專利名稱：抗肥胖致免疫雜交多肽及含有所述多肽的抗肥胖疫苗組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種致免疫雜交多肽，其中將載脂蛋白B-100的B細胞 表位的模擬肽、狂犬病病毒輔助T細胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原輔 助T細胞表位以及小鼠載脂蛋白CII的C末端肽片段或載脂蛋白B-100 的B細胞表位的模擬肽以從該致免疫雜交多肽的N末端到C末端方向的 順序相互融合。此外，本發明涉及一種用于預防和治療肥胖病的疫苗組 合物，其包含所述致免疫雜交多肽作為活性成分。進一步地，本發明涉 及編碼所述致免疫雜交多肽的多聚核苷酸、攜帶該多聚核苷酸的重組表 達載體、由該重組表達載體轉化的宿主細胞以及通過培養由該重組表達 載體轉化的宿主細胞來制備所述致免疫雜交多肽的方法。
背景技術：
近來，由于向西方飲食習慣的轉變，導致在韓國糖尿病、動脈硬化 和冠狀動脈粥樣硬化疾病(CAD)逐漸增多，其不僅對人而且對于寵物 如狗或貓均是如此。引起這些疾病的血脂包括膽固醇、甘油三酯(TG)、 游離脂肪酸和磷脂。這些血脂形成具有載脂蛋白的脂蛋白，并且通過血 流輸送。其中，極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)輸送 大部分甘油三酯和膽固醇的功能以及LDL-膽固醇水平的變化是疾病預 后的指標。成人脂類代謝相關疾病的主要因素LDL-膽固醇結合于每種組 織中細胞質膜的LDL受體上，并在組織中保存并利用。選擇性地，由清 除細胞吸收LDL-膽固醇并將其水解，然后將游離膽固醇轉化為HDL， 與載脂蛋白E (apoE)脂蛋白一起在肝中再循環，或者將其轉化為膽鹽 釋放。在該過程中，載脂蛋白表現出維持脂蛋白結構性體內穩態的重要 功能，充當酶脂蛋白脂肪酶的輔助因子，并且在與質膜上特定受體的結 合中起重要作用。
載脂蛋白B-100(載脂蛋白B-100)是低密度脂蛋白的主要蛋白組分， 并且還存在于中密度脂蛋白(IDL)和VLDL中。因此，當將血液中的 抗體誘導識別載脂蛋白B-100時，由吞噬細胞來清理LDL就容易發生了。
5在這方面，某些最新研究集中于利用疫苗來降低血槳LDL-膽固醇水平并
減少動脈硬化的發生。由這種抗膽固醇疫苗療法誘導的抗體是IgM型， 其被認為結合于VLDL、 IDL和LDL，并且該策略暗示了研制疫苗用于 預防和治療高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的可能性(Bailey等人， Cholesterol vaccines, Science 264， 1067-1068， 1994; PalinskiW等人， Proc Natl Acad Sci U.S.A. 92， 821-5， 1995; Wu R, de Faire U等人， Hypertension. 33， 53-9， 1999)。此外，載脂蛋白B-100是巨大的蛋白 分子，其由4560個氨基酸殘基組成，包含24個氨基酸殘基的信號肽并 具有超過500kDa的分子量(Elovson J等人，Biochemistry, 24:1569-1578， 1985)。因為載脂蛋白B-100主要由肝臟分泌，并且是兩性分子，所以 其可與血漿脂蛋白的脂類組分和水相環境相互作用(Segrest J. P等人， Adv. Protein Chem.， 45:303-369， 1994)。載脂蛋白B-100穩定LDL顆 粒的大小和結構，并且在通過結合于其受體來控制血漿LDL-膽固醇的體 內平衡中起關鍵作用(Brown MS等人，Science, 232:34-47， 1986)。
本發明人所發表的韓國專利號10-0639397公開了一種用于載脂蛋白 B-100的表位的模擬肽，其顯示對于肥胖病的抑制作用； 一種致免疫雜交 多肽(B4T)，其中上述模擬肽融合于輔助T細胞表位，以及含有致免 疫雜交多肽的抗肥胖病組合物。但是，由于在免疫相關物質和代謝中的 差異，不能預期由載脂蛋白B-100的B細胞表位的模擬肽與輔助T細胞 表位融合所產生的雜交多肽對于動物的預防和治療如同在人類中同樣有 效。另外，雖然在一個群體之內具有免疫性，但是因為其折疊穩定性較 低，所以依照個體而言，融合的多肽引起免疫應答具有很大程度的偏差。
另一方面，做了很多努力將半抗原與載體蛋白融合以增強半抗原的 免疫原性，但是未能獲得一致的增強效果。特別地，如本發明的B細胞 表位和T細胞表位的線性連接導致依表位方向、每個表位類型等的免疫 原性的喪失(Francis, M. J.等人，Nature 330:168-170， 1987)，并且連 接子的存在導致抗原性減低(Partidos, C.等人，Mol. Immunol. 29:651-658， 1992)。也就是說，沒有一常不變的規律可適用于肽疫苗設 計，并且設計的疫苗的效力也是不可預知的。基于同樣的理由，當載脂 蛋白B-100的B細胞表位的高度疏水性模擬肽與狂犬病病毒輔助T細胞
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表位、乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表位或載脂蛋白CII融合時， 抗原區域可以內化到融合蛋白中，導致其誘導抗體應答的能力降低。
發明內容
為了得到本發明，本發明人對適用于動物(例如狗、牛等以及人) 并能在個體中引起一致的抗體反應的穩定的抗肥胖病疫苗進行了充分而 徹底的研究。
因此，本發明人令人驚訝地發現本發明的雜交多肽除了顯示極好的 免疫刺激作用以外，可以有效地用于預防或治療動物以及人的肥胖病，
所述雜交多肽包含載脂蛋白B-100的B細胞表位的四聚體模擬肽(B4)、 狂犬病病毒輔助T細胞表位(R)或乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞
表位(T)以及載脂蛋白cn的c末端肽片段(cn)或載脂蛋白B-ioo
的B細胞表位的二聚體模擬肽(B2)以從該致免疫雜交多肽的N末端的 順序融合，從而完成本發明。
因此，本發明的一個目的在于提供了一種致免疫雜交多肽，其中將 載脂蛋白B-100的B細胞表位的四聚體模擬肽、狂犬病病毒輔助T細胞 表位或乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表位以及載脂蛋白CII的C末 端肽片段或載脂蛋白B-100的B細胞表位的二聚體模擬肽以從該致免疫 雜交多肽的N末端的順序相互融合。
本發明的另一目的在于提供了一種用于預防或治療肥胖病的疫苗組 合物，其包含致免疫雜交多肽。
本發明的又一目的在于提供了一種編碼所述致免疫雜交多肽的多聚 核苷酸。
本發明的又一目的在于提供了一種包含該多聚核苷酸的重組表達載體。
本發明的又一目的在于提供了一種用該重組表達載體轉化的宿主細胞。
本發明的又一目的在于提供了一種通過培養用該重組表達載體轉化 的宿主細胞來生產所述致免疫雜交多肽的方法。
圖1 (a)是在每孔2pl負載的TBE緩沖系統的2%瓊脂糖凝膠上電 泳載脂蛋白CII基因的PCR產物(在道2中)以及25/100bp混合DNA 梯(在道1中)之后的照片。
