終鋪平板。輕輕混合細胞且移液到96孔板內且允許生長。在第7或10天時，取出一半培養基，且細胞再補料雜交瘤選擇培養基。實施例3通過FMAT/FACS篩選抗體在培養14天后，通過FMAT(熒光微體積測定技術(FluorometricMicrovolumeAssayTechnology))就ErbB2特異性抗體篩選雜交瘤上清液。簡言之，使4275個B300.19/hErbB2(陽性細胞)或B300.19(ErbB2-陰性細胞)細胞與溶于15)ilFACS緩沖液中的400ng/mlCy5山羊抗人IgG(JIR，目錄#109-176-098)混合，且隨后與15pl雜交瘤上清液在室溫下溫育3小時。陽性對照抗體是抗hErbB2(2C4)，其用與SA-Cy5(JIR目錄#016-170-084,350ng/ml)組合的Cy5山羊抗小鼠IgGy(JIR,目錄#115-176-071)或山羊抗小鼠IgG-Biot(SouthernBiotechnology/SB目錄#1030-08，400ng/ml)進行4全測。抗KLHGl抗體(Gmix,內部的)用作同種型對照。板在來自AppliedBiosystems的FMAT8100HTS系統上進行讀數。在數據分析后測定熒光信號和計數，且鑒定了顯示與ErbB2陽性細胞而不與陰性細胞結合的362個陽性雜交瘤。FMAT篩選中的362個陽性上清液通過FACS以2組進行進一步篩選，一組用于hlgG重鏈沖全測且另一組用于人Igk輕鏈;險測，以證實關于Igy和IgK鏈的全人組成。使2.5x105B300.19/hErbB2細胞或B300.19親本細胞與在FACS緩沖液中以1:2稀釋的雜交瘤上清液于4。C溫育1小時，且隨后用PBS進行洗滌。細胞隨后與山羊抗人yCy5于4。C溫育l小時用于Igy檢測，或與山羊抗人kPE(SB目錄#2063-09)于4。C溫育1小時用于Igk檢測。洗滌后，在FACS分析前使細胞在1%低聚甲醛/PBS中進行固定。1:50稀度的匯合血清用作陽性對照，而1:10稀釋的Gmix(抗-KLHIgG)在測定中用作陰性同種型對照。陽性和陰性細胞之間的Geomean值的比進行制表且給出超過1.95的比的雜交瘤一見為命中(hit)。在這次篩選中證實了總共152種全人抗hErbB2IgG/k抗體。實施例4MCF7細胞中調蛋白-(3誘導的ErbB2磷酸化的抑制ErbB2通過與其他ErbB家族成員例如ErbB3二聚化在活化后是酪氨酸磷酸化的。與ErbB3結合的調蛋白-(3可以在人乳腺癌MCF7細胞中誘導ErbB2酪氨酸磷酸化，所述MCF7細胞表達ErbB2和ErbB3。為了鑒定阻斷ErbB2活化的抗體，我們在基于細胞的ErbB2磷酸化測定中篩選了152種人ErbB2結合抗體。MCF7細胞以25,000細胞/孔接種在96孔板中且在完全生長培養基(10%FCS)中培養過夜。第二天，細胞培養板用PBS洗滌次，且用無酚紅和無血清培養基替換培養基。細胞血清饑餓過夜，且隨后在用10nM調蛋白-P處理IO分鐘前，與和25|nl無酚紅培養基混合的25^1雜交瘤上清液溫育l小時。可替代地，細胞不血清饑餓但在調蛋白-(3處理前與雜交瘤上清液溫育過夜(24小時)。為了制備細胞裂解物，細胞在水冷的PBS中洗滌2次，且與100^1/孔裂解緩沖液(50mMTris隱HClpH7.7、1%TrixtonX-IOO、10%甘油、100mMNaCl、2.5mMEDTA、10mMNaF、40ug/mlPMSF、luM胃酶抑制劑、0.5ug/ml亮抑酶肽、10ug/ml大豆胰蛋白酶抑制劑、0.2mMNaV04、lmMNaMo04、5mMb-磷酸甘油)于4。C溫育30分鐘。磷-ErbB2水平使用來自R&Dsystems的人磷-ErbB2(Phosphor-ErbB2)ELISA試劑盒(人Phospho-ErbB2DuoSetIC,目錄#DYC1768)根據所提供的規程進行測量。基于在不存在抗體的情況下未刺激的細胞和調蛋白刺激的細胞中的pErbB2水平計算抑制百分比。圖1舉例說明當它們與MCF7細胞預溫育1小時對過夜溫育24小時時，測試的152種抗體的中和活性的相關性。當細胞與上清液預溫育l小時時，152種抗體中的51種給出超過30%的抑制。這些抗體可能通過阻斷ErbB2與ErbB3的二聚化來抑制ErbB2磷酸化。當細胞與雜交瘤上清液預溫育過夜時，明顯更多的抗體顯示超過30%的抑制。這些中的一些可能通過其他機制例如誘導ErbB2下調來達到這點。實施例5與CvnoErbB2的交叉反應性的測定為了測定這些抗體與非人靈長類動物獼猴ErbB2的物種交叉反應性，產生表達獼猴ErbB2的CH0-K1細胞。簡言之，從獼猴卵巢組織獲得cynoErbB2cDNA,且通過HindIII和Xbal限制性內切核酸酶位點克隆到pCR3.1表達載體內。包含3767bps的插入片段的表達載體cyno-ErbB2(FL)/pCr3.1使用Lipofectamine2000(Invitrogen,目錄#11668)根據所提供的規程轉染到CHO-kl細胞內。在lmg/ml的G418的存在下選擇表達cyno-ErbB2的CHO-kl的穩定克隆。表達通過FACS使用小鼠抗人c-ErbB2/c-neu(Ab-2)(Oncogene,目錄弁OP14)和山羊抗小鼠IgG-PE(Caltag,目錄弁M30004-4)得到證實。CHO-Kl/cynoE4rbB2克隆#4用于測量人ErbB2結合抗體的交叉反應性。使200,000個CHO-Kl/cynoErbB2克隆#4或親本CH0-K1細胞與1:2稀釋的雜交瘤上清液或2|iig/ml陽性對照抗體Ab-2(Oncogene,目錄弁OP14)于4。C溫育1小時。細胞用PBS洗滌1次，且隨后與第二檢測抗體5pg/ml山羊抗人IgGCy5或山羊抗小鼠IgGCy5于4。