趨化因子受體活性調節劑及其晶型和制法的制作方法

專利名稱：趨化因子受體活性調節劑及其晶型和制法的制作方法
本申請要求分別于2006年7月28日和2007年3月21日提出的美國臨時申請號60/834,235和60/896,026的優先權，此兩案公開的內容均并入本文供參考。
發明領域 本發明提供N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺或其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或前體藥物，其具有所要藥理學特性的令人意外的組合。還提供本發明的結晶型。含有它們的醫藥組合物和使用它們作為藥劑以治療炎性疾病、過敏性、自身免疫、代謝、癌癥和/或心血管疾病的方法也是本發明的目的。本公開內容還提供制備式(I)化合物的方法，該化合物包括N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺
其中R1、R8、R9、R10和

均如本文中所述。本文還提供可用于所述方法的中間體的化合物。

背景技術：
趨化因子為分子量6-15kDa的趨化細胞因子，其通過許多種細胞釋放，以在其它細胞類型中吸引和活化巨噬細胞、T和B淋巴細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞及中性粒細胞(綜述于Charo and Rasonhoff，NewEng.J.Med.2006，354，610-621；Luster，New Eng.J.Med.1998，338，436-445；以及Rollins，Blood 1997，90，909-928)。有兩種主要趨化因子種類，CXC和CC，依在氨基酸順序中的最初兩個半胱胺酸是被單一氨基酸分隔(CXC)或者為相鄰(CC)而定。CXC趨化因子，例如白細胞介素-8(IL-8)、中性粒細胞活化蛋白質-2(NAP-2)及黑色素瘤生長刺激活性蛋白質(MGSA)，主要是對中性粒細胞與T淋巴細胞具有趨化性，而在其它細胞類型中，CC趨化因子例如RANTES、MIP-1α、MIP-1β、單細胞趨化性蛋白質(MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4及MCP-5)和嗜酸細胞活化趨化因子(eotaxin)(-1和-2)是針對巨噬細胞、T淋巴細胞、嗜酸粒細胞、樹突細胞和嗜堿粒細胞具有趨化性。還存在趨化因子淋巴細胞趨化因子-1、淋巴細胞趨化因子-2(兩者均為C趨化因子)以及fractalkine(CX3C趨化因子)存在，它們并未落在任一種主要趨化因子亞族群中。
這些趨化因子結合到屬于G-蛋白質偶合的七跨膜域蛋白質族群的特異性細胞表面受體(綜述于Horuk，Trends Pharm.Sci.1994，15，159-165)，其被稱為＂趨化因子受體＂。在結合其同源配位體時，趨化因子受體會經過所締合的三聚G蛋白質轉導細胞內信號，而在其它應答中，造成細胞內鈣濃度的快速增加，細胞形狀改變，增加細胞粘附分子的表達，去顆粒化作用和細胞遷移的促進作用。有至少十種人類趨化因子受體會對CC趨化因子結合或應答，其具有下列特征型式(綜述于Zlotnik and Oshie Immunity 2000，12，121)CCR-1(或者＂CKR-1＂或＂CC-CKR-1＂)[MIP-1α、MCP-3、MCP-4、RANTES](Ben-Barruch，et al.，Cell 1993，72，415-425，以及Luster，New Eng.J.Med.1998，338，436-445)；CCR-2A和CCR-2B(或＂CKR-2A＂/＂CKR-2B＂或＂CC-CKR-2A＂/＂CC-CKR-2B＂)[MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5](Charo，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91，2752-2756，以及Luster，New Eng.J.Med.1998，338，436-445)；CCR-3(或＂CKR-3＂或＂CC-CKR-3＂)[嗜酸細胞活化趨化因子-1，嗜酸細胞活化趨化因子-2，RANTES，MCP-3，MCP-4](Combadiere，et al.，J.Biol.Chem.1995，270，16491-16494，以及Luster，New Eng.J.Med.1998，338，436-445)；CCR-4(或者＂CKR-4＂或＂CC-CKR-4＂)[TARC，MDC](Power，et al.，J.Biol.Chem.1995，270，19495-19500，以及Luster，New Eng.J.Med.1998，338，436-445)；CCR-5(或者＂CKR-5＂或＂CC-CKR-5＂)[MIP-α，RANTES，MIP-1β](Sanson，et al.，Biochemistry 1996，35，3362-3367)；CCR-6(或者＂CKR-6＂或＂CC-CKR-6＂)[LARC](Baba，et al.，J.Biol.Chem.1997，272，14893-14898)；CCR-7(或者＂CKR-7＂或＂CC-CKR-7＂)[ELC](Yoshieet al.，J.Leukoc.Biol.1997，62，634-644)；CCR-8(或者＂CKR-8＂或＂CC-CKR-8＂)[I-309](Napolitano et al.，J.Immunol.，1996，157，2759-2763)；CCR-10(或者＂CKR-10＂或＂CC-CKR-10＂)[MCP-1，MCP-3](Bonini，et al.，DNA and Cell Biol.1997，16，1249-1256)；以及CCR-11[MCP-1，MCP-2及MCP-4](Schweickert，et al.，J.Biol.Chem.2000，275，90550)。
除了哺乳動物趨化因子受體以外，已證實哺乳動物巨細胞病毒、皰疹病毒及痘病毒會在受感染細胞中表達蛋白質而具有趨化因子受體的結合性質(綜述于Wells and Schwartz，Curr.Opin.Biotech.1997，8，741-748)。人類CC趨化因子，例如RANTES與MCP-3，可通過這些病毒編碼受體造成鈣的快速移動。受體表達可通過使正常免疫系統監督和對感染的應答遭到破壞而隨意受影響。此外，人類趨化因子受體，例如CXCR4、CCR2、CCR3、CCR5和CCR8，可充當哺乳動物細胞被微生物(與例如人類免疫缺陷病毒(HIV)一樣)感染的共受體。
趨化因子及其同源受體作為重要的介質與炎性、感染性及免疫調節病癥和疾病有關，所述病癥和疾病包括哮喘和過敏性疾病，以及自身免疫病理學疾病，例如風濕性關節炎和多發性硬化；以及代謝疾病，例如動脈粥樣硬化和糖尿病(綜述于Charo and Rasonhoff，New Eng.J.Med.2006，354，610-621；Z.Gao and W.A.Metz，Chem.Rev.2003，103，3733；P.H.Carter，Current Opinion in Chemical Biology 2002，6，510；Trivedi，et al，Ann.Reports Med.Chem.2000，35，191；Saundersand Tarby，Drug Disc.Today 1999，4，80；Premack and Schall，NatureMedicine 1996，2，1174)。例如，趨化因子單核細胞化學引誘劑-1(MCP-1)及其受體CC趨化因子受體2(CCR-2)在吸引白細胞至發炎位置及在接著活化這些細胞中發揮關鍵作用。當趨化因子MCP-1結合至CCR-2時，其會引發胞內鈣濃度的快速增加，增加細胞粘附分子的表達，以及促進白細胞遷移。MCP-1/CCR-2相互作用的重要性已通過使用基因變性小鼠的實驗提供證明。MCP-1-/-小鼠在數種不同類型的免疫激發后，不能夠使單核細胞補充至發炎位置(Bao Lu，et al.，J.Exp.Med.1998，187，601)。同樣地，當用各種外源性藥劑激發時，CCR-2-/-小鼠不能夠補充單核細胞或產生干擾素-γ；再者，CCR-2裸鼠的白細胞不會在對MCP-1的應答中遷移(Landin Boring，et al.，J.Clin.Invest.1997，100，2552)，從而證實MCP-1/CCR-2相互作用的特異性。兩個其它組已獨立報道了使用不同品系的CCR-2-/-小鼠的相效結果(William A.Kuziel，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，94，12053，以及TakaoKurihara，et al.，J.Exp.Med.1997，186，1757)。MCP-1-/-和CCR-2-/-動物的存活力和一般正常健康狀況是值得注意的，因為MCP-1/CCR-2相互作用的中斷不會導致生理危象。總之，這些數據得到的結論是，阻斷MCP-1/CCR2作用的分子將可用于治療多種炎性和自身免疫病癥(綜述于M.Feria and F.Diaz-González，Exp.Opin.Ther.Patents 2006，16，49；和J.DaWson，W.Miltz，and C.Wiessner，C.Exp.Opin.Ther.Targets 2003，7，35)。如下文所述，此項假說目前已在多種不同動物疾病模型中得到確認。
已知MCP-1在患有風濕性關節炎的患者中被上調節(Alisa Koch，etal.，J.Clin.Invest.1992，90，772-779)。此外，在治療風濕性關節炎中，多項臨床前研究已證實MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值。編碼MCP-1的DNA疫苗最近已證實會改善大鼠的慢性多佐劑所引發的關節炎(Sawsan Youssef，et al.，J.Clin.Invest.2000，106，361)。同樣地，通過直接給大鼠施用針對MCP-1的抗體，可以控制膠原誘導的關節炎(Hiroomi Ogata，et al.，J.Pathol.1997，182，106)或鏈球菌細胞壁誘導的關節炎(Ralph C.Schimmer，et al.，J.Immunol.1998，160，1466)的大鼠的疾病癥狀。可能最顯著的是，在關節炎的MRL-1pr小鼠模型中，經證實MCP-1的肽拮抗劑MCP-1(9-76)既會防止疾病發病又會降低疾病癥狀(取決于施用時間)(Jiang-Hong Gong，et al.，J.ExP.Med.1997，186，131)。此外，在關節炎的嚙齒動物模型中，已證實施用小分子CCR2拮抗劑會降低臨床評分(C.M.Brodmerkel，et al，J.Immunol.2005，175，5370；以及M.Xia，et al.，美國專利申請0069123，2006)。施用抗CCR2抗體對鼠科動物CIA具有不同作用，這取決于施用時間(H.Bruhl，et al.，J.Immunol.2004，172，890)。最近使用CCR2-/-小鼠的研究已顯示CCR2的缺失可在特定實驗情況中使嚙齒動物關節炎模型更為惡化(M.P.Quinones，et al.，J.Clin.Invest.2004，113，856；M.PQuinones，et al.，J.Mol.Med.2006，84，503)。
已知MCP-1在動脈粥樣硬化性病變中被上調節，并且已證實MCP-1的循環水平通過用治療劑治療而被降低(Abdolreza Rezaie-Majd，et al，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2002，22，1194-1199)。在治療動脈粥樣硬化中，數項關鍵研究已證實MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值。例如，當MCP-1-/-小鼠與LDL受體-缺陷小鼠雜交時，發現主動脈脂質沉積降低83％(Long Gu，et al.，Mol.Cell 1998，2，275)。同樣地，當從已過度表達人類載脂蛋白B的小鼠中基因切除MCP-1時，相對于MCP-1+/+apoB對照小鼠而言，使所得到的小鼠被保護而免于動脈粥樣硬化性損傷形成(Jennifa Gosling，et al.，J.Clin.Invest.1999，103，773)。同樣地，當CCR-2-/-小鼠與載脂蛋白E-/-小鼠雜交時，發現顯著降低動脈粥樣硬化性損傷的發生率(Landin Boring，et al，Nature1998，394，894；T.C.Dawson，et al.，Atherosclerosis 1999，143，205)。最后，當載脂蛋白E-/-小鼠被施用一種編碼CCR2的肽拮抗劑的基因時，則損傷大小被降低，并且斑塊穩定性被增加(W.Ni，et al.，Circulation2001，103，2096-2101)。得自CCR2-/-小鼠的骨髓移植至ApoE3-Leiden小鼠中，會抑制早期動脈粥樣硬化形成(J.Guo，et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2003，23，447)，但對已發展的損傷具有最小作用(J.Guo，et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2005，25，1014)。
患有2型糖尿病的患者通常顯示胰島素抗藥性，這是該疾病的標志特征之一。胰島素抗藥性還與稱為＂代謝綜合癥＂或＂綜合征X＂的異常族群有關聯，該族群包括肥胖、動脈粥樣硬化、高血壓和脂血障礙(綜述于Eckel，et al.，Lancet 2005，365，1415)。充分明了的是，發炎在使2型糖尿病與＂綜合征X＂病理學疾病中的疾病過程更為惡化中發揮作用(綜述于Chen，Pharmacological Research 2006，53，469；Neels andOlefsky，J.Clin.Invest.2006，116，33；Danadona and Aljada，Am JCardiol.2002 90，27G-33G；Pickup and Crook，Diabetologia 1998，41，1241)。MCP-1被認為在肥胖誘發的胰島素抗藥性中發揮作用。在培養物中，人類前脂肪細胞在構成上表達MCP-1(Gerhardt，Mol.Cell.Endocrinology 2001，175，81)。CCR2被表達于脂肪細胞上；在體外，添加MCP-1至經分化的脂肪細胞中，會降低經胰島素刺激的葡萄糖吸收以及數種脂肪生成基因(LpL，adipsin，GLU-4)、aP2、β3-腎上腺素能受體和PPARγ的表達(P.Sartipy and D.Loskutoff，Proc.Natl.Acad.SciUSA 1999，96，6902)。患有2型糖尿病的患者具有比非糖尿病對照組更高水平的循環MCP-1(S.Nomura，et al.，Clin.Exp.Immunol.2000，121，437)，并且MCP-1從脂肪組織的釋放可通過用抗糖尿病治療劑例如二甲雙胍或噻唑烷二酮的治療而被降低(J.M.Bruun，et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.2005，90，2282)。同樣地，MCP-1也在肥胖的鼠科動物實驗模型中過表達，并且主要由脂肪組織產生(Sartipy andLoskutoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003，100，7265)。在肥胖小鼠中，MCP-1的表達既在胰島素抗藥性開始之前，又與其同時地發生(H.Xu，et al.，J.Clin.Invest.2003，112，1821)。另一項研究證實，在小鼠生殖腺周圍脂肪組織中MCP-1的表達與體重呈正相關(Weisberg，et al.，J.Clin.Invest.2003，112，1796)。與這些數據一致，胰島素抗藥性在db/db小鼠中的發展是通過MCP-1的基因缺失或通過顯性負肽基因誘導的表達而被改善(H.Kanda，et al.，J.Clin.Invest.2006，116，1494)。相反邏輯也可證實MCP-1在脂肪組織中的過表達會促進胰島素抗藥性(N.Kamei，et al.，J.Biol.Chem.2006，281，26602)。證實MCP-1的基因缺失不會在db/db小鼠中影響胰島素抗藥性的一項矛盾結果也已出現(F.Y.Chow，et al.，Diabetologia 2007，50，471)。與關于MCP-1的數據一致，使用CCR2(MCP-1受體)的直接研究已證實其在肥胖的形成與肥胖誘導的胰島素抗藥性中發揮作用。高脂肪膳食的維持會在野生型小鼠(C.L.Tsou，et al.，J.Clin.Invest.2007，117，902)和ApoE-/-小鼠(F.Tacke，et al.，J.Clin.Invest.2007，117，185)中增加循環CCR2+炎性單細胞的數目。CCR2的基因缺失會減少小鼠脂肪組織中活化的巨噬細胞的數目(C.N.Lumeng，et al.，Diabetes 2007，56，16)，但不會影響被認為會保持＂纖瘦＂狀態的M2脂肪巨噬細胞的群體(C.N.Lumeng，et al.，J.Clin.Invest.2007，117，175)。在飲食誘導的肥胖模型中，CCR2的基因缺失會降低飲食誘導的肥胖并且改善胰島素敏感性(S.P.Weisberg，et al.，J.Clin.Invest.2006，116，115；P Cornelius，RP Gladue，RS Sebastian，WO專利2006/013427 A2，2006)，這取決于實驗條件(A.Chen，et al.，Obes.Res.2005，13，1311)。小分子CCR2拮抗劑的施用也會在此相同模型中改善胰島素敏感性(S.P.Weisberg，et al.，J.Clin.Invest.2006，116，115)。
兩項研究描述了CCR2在高血壓誘導的血管發炎、重構(remodeling)和肥大中的重要作用(E Bush，et al.，Hypertension 2000，36，360；MIshibashi，et al.，Circ.Res.2004，94，1203)。