圖1 (b)是顯示將目的多聚核苷酸片段插入轉化到大腸桿菌JM109 中的重組載脂蛋白CII (ApoCn) /pQE30載體中的照片。
圖2 (a)是在每孔2pl負載的TBE緩沖系統的2%瓊脂糖凝膠上電 泳RVNP基因的PCR產物(在道2中)以及100bp梯度(Bioneer)(在 道1中)之后的照片。
圖2 (b)是顯示Sal I消化片段以適當的方向插入轉化到大腸桿菌 JM109中的重組B4RCII/pQE30載體中的照片。
圖2 (c)是顯示Sal I消化片段以適當的方向插入轉化到大腸桿菌 JM109中的重組B4RB2/pQE30載體中的照片。
圖2 (d)是顯示Sal I/Hind III消化片段以適當的方向插入轉化到大 腸桿菌JM109中的重組B4TB2/pQE30載體中的照片。
圖3是說明制備表達B4RCII融合多肽的重組表達載體的方法示意圖。
圖4是說明制備表達B4RB2融合多肽的重組表達載體的方法示意圖。
圖5是說明制備表達B4TB2融合多肽的重組表達載體的方法示意圖。
圖6顯示pB4RCII的核苷酸序列及由其編碼的氨基酸序列，所述核 苷酸序列通過DNA測序來確定。
圖7顯示pB4RB2的核苷酸序列及由其編碼的氨基酸序列，所述核 苷酸序列通過DNA測序來確定。
圖8顯示pB4TB2的核苷酸序列及由其編碼的氨基酸序列，所述核 苷酸序列通過DNA測序來確定。
8圖9 (a)是顯示B4RCII的表達隨時間變化的SDS-PAGE照片，其 中將在IPTG誘導之后1 4小時，從大腸桿菌M15/pB4RCII中獲得的 B4RCII在道2 5中與標記(NEB)在道M中、非IPTG誘導的大腸桿 菌M15/pB4RCII在道1中一起進行電泳。
圖9 (b)是顯示B4RB2的表達隨時間變化的SDS-PAGE照片，其 中將在IPTG誘導之后2 5小時，從大腸桿菌M15/pB4RB2中獲得的 B4RB2在道2 5中與標記(NEB)在道M中、非IPTG誘導的大腸桿 菌M15/pB4RB2 —起進行電泳。
圖9 (c)是顯示B4TB2的表達隨時間變化的SDS-PAGE照片，其 中將在IPTG誘導之后3 5小時，從大腸桿菌M15/pB4TB2中獲得的 B4TB2在道2 3中與標記(NEB)在道Ml中、非IPTG誘導的大腸桿 菌M15在道1中、總可溶蛋白在道4中以及由8M尿素溶解的總蛋白在 道5中一起進行電泳。
圖9 (d)是通過利用兔抗PB14多克隆抗體的Western印跡分析顯 示B4RCII存在的照片。
圖IO顯示根據在圖(a)和SDS-PAGE照片(b)中的線性咪唑濃度 梯度從樹脂結合的B4RCII中洗脫B4RCII (Ml: NEB預先染色標記，
道l:非誘導細胞粗提物，道2: 4小時誘導細胞粗提物，道3:總可溶 蛋白；道4:(在樹脂結合之前)由8M尿素溶解的總蛋白，道5:上樣 流穿(flow-through)，道6:沖洗部分(50mM咪唑)以及道7:洗脫部 分(500mM咪唑)，7.5pl/孔負載)。
圖IO顯示根據在圖(c)和SDS-PAGE照片(d)中的線性咪唑濃度 梯度從樹脂結合的B4RB2中洗脫B4RB2 (道1: Elpis預先染色蛋白標 記，道2:總可溶蛋白，道3:(在樹脂結合之前)由8M尿素溶解的總 蛋白，道4:上樣流穿，道6:洗脫部分(500mM咪唑)，3|^1/孔負載)。
圖IO顯示根據在圖(e)和在SDS-PAGE照片(f)中的線性咪唑濃 度梯度從樹脂結合的B4TB2中洗脫B4TB2 (道1: Elpis預先染色蛋白標 記，道2:總可溶蛋白，道3:(在樹脂結合之前)由8M尿素溶解的總 蛋白，道4:上樣流穿，道5:沖洗部分(50mM咪唑)，道6:洗脫部分(500mM咪唑)，道7:洗脫部分(500mM咪唑)，7.5nl/孔負載)。
圖11是顯示在由紅色箭頭指示的時間點上，用B4RCI1、 B4RB2禾口 B4TB2免疫的C57BL/6小鼠組的體重增加的圖，由藍色箭頭指示飲食誘 導的肥胖病(DIO)的起始點。
圖12是顯示對于用B4RCII 、 B4RB2和B4TB2免疫動物，抗B4抗 體的滴度隨時間的變化圖。圖13是顯示在用本發明的疫苗第三次加強之后一周的動物(16周 齡)的血脂水平的圖。
具體實施例方式
根據其一個方面，本發明涉及一種致免疫雜交多肽，其中將載脂蛋 白B-100的B細胞表位的模擬肽、狂犬病病毒輔助T細胞表位或乙型肝 炎病毒表面抗原輔助T細胞表位以及載脂蛋白CII的C末端肽片段或載 脂蛋白B-100的B細胞表位的二聚體模擬肽以從該致免疫雜交多肽的N 末端的順序相互融合。
本文所用的術語"表位的模擬肽"指模擬表位最小部分的肽，其是 與天然表位足夠相似使得其可被對天然表位具有特異性的抗體所識別的 表位、或能促進抗體與天然表位交聯的表位。模擬肽也稱為模擬位。這 種模擬肽是有利的，因為其在體內被識別為是"非自我的"，并因此克 服免疫應答中自體耐受性的問題。由特異性結合于載脂蛋白B-100的抗 體識別載脂蛋白B-100的B細胞表位的模擬肽。特異結合于載脂蛋白 B-100的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體及其片段，所述抗體特異性識 別并結合于載脂蛋白B-IOO，例如Fc、 Fab和F(ab')2。其中，優選單克 隆抗體，更優選MabB9和MabB23。
根據本發明的載脂蛋白B-100的B細胞表位的模擬肽包括選自由序 列編號1、序列編號2和序列編號3所組成的組的氨基酸序列。本發明人 使用文庫生物淘篩從噬菌體展示肽文庫中分離了可由抗載脂蛋白B-100 的單克隆抗體MabB9或MabB23識別的模擬肽(序列編號1、 2和3)。 載脂蛋白B-100的表位的模擬肽，其包括選自由序列編號l、序列編號2 和序列編號3所組成的組中的氨基酸序列，可處于由具有上述任一序列編號的氨基酸序列的單拷貝組成的單體形式，或者為了進一步增強模擬
肽的免疫原性，可為多聚體形式，其中將具有上述任一序列編號的氨基
酸序列的兩個或多個，優選三至八個，更優選三至六個拷貝進行連接。
最優選是四聚體，其中將四個拷貝進行連接。當模擬肽為多聚體形式時， 每個構成單體的氨基酸序列可直接或者經由連接子共價連接。當氨基酸
序列經由連接子連接時，連接子可由一至五個氨基酸殘基組成，所述氨 基酸殘基選自例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯 氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰 胺、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸。優選的用于連接子的氨基酸可包括纈氨 酸、亮氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。更優選地，考慮 到易于進行基因操作，可將選自纈氨酸、亮氨酸、天門冬氨酸等的兩個 氨基酸連接并用作連接子。通過連接子將選自序列編號1、 2和3的氨基 酸序列的兩個或多個拷貝連接來制備優選的模擬肽。
本文所用的術語"T細胞表位"指能夠以適當的效率結合于MHCII