C溫育1小時。細胞用PBS洗滌3次，在r/。低聚曱醛/PBS中進行固定且隨后通過FACS進行分析。對于每次染色，陽性和陰性細胞之間的Geomean值的比進行制表且超過1.95的比視為陽性的。發現8種抗體不與cynoErbB2交叉反應且從隨后分析中排除。實施例6高抗原和有限抗原ELISAs表現cynoErbB2交叉反應性且當與細胞溫育1小時或過夜時還顯示ErbB2磷酸化^30。/。抑制的113種抗ErbB2抗體通過高抗原(HA)和有限抗原(LA)ELISAs進行進一步表征。HAELISA用包被在板上的高濃度的抗原來進行，并且是濃度依賴性反應；而LAELISA用包被在板上的有限量的抗原來進行，且因此是親和力依賴性反應。可以由HA/LA分析達到抗體的相對親和力分級。因為重組人ErbB2ECD-Fcyl融合蛋白不能用于這種目的，所以在內部產生人ErbB2ECD-myc/His融合蛋白。人ErbB2/ECDcDNA得自A431細胞，且通過Nhel和Xhol限制性內切核酸酶切割位點克隆到pSecTag2Hygro表達載體(Invitrogen，目錄弁V910-20)內。表達載體huErbB2(ECD)/pSecTag2BHygro包含對于僅ErbB2(ECD)1956bp的插入片段大小和對于hErbB2(ECD)力口c-myc/His標記2034bp的插入片段大小。質粒使用293fectin(Invitrogen目錄#12347-019)瞬時轉染到293T懸浮細胞內。細胞在轉染后用丁酸鈉處理1天以加強表達水平。轉染后4天，上清液在純化前就ErbB2(ECD)表達進行測試。對于ELISA檢測,1pg/ml山羊抗ErbB2(R&Dsystems,目錄弁AF1129)用于包被板，lpg/ml小鼠抗ErbB2(R&Dsystems,目錄#MAB1129)是第一檢測抗體且第二抗體是山羊抗小鼠IgG-HRP(Caltag，目錄#M30107)。收獲上清液且濃縮5倍，且隨后過夜透析到透析緩沖液(50mMNaH2P04，pH8,200mMNaCl)內。向上清液中加入咪唑至5mM的終濃度，并且使上清液與1/100體積的Ni-NTAsuperflow樹脂混合物(Qiagen,目錄#30430)在RT下溫育3小時。樹脂用包含50mMNaHP04、300mMNaCl和20mM咪唑的緩沖液進行洗滌，且隨后用包含250mM咪唑、50mMNaHP04和300mMNaCl的洗脫緩沖液進行洗滌。純化的蛋白質最后透析到PBS內以保存活性。純化的蛋白質huErbB2(ECD)/c-myc-His具有655AAs,具有72.2kDa的理論MW,在4-20。/oTris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠上運行到100kDa左右。蛋白質特性通過蛋白質印跡使用小鼠單克隆抗ErbB2(R&Dsystems,目錄存MAB1129)隨后為第二山羊抗小鼠IgG-HRP(Caltag，目錄弁M30107)加以證實。對于HA,將溶于PBS中的Ojig/ml人ErbB2ECD-myc/His包被在ELISA板上于4。C過夜。對于LA,包被100、500、250、125、62和31ng/ml人ErbB2ECD-myc/His。將抗原包被的板洗滌3次，用1%脫脂乳/PBS在室溫下封閉至少30分鐘，且隨后再洗滌3次。每個雜交瘤系樣品在1。/o脫脂乳/PBS1:3中滴定，進行從1:25稀釋開始的7個點。將連續稀釋的雜交瘤樣品或對照(Herceptin)轉移至HA包被的板，且將l:25稀釋的雜交瘤樣品轉移至LA包被的板。樣品在板上在室溫下溫育過夜進行18.5小時。第二天，將板洗滌3次且與50)iil400ng/ml免疫純的(immunopure)山羊抗人IgG(Fc)-HRP(Pierce目錄#31416)在室溫下溫育l小時。隨后，將板徹底洗滌且在紙巾上拍干以去除孔中殘留的HRP。向每個孔中加入HRP底物TMB(增強的K-blueTMB，Neogen目錄#308177)且溫育30分鐘。反應通過添加INHC1得到終止。在微量培養板閱讀儀(TiterteckMultiskanAscent)上閱讀在450nm處的光密度。雜交瘤上清液中ErbB2特異性抗體的濃度得自用已知濃度的Herceptin⑧在HAELISA中產生的標準曲線。對于每個雜交瘤樣品將31ng/ml抗原時的LAOD信號針對來自HA的抗體濃度進行繪圖，如圖2中所示。與該圖中右下角中的抗體相比較，左上角中的抗體具有相對高的親和力。實施例7雜交瘤克隆基于來自cyno交叉反應性測試、ErbB2磷酸化抑制的測定和LA/HAELISAs的數據，選擇31個雜交瘤系用于克隆。它們的活性概括于表3中。表3.選擇用于克隆的雜交瘤系的初步表征數據<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>每個雜交瘤系中的細胞以1細胞/孔在FACSAria(BD)上分選到%孔板內且培養約2周。來自單個克隆的上清液通過在表達高水平的ErbB2的BT474細胞上的FMAT就ErbB2結合活性，并且還就人Igy和k鏈組成，以及通過ELISA就人IgM和'J、鼠IgM的存在進行篩選。對于FMAT,使在384孔FMAT板中在40plFACS緩沖液中的6000個BT474細胞(ATCC)與15pl上清液在室溫下溫育2小時，且隨后在FMAT機器8200上讀數前與10pl4.5嗎/ml山羊抗人IgGCy5在室溫下溫育6小時。分析焚光和計數數據。Herceptin⑧在篩選中用作陽性對照。對于人抗體鏈組成分析，中等結合的96孔板(Coastar3368)用溶于PBS中的2|ig/ml山羊抗人IgGFc于4°C包被過夜，且用1%乳/PBS在室溫下封閉30分鐘。上清液在1。