已知MCP-1在人類多發性硬化中被向上調節，并且已證實使用干擾素β-1b的有效療法會降低末梢血液單核細胞中的MCP-1表達，這說明MCP-1在疾病進展中發揮作用(Carla Iarlori，et al.，J.Neuroimmunol.2002，123，170-179)。其它研究已證實，在治療多發性硬化中，MCP-1/CCR-2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值；所有這些研究已在實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)中被證實，該實驗性自身免疫腦脊髓炎為多發性硬化的常用動物模型。將對MCP-1的抗體施用于具有EAE的動物，顯著地減少了疾病復發(K.J.Kennedy，et al.，J.Neuroimmunol.1998，92，98)。再者，兩份報告已證實CCR-2-/-小鼠對于EAE具抵抗性(B.T.Fife，et al.，J.Exp.Med.2000，192，899；L.Izikson，et al.，J.Exp.Med.2000，192，1075)。后續報告是通過檢驗來自不同品系的小鼠中CCR2缺失的作用來延伸這些最初觀察的(S.Gaupp，et al.，Am.J.Pathol.2003，162，139)。值得注意的是，小分子CCR2拮抗劑的施用也會在C57BL/6小鼠中使疾病進展變得遲鈍(C.M.Brodmerkel，et al.，J.Immunol.2005，175，5370)。
已知MCP-1在肺臟移植后發展閉塞性細支氣管炎綜合征的患者中被向上調節(Martine Reynaud-Gaubert，et al.，J.of Heart and LungTransplant.，2002，21，721-730；John Belperio，et al.，J.Clin.Invest.2001，108，547-556)。在閉塞性細支氣管炎綜合征的鼠科動物模型中，施用對MCP-1的抗體會導致氣道閉塞的減弱；同樣地，CCR2-/-小鼠在此相同模型中對于氣道閉塞具有抵抗性(John Belperio，et al.，J.Clin.Invest.2001，108，547-556)。這些數據指出，MCP-1/CCR2的拮抗作用可有益于治療移植后的器官排斥。此外，研究已證實MCP-1/CCR2軸的中斷能夠延長胰島移植物的存活(I Lee，et al.，J Immunol 2003，171，6929；R Abdi，et al.，J Immunol 2004，172，767)。在大鼠移植模型中，CCR2和MCP-1經證實在發展移植物血管病的移植物中被向上調節(KHoriguchi，et al.，J Heart Lung Transplant.2002，21，1090)。在另一項研究中，抗-MCP-1基因療法會減弱移植物血管病(A Saiura，et al.，Artherioscler Thromb Vasc Biol 2004，24，1886)。一項研究描述了通過MCP-1的阻斷對實驗性靜脈移植物新血管內膜形成的抑制作用(HTatewaki，et al.，J Vasc Surg.2007，45，1236)。
其它研究已證實了在治療哮喘中MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值。在卵清蛋白激發的小鼠中，MCP-1與中和抗體的多價螯合作用會造成支氣管高響應性和發炎的顯著降低(Jose-AngelGonzalo，et al.，J.Exp.Med.1998，188，157)。已證實可以通過施用對MCP-1的抗體，而在曼氏裂體吸蟲(Schistosoma mansoni)卵激發的小鼠中降低過敏性氣道發炎(Nicholas W.Lukacs，et al.，J.Immunol.1997，158，4398)。與此一致，MCP-1-/-小鼠顯示降低對曼氏裂體吸蟲卵激發的應答(Bao Lu，et al.，J.Exp.Med.1998，187，601)。
其它研究已證實，在治療腎臟疾病中，MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值。在腎小球性腎炎的鼠科動物模型中，施用MCP-1的抗體會造成顯著降低腎小球新月體形成和I型膠原的沉積(Clare M.Lloyd，et al.，J.Exp.Med.1997，185，371)。此外，具有經誘導的腎中毒血清腎炎的MCP-1-/-小鼠與其MCP-1+/+相對物相比顯示出顯著更少的管狀損傷(Gregory H.Tesch，et al.，J.Clin.Invest.1999，103，73)。
數項研究已證實，在治療系統紅斑狼瘡中，MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值。在系統性紅斑狼瘡的鼠科動物模型中，CCR2-/-小鼠與其WT相對物相比顯示出延長的存活期與降低的腎病(G.Perez de Lema，et al.，J.Am.Soc.Neph.2005，16，3592)。這些數據與最近研究中針對MCP-1基因缺失所發現的改善疾病的活性一致(S.Shimizu，et al.，Rheumatology(Oxford)2004，43，1121；Gregory H.Tesch，et al.，J.Exp.Med.1999，190，1813)，或者與在狼瘡的嚙齒動物模型中CCR2肽拮抗劑的施用(H.Hasegawa，et al.，關節炎與風濕病，2003，48，2555)一致。
相對于未患病的回腸，CCR2+固有層淋巴細胞的顯著30倍增加被發現于克羅恩氏患者的小腸中(S.J.Connor，et al.，Gut 2004，53，1287)。還應注意的是，相對于對照組，在患有活性克羅恩氏病的患者中，在循環CCR2+/CD14+/CD56+單細胞的亞群中有擴大現象。數項嚙齒動物研究已證實，在治療克羅恩氏病/結腸炎中，MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值。CCR-2-/-小鼠被保護而免受葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎的作用(Pietro G.Andres，et al.，J.Immunol.2000，164，6303)。CCR2、CCR5和CXCR3的小分子拮抗劑(小鼠結合親和力分別＝24、236和369nM)的施用也會保護抵抗葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎(H.Tokuyama，et al.，Int.Immunol.2005，17，1023)。最后，MCP-1-/-小鼠在結腸炎的半抗原誘導的模型中顯示基本上降低的結腸傷害(肉眼和組織學兩者)(W.I.Khan，et al.，Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.2006，291，G803)。
兩份報告描述MCP-1在患有炎性腸疾病的患者的腸上皮細胞和腸粘膜中的過表達(H.C.Reinecker，et al.，Gastroenterology 1995，108，40，以及Michael C.Grimm，et al.，J.Leukoc.Biol.1996，59，804)。
一項研究描述MCP-1基因中的啟動子多晶型現象與硬皮病(系統性硬化癥)的相關性(S Karrer，et al.，J Invest Dermatol.2005，124，92)。在組織纖維變性的相關模型中，CCR2/MCP-1軸的抑制會降低在皮膚(TYamamoto與K Nishioka，J Invest Dermatol，2003，121，510；AM Ferreira，et al.，J Invest Dermatol.2006，126，1900)、肺臟(T Okuma，et al.，J Pathol.2004，204，594；M Gharaee-Kermani，et al.，Cytokine 2003，24，266)、腎臟(K Kitagawa，et al.，Am J Pathol.2004，165，237；T Wada，et al.，J Am Soc Nephrol 2004，15，940)、心臟(S Hayashidani，et al.，，Circulation2003，108，2134)以及肝臟(S Tsuruta，et al.，Int J Mol Med.2004，14，837)中的纖維變性。
一項研究已證實，在治療肺泡炎中，MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值。當IgA免疫復合肺臟傷害的大鼠以靜脈內方式用抗大鼠MCP-1產生的抗體(JE)治療時，肺泡炎的癥狀被部分減輕(Michael L.Jones，et al.，J.Immunol.1992，149，2147)。
數項研究已證實，在治療癌癥中，MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值(綜述于M.J.Craig and R.D.Loberg，CancerMetastasis Rev.2006，25，611；I.Conti and B.Rollins，Seminars in CancerBiology 2004，14，149；R.Giles and R.D.Loberg，Curr.Cancer DrugTargets 2006，6，659)。當帶有人類乳房癌細胞的免疫缺陷的小鼠用抗-MCP-1抗體治療時，發現肺臟微轉移的抑制以及存活期增加(RosalbaSalcedo，et al.，Blood 2000，96，34-40)。使用人類臨床腫瘤樣品，CCR2表達與前列腺癌癥進展有關(Y.Lu，et al.，J.Cell.Biochem.2007，101，676)。在體外，MCP-1表達已被證實會介導前列腺癌細胞生長和侵入(Y.Lu，et al.，Prostate 2006，66，1311)；再者，通過前列腺癌細胞表達的MCP-1會誘導用于骨質再吸收的人類骨髓原始粒子(Y.Lu，et al.，Cancer Res.2007，67，3646)。
多項研究已描述，在治療再狹窄中，MCP-1/CCR2相互作用的拮抗作用的潛在治療價值。在人類中，MCP-1水平直接與再狹窄的危險產生有關(F.Cipollone，et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2001，21，327)。缺乏CCR2或MCP-1的小鼠顯示動脈損傷后的血管內膜面積與血管內膜/介質比例的降低(相對于野生型小動物伙伴)(Merce Roque，etal.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2002，22，554；A.Schober，et al.，Circ.Res.2004，95，1125；W.J.Kim，et al.，Biochem Biophys ResCommun.2003，310，936)。在小鼠中，MCP-1的顯性負抑制劑在骨骼肌中的轉染(K.Egashira，et al.，Circ.Res.2002，90，1167)也會降低動脈損傷后的血管內膜增生。CCR2使用中和抗體的阻斷會在將支架放置于靈長類動物之后降低新血管內膜增生(C.Horvath，et al.，Circ.Res.2002，90，488)。
兩份報告描述具有誘發腦部創傷的MCP-1大鼠的過表達(J.S.King，et al.，J.Neuroimmunol.1994，56，127，以及Joan W.Berman，et al.，J.Immunol.1996，156，3017)。此外，研究已證實CCR2-/-(O.B.Dimitrijevic，et al.，Stroke 2007，38，1345)和MCP-1-/-小鼠(P.M.Hughes，et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.2002，22，308)兩者均被部分保護而免受缺血/再灌注損傷。
已知單細胞/巨噬細胞在神經性疼痛的發展上發揮重要作用(Liu T，van Rooijen N，Tracey DJ，Pain 2000，86，25)。與此概念一致，最近已描述CCR2在治療炎性與神經原性兩種疼痛中的潛在作用。相對于其WT相對物而言，CCR2-/-小鼠顯示出對炎性疼痛的應答改變，包括足底內(intraplantar)福爾馬林注射后的疼痛行為降低以及足底內CFA注射后的機械感覺異常稍微降低(C.Abbadie，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 2003，100，7947)。此外，CCR2-/-小鼠并未在坐骨神經損傷后顯示出顯著的機械感覺異常。同樣地，小分子CCR2拮抗劑會在口服施用后降低機械感覺異常達到損傷前程度的～80％(C.Abbadie，J.A.Lindia及H.Wang，WO PCT 110376，2004)。
一項研究描述MCP-1在缺血性心肌病中的關鍵作用(N.G.rangogiannis，et al.，Circulation2007，115，584)。另一項研究描述在MCP-1的抑制后，實驗性心臟衰竭的減弱(S Hayashidani，et al.，Circulation2003，108，2134)。
其它研究已提供MCP-1在未于上文提及的各種疾病狀態中被過度表達的證據。這些報告提供相關證據顯示，MCP-1拮抗劑可能是此種疾病的有用治療劑。另一項研究已證實MCP-1在嚙齒動物心臟同種異體移植物中的過表達，表明MCP-1在移植物動脈硬化的發病原理中的作用(MaryE.Russell，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90，6086)。MCP-1的過表達已被發現于患有特發性肺纖維變性患者的肺臟內皮細胞中(Harry N.Antoniades，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89，5371)。同樣地，MCP-1的過表達已被發現于患有牛皮癬患者的皮膚中(M.Deleuran，et al.，J.Dermatol.Sci.1996，13，228，以及R.Gillitzer，et al.，J.Invest.Dermatol.1993，101，127)；與CCR2+細胞優勢有關的發現也已被報告(C.Vestergaard，et al.，Acta Derm.Venerol.2004，84，353)。最后，最近的報告已證實，MCP-1被過度表達于患有HIV-1相關癡呆癥患者的腦部與腦脊髓液中(Alfredo Garzino-Demo，WO99/46991)。
此外，CCR2多晶型現象已被證實至少在患者的一個亞群中與肉狀瘤病有關(P.Spagnolo，et al.，Am J Respir Crit Care Med.2003，168，1162)。
還應注意的是，CCR-2已涉及作為一些HIV菌種的共受體(B.J.Doranz，et al.，Cell 1996，85，1149)。還已測定出利用CCR-2作為HIV共受體可與疾病進展產生關聯(Ruth I.Connor，et al.，J.Exp.Med.1997，185，621)。此項發現與最近發現一致，該最近發現是，CCR-2突變種CCR2-64I的存在與HIV在人類體群中的延遲發病呈正相關(Michael W.Smith，et al.，Science 1997，277，959)。雖然MCP-1未涉及這些過程，但可能的情況是，通過結合至CCR-2而起作用的MCP-1拮抗劑可具有在HIV感染的患者中延遲此疾病進展成AIDS的有益治療作用。
應注意的是，CCR2也是人類趨化因子MCP-2、MCP-3和MCP-4的受體(Luster New Eng.J.Med.1998，338，436-445)。由于本文所述式(I)新化合物會通過結合至CCR-2受體而拮抗MCP-1，因此這些式(I)化合物也可以是由CCR-2介導的MCP-2、MCP-3和MCP-4的作用的有效拮抗劑。因此，當于本文中提及＂MCP-1的拮抗作用＂時，是假定它相當于＂CCR-2的趨化因子刺激的拮抗作用＂。
因此，調節趨化因子活性的化合物可證實在治療炎性、過敏性、自身免疫、代謝、癌癥和/或心血管疾病中的廣泛用途。美國專利申請公開WO2005021500 A1(并入本文供參考，并且歸屬于本案申請人)公開了通過CCR2調節MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4活性的化合物。該文獻還公開了制備這些化合物的各種方法，包括多步驟合成，其包括保護基團的引入和后續移除。
期待發現與已知趨化因子調節劑相比具有改良的藥理學特性的新穎化合物。例如，期待發現具有改良的CCR-2抑制活性和對CCR-2相對于其它G蛋白質-偶合受體(意即5HT2A受體)的選擇性的新穎化合物。還期待發現具有一種或多種下述種類和有利和改良特性的化合物 (a)醫藥性質(意即溶解度、滲透性、對持續釋放配方的可順從性)； (b)劑量需求(例如，較低劑量和/或每日一次服藥)； (c)降低血液濃度峰頂至峰谷特性的因素(意即清除率和/或分布容積)； (d)增加活性藥物在受體處的濃度的因素(意即蛋白質結合、分布容積)； (e)降低臨床藥物-藥物相互作用傾向的因素(細胞色素P450酶抑制作用或誘導作用，例如CYP 2D6抑制作用，參閱G.K.Dresser，J.D.Spence，D.G.Bailey，Clin.Pharmacokinet.2000，38，41-57，其在此并入本文供參考)； (f)降低不良副作用可能性的因素(例如除了G蛋白質-偶合受體以外的藥理學選擇性、潛在化學或代謝反應性、受限的CNS穿透、離子通道選擇性)。特別期待發現具有前述藥理學特性的期望組合的化合物。
本領域還期待提供制備這些化合物的新穎和/或改良的方法。這些方法的特征可以(非限制性的)是a)容易改變成較大規模生產，例如試驗工廠或制造規模；b)能夠改善中間體和/或最后化合物的純度(包括手性純度)、穩定性和/或容易處理性的操作步驟和/或技術；和/或c)較少的操作步驟。
發明概述 本發明提供MCP-1受體活性的新穎拮抗劑或部分激動劑/拮抗劑N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，或其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或前體藥物，其具有所需藥理學特性的令人意外的組合。還提供了本發明化合物的結晶型。含有它們的醫藥組合物以及使用它們作為藥劑以治療炎性疾病、過敏性、自身免疫、代謝、癌癥和/或心血管疾病的方法也是本發明的目的。本公開內容還提供制備式(I)化合物的方法，該化合物包括N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺
其中R1、R8、R9、R10和