類分子并刺激T細胞或以與MHCII類分子復合體結合于T細胞上的氨基 酸序列。在這種情況下，T細胞表位由在T細胞上呈遞的特異性受體所 識別，并且其功能在于提供B細胞分化成抗體產生細胞所需要的信號并 誘導細胞毒T淋巴細胞(CTL)來破壞靶細胞。就本發明的目的而言， 輔助T細胞表位優選用作特異性受體的識別靶點。其中，發現狂犬病病 毒輔助T細胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表位得到更好的 效果。
狂犬病病毒傳染給家畜和野生動物以及寵物例如狗和貓，導致急性 腦炎。人及其它動物可通過接種疫苗預防狂犬病。對于本發明，使用通 過基因操作從狂犬病病毒核糖核蛋白基因(NCBI基因ID; AF406695) 中制備包含宿主的輔助T細胞表位的58個氨基酸長的肽片段(R)，其 氨基酸序列如序列編號6所示(Ertl， H.C丄等人，Journal of Virology, 63(7)， 2885-2892， 1989)。
乙型肝炎病毒(HBV)的基因組長度是3.2kb，具有四種重要蛋白的 信息并包含四個開放閱讀框架，S基因(表面抗原蛋白)、C基因(核心 蛋白)、P基因(DNA聚合酶)和X基因。將S基因分成編碼HBsAg
11的S區和preS區。將preS區分成根據HBV菌株的、編碼108或119個 氨基酸的preSl和與亞型無關的編碼55個氨基酸的preS2。在體內免疫 應答期間，HBVpreS2蛋白活化輔助T細胞，從而刺激抗HBV抗體的形 成。序列編號7表示HBV輔助T細胞表位的氨基酸序列。
在致免疫雜交多肽的C末端區域設置有小鼠載脂蛋白CII的C末端 肽片段或載脂蛋白B-100的B細胞表位的模擬肽。
由79個氨基酸殘基組成的、分子量為8，800Da的小鼠載脂蛋白CII (Hoffer， M丄等人，Genomics 17(1)， 45-51， 1993)主要在小腸和肝中 產生，并可在乳糜微粒、VLDL和HDL中發現，起到作為載脂蛋白脂酶 (LPL)的酶活性的必需輔助因子的作用(Storjohann, R.等人，Biochimica et Biophysica Acta， 1486， p253 264， 2000)。在本發明的優選實施例 中，將負責控制LPL活性的、由載脂蛋白CII的33個C末端氨基酸殘 基組成的肽從小鼠載脂蛋白CII基因(NCBI基因ID; NM009695)中克 隆，并由序列編號8所示。
提供給本發明致免疫雜交多肽的C末端區域的載脂蛋白B-100的表 位的模擬肽包含選自由序列編號1、序列編號2和序列編號3所組成的組 的氨基酸序列。載脂蛋白B-100的表位的模擬肽，其包括選自由序列編 號1、序列編號2和序列編號3所組成的組的氨基酸序列，可為由其單拷 貝組成的單體形式。為了進一步增強其免疫原性，模擬肽可為多聚體形 式，其中將氨基酸序列的兩至四個拷貝進行連接，更優選由兩個拷貝組 成的二聚體形式。就多聚體形式而言，每個構成單體的氨基酸序列可直 接或經由連接子共價連接。
本文所用的術語"免疫原性"指誘導細胞免疫應答和體液免疫應答 來使身體防御異物的能力。誘導這些免疫應答的物質稱為免疫原。在根 據本發明的融合多肽中，將載脂蛋白B-100的B細胞表位、狂犬病病毒 輔助T細胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表位和載脂蛋白 CII的C末端肽片段用作免疫原。
當將B細胞表位和T細胞表位進行融合形成致免疫多肽，如同本發 明的多肽，已知B細胞表位應該暴露于多肽折疊結構的外面，且T細胞
12表位位于內部，以便誘導有效的免疫應答(Partidos C等人，Eur J Immunol., 22 ( 10) : 2675-80， 1992)。除了現有技術中B4T融合蛋白 的結構以外，其中僅將載脂蛋白B-100的B細胞表位的模擬肽和T細胞 表位進行連接，按照本發明，將載脂蛋白CII的片段或載脂蛋白B-100 的B細胞表位的模擬肽連接到T細胞表位的C末端。發現產生的融合多 肽在蛋白折疊結構的穩定性方面有改進，并且在全部個體中誘導出一致 的抗體反應，這是由于T細胞表位進一步被B細胞表位包圍，最小限度 的暴露在外面。
本文所用的術語"多肽"是包括全長氨基酸鏈的術語，其中包括兩 個或多個氨基酸殘基由共價肽鍵相連接，包括二肽、三肽、寡肽和多肽。 特別地，在本發明中，多肽指兩個或多個肽彼此連接在一起的雜交多肽， 其中所述的兩個或多個肽是幾個至幾十個氨基酸共價相連的肽。含有所 述多肽的每個肽序列包括對應于上述表位的序列，并可以進一步包括接 近上述表位的序列。這些肽可由L-氨基酸或D-氨基酸構成，或可為兩種 不同構型的氨基酸的不同組合。
本文所用的術語"雜交多肽"通常指具有不同來源的異質肽 (heterogeneous peptides)相連接的肽。在本發明中，雜交多肽是這樣的 肽，其中B細胞表位、狂犬病病毒輔助T細胞表位或乙型肝炎病毒表面 抗原輔助T細胞表位以及載脂蛋白CII的C末端肽片段或載脂蛋白B-IOO 的B細胞表位的模擬肽以從該致免疫雜交多肽的N末端到C末端的順序 排列并相互連接。
在根據本發明的優選實施方式中，所述雜交多肽是多肽(B4RCn)， 其中序列編號1的氨基酸序列的四個拷貝(B4)、狂犬病病毒輔助T細 胞表位(R)和小鼠載脂蛋白CII的C末端肽片段(CII)從N末端向C 末端順序連接(序列編號9)。在本發明的另一優選實施方式中，所述雜 交多肽是多肽(B4RB2)，其中序列編號1的氨基酸序列的四個拷貝(B4)、 狂犬病病毒輔助T細胞表位(R)和序列編號1的氨基酸序列的兩個拷 貝(B2)從N末端向C末端順序連接(序列編號10)。在本發明的又 一優選實施方式中，所述雜交多肽是多肽(B4TB2)，其包含序列編號1 的氨基酸序列的四個拷貝(B4)、乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表
13位(T)和序列編號1的氨基酸序列的兩個拷貝(B2)從N末端向C末端順序連接(序列編號11)。根據本發明，所述雜交多肽可完全由致免疫部分和其相鄰的序列組成，并可選擇性地進一步包含附加序列，所述致免疫部分包括B細胞表 位、狂犬病病毒輔助T細胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表 位、載脂蛋白CII的C末端肽片段。然而，優選使所述附加序列抑制整 體免疫性的下降。所述附加序列包括連接子序列。當使用連接子經由其 連接表位區域時，必須對它們進行選擇，以使對免疫應答的誘導不產生 負影響。在另一方面，本發明涉及一種重組載體，所述重組載體包含編碼所 述致免疫雜交多肽的多聚核苷酸；包含該多聚核苷酸的重組表達載體； 用該重組表達載體轉化的宿主細胞；以及通過培養用該重組表達載體轉 化的宿主細胞來生產所述致免疫雜交多肽的方法。可通過化學合成或基因重組來生產本發明的致免疫雜交多肽。詳細 來說，由基因重組來生產本發明致免疫雜交多肽的方法包含以下四個步 驟第一步是將編碼所述雜交多肽的基因插入到載體中來構建重組載體。導入外來DNA的載體可為質粒、病毒、裝配型質粒等。重組載體包括克隆載體和表達載體。克隆載體包含復制原點，例如質粒、噬菌體 或裝配型質粒的復制原點，其為"復制子"，在該"復制子"處，與其連接的外源DNA片段開始復制。開發了表達載體用于蛋白合成。