/。乳/PBS中1:5稀釋且加入2個包被的ELISA板中，且在室溫下溫育1小時。隨后添加在1。/q乳/PBS中250ng/ml的生物素化的山羊抗人k(Vector目錄弁BA3060)或在1%乳/PBS中250ng/ml的生物素化的山羊抗人、(SouthernBiotech目錄#2070-08),且在室溫下溫育1小時，隨后與以在1。/。乳/PBS中l嗎/ml的鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶綴合物在室溫下溫育1小時。板在溫育步驟之間徹底洗滌。添加50過氧化物酶底物TMB且在室溫下溫育30分鐘，且用50^lMHCL猝滅酶反應。在微量培養板閱讀儀(TiterteckMultiskanAscent)上閱讀在450nm處的光密度。我們如下證實人IgM的不存在。中等結合的96孔板(Coastar3368)用在PBS中的1)ig/ml山羊抗人IgM于4°C包被過夜，且用1%乳/PBS在室溫下封閉30分鐘。上清液在1。/。乳/PBS中1:5稀釋且加入包被的ELISA板中，且在室溫下溫育1小時。隨后添加在1W乳/PBS中666ng/ml的驢抗人IgMPOD(AccurateChemical目錄#JNH035043),且在室溫下溫育l小時。如上所述板通過添加POD底物進行顯色。我們如下證實人IgM的不存在。中等結合的96孔板用在PBS中的1|ng/ml山羊抗人小鼠入(SouthernBiotech1060-01)于4。C包被過夜，且用1W乳/PBS在室溫下封閉30分鐘。上清液在l。/。乳/PBS中1:5稀釋且加入包被的ELISA板中，且在室溫下溫育l小時。隨后添加在1%乳/PBS中400ng/ml的山羊抗人IgG(Fc)POD(Pierce目錄#31413),且在室溫下溫育1小時。如前所述板通過添加POD底物進行顯色。在上文描述的ELISAs中，來自不含第一抗體的孔的信號用作背景，且給出為背景的3倍的信號的樣品視為陽性的。通過FMAT證實與ErbB2天然結合且通過ELISAs證實對于人y鏈和k鏈陽性的單克隆抗體在克隆后得自20個雜交瘤系。測序來自每個親本系的3個亞克隆。除非另有說明，所有3個亞克隆都是相同的。例如，親本克隆1.14的亞克隆1.14.1、1.14.2和1.14.3全都具有相同的序列，且通過2數字親本名稱或3數字亞克隆名稱可互換地提及。鑒定了11種獨特的單克隆抗體且在基于細胞的功能測定中進行進一步表征。實施例8ErbB2單克隆抗體的結構分析測序了抗體的重鏈和輕鏈可變結構域。關于抗ErbB2抗體的全序列信息在具有關于每個Y和k鏈組合的核苷酸和氨基酸序列的序列表中提供。免疫球蛋白鏈的可變(v)區由多個種系DNA區段編碼，其在B細胞個體發育期間連接成功能可變區(VhDJh或VKJK)。分析可變重序列以測定VH家族、D-區序列和J-區序列。隨后翻譯序列以測定原始氨基酸序列，且與種系VH、D和J-區序列比較以評估體細胞高變。類似地分析高變輕鏈序列。表4和表4(a)是比較抗體重鏈區域與其同源的種系重鏈區域的表。表5是比較抗體k輕鏈區域與其同源的種系輕鏈區域的表。表4和4(a)之間的差異是用于限定重鏈CDRls的定義。公開于表4(a)中的重鏈CDRls具有Kabat定義。可替代地，CDRls可以使用可替代的定義進行限定以便包括FR1序列的最后4個殘基，如表4中所示。對ErbB2特異的20種個別抗體的分析指出它們中的一些是相同的，且僅11種獨特的單克隆抗體由克隆得到11種抗體的8種在序列中是非常相似的，且得自相同的種系VH和VK基因。還應當理解在特定抗體在氨基酸水平上不同于其各自的種系序列的場合，抗體序列可以突變回種系序列。此種校正突變可以使用標準分子生物學技術在l、2、3或更多位置或突變位置的任何一個的組合處發生。作為非限制性例子，表4顯示1.24.3的重鏈序列在氨基酸33處通過CDR1區中的T對S而不同于相應的種系序列。因此，編碼1.24.3的重鏈的氨基酸或核苷酸序列可以進行修飾以改變T至S,以產生在突變位點處的種系序列。在另一個例子中，1.140.1的重鏈序列在氨基酸42處通過在FR2區中的R對G而不同于相應的種系序列。因此，編碼1.140.1的重鏈的氨基酸或核苷酸序列可以進行修飾以改變R至G,以產生在突變位點處的種系序列。作為另一個非限制性例子，表5顯示了1.140.1的輕鏈序列通過FR1區中的T至N突變(突變1),通過CDR1區中的F至L、F至Y和C至Y(突變2、3和4),通過FR2區中的R至K和N至K(突變5和6)以及通過CDR3區中的F至Y、G至S和S至T而不同于相應的種系序列。因此，編碼1.140.1的輕鏈的氨基酸或核苷酸序列可以進行修飾以改變突變1,以產生在突變1的位點處的種系序列。進一步地，編碼1.140.1的輕鏈的氨基酸或核苷酸序列可以進行修飾以改變突變2,以產生在突變2的位點處的種系序列。再進一步地，編碼1.140.1的輕鏈的氨基酸或核苷酸序列可以進行修飾以改變突變3，以產生在突變3的位點處的種系序列。再次再進一步地，編碼1.140.1的輕鏈的氨基酸或核普酸序列可以進行修飾以改變突變1、突變2、突變3、突變4、突變5和突變6，以產生在這些處的種系序列。下表6舉例說明關于1.140來自種系的此種變異的位置。每行表示在由粗體類型指出的位置處種系和非種系殘基的獨特組合。表6還應用于抗體1.39,因為就種系突變而言，關于抗體1.39的輕鏈分析等同于1.140。此外，就種系突變而言，關于抗體1.96的輕鏈分析等同于1.140,除了抗體1.96具有在FR4中抗體序列和種系序列之間的差異。在這個例子中，抗體序列的L可以突變回F的種系序列，并且這個突變可以與表6中所示的任何組合相組合。在一個實施方案中，本發明的特征在于修飾CDR區即CDR1、CDR2和/或CDR3中的一個或多個氨基酸。