均如本文中所述。本文還提供可用于所述方法的中間體的化合物。
本發明公開內容還提供N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺或藥學上可接受的鹽、溶劑合物或前體藥物在藥劑制造中的用途，該藥劑用于治療炎性疾病、過敏性、自身免疫、代謝、癌癥和/或心血管疾病。
附圖簡述

圖1揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，二-苯磺酸鹽，型式N-1的實驗和模擬粉末圖。
圖2揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式N-2的實驗和模擬粉末圖。
圖3揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式E-1(單-乙醇化物)的實驗和模擬粉末圖。
圖4揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，HCl鹽，型式H4-1(四水合物)的實驗和模擬粉末圖。
圖5揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式A-1(單-丙酮溶劑合物)的實驗和模擬粉末圖。
圖6揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式DC-1(單-二氯甲烷溶劑合物)的實驗和模擬粉末圖。
圖7揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式AN-3(單-乙腈溶劑合物)的實驗和模擬粉末圖。
圖8揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，二-苯磺酸鹽，型式N-1的差示掃描量熱法分析。
圖9揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，二-苯磺酸鹽，型式N-1的熱重分析。
圖10揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式N-2的差示掃描量熱法分析。
圖11揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式N-2的熱重分析。
圖12揭示N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式N-2的水份吸著等溫線。
圖13揭示(1R，3R，4S)-3-乙酰胺基-4-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)環己基胺基甲酸叔丁酯的X-射線晶體結構。
圖14在hCCR2 KI小鼠中的48小時TG腹膜炎模型單細胞/巨噬細胞浸潤至腹膜腔中的實施例1抑制作用(分類細胞計數)。
圖15在hCCR2 KI小鼠中的48小時TG腹膜炎模型單細胞/巨噬細胞浸潤至腹膜腔中的實施例1抑制作用(FACS分析)。
圖16在hCCR2 KI小鼠中的EAE實施例1治療的臨床評分。
詳細說明 本發明提供MCP-1受體活性的新穎拮抗劑或部分激動劑/拮抗劑N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，或其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或前體藥物，其具有所需藥理學特性的令人意外的組合。還提供本發明的結晶型。含有它們的醫藥組合物以及使用它們作為藥劑以治療炎性疾病、過敏性、自身免疫、代謝、癌癥和/或心血管疾病的方法也是本發明的目的。本公開內容還提供制備式(I)化合物的方法，該化合物包括N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺
其中R1、R8、R9、R10和