重組載 體用作將外來DNA片段插入其中的載體，其一般指雙鏈DNA片段。本 文所用的術語"外來DNA"指來源于不同物種的DNA，或來自同族物 種的天然DNA的實質上的修飾體。此外，外來DNA包括在正常情況下 不在細胞中表達的未經修飾的DNA序列。在這種情況下，外源基因是要 轉錄的特定靶核酸，其編碼多肽。重組載體包含可操作連接于轉錄和翻 譯表達調控序列的靶基因，其在所選宿主細胞中發揮作用以便增加轉染 基因在宿主細胞中的表達水平。重組載體是包含主要調節元件的基因構 建體，基因插入片段可操作地連接于所述主要調節元件從而在個體的細14胞中表達。利用標準的重組DNA技術來制備這種基因構建體。只要載體在包括原核細胞和真核細胞的各種宿主細胞中表達耙基因并能生產耙蛋 白，那么就不特別限定重組載體的種類。然而，優選能夠大量生產與天 然形式相似的形式的外源蛋白、同時具有強啟動子來實現靶蛋白的強表 達的載體。重組載體優選至少包含啟動子、起始密碼子、編碼耙蛋白的 基因、終止密碼子和終止子。重組載體可進一步適當地包含編碼信號肽的DNA、增強子序列、靶基因的5'-和3'-非翻譯區、選擇標記區、復制 單位等。第二步是用重組載體轉化宿主細胞，并且培養宿主細胞。通過 Sambrook, J.等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed.)， Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74， 1989所述的方法將重組載體導入宿 主細胞來產生轉化體，該方法包括磷酸鈣或氯化鈣/氯化銣方法、電穿孔 法、電子注射法、化學處理(例如PEG處理法)以及基因槍法。可通過 在營養培養基中培養表達重組載體的轉化體來大規模生產和分離有用的 蛋白。可根據宿主細胞適當地選擇通用的培養基和培養條件。應該保持 培養條件(包括溫度、培養基的pH和培養時間)適合于細胞生長和目的 蛋白的大量生產。能夠用被本發明的重組載體轉化的宿主細胞包括原核 細胞和真核細胞。 一般使用具有高DNA導入效率和具有導入的DNA的 高表達水平的宿主細胞。宿主細胞的實例包括已知的原核細胞和真核細 胞，例如埃希氏菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、真菌和酵 母；昆蟲細胞例如草地夜蛾(Sf9);以及動物細胞例如CHO、 COSl、 COS 7、 BSC1、 BSC40禾卩BMT 10。優選使用大腸桿菌。第三步是誘導雜交多肽表達和積聚。在本發明中，將誘導物IPTG用 于肽表達的誘導，調節誘導時間來獲得最大的蛋白產量。最后一步是分離并純化雜交多肽。 一般來說，可從培養基或細胞裂 解物中回收重組生產的肽。當肽處于膜結合形式時，可使用適當的表面 活性劑溶液(例如Triton-XlOO)或通過酶裂解來從膜中釋放。可通過 各種物理或化學方法例如反復凍融、超聲處理、機械破壞或細胞破裂劑 來破壞用于表達雜交肽的細胞，并且可通過通常使用的生物化學分離技 術來分離和純化雜交肽(Sambrook等人，Molecular Cloning: A laboraroryCold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M.， Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego， CA， 1990)。生物化學分離技術的非限制性實 例包括電泳、離心、凝膠過濾、沉淀、透析、色譜(離子交換色譜、親 和色譜、免疫吸附親和色譜、反相高效液相色譜、凝膠滲透高效液相色 譜)、等電聚焦及其變形和組合。在本發明的優選實施方式中，將編碼B4的C末端區域的基因與編 碼包含T細胞表位的狂犬病病毒核蛋白的基因的一部分(R片段)連接， 然后與小鼠載脂蛋白基因的一部分(CII片段)連接來構建B4RCII基因 (圖3)，所述的B4為顯示抗肥胖病活性的載脂蛋白B-100的模擬肽的 四聚體形式， 一種包含B細胞表位但無T細胞表位的功能性肽。用于本發明的是B4片段，其公開于韓國專利號10-0639397。利用 RT-PCR獲得載脂蛋白CII和RVNP(包含輔助T細胞表位的狂犬病病毒 核蛋白)基因。選擇pQE30作為B4RCII的表達載體，因為其從其內在 的起始密碼子隨同六個組氨酸殘基一起開始蛋白表達以便于蛋白純化， 其后是腸激酶酶切位點。發現基于其氨基酸分子量計算，如此表達的蛋 白約為21KDa大小；按照SDS-PAGE測定，約為22KDa大小。按照時 間采取的樣品進行的SDS-PAGE證明了目的蛋白的表達(圖9)。另一方面，本發明涉及一種用于預防或治療肥胖病的疫苗組合物， 所述組合物包含致免疫雜交多肽。沒有一常不變的規律可適用于肽疫苗設計，并且設計的疫苗的效力 也是不可預知的。由于同樣的理由，當將高度疏水性PB14肽與異質肽T 細胞表位融合時，抗原區域可以被內化到融合蛋白中，導致其誘導抗體 應答的能力下降。根據結果難以解釋的上述背景，構建雜交多肽，顯示 其具有抗肥胖病的免疫原性，所述雜交多肽中，載脂蛋白B-100的B細 胞表位的模擬肽、狂犬病病毒輔助T細胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原 輔助T細胞表位以及載脂蛋白CII的C末端肽片段或載脂蛋白B-100的 B細胞表位的模擬肽以從該致免疫雜交多肽的N末端向C末端的方向的 順序融合。使用通過基因重組表達和純化的本發明的致免疫雜交多肽對大鼠進 行免疫，并且通過研究(a)體重增加、(b)血清抗體滴度和(C)血脂 水平的變化，從而確定抗原的高效形式，評價抗原對于誘導免疫應答的作用。結果與對照組相比，用雜交多肽(B4RCI1、 B4RB2和B4TB2) 接種的組顯示抑制體重增加、抗模擬肽的抗體的高滴度和延長保持、以 及TG和LDL-膽固醇血清水平的降低。詳細來說，將純化的B4RCII 、 B4RB2和B4TB2各50嗎/150pl按照兩周的定期間隔重復三次腹膜內注射給6周齡的ICR大鼠后，觀察大鼠 體重變化并繪制成圖(圖12)。在初級加強之后，向大鼠供給高脂肪飲 食以引起DIO (飲食誘導的肥胖病)。直到初次注射和加強為止，各組 中小鼠個體在體重上相似，均在22-23g的范圍內。但是，從DIO開始， 發現對照(肥胖病)體重增加，而注射B4RCI1、 B4RB2或B4TB2的組 顯示體重僅有輕微增加。當其為14周齡(在初次注射之后8周)時，對 照和B4RB2注射組在體重上大約有8g的差別，表明由初次注射誘導的 弱免疫應答通過二次注射而加強，達到足以抑制體重增加的程度。在第 三次注射之后，測定體重增加保持在預期的偏差范圍之內。另外，應用間接酶聯免疫吸附法在7、 10、 12、 14、 16和18周齡時 研究預防接種組中ICR小鼠的抗體滴度(圖12)。就血液中的脂類水平 而言，發現預防接種組在總血膽固醇(TC)、甘油三酯(TG) 、 HDL 膽固醇和LDL膽固醇脂類水平上比對照更低(圖13)。總的來說，這些結果證明根據本發明的雜交多肽B4RCI1、 B4RB2 和B4TB2可用作有效的抗肥胖病疫苗。與常規的雜交多肽B4T相比，本 發明的雜交多肽能誘導出更一致和穩定的免疫應答，因此其可用于制備 有效的抗肥胖病疫苗組合物。