在一個例子中，本文描述的抗體的重、輕或2條鏈的CDR3得到修飾。一般地，氨基酸用具有相似側鏈的氨基酸進行置換(保守氨基酸置換)，回到種系，或可以用任何合適的氨基酸例如丙氨酸或亮氨酸進行置換。在一個實施方案中，1.24.3CDR3，QQYSSPFT(SEQIDNO:48)可以例如通過使CDR3序列突變成QQYYSPFT(SEQIDNO:49)在一個或多個氨基酸處向回修飾。在另一個實施方案中，本發明的特征在于修飾抗體以去除不成對的半胱氨酸。不成對的半胱氨酸的例子出現在抗體1.39.1中氨基酸38處，抗體1.96.1中氨基酸38處，和關于抗體1.140.1在氨基酸38處。這些半胱氨酸可以突變回種系，例如使C突變成Y或通過使C突變成任何合適的氨基酸例如絲氨酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表5:輕鏈分析<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table>實施例9ErbB2低表達MCF7細胞中調蛋白-(3誘導的ErbB2磷酸化和細胞增殖的抑制如實施例4中所述，雜交瘤上清液可以抑制MCF7細胞中調蛋白誘導的ErbB2磷酸化。使用純化的單克隆抗體，測定ErbB2抗體的效力，還與2種抑制性抗體2C4和Herceptin⑧進行比較。簡言之，MCF7細胞以20,000細胞/孔接種在96孔板中且在完全生長培養基(10%FCS)中培養過夜。第二天，細胞培養板用PBS洗滌1次，且用無酚紅和無血清培養基替換培養基。細胞血清饑餓過夜，且隨后在用10nM調蛋白-卩處理10分鐘前，與在無血清培養基中從10昭/ml1:5滴定的mAbs、Herceptin⑧或2C4溫育1小時。如實施例4中所述制備細胞裂解物，且使用來自RnDsystems的ELISA試劑盒(人磷-ErbB2DuoSetIC,目錄#DYC1768)根據所提供的規程測量磷-ErbB2水平。基于在不存在抗體的情況下未刺激的細胞和調蛋白刺激的細胞中的pErbB2水平計算抑制百分比。使用PrismGmphpad軟件對于每種抗體標繪劑量應答曲線。圖3舉例說明來自代表性實驗的劑量應答曲線。EC50值得自非線性回歸分析，且顯示于表7中。2C4抑制ErbB2磷酸化而Herceptin⑧具有很少的作用。測試的本發明的11種單克隆抗體中的8種顯示對于MCF7細胞中的ErbB2磷酸化的抑制活性。1.18.1看起來具有比2C4更佳的效力。表7.本發明的10種純化的mAbs在抑制MCF7細胞中調蛋白誘導的ErbB2磷酸化方面的效力。167<table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>表10.本發明的8種抗體在抑制SKBR3細胞增殖方面的效力和功效<table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table>實施例11在BT474細胞中的ErbB2磷酸化抑制為了鑒定這些抗體在ErbB2高表達細胞系中的作用機制，本發明的抗體1.18.1連同Herceptin⑧和2C4就對BT474細胞中的組成型ErbB2磷酸化的作用進行測試。BT474細胞在第1天時以5000細胞/孔，在第2天和第3天時以10000細胞/孔，或在第4天時以20000細胞/孔接種在96孔培養板中在完全培養基中。細胞于37。C溫育3-4小時且允許與板附著。單克隆抗體從10jLig/ml開始在完全培養基中1:5滴定，進行6個點，且隨后加入細胞中。使細胞與單克隆抗體溫育1-4天。在第5天時，如前所述細胞在補加有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的緩沖液中進行裂解。細胞裂解物中的磷-ErbB2水平通過ELISA進行測定。細胞增殖通過CyQuant(Invitrogen)進行測量。根據在不存在抗體的情況下的pErbB2水平計算抑制百分比。還通過使磷-ErbB2水平對細胞數目標準化來計算磷-ErbB2/細胞。使用PrismGraphpad軟件對于每種抗體標繪劑量應答曲線，且EC50值得自非線性回歸分析。圖7和8舉例說明在不同時間點時的劑量應答。EC50和最大抑制百分比在表11中列出。單克隆Ab1.18.1在48小時時開始顯示pErbB2的抑制且在72小時時達到最大抑制。然而，Herceptin⑧直至72小時時才顯示出顯著作用而2C4具有很少的作用。有趣的是，當磷-ErbB2水平通過細胞數目進行標準化時，ErbB2磷酸化經由1.18.1的抑制在48小時時達到最大值；而如先前公開的，Herceptin⑧看起來不抑制ErbB2的磷酸化。接下來，研究了在48小時后抗體中的7種對BT474細胞中的組成型ErbB2磷酸化的作用。簡言之，將在50pl完全培養基中的IO，OOOBT474細胞接種在96孔板中，且于37。C培養3-4小時以與板附著。隨后向板中加入在完全培養基中以2X終濃度制備的、50|Lil20ug/ml2C4、Herceptin⑧和本發明的抗ErbB2單克隆抗體，且與細胞溫育48小時。制備細胞裂解物且如實施例4中所述通過ELISA測量磷-ErbB2水平。根據在不存在抗體的情況下的pErbB2水平計算抑制百分比。如表11中列出的，所有7種本發明的mAbs在48小時時都顯示BT474細胞中ErbB2磷酸化的劑量依賴性抑制。與之相比，Herceptin⑧和2C4具有很少的作用。表11.本發明的7種抗體在48小時時在抑制BT474細胞中ErbB2磷酸化方面的效力<table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table>實施例12使用下述測定抗ErbB2抗體親和力(A)中等分辨率Biacore分析8種抗ErbB2抗體的結合親和力通過中等分辨率Biacore進行測量。