均如本文中所述。本文還提供可用于所述方法的中間體的化合物。
N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，其令人意外地證實所需藥理學特性的組合，包括令人驚訝的高度口服生物利用率和高度地有效且具有優越安全性標準的適應癥的組合。
證實足夠程度的細胞膜滲透性(口服生物利用率的一項重要因素)的已知CCR2受體調節劑，例如在2005年3月10日公告的專利公報WO2005021500 A1(2007年1月16日授予，歸屬于本案申請人的美國專利7,163,937)中所揭示的，當通過其CCR2-結合能力(功效的測量法)測量時其不充分有效，和/或當通過hERG與Na+離子通道研究測量時其缺少如通過離子通道選擇性所指示的適當安全性標準。
相比之下，如本文中通過下文標題為＂比較藥理學特性＂的部分中所提出的數據所示，相對于更具極性的分子，證實N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺的令人驚訝的高度細胞膜滲透性，并且仍保持有效CCR2結合能力，伴有優越的離子通道選擇性。
因此，本發明提供具有經改良藥理學特性的新穎趨化因子調節劑，預期其可用于治療炎性、過敏性、自身免疫、代謝、癌癥和/或心血管疾病。
實施方案 在一項實施方案中，公開內容涉及N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，及其藥學上可接受的鹽。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的結晶型。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的結晶型，此結晶型包括N-2型式。
另一項實施方案為N-2型式，其特征為(或具有)基本上等于下列的單位晶胞參數 晶胞尺寸 a＝11.8427(3) b＝18.1503(7) c＝12.7923(4) α＝90 β＝105.362(2) γ＝90 空間群P21 分子/單位晶胞2 其中該晶體是在約+22℃(RT)的溫度下。
另一項實施方案為N-2型式，其特征為(或具有)包含三個或更多個2θ值

的粉末x-射線衍射圖，該2θ值選自7.2、8.7、9.7、12.5、12.8、13.3、16.0、16.6、18.2和18.8，在約22℃的溫度下。
另一項實施方案為N-2型式，其特征為(或具有)進一步包含四個或更多個2θ值

的粉末x-射線衍射圖，該2θ值選自7.2、8.7、9.7、12.5、12.8、13.3、16.0、16.6、18.2和18.8，在約22℃的溫度下。
另一項實施方案為N-2型式，其特征為(或具有)基本上如列示于表7中的部分原子坐標。
另一項實施方案為N-2型式，其特征為(或具有)基本上根據圖2的粉末x射線衍射圖。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺二-苯磺酸鹽的結晶型，包括型式N-1，其特征為于表1中所發現的單位晶胞參數；3或4或更多個選自表10的2θ值

基本上如列示于表2中的部分原子坐標，和/或基本上根據圖1的粉末x-射線衍射圖。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的結晶型，包括型式E-1(單-乙醇化物)，其特征為于表1中所發現的單位晶胞參數；3或4或更多個選自表10的2θ值

基本上如列示于表5中的部分原子坐標，和/或基本上根據圖3的粉末x-射線衍射圖。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺HCl鹽的結晶型，包括型式H4-1(四水合物)，其特征為于表1中所發現的單位晶胞參數；3或4或更多個選自表10的2θ值

基本上如列示于表9中的部分原子坐標，和/或基本上根據圖4的粉末x-射線衍射圖。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的結晶型圖，包括型式A-1(單-丙酮溶劑合物)，其特征為于表1中所發現的單位晶胞參數；3或4或更多個選自表10的2θ值


基本上如列示于表6中的部分原子坐標，和/或基本上根據圖5的粉末x-射線衍射圖。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的結晶型，包括型式DC-1(單-二氯甲烷溶劑合物)，其特征為于表1中所發現的單位晶胞參數；3或4或更多個選自表10的2θ值


基本上如列示于表3中的部分原子坐標，和/或基本上根據圖6的粉末x-射線衍射圖。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的結晶型，包括型式AN-3(單-乙腈溶劑合物)，其特征為于表1中所發現的單位晶胞參數；3或4或更多個選自表10的2θ值


基本上如列示于表8中的部分原子坐標，和/或基本上根據圖7的粉末x-射線衍射圖。
另一項實施方案為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的結晶型，包括型式THOO-1(單-四氫呋喃溶劑合物)，其特征為于表1中所發現的單位晶胞參數；3或4或更多個選自表10的2θ值


和/或基本上如列示于表4中的部分原子坐標。
另一項實施方案為一種醫藥組合物，包含藥學上可接受的載體和實施例的化合物。
另一項實施方案為一種調節趨化因子或趨化因子受體活性的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種調節CCR-2受體活性的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種調節通過CCR2受體所介導的MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4以及MCP-5活性的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種調節MCP-1活性的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種治療病癥的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物，該病癥選自糖尿病、肥胖、代謝綜合癥、中風、神經性疼痛、缺血性心肌病、牛皮癬、高血壓、硬皮病(scheroderma)、骨關節炎、動脈瘤、發熱、心血管疾病、克羅恩氏病、充血性心力衰竭、自身免疫疾病、HIV感染、與HIV有關聯的癡呆癥、牛皮癬、特發性肺纖維變性、移植物動脈硬化、物理或化學誘導的腦部創傷、炎性腸疾病、肺泡炎、結腸炎、系統性紅斑狼瘡、腎毒血清腎炎、腎小球性腎炎、哮喘、多發性硬化、動脈粥樣硬化、血管炎、易受傷害性斑塊、風濕性關節炎、再狹窄、靜脈新血管內膜增生(venousneointimal hyperplasia)、滲析-移植物新血管內膜增生、動脈-靜脈旁路血管內膜增生、器官移植、慢性同種異體移植腎病和癌癥。
另一項實施方案為一種治療病癥的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物，其中該病癥選自糖尿病、肥胖、克羅恩氏病、牛皮癬、特發性肺纖維變性、移植物動脈硬化、物理或化學誘導的腦部創傷、炎性腸疾病、肺泡炎、結腸炎、系統性紅斑狼瘡、腎毒血清腎炎、腎小球性腎炎、哮喘、多發性硬化、動脈粥樣硬化與風濕性關節炎、再狹窄、器官移植和癌癥。
另一項實施方案為一種治療病癥的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物，其中該病癥選自糖尿病、肥胖、克羅恩氏病、系統性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎、多發性硬化、動脈粥樣硬化、再狹窄和器官移植。
另一項實施方案為一種治療病癥的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物，其中該病癥選自多發性硬化、動脈粥樣硬化、克羅恩氏病和糖尿病。
另一項實施方案為一種治療病癥的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物，其中該病癥選自再狹窄、器官移植和癌癥。
另一項實施方案為一種治療糖尿病的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種治療克羅恩氏病的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種治療多發性硬化的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種治療動脈粥樣硬化的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種治療再狹窄的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例化合物。
另一項實施方案為一種治療器官移植的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例1化合物。
另一項實施方案為一種治療癌癥的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例1化合物。
另一項實施方案為一種治療癌癥的方法，其中癌癥選自乳癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤。
另一項實施方案為一種治療炎性疾病、過敏性、自身免疫、代謝、癌癥和/或心血管疾病的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例1化合物。
另一項實施方案為一種治療至少部分通過CCR-2所介導的疾病的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例1化合物。
另一項實施方案為一種調節CCR2活性的方法，其包括對有需要的患者施用治療有效量的實施例1化合物。
另一項實施方案為在醫藥的制劑中的實施例1的化合物，所述制劑用于治療糖尿病、肥胖、代謝綜合癥、中風、神經性疼痛、缺血性心肌病、牛皮癬、高血壓、硬皮病、骨關節炎、動脈瘤、發熱、心血管疾病、克羅恩氏病、充血性心力衰竭、自身免疫疾病、HIV感染、與HIV有關聯的癡呆癥、牛皮癬、特發性肺纖維變性、移植物動脈硬化、物理或化學誘導的腦部創傷、炎性腸疾病、肺泡炎、結腸炎、系統性紅斑狼瘡、腎毒血清腎炎、腎小球性腎炎、哮喘、多發性硬化、動脈粥樣硬化、血管炎、易受傷害性斑塊、風濕性關節炎、再狹窄、靜脈新血管內膜增生、滲析-移植物新血管內膜增生、動脈-靜脈旁路血管內膜增生、器官移植、慢性同種異體移植腎病和癌癥。
另一項實施方案為用于治療的實施例的化合物。
本發明可在未偏離其精神或基本特質下，以其它特定形式具體體現。本發明還涵蓋本文所指出本發明的替代方面和實施方案的所有組合。應明了的是，任何和所有實施方案，均可結合任何其它實施方案，以描述本發明的其它實施方案。再者，一項實施方案的任何要素意欲與來自任何實施方案的任何和所有其它要素合并，以描述其它實施方案。
方法實施方案 在第1項實施方案中，本公開內容提供一種制備式IV化合物或其鹽的方法
此方法包括以下步驟 使式II的β-氨基酯或其鹽與式III的經適當保護的手性α-氨基酸偶合，得到酰胺IV(參閱WO2005021500)；其中 Ra和Rb獨立地為C1-6烷氧基； 或Ra和Rb和它們均連接的碳一起合并以形成羰基、硫代羰基、環狀縮醛或環狀硫代縮醛，其中環狀縮醛或環狀硫代縮醛選自-O-Z-O-與-S-Z-S-，Z為-(CT1T2)2-、-(CT1T2)3-或

且T1、T2和T3，在每一存在處，獨立地選自氫、C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3、C(＝O)C1-4烷基和CO2C1-4烷基(T1、T2和T3優選各自為氫)； R1、R2和R3獨立地為氫，或胺-保護基團，選自芐氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(BOC)、芴基甲基氧基羰基(FMOC)、芐基(Bn)和對-甲氧基芐基(PMB)(胺-保護基團優選為Cbz、Bn或BOC，尤其是Cbz或Bn)； R4為低級C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代； Y為鹵素、SR12或OSO2R13； X為OH、鹵素或OCOR14； R12為C1-6烷基、-(CH2)C(O)OR13或-(CH2)C(O)R13； R13在每一存在處為C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代；并且 R14在每一存在處為氫、C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代。
當在本文中使用時，任選被取代的芐基是指經過其亞甲基(-CH2-)連接的芐基，并且任選在連接至亞甲基的苯環上被取代。
在第2項實施方案中，本公開內容提供一種形成式IV產物或其鹽的方法，其中 Ra和Rb和它們均連接的碳原子一起合并以形成羰基或1，3-二氧戊環基團(優選的是，Ra和Rb和它們均連接的碳原子一起合并以形成1，3-二氧戊環基團)； R1為氫； R2為Cbz； R3為氫； R4為C1-6氧烷基； Y為S(Me)；以及 X為OH。
在第3項實施方案中，本公開內容提供一種方法，其中式II的β-氨基酯為甲苯磺酸鹽或氫溴酸鹽。優選的式II的β-氨基酯的鹽為