本發明的抗肥胖病疫苗由抗原、藥學上可接受的載體、適當的輔料 及其它常見的原料所組成，并且以免疫上有效的量來給藥。本文所用的 術語"免疫上有效的量"指對于肥胖病足以發揮治療和預防作用而不引 起副作用或嚴重或過度免疫應答的量。精確的劑量可根據給藥的特異性 免疫原而改變，并可應用測定免疫應答進展的已知方法由本領域技術人17員來測定。此外，劑量可依據給藥形式和途徑、接受者的年齡、健康狀 態和體重、癥狀的性質和程度、目前接受治療的種類以及治療頻率而改 變。載體為本領域已知的，包括穩定劑、稀釋劑和緩沖劑。適當的穩定 劑包括碳水化合物例如山梨醇、乳糖、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖和 葡萄糖；以及蛋白質例如白蛋白或酪蛋白。適當的稀釋劑包括鹽水、Hanks，平衡鹽溶液和林格液(Ringer's solution)。適當的緩沖液包括堿金 屬磷酸鹽、堿金屬碳酸鹽和堿土金屬碳酸鹽。疫苗還可包含一種或多種 輔料來增加或強化免疫應答。適當的輔料包括肽；氫氧化鋁；磷酸鋁； 氧化鋁；以及組合物，所述組合物由礦物油(例如Marco152)或植物油 以及一種或多種乳化劑或表面活性物質(例如溶血卵磷脂、多聚陽離子 和多聚陰離子)所組成。可將本發明的疫苗組合物作為單一治療劑給藥 或與另一種治療劑結合給藥，并且可與常規治療劑順次或同時共同給藥。 可通過已知的給藥途徑給予疫苗組合物。給藥方法包括口服、皮內、肌 內、腹腔內、靜脈內、皮下和鼻內途徑，但不限于此。此外，可使用特 定裝置給予藥物組合物，所述裝置可以將活性物質傳遞到靶細胞。通過以下所列的、用于舉例說明的實施例可更好地理解本發明，但 并不對本發明構成限制。實施例1試驗材料和試驗動物的制備DNA小量提取試劑盒和用于從凝膠中提取DNA的試劑盒購自 Nucleogen;Bacto胰蛋白胨、Bacto酵母提取物、瓊脂等來自Difco(Detroti， MI);限制酶來自Takara; T4 DNA連接酶來自NEB。使用pBluescript II SK (Stratagene) 、 PCR 2.1 (Invitrogen， Carlsbad， CA)和pQE30 (Qiagen) 載體以及大腸桿菌JM109和M15菌株(Qiagen)。用于誘導蛋白生產的 IPTG購自Sigma;用于純化表達的蛋白的Ni-NTA樹脂來自Novagen; 用于SDS-PAGE、 Western印跡、ECL等的預先染色標記來自NEB。用 于使蛋白變性的尿素購自Duchefa;用于蛋白純化的咪唑來自USB。用 于透析的膜是購自Spectrum的MWCO3，500;用于預防蛋白凝集的試劑 是來自Amresco的CHAPS。用于酶聯免疫吸附法的抗體是來自Amresco 的辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗大鼠IgG。用于Western印跡和ECL 的底物溶液是來自Sigma的BCIP/NBT; ECL Plus Western印跡檢測試劑購自Amersham。使用的輔料是弗氏佐劑(Freund's adjuvant, Sigma) 和氫氧化鋁(Reheis)。通過Pierce's BCA蛋白法和Biorad's Bradford法
來確定蛋白濃度。
6周齡雌性ICR小鼠購自韓國的Central Lab.Animal Inc.。用正常飲 食(Samtako Inc.,天然蛋白18%或更高，粗脂肪5.3%，粗纖維4.5%， 礦物質8.0%)飼養ICR小鼠直到免疫應答加強為止，然后用高脂肪的飲 食(60%kCal脂肪，D12492， Research Diets Inc.， New Brunswick, NJ)。
實施例2小鼠ApoCII基因克隆
2-1從鼠肝組織中分離總RNA
用TRIzol (Invitrogen)進行總RNA的分離。將所有用于RNA分離 的溶液用0.1%焦碳酸二乙酯處理過的水(DEPC-dH20)處理以抑制核糖 核酸酶(RNase)活性。將50mg來自小鼠的肝組織與2ml TRIzol混合， 然后勻漿。將勻漿置于冰上20分鐘，然后在4。C下、以14,000rpm離心 15分鐘。將上清液轉入新管中，從管中小心除去所有的蛋白。將20(^1 的氯仿(Merck)加入管中，然后渦旋30秒。再次在冰上另外反應20分 鐘，隨后在4"C下、以14,000rpm離心15分鐘。僅將上清液轉入新管， 然后與等體積的苯酚/氯仿和0.2M醋酸鈉(pH 5.2)混合后，渦旋5秒鐘。 將其置于冰上20分鐘之后，將混合物在4。C下、以14，000rpm離心15分 鐘。將上清液與等體積的異丙醇(Merck)混合，并在-7(TC下保存1小 時，隨后在4'C下、以14,000rpm離心10分鐘以形成RNA團塊。在-70。C 保存前，用lml的75%乙醇沖洗、干燥，并懸浮于DEPC-dH20中。通過 在1%瓊脂糖凝膠(0.5%TAE)上進行電泳來鑒定由此獲得的RNA，而 使用GeneQuantII (Pharmaciabiotech)來測定RNA濃度。
2-2從總RNA合成cDNA
利用cDNA環化TM試劑盒(cDNA cycle kit, Invitrogen)實現cDNA 合成。將400ng的RNA置于PCR管中，將其與DEPC-dH20混合得到 11.5pl的最終體積。其與lpl的寡-dT引物充分混合，并在65'C的水浴中 反應10分鐘，然后在室溫下反應2分鐘。將核糖核酸酶抑制劑1.(^1、 5XRT緩沖液4.0pl、 100mM的脫氧核苷三磷酸(dNTP) 1.0^1、 80mM的焦磷酸鈉l.Opl和AMV反轉錄酶0.5iil的混合物加入管中，然后將其 輕敲，置于42'C水浴中1小時，然后在95t:下放置2分鐘，立即保存于 冰上。在添加1.0|il的0.5MEDTA (pH8.0)和20^1的苯酚-氯仿后，將 混合物渦旋并在4"C下、以14,000rpm離心15分鐘。將由此形成的上清 液轉入新管中，加入22ial乙酸銨和88|^175%的乙醇，通過渦旋混合，然 后在-7(TC下保存過夜。接著在4'C下、以14,000rpm離心15分鐘，將產 生的團塊重懸在20pl的去離子水中。通過在1%瓊脂糖凝膠(0.5% TAE 緩沖液)上進行電泳來鑒定cDNA。
2-3小鼠載脂蛋白CII的C末端片段的PCR
將DNA擴增儀480 (DNA Thermal Cycler 480)用于在本實施例中 所有的PCR。為了在PCR中擴增包括小鼠載脂蛋白CII的脂肪酶活化區 域的99個基因，合成了一組ApoCII-正義引物(5'-tc aga GTC GAC gat gag aaa etc agg gac國3')禾口 ApoCII -反義弓l物(5'-tat AAG CTT ggg ctt gcc tggcagcagctac-3')。首先，向PCR管中，加入ApoCII-正義引物和ApoC II-反義引物(2pmol/Vl)各以及2pl的實施例2-2中合成的cDNA。 最后，制備包含5)al 10X緩沖液、8(ildNTP和TaqDNA聚合酶(Takara) 的50^1 PCR溶液。在94'C下進行預變性5分鐘以開始PCR，然后在98°C 變性30秒、56'C下退火30秒、72'C下延伸30秒，共進行30個這樣的 循環，隨后在72'C下延伸5分鐘。通過在1.5%瓊脂糖凝膠(0.5% TAE 緩沖液)上進行電泳來鑒定PCR產物(圖lb)。