所有實馬全都使用Biacore2000儀器來進行。首先，使用常規胺偶聯制備在3個CM5Biacore芯片上的12個高密度山羊a-人IgG抗體表面。隨后，mAbs在包含100|ng/ml牛血清清蛋白(BSA)的HBS-P運行緩沖液中進行稀釋，具體地mAb1.18.1至11pg/mL、mAb1.20.1至9.9pg/mL、mAb1.100.1至11^g/mL、mAb1.96.2至9.3|ig/mL、mAb1.140.1至9.2|tig/mL、mAbU4.1至9.3pg/mL、mAb1.39.1至10)ag/mL且mAb1.24.3至10ng/mL。在每個抗原注射循環前，每種mAb以100itiL/分鐘流速捕獲6-9秒。每次捕獲注射后是2分鐘洗滌步驟以穩定每個mAb基線。對于所有mAbs將純化的人ErbB2(ECD)-cMycmis以307-4.80nM(2x連續稀釋)的濃度范圍注射90秒，隨后為15分鐘解離，除了其中隨后為20分鐘解離的mAbs1.39.1和1.24.3。所有樣品都用散布的幾個mAb捕獲/緩沖注射循環進行隨機注射用于雙重參考。在每個循環后高密度山羊a-人抗體表面用146mM磷酸(pH1.5)的1次12秒脈沖進行再生。100fxL/分鐘的流速用于所有注射循環。數據使用CLAMP擬合l:l相互作用模型。所得到的結合常數在下表中列出。MAbs以從最高到最低親和力的順序列出。表12U).通過中等分辨率Biacore分析的本發明的8種抗體針對人ErbB2的結合親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>(B)高分辨率Biacore分析所有實驗使用BiacoreT100儀器來進行。首先，使用常規胺偶聯在2個CM5Biacore芯片上制備高密度山羊a人IgG抗體(CaltagHI0500)表面。每種mAb在包含100昭/ml牛血清清蛋白(BSA)的HBS-P運行緩沖液中進行稀釋。MAb1.140稀釋至5|ug/mL,mAb1.96.2至5.9|iig/mL,mAb1.39.1至8.7pg/mL,mAb2C4至2Kg/mL,和herceptin至4jag/mL。開發捕獲水平規程用于所有5種mAbs。在每個抗原注射循環前，每種mAb以20^L/分鐘流速捕獲15-30秒。每次捕獲注射后是5分鐘洗滌步驟以穩定每個mAb基線。對于mAbs1.140、1.96.2和1.39.1將抗原hHer-2(ECD)cMyc(批次#452)以369—5.76nM(2x連續稀釋)的濃度范圍注射4分鐘，隨后為15分鐘解離，并且對于mAb2C4和herceptin為650-10.2nM(2x連續稀釋)的濃度范圍，隨后為25分鐘解離。樣品在上文描述的運行緩沖液中進行制備。所有樣品都用散布的幾個mAb捕獲/緩沖注射循環進行隨機注射用于雙重參考。在每個循環后高密度山羊ct-人抗體表面用146mM磷酸(pH1.5)的1次15秒脈沖進行再生。50pL/分鐘的流速用于所有注射循環。所有傳感圖(sensorgram)數據都使用CLAMP擬合1:1相互作用模型。所得到的結合常數在下表中列出。MAbs以從最高到最低親和力的順序列出。表12(b).通過高分辨率Biacore分析的本發明的3種抗體針對人ErbB2的結合親和力樣品k;,(M-'s-')k'i(s.')KD(nM)2C4105,881.21X1043.91X1CT、3.2herceptin602.34X1049.80X(T'4.21.1401101.64X1041.73X10-410.61.96.293].68X]04.94X10-41.6.39.1]201.60X1042.]4Xl(y413.4實施例13抗體的竟爭裝箱據報告2C4與ErbB2上的二聚化結構域結合，而Herceptin⑧與ErbB2的細胞外區域中的C末端結構域結合(參見在此引入作為參考的Franklin等人，CancerCell.2004Apr;5(4):317-28和Cho等人，Nature.2003Feb13;421(6924):756-60)。為了測定8種抗體的結合表位是否與關于2C4或Herceptin⑧的表位重疊，進行竟爭裝箱ELISA。Costar3695中等結合96孔板用在PBS中的0.5pg/mlHerc印tin⑧或2pg/ml2C4于4°C包被過夜。包被的板進行洗滌且隨后用1%乳/PBS在室溫(RT)下封閉30分鐘。抗體滴定至1000ng/ml、100ng/ml和10ng/ml,174且與30ng/mlhErbB2(ECD)預溫育2小時。將抗體/ErbB2混合物轉移至封閉的板且在RT下溫育1小時。為了檢測結合的ErbB2，板進行洗滌且與ljag/ml山羊抗ErbB2(R&Dsystems,目錄存AF1129)在RT下溫育1小時。向板中加入第二抗體兔抗山羊IgGFcPOD(Pierce目錄#31433，400ng/ml)且在RT下溫育1小時。徹底洗滌后，加入底物TMB(Neogen)且與板在RT下溫育10-18分鐘。酶反應通過添加INHC1得到終止，并且在微量培養板閱讀儀上閱讀在450nm處的光密度。圖9舉例說明在本發明的8種抗ErbB2抗體、mAb1.71.3或內部產生的無關同種型對照mAb的存在下，ErbB2與Herceptin(A)和2C4(B)的結合能力。本發明的抗ErbB2抗體無一阻斷ErbB2與2C4或Herceptin的結合，從而暗示抗體屬于與2C4或Herceptin⑧不同的箱。本文的所有出版物、專利和專利申請都引入作為參考，其程度與每個個別出版物或專利申請特別并個別指出引入作為參考相同。