的甲苯磺酸鹽。
在第4項實施方案中，本公開內容提供一種形成式IV化合物或其鹽的方法，其中偶合是在惰性氣氛下，例如氮或氬(優選為氮)，在非質子性溶劑中進行，例如丙腈、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯或乙腈(尤其是乙腈和/或乙酸乙酯)。
在第5項實施方案中，本公開內容提供一種形成式IV化合物或其鹽的方法，其中偶合是通過使式II的β-氨基酯與二酰亞胺偶合試劑，在活化劑、經保護的式II的β-氨基酯和叔胺堿存在下接觸而完成。二酰亞胺偶合試劑包括例如EDAC的試劑。活化劑的實例包括1-羥基苯并三唑(HOBt；該術語包括其水合物)與N′，N′-4-二甲基氨基-吡啶。叔胺堿包括例如三烷基胺類，例如三乙胺、N，N-二異丙基-N-乙胺和三-正丙基胺。
在第6項實施方案中，本公開內容提供一種形成式IV化合物或其鹽的方法，其中二酰亞胺偶合試劑為EDAC，活化劑為HOBt，而叔胺堿為三乙胺或N，N-二異丙基-N-乙胺。
在第7項實施方案中，本公開內容提供一種形成式IV化合物或其鹽的方法，其中式II氨基酯比二酰亞胺偶合試劑比活化劑比三級胺的摩爾比分別為一比約0.90-1.50比約0.95-1.50比約2.00至3.00。該摩爾比優選分別為一比約0.95-1.05比約0.95-1.10和比約2.10至2.30。
在第8項實施方案中，本公開內容提供一種制備式V化合物或其鹽的方法
此方法包括以下步驟 a)使式IV化合物用烷基化劑進行烷基化，以形成經活化的化合物；和 b)使經活化的化合物當場環化，得到式IVa化合物。
在第9項實施方案中，本公開內容提供一種制備式V化合物或其鹽的方法，其中步驟a)的烷基化劑為硫烷基化劑，例如C1-6烷基鹵化物，且經活化的化合物為化合物IV的锍鹽，其中Y為

(C1-6烷基)R12。優選的是，烷基化劑為碘化甲烷，且Y為

(CH3)2。
在第10項實施方案中，本公開內容提供一種形成式V化合物或其鹽的方法，其中環化步驟包括將經活化的化合物或其鹽與堿在溶劑存在下合并。該堿選自碳酸銫、重碳酸銫、碳酸鉀、叔丁醇鈉或六甲基二硅氮化鈉(該堿優選為碳酸銫)。
在第11項實施方案中，本公開內容提供一種形成式V化合物或其鹽的方法，其中環化步驟是在惰性氣氛下，例如氮或氬，在溶劑中進行，溶劑選自DMSO、DMF、DMA、N-甲基吡咯烷酮和環丁砜。優選的是，惰性氣氛為氮，并且溶劑選自DMSO和/或DMF。
在第12項實施方案中，其中式IVa化合物具有縮醛部分基團，意即其中Ra和Rb獨立地為C1-6烷氧基，或和它們所連接的原子一起合并以形成環狀縮醛或環狀硫代縮醛，本公開內容提供一種形成式V化合物或其鹽的方法，其進一步包括使具有縮醛部分基團的式IVa化合物水解的步驟
以形成式V化合物。
水解步驟可根據本領域技術人元已知使縮醛基團水解的程序進行。例如，水解步驟可包括將式IVa化合物在溶劑中用酸處理，該溶劑例如丙酮、丁酮、乙腈及異丙醇或其水溶液。水解步驟優選包括將式IVa化合物在丙酮水溶液中用鹽酸處理。
在第13項實施方案中，本發明本公開內容提供一種制備具有酯部分基團的式VI化合物或其鹽的方法
此方法包括以下步驟 以還原方式使式V化合物與具有式NH(R8)(R9)的胺進行胺化，得到式Va的亞胺/烯胺，其中R8和R9獨立地選自氫和C1-6烷基。R8和R9優選獨立地選自C1-6烷基。胺更優選為N-甲基-N-異丙胺。
在第14項實施方案中，本公開內容提供一種形成式VI產物的方法，其包括以下的還原胺化步驟 (a)將式NH(R8)(R9)的胺與脫水劑在溫度約-20°至約+50℃下，添加至在非質子性溶劑中的式V化合物內，以形成式Va的亞胺/烯胺；和 (b)以氫氣壓力處理式Va的亞胺/烯胺與鉑催化劑5％ Pt/S/C的溶液，得到式VI化合物。
在第15項實施方案中，本公開內容提供一種形成式VI化合物或其鹽的方法，其中步驟a)的脫水劑為路易斯酸/布朗司特酸(


)(優選為四異丙氧化鈦)，并且非質子性溶劑選自二氯乙烷、二氯甲烷、乙腈、DMSO、DMF和N-甲基-吡咯烷酮(優選為二氯甲烷)。
在第16項實施方案中，本公開內容提供一種形成式VI化合物或其鹽的方法，其中在步驟b)中，5％ Pt/S/C催化劑是以相對于化合物Va而言在大約0.5至50％(重量/重量)下存在。氫氣優選為約15至約35psig的壓力。
在第17項實施方案中，本發明提供一種制備式VII化合物或其鹽的方法
此方法包括以下步驟 使式VI的酯化合物水解，得到式VII的酸化合物。溫度范圍為約40℃至約100℃(溫度范圍約50℃至約70℃是最優選的)。酸類選自硫酸、甲苯磺酸、硝酸、甲磺酸、氫溴酸和鹽酸。最優選氫溴酸。優選的，水解步驟優選在鹽酸水溶液中進行，以獲得式VII化合物。
在第18項實施方案中，本公開內容提供一種制備式VII化合物的鹽的方法，其進一步包括以下步驟，將堿與式VII酸化合物的溶液混合，任選當場進行。堿優選為堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉。
在第19項實施方案中，本公開內容提供一種制備式VIII氨基甲酸酯化合物或其鹽的方法
此方法包括以下步驟 a)使式VII酸化合物轉化成式VIIa異氰酸酯化合物；和 b)使式VIIa異氰酸酯化合物與式R15OH的醇反應，得到式VIII氨基甲酸酯化合物； 其中R15為C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代。R15優選為叔丁基或未被取代的芐基。
在第20項實施方案中，本公開內容提供一種通過Curtius重排以制備式VIII化合物或其鹽的方法，其包括使式VII化合物的鈉鹽與疊氮化物試劑(優選為疊氮化二苯基磷酰)在含有甲苯的溶劑(優選為叔丁醇)中，在高于熱重排觸發點的溫度下接觸。溫度優選大于50℃。
在第21項實施方案中，本公開內容提供一種制備式IX化合物或其鹽的方法
此方法包括以下步驟 a)使式VIII氨基甲酸酯化合物轉變成游離胺中間體；和 b)使游離胺中間體與試劑R10C(O)W當場酰化，得到式IX化合物； 其中 R10獨立地為C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代；并且 W為鹵素或R10C(O)-。
R10C(O)W優選為乙酸酐。
在第22項實施方案中，本公開內容提供一種制備式IX化合物或其鹽的方法，其中轉變步驟包括以下步驟 a)以酸處理式VIII化合物的溶液；和 b)添加堿至溶液中，得到游離胺中間體。
優選的該酸選自硫酸、甲苯磺酸、硝酸、甲磺酸、氫溴酸和鹽酸，更優選為甲磺酸。優選的是，堿為三烷基胺，優選為三乙胺。
在第23項實施方案中，本公開內容提供一種制備式IX化合物或其鹽的替代方法
此方法包括以下步驟，將式VIIa異氰酸酯化合物在其相應酸R10C(O)OH存在下任選當場添加至酰化劑(R10C(O))2O中，其中R10獨立地為C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代。R10優選為C1-6烷基，尤其是甲基。
在第24項實施方案中，本公開內容提供一種制備式X化合物或其鹽的方法
此方法包括以下步驟 使經保護的式IX胺化合物去除保護，以提供式X化合物。優選的，當R2為Cbz時，去除保護是通過在鈀催化劑存在下氫化完成的。鈀催化劑優選為10％ Pd/C。
在第25項實施方案中，本公開內容提供一種制備式I化合物的方法
此方法包括以下步驟 使式X化合物與下式化合物偶合

得到式I化合物； 其中 HET為任選被取代的3-14元雜環基或雜芳基環，其具有一至四個選自N、O或S的雜原子(優選為一至三個雜原子，尤其是一至兩個氮原子)在至少一個環中(HET優選為6-取代的喹唑啉-4-基，更優選為6-三氟甲基-喹唑啉-4-基)；并且 LG為離去基團，選自鹵素或OSO2R16(LG優選為鹵素，更優選為氯)，其中R16為C1-6烷基，苯基，具有一或多個選自N、S或O的原子的5-至7-元雜芳基，或者3-至7-元環烷基，其全部均任選被取代(優選的，對于R16的任選取代基為一至三個選自鹵素、CF3和C1-6烷基的基團)。
在第26項實施方案中，本發明提供一種制備式VIII化合物或其鹽的新穎方法
此方法包括以下步驟 以還原方式使式V化合物與式NH(R8)(R9)的胺進行胺化，得到式VI化合物，包括以下步驟 (a)將胺與脫水劑在溫度約-20°至約+50℃下，添加至在非質子性溶劑中的式V化合物中，以形成式Va的亞胺/烯胺化合物；和 (b)以氫氣壓力處理式Va的亞胺/烯胺化合物和鉑催化劑5％ Pt/S/C的溶液，得到式VI酯化合物； 使式VI酯化合物水解，得到式VII酸化合物； 使式VII酸化合物轉化成式VIIa異氰酸酯化合物；并且 使式VIIa異氰酸酯化合物與式R15OH的醇反應，得到式VIII氨基甲酸酯化合物； 其中 R1和R2獨立地為氫或胺-保護基團，選自芐氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(BOC)、芴基甲基氧基羰基(FMOC)、芐基(Bn)和對-甲氧基芐基(PMB)(胺-保護基團優選為Cbz、Bn或BOC，尤其是Cbz或Bn)； R4為低級C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代； R8和R9獨立地為氫或C1-6烷基； R15為C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代(R15優選為叔丁基或未被取代的芐基，更優選為叔丁基)； HET為任選被取代的3-14元雜環基或雜芳基環，其具有一至四個選自N、O或S的雜原子(優選為一至三個雜原子，尤其是一至兩個氮原子)在至少一個環中(HET優選為6-取代的喹唑啉-4-基，更優選為6-三氟甲基-喹唑啉-4-基)；并且 LG為離去基團，選自鹵素或OSO2R16(LG優選為鹵素，更優選為氯)，其中R16為C1-6烷基，苯基，具有一或多個選自N、S或O的原子的5-至7-元雜芳基，或者3-至7-元環烷基，其全部均任選被取代(優選的，對于R16的任選取代基為一至三個選自鹵素、CF3和C1-6烷基的基團)。
在第27項實施方案中，本發明提供一種制備式I化合物或其鹽的新穎方法
此方法包括以下步驟 以還原方式使式V化合物與式NH(R8)(R9)的胺進行胺化，得到式VI化合物，以還原方式胺化包括以下步驟 (a)將胺與脫水劑在溫度約-20°至約+50℃下，添加至在非質子性溶劑中的式V化合物中，以形成式Va的亞胺/烯胺化合物；和 (b)以氫氣壓力處理式Va的亞胺/烯胺化合物與鉑催化劑5％ Pt/S/C的溶液，得到式VI酯化合物； 使式VI酯化合物水解，得到式VII酸化合物； 使式VII酸化合物轉化成式VIIa異氰酸酯化合物； 使式VIIa異氰酸酯化合物與式R15OH的醇反應，得到式VIII氨基甲酸酯化合物； 使式VIII氨基甲酸酯化合物轉變成游離胺中間體；并且 使游離胺中間體以試劑R10C(O)W當場酰化， 得到經保護的式IX胺化合物； 使經保護的式IX胺化合物去除保護，得到式X化合物；并且 使式X化合物與下式化合物偶合