2-4 ApoClI/pQE30的構建
用Sal I和Hind III消化ApoClI PCR產物。將相同的限制酶用于 pQE30。
在16'C、 T4DNA連接酶存在下，將CII消化物與線性的pQE30載 體連接過夜。設計表達載體pQE30來生產6個組氨酸標簽蛋白，其可以 方便地進行蛋白純化。將由此獲得的重組質粒轉化到JM109大腸桿菌中 并擴增。在從轉化體中制備之后，用Sal I和Hind III處理質粒來鑒定其 中目的基因的插入。
實施例3人工RCII基因的構建3-1從狂犬病病毒菌株ERA中分離基因組DNA
用TRIzol (Invitrogen)進行總RNA的分離。將所有用于RNA分離 的溶液用0.1%焦碳酸二乙酯處理過的水(DEPC-dH20)處理以抑制核糖 核酸酶活性。為了用于分離總RNA，狂犬病病毒獲自狂犬病病毒疫苗。 首先，將包含2.5MNaCl的20% (w/v)聚乙二醇-800溶液200^1加入到 1.2ml疫苗中，并置于冰上l小時，隨后在4。C下、14,000rpm離心10分 鐘。將由此獲得的病毒團塊與lml的TRIzol混合并用移液管充分吸移。 將勻漿置于冰上20分鐘，并且在4。C下、以14,000rpm離心15分鐘。將 上清液轉入新管中，從管中小心除去所有的蛋白。將200)al的氯仿(Merck) 加入管中，然后將其渦旋30秒。再次在冰上另外反應20分鐘，隨后在4°C 下、以14,000rpm離心15分鐘。僅將上清液轉入新管，然后與等體積的 苯酚/氯仿和0.2M醋酸鈉(pH 5.2)混合后，渦旋5秒鐘。置于冰上20 分鐘后，將混合物在4"C下、以14,000rpm離心15分鐘。將上清液與等 體積的異丙醇(Merck)混合，并在-7(TC下保存1小時，隨后在4'C下、 以14,000rpm離心10分鐘以鑒定RNA團塊。在-70。C保存前，用lml 75% 的乙醇沖洗、干燥，并重懸于DEPC-dH20中。通過在1%瓊脂糖凝膠(0.5% TAE)上進行電泳來鑒定由此獲得的RNA，而使用GeneQuant II (Pharmacia biotech )來測定RNA濃度。
3-2從基因組RNA合成cDNA
利用cDNA環化 試劑盒(Invitrogen)進行cDNA合成。將400ng 的RNA置于PCR管中，并與DEPC-dH20混合得到11.5|_U的最終體積。 將其與1W的隨機六聚體充分混合，在65'C水浴下反應IO分鐘，然后在 室溫下反應2分鐘。將核糖核酸酶抑制劑l.Opl、 5X RT緩沖液4.0^1、 100mM的dNTP 1.0|il、 80mM的焦磷酸鈉1.0^1和AMV反轉錄酶0.5pl 的混合物加入管中，然后將其輕敲，置于42"C水浴中1小時，然后在95°C 下放置2分鐘，然后立即保存于冰上。在添加1.0|il的0.5M EDTA(pH 8.0) 和20fil的苯酚-氯仿后，將混合物渦旋并在4"C下、以14,000rpm離心15 分鐘。將由此形成的上清液轉入新管中，加入22^1的乙酸銨和88^175% 的乙醇，通過渦旋混合，然后在-7(TC下保存過夜。接著在4t:下、以 14,000rpm離心15分鐘，將產生的團塊重懸于20|^1的去離子水中。通過
21在1%瓊脂糖凝膠(0.5。/。TAE緩沖液)上進行電泳來鑒定cDNA。
3-3狂犬病病毒菌株ERA的核蛋白基因的PCR
為了擴增已知編碼T細胞表位(2)的狂犬病病毒菌株ERA的174 個核蛋白基因，用一組RVNP-正義引物(5'-ATA CTC GAG GAC GTA GCA CTG GCA GAT G-3')和RVNP-反義引物(5'-ATA CTC GAG GTT TGGACGGGC ATGACG-3')進行PCR。首先，向PCR管中加入RVNP-正義引物和RVNP-反義引物(2pmol/pl)各1^1以及2pl實施例3-2中合 成的cDNA。最后，制備包含5jil 10X緩沖液、8jil dNTP和1^1 TaqDNA 聚合酶(Takara)的50plPCR溶液。在94。C下進行預變性5分鐘以開始 PCR，然后在98'C變性30秒、54'C下退火30秒、72"C下延伸30秒，共 進行30個這樣的循環，隨后在72'C下延伸5分鐘。通過在1.5%瓊脂糖 凝膠(0.5。/。TAE緩沖液)上進行電泳來鑒定PCR產物。
3-4 RCII/pQE30的構建
用Xho I消化RVNP PCR產物，而用Xho I和Sal I處理 ApoC II/pQE30載體。
在16'C、 T4DNA連接酶存在下，將RVNPPCR消化物與線性化的 ApoCII/pQE30載體連接過夜。將產生的重組質粒轉化到JM109大腸桿 菌中并擴增。在從轉化體中制備之后，用Sal I和Hind III處理質粒來鑒 定其中在適當方向上存在的目的基因的插入。
實施例4。B4RCII載體的構建
如韓國專利號10-0639397公開的那樣，通過用Xho I處理來獲得插 入pQE30中的相同B14片段。另外，將攜帶RCII片段的pQE30載體用 Xhol酶切，并在16'C、 T4DNA連接酶存在下，與B14片段連接過夜， 得到重組BL4RCII/pQE30 (pB4RCI1)質粒。將300 500ng/|al的 pB4RC II委托Cosmo Co. Ltd.做DNA測序。在從固定有BL4RCII/pQE30 載體的大腸桿菌JM109中制備之后，用Sal I處理來鑒定在適當方向上基 因的插入(圖2b) 。 B4RCII的氨基酸序列如序列編號9所示。
實施例5 。B4RB2載體的構建
用Sal I禾卩Xhol消化韓國專利號10-0472841公開的BX2/pQE30(pB2)載體。將實施例3所獲得的R片段在16。C下、T4 DNA連接酶 存在下，與線性化的BX2/pQE30連接過夜，得到重組的RBX2/pQE30 (pRB2)質粒。
將可通過用Xho I酶切實施例4的pB4RCII獲得的B4片段在16°C 下、T4DNA連接酶存在下，與之前也用XhoI處理過的pTB2連接15小 時，產生重組的B4RBX2/pQE30 (pB4RB2 )質粒。在從固定有 B4RBX2/pQE30載體的大腸桿菌JM109中制備之后，用Sal I處理來鑒定 在適當方向上基因的插入(圖2c) 。 B4RB2的氨基酸序列如序列編號10 所示。
實施例6 pB4TB2載體的構建
用Sal I和Xho I消化韓國專利號10-0472841公開的BX2/pQE30 (pB2)載體。通過消化韓國專利號10-0639397公開的PCR 2.1載體來 制備T片段。將T片段在16'C下、T4DNA連接酶存在下，與線性化的 BX2/pQE30連接過夜，產生重組的TBX2/pQE30 (pRB2)質粒。
將通過用Sal I和Xho I酶切pBluescriptll SK 4獲得的B4片段在16°C 下、T4DNA連接酶存在下，與之前也用SalI處理過的pTB2連接過夜， 產生重組的B4TBX2/pQE30(pB4TB2)質粒。在從固定有B4TBX2/pQE30 載體的大腸桿菌JM109中制備之后，用Sal I和Hind III處理來鑒定在適 當方向上基因的插入(圖2d) 。 B4TB2的氨基酸序列如序列編號11所 示。