前述詳細描述僅為了理解清晰而給出并且不應理解由此有任何不必要的限制，因為修飾對于本領域技術人員將是顯而易見的。這并非承認本文提供的任何信息都是現有技術或與本發明有關，或特別或不明顯參考的任何出版物是現有技術。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。盡管本發明已結合其具體實施方案進行描述，但將理解它能夠進一步修飾，并且本申請意欲包含本發明的任何變異、用途或適應，其總的來說遵循本發明的原理，且包括來自本公開內容的此種背離，如在本發明所屬領域內已知的或常規實踐的范圍內以及如可以應用于上文闡述和如下附加權利要求的范圍中的基本特征中的。權利要求1.一種靶向結合劑，其與ErbB2特異性結合。2.根據權利要求1的把向結合劑，其中所述耙向結合劑具有至少一種下述性質(a)與人細胞結合；(b)與表達獼猴ErbB2的細胞結合；(c)與Herceptin⑧部分竟爭但不與2C4竟爭；(d)以小于50ng/ml的EC50抑制MCF7細胞中的ErbB2磷酸化；(e)以小于50ng/ml的EC50抑制SKBR3細胞中的細胞增殖；(f)以13.5nM或更小的KD與ErbB2結合；或(g)具有關于ErbB2的2.14x10-4s-l或更小的解離速率(koff)。3.權利要求2的靶向結合劑，其中所述靶向結合劑以13.5nM或更小的KD結合ErbB2且抑制ErbB2的活化。4.權利要求1的靶向結合劑，其中所述靶向結合劑是選自嵌合抗體、人抗體和人源化抗體的單克隆抗體。5.與人ErbB2特異性結合且抑制人ErbB2的靶向結合劑，其中所述靶向結合劑具有選自抗體的至少一種性質，所述抗體(a)與選自下述的抗體竟爭與ErbB2的結合:1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.%、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)與選自下述的抗體竟爭與ErbB2的結合:1.44.1、1.140、1.43、U4丄l.跳l、1.%、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1,20、1.39、1.24和1.71.3;(c)與選自下述的抗體結合相同的ErbB2表位1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1,24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(d)以與選自下述的抗體基本上相同的KD與ErbB2結合1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;和(e)以與選自下述的抗體基本上相同的解離速率與ErbB2結合1.44.1、1.40、1.43、.14.1、〗.00.〗、.96、1.18.、.20、.39、.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。6.特異性結合ErbB2的靶向結合劑，其中(a)所述靶向結合劑包含選自下述的抗體的重鏈CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;和/或(b)所述把向結合劑包含選自下述的抗體的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列:1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。7.權利要求6的靶向結合劑，其中所述靶向結合劑選自嵌合抗體、人抗體和人源化抗體。8.根據權利要求4的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體選自(a)包含SEQIDNO:2中所示的重鏈氨基酸序列、SEQIDNO:4中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(b)包含SEQIDNO:6中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:8中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(c)包含SEQIDNO:10中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:12中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(d)包含SEQIDNO:14中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:16中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(e)包含SEQIDNO:18中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:20中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(f)包含SEQIDNO:22中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:24中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(g)包含SEQIDNO:26中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:28中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