得到式I化合物； 其中 R1和R2獨立地為氫或選自以下的胺-保護基團芐氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(BOC)、芴基甲基氧基羰基(FMOC)、芐基(Bn)和對-甲氧基芐基(PMB)(胺-保護基團優選為Cbz、Bn或BOC，尤其是Cbz或Bn)； R4為低級C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代； R8和R9獨立地為氫或C1-6烷基； R10獨立地為C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代(優選為C1-6烷基，更優選為甲基)； W為鹵素或R10C(O)-； R15為C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代(R15優選為叔丁基或未被取代的芐基，更優選為叔丁基)； HET為任選被取代的3-14元雜環基或雜芳基環，其具有一至四個選自N、O或S的雜原子(優選為一至三個雜原子，尤其是一至兩個氮原子)在至少一個環中(HET優選為6-取代的喹唑啉-4-基，更優選為6-三氟甲基-喹唑啉-4-基)；并且 LG為離去基團，選自鹵素或OSO2R16(LG優選為鹵素，更優選為氯)，其中R16為C1-6烷基，苯基，具有一或多個選自N、S或O的原子的5-至7-元雜芳基，或者3-至7-元環烷基，其全部均任選被取代(優選的，對于R16的任選取代基為一至三個選自鹵素、CF3和C1-6烷基的基團)。
在第28項實施方案中，本發明提供一種制備式I化合物或其鹽的替代新穎方法
此方法包括以下步驟 以還原方式使式V化合物以式NH(R8)(R9)的胺進行胺化，得到式VI化合物，以還原方式胺化包括以下步驟 (a)將胺與脫水劑在溫度約-20°至約+50℃下，添加至在非質子性溶劑中的式V化合物中，以形成式Va的亞胺/烯胺化合物；和 (b)以氫氣壓力處理式Va的亞胺/烯胺化合物與鉑催化劑5％ Pt/S/C的溶液，得到式VI酯化合物； 使式VI酯化合物水解，得到式VII酸化合物； 使式VII酸化合物轉化成式VIIa異氰酸酯化合物； 將式VIIa異氰酸酯化合物，在其相應酸R10aC(O)OH存在下，任選當場添加至酰化劑(R10aC(O))2O中，得到經保護的式IX胺化合物； 使經保護的式IX胺化合物去除保護，得到式X化合物；并且 使式X化合物與下式化合物偶合

得到式I化合物； 其中 R1和R2獨立地為氫，或選自芐氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(BOC)、芴基甲基氧基羰基(FMOC)、芐基(Bn)及對甲氧基芐基(PMB)的胺-保護基團(胺-保護基團優選為Cbz、Bn或BOC，尤其是Cbz或Bn)； R4為低級C1-6烷基或芐基，其任選被C1-4烷基、C2-4烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、OC1-4烷基、OCF3和C(＝O)C1-4烷基取代； R8和R9獨立地為氫或C1-6烷基； 其中R10a獨立地為C1-6烷基或任選被取代的芐基(R10a優選為甲基)； HET為任選被取代的3-14元雜環基或雜芳基環，其具有一至四個選自N、O或S的雜原子(優選為一至三個雜原子，尤其是一至兩個氮原子)在至少一個環中(HET優選為6-取代的喹唑啉-4-基，更優選為6-三氟甲基-喹唑啉-4-基)；并且 LG為離去基團，選自鹵素或OSO2R16(LG優選為鹵素，更優選為氯)，其中R16為C1-6烷基，苯基，具有一或多個選自N、S或O的原子的5-至7-元雜芳基，或者3-至7-元環烷基，其全部均任選被取代(優選的，對于R16的任選取代基為一至三個選自鹵素、CF3和C1-6烷基的基團)。
在第29項實施方案中，本公開內容提供根據任何前文實施方案的方法，其中 式V化合物為

或其鹽； 式VI化合物為

或其鹽； 式VII化合物為

或其鹽(優選為鈉鹽)； 式VIII氨基甲酸酯化合物為

或其鹽； 經保護的式IX胺化合物為

或其鹽； 經去除保護的式X化合物為

或其鹽；并且式I化合物為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，或其鹽。
在第30項實施方案中，本公開內容提供式V化合物，或其鹽
其中 R1和R2為氫，或者選自BOC、Cbz或芐基的胺-保護基團；并且 R4為低級C1-6烷基。
優選的式V化合物為

或其鹽。
在第31項實施方案中，本公開內容提供式VI化合物，或其鹽
其中 R1和R2獨立地為氫，或者選自BOC、Cbz或芐基的胺-保護基團；并且 R4為C1-6烷基；而且 R8和R9獨立地選自氫或C1-6烷基。
優選的式VI化合物為

或其鹽。
在第32項實施方案中，本公開內容提供式VII化合物，或其鹽
其中 R1和R2獨立地為氫，或者選自BOC、Cbz或芐基的胺-保護基團；并且 R8和R9獨立地選自氫或C1-6烷基。
優選的式VII化合物為

或其鹽。
其優選的鹽包括堿金屬鹽，例如式VII化合物的鈉鹽。
在第33項實施方案中，本公開內容提供式VII化合物，或其鹽
其中 R1和R2獨立地為氫，或者選自BOC、Cbz或芐基的胺-保護基團； R8和R9獨立地選自氫或C1-6烷基；并且 R10為C1-6烷基或芐基。
優選的式VIII化合物為

或其鹽。
在第34項實施方案中，本公開內容提供式IX化合物，或其鹽
其中 R1和R2獨立地為氫，或者選自BOC、Cbz或芐基的胺-保護基團； R8和R9獨立地選自氫或C1-6烷基；并且 R10為C1-6烷基或任選被取代的芐基。
優選的式IX化合物為

或其鹽。
在第35項實施方案中，本公開內容提供式X化合物，或其鹽
其中 R1獨立地為氫，或者選自BOC、Cbz或芐基的胺-保護基團； R8和R9獨立地選自氫或C1-6烷基；并且 R10為C1-6烷基或任選被取代的芐基。
優選的式X化合物為

或其鹽。
在第36項實施方案中，本公開內容提供式II化合物，或其鹽
其中 Ra和Rb和它們均連接的碳原子一起合并以形成羰基或1，3-二氧戊環基團(優選的是，Ra和Rb和它們均連接的碳原子一起合并以形成1，3-二氧戊環基團)； R1為氫； R2為Cbz； R3為氫；并且 R4為C1-6烷氧基。
優選的式II化合物為