實施例7重組B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的表達
將用作蛋白表達的宿主細胞的M15涂抹于包含氨芐青霉素和卡那霉 素的LB平板上，然后菌落出現。將其中之一在10ml的包含氨芐青霉素 (50嗎/ml)和卡那霉素(50嗎/ml) LB肉湯中培養過夜。將lml的培 養物接種到50ml的新鮮LB肉湯中以觀察蛋白隨時間的誘導。在37'C下 振蕩培育培養物1.5小時至達到600nm吸光率為0.4 0.5，在此之后加 入IPTG至終濃度lmM，并且在培育期間每隔1小時抽樣lml培養物， 如此進行5小時。在加入IPTG之前，取lml培養物并用作對照。將每 一培養物以14,000rpm離心1分鐘，并在SDS-PAGE之前將由此獲得的
23團塊重懸于30pl2XSDS樣品緩沖液中。對蛋白進行計算，B4RCII的大小為22kDa、 B4RB2的大小為21kDa以及B4TB2的大小為20kDa。圖9(a) 9 (c)中給出SDS-PAGE結果，其顯示蛋白隨時間的表達。
實施例8用于重組肽B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的Western印跡
利用SDS-PAGE通過大小分析來鑒定B4RCII 、B4RB2和B4TB2肽，但是為了進一步確認表達的蛋白是否是B4RCI1、 B4RB2和B4TB2，使用兩種能夠識別B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的抗體進行Western印跡。作為B4RCI1、 B4RB2和B4TB2的Western印跡中的對照，用不包含B4RCII 、B4RB2和B4TB2片段的pQE30載體轉化大腸桿菌M15。在IPTG誘導之前以及IPTG誘導之后四個小時收集樣品。
將兔抗PB14多克隆抗體以1:10000稀釋于PBS中，并用作第一抗體。作為能夠識別第一抗體的第二抗體，在以1:10000稀釋于PBS中之后，使用過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG。利用ECL Plus Western Blotting試劑盒對產生的印跡進行顯色。將印跡置于暗盒中，并將一張富士醫用X線膠片置于印跡上。將印跡暴露于膠片10秒并顯影。如圖9 (d)所示，B4RCII得到正確表達。
實施例9在細菌細胞中重組B4RCI1、 B4RB2和B4TB2的鑒定
在將如實施例5中誘導蛋白表達的細胞培養物在4'C下、以9,000rpm離心30分鐘之后，將團塊在-2(TC下短時間冷凍，并在冰上解凍。將每一團塊各lg重懸于5ml的超聲處理緩沖液中，并且通過15個30秒超聲處理循環來破碎，每一循環之間的間歇為l分鐘。在4'C下、以9000rpm離心30分鐘來產生上清液中的可溶蛋白(粗提物A)和團塊中的不溶蛋白(粗提物B)。將每個樣品與2X SDS緩沖液混合，并且就在SDS-PAGE之前，在95t下煮沸5分鐘(圖10)。
實施例10用于純化重組B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的緩沖液的制備
如下制備緩沖液超聲處理緩沖液5mM咪唑、0.5MNaCl、 20mMTris-Cl、 pH7.9;結合緩沖液5mM咪唑、0.5MNaCl、 20mM Tris-Cl、8M尿素、pH7.9;沖洗緩沖液50mM咪唑、0.5MNaCl、 20mMTris-Cl、8M尿素、pH 7.9;洗脫緩沖液400mM咪唑、0.5M NaCl、 20mM Tris-Cl、8M尿素、pH7.9。
實施例11重組B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的純化
利用Ni-NTA樹脂(Novagen)對于組氨酸標簽蛋白進行肽純化。該純化是利用結合于樹脂的Ni+和融合蛋白N末端的組氨酸六聚體之間相互作用的親合層析方法。在將轉化的大腸桿菌細胞在10ml的LB培養基中預培養過夜之后，將10ml培養物接種于500ml LB培養基中，并在37°C下培養直到600nm處OD達到0.4-0.5為止。然后，將lmM IPTG加入培養基中，然后將細胞進一步培養4小時。將細胞在9000rpm下離心30分鐘，然后將細胞團塊置于-2(TC下。在將冷凍細胞在冰上解凍之后，將其重懸于超聲處理破碎緩沖液(5ml/g的濕細胞)中，然后超聲處理。然后在4t:下、以9000rpm離心細胞裂解物30分鐘。將團塊重懸于與上清液體積相等的結合緩沖液中，超聲處理三次來除去細胞碎片，然后在4'C下、以9000rpm離心30分鐘。利用Ni-NTA樹脂對于由此獲得的上清液進行親合層析。柱直徑為1厘米，高度為15厘米，并且填裝2ml樹脂，以2ml/min的流速進行所有步驟。在將樹脂裝入柱后，用三至五倍柱容積的蒸餾水沖洗樹脂，然后用五倍柱容積的Ix電荷緩沖液(50mM NiS04)使樹脂帶有N產，然后用結合緩沖液平衡，從而產生Ni-螯合的親和層析柱。在將樣品兩次上樣到柱之后，用結合緩沖液沖洗柱直到280nm處的吸光度達到1.0的基線為止，然后用沖洗緩沖液沖洗IO分鐘。在柱完全平衡之后，僅將洗脫緩沖液通過柱并收集洗脫蛋白。因為洗脫肽溶于8M尿素中，所以在PBS中透析來除去尿素。用緩慢下降的尿素濃度來進行透析，以便精確地重折疊蛋白。在色譜分析中重折疊蛋白部分在280nm處的吸光度如圖6 (a) 、 6 (c)和6 (e)所示。通過SDS-PAGE鑒定各步驟中獲得的部分，如圖10 (b) 、 10 (d)和10 (f)所示。
實施例12重組B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的定量
因為B4RCII不聚集成沉淀物，所以雖然將其用緩慢下降的尿素濃度透析，但在這種條件下其量是確定的。利用BCA蛋白試驗和紫外吸收法來進行蛋白的定量。通過將2.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA)儲備液稀釋為1000、 500、 250、 125和62.5嗎/ml來制備用于BCA蛋白法的BSA標準樣品。將樣品與50:1試劑A:試劑B的混合物在37t:下反應30分鐘，然后測定562nm處的吸光度。使用標準曲線來測定蛋白濃度。就紫外吸收而言，通過將280nm的吸光度除以1.63來確定蛋白濃度，其中1.63是B4RCII的s值。
實施例13ICR小鼠的免疫
將ICR小鼠分為五組，包括陽性組(飲食誘導的肥胖病(DIO))、陰性對照(非DIO，正常組)、B4RCII免疫組、B4RB2免疫組以及B4TB2免疫組。將包含50pgB4RCn、 B4RB2或B4TB2的100nl溶液腹膜注射給6周齡的ICR小鼠。按照兩周的定期間隔重復注射三次之后，監控體重并繪制出變化。在初級加強之后，供給高脂肪飲食來使小鼠患上DIO
(飲食誘導的肥胖病)。在初級加強之后一周以及二次加強之后一周、三周和五周，從尾部抽取血樣。