(h)包含SEQIDNO:30中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:32中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(i)包含SEQIDNO:34中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:36中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；(j)包含SEQIDNO:38中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:40中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體；和(k)包含SEQIDNO:42中所示的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:44中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者的抗體。9.根據權利要求7的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體進一步包含SEQIDNO:46中所示的重鏈氨基酸序列、SEQIDNO:47中所示的輕鏈氨基酸序列或兩者。10.根據權利要求9的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體可以來自任何同種型。11.根據權利要求4的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或部分包含利用人VH3-21基因、人VH3-7基因、人VH4-31基因或人VH3-13基因的重鏈。12.根據權利要求4的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或部分包含利用人VKB3基因、人VKL1基因、人VKA2基因或人VKAl基因的輕鏈。13.根據權利要求9的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或部分進一步包含利用人VKB3基因、人VKL1基因、人VKA2基因或人VKA1基因的輕鏈。14.根據權利要求4的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述VL結構域、所述VH結構域或兩者在氨基酸序列中與下述的單克隆抗體的VL結構域、VH結構域或兩者分別至少90%等同1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、l.跳l、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。15.特異性結合ErbB2的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體包含選自下述的抗體的FR1、FR2、FR3或FR4氨基酸序列中的一個或多個1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。16.根據權利要求4的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體包含(a)與下述的單克隆抗體的重鏈氨基酸序列至少90%等同的重鏈氨基酸序列1.44.1、1,140、1.43、1,14.1、1,100,1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)與下述的單克隆抗體的輕鏈氨基酸序列至少90%等同的輕鏈氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1140、1.43、1.14.1、1100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;或(a)和(b)兩者。17.根據權利要求4的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗原結合部分選自Fab、Fab，、F(ab，)2、Fd、Fv、dAb、和互補性決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv或scFv2)、嵌合抗體、雙抗體、雙特異性抗體和這樣的多肽，其包含足以賦予與所述多肽特異性抗原結合的抗體的至少部分。18.—種組合物，其包含根據權利要求1-18中任一項的耙向結合劑和藥學上可接受的載體。19.根據權利要求18的組合物，其包含另外的治療或診斷劑。20.根據權利要求18的組合物，其進一步包含特異性結合ErbB2的抗體，其中所述抗體不與選自下述的抗體竟爭與ErbB2的結合1.14.1、1.18.1、1.20.1、1.24.3、1.39.1、1.71.3、1.96.2、1.100.1和U40丄21.—種分離的細胞系，其生產根據權利要求1-18中任一項的把向結合劑。22.—種分離的核酸分子，其包含編碼根據權利要求4的抗體的重鏈或其抗原結合部分、輕鏈或其抗原結合部分或兩者的核苷酸序列。23.