或其鹽。
優選的鹽為甲苯磺酸鹽或氫溴酸鹽，尤其是甲苯磺酸鹽。
在第46項實施方案中，本公開內容提供一種方法，其中式I化合物為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺或其鹽。
本發明可在未偏離其精神或基本特質下，以其它特定形式具體體現。因此，上述實施方案不應被認為是限制。本發明的任何和所有實施方案均可結合任何其它一或多項實施方案以描述其它實施方案。實施方案的各個別要素(例如優選的或特殊的方面)是其自身獨立的實施方案。再者，一項實施方案的任何要素意欲與來自任何實施方案的任何和所有其它要素合并，以描述其它實施方案。此外，本發明涵蓋本文所指出的本發明的不同實施方案、部分實施方案、定義、說明例和實施例的組合。
定義 下文為本專利說明書和所附權利要求書中所使用術語的定義。對本文中基團或術語所提供的最初定義，在整個本專利說明書和權利要求書中適用于該基團或術語，個別地或作為另一種基團的一部分，除非另有指出。
＂烷基＂一詞是指直鏈或分支鏈烴基，其具有1至12個碳原子，優選為1至6個碳原子。當數目以下標出現在符號＂C＂之后時，該下標更明確地界定特定基團可含有的碳原子數。例如，＂C1-6烷基＂是指具有一至六個碳原子的直鏈與分支鏈烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等等。下標＂0＂是指一個鍵。因此，術語羥基(C0-2)烷基或(C0-2)羥烷基包括羥基、羥甲基和羥乙基。烷基可被一至三個選自以下的基團取代(C1-6)烷基、(C2-6)烯基、羥基、鹵素、氰基、硝基、CF3、O(C1-6烷基)、OCF3、C(＝O)H、C(＝O)(C1-6烷基)、CO2H、CO2(C1-6烷基)、NHCO2(C1-6烷基)、-S(C1-6烷基)、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、N(CH3)3+、SO2(C1-6烷基)、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH2、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH(烷基)、C(＝O)(C1-4亞烷基)N(C1-4烷基)2、C3-7環烷基、苯基、芐基、苯基乙基、苯基氧基、芐氧基、萘基、四-至七-元雜環基和/或五-至六-元雜芳基。當被取代的烷基被芳基、雜環基、環烷基或雜芳基取代時，該環狀系統均如下文定義，并且因此可具有零、一、二或三個也如下文定義的取代基。
當＂烷基＂一詞與另一種基團一起使用時，例如在＂芳烷基＂中，此搭配更明確地定義被取代烷基將含有的取代基之一。例如，＂芳烷基＂是指如上文定義的取代的烷基，其中至少一個取代基為芳基，例如芐基。因此，芳基(C0-4)烷基一詞包括具有至少一個芳基取代基的取代的低級烷基，并且還包括直接結合至另一個基團的芳基，意即芳基(C0)烷基。
＂烯基＂一詞是指直鏈或分支鏈烴基，其具有2至12個碳原子以及至少一個雙鍵。2至6個碳原子并且具有一個雙鍵的烯基是最優選的。烯基可如上文關于烷基所述被取代。
＂炔基＂一詞是指直鏈或分支鏈烴基，其具有2至12個碳原子以及至少一個叁鍵。2至6個碳原子并且具有一個叁鍵的炔基是最優選的。炔基可如上文關于烷基所述被取代。
＂亞烷基＂一詞是指二價直鏈或分支鏈烴基，其具有1至12個碳原子，優選為1至8個碳原子，例如{-CH2-}n，其中n為1至12，優選為1-8。低級亞烷基，意即1至2個碳原子的亞烷基是最優選的。術語＂亞烯基＂和＂亞炔基＂分別指如上文定義的烯基和炔基的二價基團。亞烯基可如上文關于烷基所述被取代。
＂烷氧基＂一詞是指被如本文所定義的烷基取代的氧原子。例如，＂烷氧基＂一詞包括基團-O-C1-6烷基。
當下標涉及與烷氧基、硫基烷基或氨基烷基使用時，該下標是指該基團除了雜原子以外可含有的碳原子數。
應明了的是，對于所有基團的選擇，包括例如烷氧基、硫基烷基和氨基烷基，將由本領域技術人員執行以提供穩定化合物。
＂羰基＂一詞是指二價羰基-C(＝O)-。
＂酰基＂一詞是指連結至有機基團的羰基，更特別是基團C(＝O)Re，以及二價基團-C(＝O)Re-，其被連結至有機基團。基團Re可選自如本文定義的烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，或當合適時，為其相應的二價基團，例如亞烷基。
＂環烷基＂一詞是指3至9個，優選為3至7個碳原子的完全飽和和部分不飽和烴環(并且因此包括＂環烯基環＂)。＂環烷基＂一詞包括具有零、一、二或三個取代基的環，所述取代基選自(C1-4)烷基、(C2-4)烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、O(C1-4烷基)、OCF3、C(＝O)H、C(＝O)(C1-4烷基)、CO2H、CO2(C1-4烷基)、NHCO2(C1-4烷基)、S(C1-4烷基)、NH2、NH(C1-4烷基)、N(C1-4烷基)2、N(C1-4烷基)3+、SO2(C1-4烷基)、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH2、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH(烷基)和/或C(＝O)(C1-4亞烷基)N(C1-4烷基)2。＂環烷基＂一詞還包括具有稠合到其上的第二環(例如，包括苯并、雜環基或雜芳基環)或者具有3至4個碳原子的碳-碳橋基的環。
＂鹵＂或＂鹵素＂術語是指氯、溴、氟及碘。
＂鹵烷基＂一詞表示具有一或多個鹵素取代基的取代的烷基。例如，＂鹵烷基＂包括單、雙和三氟甲基。
＂鹵烷氧基＂一詞表示具有一或多個鹵素取代基的烷氧基。例如，＂鹵烷氧基＂包括OCF3。
＂雜原子＂一詞包括氧、硫和氮。
＂芳基＂一詞是指苯基、聯苯基、芴基、1-萘基和2-萘基。＂芳基＂一詞包括具有零、一、二或三個取代基的環，所述取代基選自(C1-4)烷基、(C2-4)烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、O(C1-4烷基)、OCF3、C(＝O)H、C(＝O)(C1-4烷基)、CO2H、CO2(C1-4烷基)、NHCO2(C1-4烷基)、S(C1-4烷基)、NH2、NH(C1-4烷基)、N(C1-4烷基)2、N(C1-4烷基)3+、SO2(C1-4烷基)、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH2、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH(烷基)和/或C(＝O)(C1-4亞烷基)N(C1-4烷基)2。
術語＂雜環基＂或＂雜環族＂是指被取代與未被取代的非芳族(其可為部分或完全飽和)3-至15-元環，其具有一至四個雜原子。這些環可為3-至7-元單環狀基團、7-至11-元雙環狀基團和10-至15-元三環狀基團。含有雜原子的雜環基的各環可含有一或兩個氧或硫原子和/或一至四個氮原子，其條件是各環中雜原子的總數為四或更少，以及進一步的條件是該環含有至少一個碳原子。完成雙環狀與三環狀基團的稠合環可僅含有碳原子，并且可為飽和、部分飽和或不飽和。氮和硫原子可任選被氧化，并且氮原子可任選被季銨化。雜環基可被連接在任何可使用的氮或碳原子上。雜環基環可含有零、一、二或三個選自以下的取代基(C1-4)烷基、(C2-4)烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、O(C1-4烷基)、OCF3、C(＝O)H、C(＝O)(C1-4烷基)、CO2H、CO2(C1-4烷基)、NHCO2(C1-4烷基)、S(C1-4烷基)、NH2、NH(C1-4烷基)、N(C1-4烷基)2、N(C1-4烷基)3+、SO2(C1-4烷基)、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH2、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH(烷基)和/或C(＝O)(C1-4亞烷基)N(C1-4烷基)2。舉例的雜環族基團包括氮雜環丁烷基、吡咯烷基、環氧丙烷基、咪唑啉基、噁唑烷基、異噁唑啉基、噻唑烷基、異噻唑烷基、四氫呋喃基、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮雜環庚烯基、氮雜環庚烯基(azepinyl)、4-哌啶酮基、四氫吡喃基、嗎啉基、硫嗎啉基、硫嗎啉基亞砜、硫嗎啉基砜、1，3-二氧戊環、奎寧啶基和四氫-1，1-二氧代噻吩基等。
＂雜芳基＂一詞是指被取代與未被取代的芳族3-至14-元環，其在至少一個環中具有一至四個選自O、S或N的雜原子。該環可為5-或6-元單環狀基團、9-或10-元雙環狀基團和11-至14-元三環狀基團。含有雜原子的雜芳基的各環可含有一或兩個氧或硫原子和/或一至四個氮原子，其條件是各環中雜原子的總數為四或更少，并且各環具有至少一個碳原子。完成雙環狀與三環狀基團的稠合環可僅含有碳原子，并且可為飽和、部分飽和或不飽和。氮和硫原子可任選被氧化，并且氮原子可任選被季銨化。雙環狀或三環狀的雜芳基必須包含至少一個全芳族環，但一個或多個其它稠合環可為芳族或非芳族。雜芳基可被連接在任何環的任何可使用的氮或碳原子上。雜芳基環系統可含有零、一、二或三個選自以下的取代基(C1-4)烷基、(C2-4)烯基、鹵素、羥基、氰基、硝基、CF3、O(C1-4烷基)、OCF3、C(＝O)H、C(＝O)(C1-4烷基)、CO2H、CO2(C1-4烷基)、NHCO2(C1-4烷基)、S(C1-4烷基)、NH2、NH(C1-4烷基)、N(C1-4烷基)2、N(C1-4烷基)3+、SO2(C1-4烷基)、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH2、C(＝O)(C1-4亞烷基)NH(烷基)和/或C(＝O)(C1-4亞烷基)N(C1-4烷基)2。
舉例的雜芳基包括吡咯基、吡唑基、吡唑烷基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、三嗪基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并二氧戊環烯基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、二氫異吲哚基、四氫喹啉基等。特定雜芳基包括例如6-取代的喹唑啉-4-基和6-三氟甲基-喹唑啉-4-基。
在基團為任選被取代的情況中，其包括被取代與未被取代的基團。
本文所描述的化合物可具有不對稱中心。含有不對稱取代原子的本發明化合物可以分離成光學活性或外消旋形式。本領域公知如何制備光學活性形式，例如通過外消旋形式的拆分，或通過光學活性起始物質的合成得到。烯烴、C＝N雙鍵等多種幾何異構體也可以存在于本文所述的化合物中，并且所有這些穩定的異構體均意欲涵蓋在本發明中。本發明化合物的順式和反式幾何異構體被描述為并且可以被分為異構體的混合物或為分離的異構體形式。一種結構的所有手性、非對映異構體、外消旋形式和所有幾何異構形式均是希望的，除非明確指示特定立體化學或異構物形式。
本文中所揭示化合物的一種對映體與另一種比較可顯示優越的活性。因此，所有立體化學物質均被認為是本發明的一部分。當需要時，外消旋物質的分離可通過HPLC使用手性柱而完成，或者通過使用拆分試劑例如氯化樟腦磺酰拆分而完成，如Steven D.Young et al.，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1995，2602-2605。
本文中使用的＂藥學上可接受＂的措辭，是指在合理的醫學判斷的范圍內，適用于與人類和動物的組織接觸而不會有過度毒性、刺激性、過敏性應答或其它問題或并發癥，并有合理的利益/風險比的化合物、物質、組合物和/或劑型。
本文中使用的＂藥學上可接受的鹽＂是指所揭示化合物的衍生物，其中該母體化合物通過制造其酸或堿鹽而被修飾。藥學上可接受鹽的實例，包括但不限于堿性殘基例如胺類的礦酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基例如羧酸類的堿或有機鹽；等等。藥學上可接受的鹽，包括母體化合物的常用無毒性鹽或季銨鹽，例如來由無毒性無機酸或有機酸的鹽。例如，這些常用的無毒性鹽包括衍生自無機酸的鹽，無機酸例如鹽酸、苯磺酸、氫溴酸、硫酸、胺基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有機酸制得的鹽，有機酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、雙羥萘酸、順丁烯二酸、羥基順丁烯二酸、苯基乙酸、麩胺酸、苯甲酸、柳酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸等。
本發明藥學上可接受的鹽可以從含有堿性或酸性部分的母體化合物通過常規化學方法合成得到。一般而言，這些鹽可以在水中或在有機溶劑中或在此兩者的混合物中，通過使這些化合物的游離酸或堿形式與化學計量的適宜堿或酸反應而制成；一般而言，非水性介質例如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈是優選的。適合的鹽的列舉可參閱Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，PA，1985，p.1418，其公開內容并入本文供參考。
由于已知前體藥物會提高許多需要的醫藥質量(例如溶解度、生物利用率、制造等...)，故本發明化合物可以前體藥物形式遞送。因此，本發明系意欲涵蓋目前所主張的化合物的前體藥物，它們的遞送方法和含有它們的組合物。＂前體藥物＂意欲包括任何共價結合的載體，當此種前體藥物被施用于哺乳動物患者時，其會在體內釋放本發明的活性母體藥物。本發明中的前體藥物是通過改變存在于化合物中的官能基而制成的，其方式是在例行操作中或在體內使這些修飾分裂成母體化合物。前體藥物包括本發明的化合物，其中羥基、氨基或巰基結合至任何基團，當本發明的前體藥物被施用于哺乳動物患者時，其會分別分裂而形成游離羥基、游離胺基或游離巰基。前體藥物的實例包括但不限于在本發明化合物中的醇與胺官能基的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。