如圖11所示，直到初次注射和加強為止，各組中小鼠個體在體重上相似，均在22-23g的范圍內。但是，從飲食誘導的肥胖病開始，發現對照(肥胖病)體重增加，而注射B4RCI1、 B4RB2或B4TB2的組顯示體重僅有輕微增加。當其為14周齡(在初次注射之后8周)時，對照和B4RB2注射組在體重上大約有8g的差別，表明由初次注射誘導的弱免疫應答由二次注射加強，達到足以抑制體重增加的程度。在第三次注射之后，測定體重增加保持在預期的偏差范圍之內。
實施例14通過間接酶聯免疫吸附法(ELASA)使用血清樣品測定抗體滴度
將100(il (100ng)的PB14置于微量滴定板的每個孔中。將微量滴定板在4。C下培育過夜，然后在封閉液(PBS， 0.5%酪蛋白，0.02%NaN3)中于37。C培育1小時。用沖洗緩沖液沖洗每個孔三次。將從實施例10中收集的血清樣品以1:1000到1:8000稀釋于PBS中。將100^1每種稀釋的血清樣品加入到每個孔中，并且在37"C下培育1小時。用沖洗緩沖液沖洗每個孔三次，然后用1:1000稀釋的山羊抗小鼠IgG作為第二抗體進行培育。
如圖12所示，B4RB2或B4TB2免疫組的抗體滴度一直增加到14周齡為止，但在該點之后降低；而B4RCII免疫組的抗體滴度一直增加到16周齡為止，并在該點之后降低。實施例15血脂水平的評估
如下測定甘油三酯和膽固醇的水平。將4^1血清樣品與200^1顯色試劑混合，然后在37。C下培育5分鐘，然后測定505nm和500nm處的吸光度。為了測定HDL水平，將血清樣品與沉淀劑以1:1的比例混合，使其在室溫下放置10分鐘，然后在超過3000 rpm下離心IO分鐘。將4^1離心上清液與200^1顯色試劑混合，在37。C下培育5分鐘，然后測定555nm處的吸光度。利用EZ LDL膽固醇試劑盒(Sigma)和LDL校準器(Randox)測定LDL-膽固醇水平。根據制造商提供的說明書，將4^1血清樣品與該試劑盒中含有的1,150(il試劑混合，在37。C下培育5分鐘，補充250)al該試劑，再次在37。C下培育5分鐘。然后，測定600nm處的吸光度。利用測定的吸光度來確定每種脂類的血清水平，利用標準溶液獲得標準曲線。
就血液中的脂類水平而言，如圖13所示，發現預防接種組在血液總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG) 、 HDL膽固醇以及LDL膽固醇脂類水平上比對照(肥胖病)更低。
工業實用性
如至此所描述的，可將根據本發明的致免疫雜交多肽用于哺乳動物動物，例如狗、貓、牛等，以及人。所述雜交多肽具有誘導更一致和穩定的免疫應答的能力，其用于預防和治療動物以及人的肥胖病。
權利要求
1.一種致免疫雜交多肽，包含(i)具有選自由序列編號1、序列編號2和序列編號3所組成的組的氨基酸序列的肽的單體或多聚體；(ii)狂犬病病毒輔助T細胞表位，或乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表位；以及(iii)小鼠載脂蛋白C II的C末端肽片段，或具有選自由序列編號1、序列編號2和序列編號3所組成的組的氨基酸序列的肽的單體或多聚體，順序是從所述致免疫雜交多肽的N末端到C末端方向。
2. 根據權利要求1所述的致免疫雜交多肽，其中上述(i)所述的 多聚體包含兩至八個肽，每個肽具有選自由序列編號1、序列編號2和序 列編號3所組成的組的氨基酸序列。
3. 根據權利要求2所述的致免疫雜交多肽，其中所述多聚體包含四 個肽，每個肽具有選自由序列編號1、序列編號2和序列編號3所組成的 組的氨基酸序列。
4. 根據權利要求3所述的致免疫雜交多肽，其中所述多聚體包含四 個具有序列編號1的氨基酸序列的肽。
5. 根據權利要求4所述的致免疫雜交多肽，其中所述多聚體具有序 列編號5的氨基酸序列。
6. 根據權利要求l所述的致免疫雜交多肽，其中所述狂犬病病毒輔 助T細胞表位具有序列編號6的氨基酸序列。
7. 根據權利要求l所述的致免疫雜交多肽，其中所述乙型肝炎病毒 表面抗原輔助T細胞表位具有序列編號7的氨基酸序列。
8. 根據權利要求l所述的致免疫雜交多肽，其中所述載脂蛋白CII 的C末端肽片段具有序列編號8的氨基酸序列。
9. 根據權利要求1所述的致免疫雜交多肽，其中上述(iii)所述的 多聚體包含兩至四個肽，每個肽具有選自由序列編號1、序列編號2和序列編號3所組成的組的氨基酸序列。
10. 根據權利要求9所述的致免疫雜交多肽，其中所述多聚體包含 兩個肽，每個肽具有選自由序列編號1、序列編號2和序列編號3所組成 的組的氨基酸序列。
11. 根據權利要求IO所述的致免疫雜交多肽，其中所述多聚體包含 兩個具有序列編號1的氨基酸序列的肽。
12. 根據權利要求1所述的致免疫雜交多肽，包含(i)具有序列編 號1的氨基酸序列的肽的四聚體；(ii)狂犬病病毒輔助T細胞表位；以 及(iii)小鼠載脂蛋白CII的C末端肽片段，順序是從所述致免疫雜交 多肽的N末端到C末端方向。
13. 根據權利要求12所述的致免疫雜交多肽，具有序列編號9的氨 基酸序列。
14. 根據權利要求l所述的致免疫雜交多肽，包含(i)具有序列編 號1的氨基酸序列的肽的四聚體；(ii)狂犬病病毒輔助T細胞表位；以 及(iii)具有序列編號i的氨基酸序列的肽的二聚體，順序是從所述致免疫雜交多肽的N末端到C末端方向。
15. 根據權利要求14所述的致免疫雜交多肽，具有序列編號10的 氨基酸序列。
16. 根據權利要求1所述的致免疫雜交多肽，包含(i)具有序列編 號1的氨基酸序列的肽的四聚體；(ii)乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表位；以及(iii)具有序列編號1的氨基酸序列的肽的二聚體，順序 是從所述致免疫雜交多肽的N末端到C末端方向。
17. 根據權利要求16所述的致免疫雜交多肽，具有序列編號ll的 氨基酸序列。
18. —種用于預防或治療肥胖病的疫苗，包含權利要求1至17之一 所述的致免疫雜交多肽作為活性成分。
19. 一種多聚核苷酸，編碼權利要求1至17之一所述的致免疫雜交 多肽。
20. —種重組表達載體，包含權利要求19所述的多聚核苷酸。
21. —種宿主細胞，用權利要求20所述的重組表達載體轉化。
22. —種用于生產權利要求1所述的致免疫雜交多肽的方法，包括 培養用權利要求20所述的重組表達載體轉化的宿主細胞。
全文摘要
本發明公開一種預防和治療肥胖病的致免疫雜交多肽，其中將載脂蛋白B-100的B細胞表位的模擬肽、狂犬病病毒輔助T細胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原輔助T細胞表位以及小鼠載脂蛋白CII的C末端肽片段或載脂蛋白B-100的B細胞表位的模擬肽以從該致免疫雜交多肽的N末端到C末端方向的順序相互融合。此外，公開了一種包含該致免疫雜交多肽的用于預防和治療肥胖病的疫苗組合物、編碼該致免疫雜交多肽的多聚核苷酸、攜帶該多聚核苷酸的重組表達載體、固定有該重組表達載體的宿主細胞，以及通過培養由該重組表達載體轉化的宿主細胞來制備所述致免疫雜交多肽的方法。
文檔編號C07K19/00GK101516915SQ200780035653
公開日2009年8月26日 申請日期2007年9月21日 優先權日2006年9月25日
發明者李禧宗, 金曉駿 申請人:Sj Biomed株式會社