根據權利要求22的分離的核酸分子，其包含選自下述的核普酸序列(a)SEQIDNO:1的核苦酸序列；(b)編碼SEQIDNO:2的核普酸序列；(c)SEQIDNO:3的核苦酸序列；(d)編碼SEQIDNO:4的核苷酸序列；(e)SEQIDNO:5的核苦酸序列；(f)編碼SEQIDNO:6的核苷酸序列；(g)SEQIDNO:7的核苦酸序列；(h)編碼SEQIDNO:8的核苷酸序列；(i)SEQIDNO:9的核苦酸序列；(j)編碼SEQIDNO:IO的核苷酸序列；(k)SEQIDNO:ll的核苷酸序列；(I)編碼SEQIDNO:12的核苷酸序列；(m)SEQIDNO:13的核苷酸序列；(n)編碼SEQIDNO:14的核苷酸序列；(o)SEQIDNO:15的核苷酸序列；(p)編碼SEQIDNO:16的核普酸序列；(q)SEQIDNO:17的核苷酸序列；(r)編碼SEQIDNO:18的核苷酸序列；(s)SEQIDNO:19的核苷酸序列；(t)編碼SEQIDNO:20的核苦酸序列；(u)SEQIDNO:21的核苷酸序列；(v)編碼SEQIDNO:22的核香酸序列；(w)SEQIDNO:23的核苷酸序列；(x)編碼SEQIDNO:24的核苷酸序列；(y)SEQIDNO:25的核芬酸序列；(z)編碼SEQIDNO:26的核苦酸序列；(aa)SEQIDNO:27的核苷酸序列;(bb)編碼SEQIDNO:28的核苷酸序列；(cc)SEQIDNO:29的核苷酸序列；(dd)編碼SEQIDNO:30的核苷酸序列；(ee)SEQIDNO:31的核苷酸序列；(ff)編碼SEQIDNO:32的核苷酸序列；(gg)SEQIDNO:33的核苷酸序列;(hh)編碼SEQIDNO:34的核普酸序列;(ii)SEQIDNO:35的核苷酸序列；(jj)編碼SEQIDNO:36的核普酸序列；(kk)SEQIDNO:37的核普酸序列；(II)編碼SEQIDNO:38的核苦酸序列；(mm)SEQIDNO:39的核苦酸序列；(mi)編碼SEQIDNO:40的核苷酸序列；(oo)SEQIDNO:41的核苷酸序列；(pp)編碼SEQIDNO:42的核苷酸序列；(qq)SEQIDNO:43的核苷酸序列；和(rr)編碼SEQIDNO:44的核苦酸序列。24.權利要求23的分離的核酸分子，其進一步包含表達控制序列。25.—種包含根據權利要求22的核酸分子的載體，其中所述載體任選包含與所述核酸分子可操作地連接的表達控制序列。26.—種宿主細胞，其包含權利要求25的載體或根據權利要求22的核酸分子。27.—種用于生產靶向結合劑的方法，其包括在合適的條件下培養權利要求26的宿主細胞和回收所述靶向結合劑。28.—種包含根據權利要求22的核酸的非人轉基因動物或轉基因植物，其中所述非人轉基因動物或轉基因植物表達所述核酸。29.—種用于分離與人ErbB2特異性結合的抗體或其抗原結合部分的方法，其包括從根據權利要求28的非人轉基因動物或轉基因植物中分離所迷抗體的步驟。30.—種用于制備與ErbB2特異性結合的人單克隆抗體的方法，其包括下述步驟i)用ErbB2、ErbB2的免疫原性部分或者表達ErbB2的細胞或組織免疫能夠生產人抗體的非人轉基因動物；ii)允許所迷轉基因動物發動針對ErbB2的免疫應答；和回收所述抗體。31.—種分離的抗體，其通過權利要求30的方法產生。32.—種用于治療、預防或減輕有此需要的受試者中ErbB2介導的病癥的癥狀的方法，其包括給所述受試者施用根據權利要求1的靶向結合劑的步驟，其中所述耙向結合劑抑制ErbB2。33.—種用與ErbB2特異性結合的抗體或其抗原結合部分用于治療、預防或減輕有此需要的受試者中ErbB2介導的病癥的癥狀的方法，其包括下述步驟(a)施用有效量的編碼重鏈或其抗原結合部分的分離的核酸分子，編碼輕鏈或其抗原結合部分的分離的核酸分子，或編碼輕鏈和重鏈或其抗原結合部分的核酸分子兩者；和(b)表達所述核酸分子。34.根據權利要求32或33的方法，其中所述ErbB2介導的病癥是癌癥。35.根據權利要求34的方法，其中所述癌癥選自乳腺、膀胱、肺、頭、頸、前列腺、胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰癌和成"交質細胞瘤。36.—種抑制有此需要的受試者中表達ErbB2的癌細胞增殖的方法，所述方法包括給所述受試者施用權利要求1的靶向結合劑的步驟。37.—種用于抑制表達ErbB2的細胞中的ErbB2活性的方法，其包括使所述細胞與權利要求1的耙向結合劑接觸，其中所述細胞中的所述ErbB2活性選自(a)ErbB2的石舞酸4匕；(b)MAPK途徑的活化；(c)PI3K途徑的活化；(d)CDC2的抑制；和(e)其組合。38.—種用于調節表達ErbB2的細胞中的ErbB2活性的方法，其包括使所述細胞與權利要求1的靶向結合劑接觸，其中所述細胞中的所述ErbB2活性是p38-TSP-l途徑的活化。39.根據權利要求37的方法，其中所述細胞在受試者中。40.根據權利要求37的方法，其中所述細胞是癌細胞。41.根據權利要求37的方法，其中所述ErbB2的磷酸化被抑制48小時。全文摘要本發明涉及與ErbB2優選人ErbB2特異性結合的抗體，包括人抗體及其抗原結合部分。在另一個實施方案中，抗體或其抗原結合部分抑制ErbB2。本發明還涉及嵌合的、雙特異性、衍生的抗體，單鏈抗體或融合蛋白的部分。本發明還涉及衍生自人抗ErbB2抗體的分離的重和輕鏈免疫球蛋白或其部分和編碼此種免疫球蛋白的核酸分子。本發明還涉及使用抗體和組合物用于診斷和治療的方法。本發明還提供使用編碼構成人抗ErbB2抗體的重和/或輕免疫球蛋白分子的核酸分子的基因治療方法。本發明還涉及包含本發明的核酸分子的轉基因動物或植物。文檔編號C07K16/32GK101522717SQ200780037095公開日2009年9月2日申請日期2007年8月2日優先權日2006年8月4日發明者I·富爾茨,J·S·康,J·董,M·希金森,S·A·卡蒂拉奇申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司