＂穩定化合物＂與＂穩定結構＂意欲表示一種化合物，其足夠強健而從反應混合物中留存著，分離至有用的純度，以及配制成有效治療劑。本發明意欲具體體現穩定化合物。
＂治療有效量＂意欲包括本發明化合物單獨的量，或者所主張的化合物的組合的量，或者本發明化合物與其它有效抑制MCP-1或有效治療或預防本文中所討論的病癥的活性成份的量。
本文中使用的＂治療＂或＂治療＂涵蓋在哺乳動物特別是人類中的疾病狀態的治療，并且包括(a)預防該疾病狀態發生于哺乳動物中，特別是當此種哺乳動物易罹患該疾病狀態，但尚未被診斷為具有該疾病時；(b)抑制該疾病狀態，意即遏制其發展；和/或(c)減輕該疾病狀態，意即造成該疾病狀態的退化。
本文中使用以指稱特定型式例如＂N-2＂的名稱，不應被認為是限制有關具有類似或相同物理和化學特性的任何其它物質，而是應理解為這些指稱僅僅是鑒別符號，其應根據本文中提出的表征信息加以解釋。
本發明提供作為一種新穎物質的N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺的游離堿的結晶型，特別是呈藥學上可接受的型式。在某些優選實施方案中，游離堿的結晶型呈基本上純凈的型式。游離堿的優選實施方案公開于實施例中，例如N-2、DC-1、THOO-1、E-1、A-1和AN-3。
本發明還提供一種新穎物質的N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺的鹽的結晶型，特別是呈藥學上可接受的型式。在某些優選實施方案中，鹽的結晶型呈基本上純凈的型式。鹽的優選實施方案公開于實施例中，例如二-苯磺酸鹽的N-1型式，和HCl鹽的H4-1型式。
本文中使用的＂多晶型物＂是指形成晶體的分子、原子和/或離子具有相同化學組成但不同空間排列的結晶型。
本文中使用的＂溶劑合物＂是指分子、原子和/或離子的結晶型，其進一步含有被并入晶體結構中的一種或多種溶劑的分子。在溶劑合物中的溶劑分子可以規則排列和/或非有序排列存在。溶劑合物可含有無論是化學計量或非化學計量的溶劑分子的量。例如，具有非化學計量的溶劑分子的量的溶劑合物可以從溶劑合物部分損失溶劑得到。
本文中使用的＂非晶型＂是指不是結晶性的分子、原子和/或離子的固體形式。非晶型固體不會顯示明確的X-射線衍射圖。
本文中使用的＂基本上純凈＂，當參考結晶型使用時，表示以化合物重量為基準，化合物具有純度大于90重量％，包括大于90、91、92、93、94、95、96、97、98和99重量％，也包括等于約100重量％的化合物I。其余物質包括該化合物的其它型式，和/或由于其制備而產生的反應雜質和/或操作雜質。例如，N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(游離堿或鹽)的結晶型，當通過目前已知并且本領域通常接受的方式測量時，可被視為基本上純凈，因其具有純度大于90重量％，其中其余小于10重量％的物質包含N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(游離堿或鹽)的其它型式，和/或反應雜質和/或操作雜質。
結晶型的樣品可具有基本上純凈的相均一性，這顯示有優勢量的單晶型式和任選少量的一種或多種其它結晶型存在。超過一種結晶型存在于樣品中，其可通過例如粉末X-射線衍射(PXRD)或固態核磁共振光譜學(SSNMR)的技術測定。例如，在以實驗方式測量的PXRD圖和模擬PXRD圖的比較中，額外吸收峰的存在可表示超過一種結晶型在樣品中。模擬PXRD可以從單晶X-射線數據算得。參閱Smith，D.K.，“AFORTRAN Program for Calculating X-Ray Powder Diffraction Patterns，”Lawrence Radiation Laboratory，Livermore，California，UCRL-7196(April1963)。
優選地，結晶型具有基本上純凈的相均一性，如通過在以實驗方式測量的PXRD圖中，由模擬PXRD圖中不存在的額外吸收峰所產生的總吸收峰面積低于10％，優選低于5％，并且更優選低于2％所顯示的。最優選的是一種這樣的結晶型，其具有基本上純凈的相均一性，其在以實驗方式測量的PXRD圖中，由模擬PXRD圖中不存在的額外吸收峰所產生的總吸收峰面積低于1％。
制備結晶型的操作是本領域已知的。結晶型可通過多種方法制備，包括例如從適宜溶劑中結晶或重結晶，升華作用，從熔融體生長，從另一相的固態轉變，從超臨界流體結晶，以及噴射噴霧。結晶型來自溶劑混合物的結晶或重結晶化的技術，包括例如溶劑的蒸發，降低溶劑混合物的溫度，將晶體播種到分子和/或鹽的過飽和溶劑混合物中，使溶劑混合物凍干，以及將反溶劑(反萃溶劑)添加至溶劑混合物中。
該型式可使用單晶X-射線衍射表征和區別，其是以一種型式的單晶在固定分析溫度下的單位晶胞測量為基礎。單位晶胞的詳細說明提供于Stout & Jensen，X-Ray Structure DeterminationA Practical Guide，Macmillan Co.，New York(1968)，Chapter 3，其并入本文供參考。或者，原子在晶格內空間關系上的獨特排列，可根據所發現的部分原子坐標來表征。另一種表征晶體結構的方式是通過粉末X-射線衍射分析進行的，其中將實驗或所發現的衍射分布形態與代表性的純粉末物質的模擬分布形態作比較，兩者均在相同分析溫度下操作，并且主題型式的測量值以一系列2θ值表征。
可使用表征該型式的其它方式，例如固態核磁共振(SSNMR)、差示掃描量熱法和熱重分析。這些參數還可合并使用以表征主題型式。
本文中使用的＂可忽視的重量損失＂一詞，當通過TGA表征時，顯示存在純(非溶劑化的)結晶型。
本文中使用的＂可忽視的％吸水率＂一詞，當通過水份吸著等溫線表征時，顯示經測試的型式為非吸濕性。
在本發明的一項實施方案中，N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(游離堿或鹽)的結晶型是以基本上純凈的形式提供的。此結晶型可被使用于醫藥組合物中，該醫藥組合物可任選包含一種或多種其它選擇的成份，例如選自賦形劑、載體以及其它不同分子結構的活性醫藥成份或活性化學個體之一。
優選地，結晶型具有基本上純凈的相均一性，如通過在以實驗方式測量的PXRD圖中，由模擬PXRD圖中不存在的額外吸收峰所產生的總吸收峰面積低于10％，優選低于5％，并且更優選低于2％所顯示的。最優選的是一種這樣的結晶型，其具有基本上純凈的相均一性，其在以實驗方式測量的PXRD圖中，由模擬PXRD圖中不存在的額外吸收峰所產生的總吸收峰面積低于1％。
在另一項實施方案中，提供了一種組合物，其包含基本上結晶型的N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(游離堿或鹽)。此項實施方案的組合物可包含至少90重量％該型式，以其在組合物中的重量為基準。
反應雜質和/或操作雜質的存在可通過本領域已知的分析技術測定，例如色譜法、核磁共振光譜法、質譜法或紅外光譜法。
結晶型可通過多種方法制備，包括例如從適宜溶劑中結晶或重結晶，升華作用，從熔融體生長，從另一相的固態轉變，從超臨界流體結晶，以及噴射噴霧。結晶型來自溶劑混合物的結晶或重結晶化的技術，包括例如溶劑的蒸發，降低溶劑混合物的溫度，將晶體播種到分子和/或鹽的過飽和溶劑混合物中，使溶劑混合物凍干，以及將反溶劑(反萃溶劑)添加至溶劑混合物中。可使用高通過量結晶技術來制備結晶型(包括多晶型物)。
藥物的晶體(包括多晶型物)、制備方法、以及藥物晶體的表征，討論于Solid-State Chemistry of Drugs，S.R.Byrn，R.R.Pfeiffer，and J.G.Stowell，2nd Edition，SSCI，West Lafayette，Indiana(1999)。
對于使用溶劑的結晶技術，一種或多種溶劑的選擇通常取決于一種或多種因素，例如化合物的溶解度、結晶技術以及溶劑的蒸氣壓。可使用溶劑的組合；例如，可使化合物溶解至第一溶劑中得到溶液，接著添加反溶劑以降低化合物在溶液中的溶解度，再獲得晶體的形成。＂反溶劑＂是化合物在其中具有低溶解度的溶劑。制備晶體的適宜溶劑包括極性溶劑和非極性溶劑。
在一種制備晶體的方法中，使N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(為游離堿或鹽)懸浮和/或攪拌于適宜溶劑中，得到漿液，可將其加熱以促進溶解。本文中使用的＂漿液＂一詞表示飽和溶液，其還可含有另一數量的固體，得到在給定溫度下的不均勻混合物。關于這方面的適宜溶劑包括，例如，極性非質子性溶劑和極性質子性溶劑，以及它們的兩種或多種的混合物，如本文中所公開的。
可將種子晶體添加至任何結晶混合物中以促進結晶。正如本領域技術人員理解的，使用晶種播種作為一種控制特定結晶型生長的方式，或作為一種控制結晶性產物粒子大小分布的方式。因此，所需晶種量的計算取決于可使用晶種的大小和平均產物粒子的所需大小，例如在“Programmed cooling of batch crystallizers，”J.W.Mullin and J.Nyvlt，Chemical Engineering Science(1971)26369-377中描述的。一般而言，需要小尺寸晶種以有效地控制晶體在批次中的生長。小尺寸晶種可通過較大晶體的篩濾、研磨或微粉化，或通過溶液的微結晶作用而產生。應當注意，晶體的研磨或微粉化不會造成所需結晶型在結晶度上的任何改變(意即改變成非晶型或另一種多晶型物)。
可以在真空下將冷卻的混合物過濾，并且可將分離的固體用適宜溶劑(例如冷的重結晶溶劑)洗滌，再在氮氣吹掃下干燥，得到所需的結晶型。分離的固體可通過適宜的光譜或分析技術分析，例如SSNMR、DSC、PXRD或其類似方式，以確保產物的優選結晶型形成。所形成的結晶型通常以大于約70重量％分離產率，但優選大于90重量％的量制成，以最初被使用于結晶操作中的N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(游離堿或鹽)的重量為基準。如果必要，此產物可經共研磨或過篩，以去除產物團塊。
結晶型可直接從制備N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(游離堿或鹽)的最后處理步驟的反應介質中制備。這可例如通過在最后處理步驟中使用化合物可從其中結晶的溶劑或溶劑混合物來完成。或者，結晶型可通過蒸發或溶劑添加技術獲得。為此目的使用的適宜溶劑，包括本文中所述的任何溶劑，包括質子性極性溶劑如醇類，以及非質子性極性溶劑如酮類。
以下述作為一般指導，可將反應混合物過濾以移除任何不期望的雜質、無機鹽等，接著用反應或結晶溶劑洗滌。可使所形成的溶液濃縮，以移除過量溶劑或氣態組份。若使用蒸餾，則所收集的餾出物的最后量可以改變，這取決于包括例如以下的操作因素容器大小、攪拌能力等。以下述作為一般指導，在進行溶劑置換之前，可使反應溶液蒸餾至原先體積的約1/10。可根據標準操作技術，將反應物取樣并檢測，以測定反應的程度和重量％產物。如果需要，可添加或移除其它反應溶劑，以使反應濃度達到最佳。最終濃度優選被調整至約50重量％，此時通常形成漿液。
優選可直接添加溶劑至反應容器，而無需蒸餾反應混合物。為此目的使用的優選溶劑是可以在最后參入到晶格中的，如上文關于溶劑交換所討論的。雖然最終濃度可依所需的純度、回收等而改變，但游離堿在溶液中的最終濃度，優選為約4％至約7％。可將反應混合物在溶劑添加之后攪拌，并且同時溫熱。以下述作為說明，可將反應混合物攪拌約1小時，同時溫熱至約70℃。反應優選經熱過濾，并用反應溶劑、添加的溶劑或其組合洗滌。可添加種子晶體至任何結晶溶液中，以引發結晶。
本文中所述的各種型式可通過利用本領域技術人員已知的各種分析技術來使它們相互區別。這些技術包括但不限于粉末X-射線衍射(PXRD)、差示掃描量熱法(DSC)和/或熱重分析(TGA)。或者，這些型式可使用單晶X-射線衍射來表征和區別，其是以一種給定型式的單晶在固定分析溫度下的單位晶胞測量為基礎。單位晶胞的詳細說明提供于Stout & Jensen，X-Ray Structure DeterminationA Practical Guide，Macmillan Co.，New York(1968)，Chapter 3，其并入本文供參考。具體地說，原子在晶格內在空間關系上的獨特排列可根據所發現的部分原子坐標表征。另一種表征晶體結構的方式是通過粉末x-射線衍射分析，其中將所發現的衍射分布形態與單晶結構數據產生的模擬分布形態作比較。有關主題型式的粉末x-射線衍射測量值被表征為一系列2θ值(通常為四個或更多個)。
可使用表征此型式的其它方式，例如固態核磁共振(SSNMR)波譜法、差示掃描量熱法(DSC)、熱相圖法(thermography)以及結晶性或非晶型型態學的總體檢測。這些參數也可合并使用，以表征主題型式。
本領域普通技術人員將理解，可以獲得具有測量誤差的X-射線衍射圖，其取決于所使用的測量條件。特別是，一般已知X-射線衍射圖中的強度可能波動，這取決于所使用的測量條件以及晶體的形狀或型態學。應進一步理解的是，相對強度還可根據實驗條件而改變，因此確切的強度級數不應考慮在內。此外，有關常用X-射線衍射圖衍射角度的測量誤差，通常為約0.2°2θ值或更低，優選為約0.1°2θ值(如后文所討論)，并且此種程度的測量誤差應考慮在內，例如有關前文所提及的衍射角度。因此，應理解的是，本發明的結晶型并不限于提供X-射線衍射圖完全相同于本文所公開的附圖中所描繪的X-射線衍射圖的結晶型。提供X-射線衍射圖基本上相同于附圖中所公開的任何結晶型均落在本發明的范圍內。確定X-射線衍射圖基本上相同的能力是在本領域技術人員的視界范圍內。
合成 圖式1酰胺IV的制備
使用本領域已知的方法，將式II的β-氨基酯或其鹽(包括甲苯磺酸鹽或氫溴酸鹽)與適當保護的式III手性α-氨基酸偶合，得到酰胺IV。參閱，例如WO2005021500中的制備。此偶合反應可以用二酰亞胺試劑，在活化劑和叔胺堿存在下，在惰性氣氛例如氮或氬(優選為氮)氣下，在非質子性溶劑例如丙腈、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯或乙腈(尤其是乙腈和/或乙酸乙酯)中進行。該二酰亞胺偶合試劑包括例如EDAC的試劑。活化劑的實例包括1-羥基苯并三唑(HOBt；該術語包括其水合物)和N′，N′-4-二甲基氨基-吡啶。叔胺堿包括例如三乙胺、N-N-二異丙基-N-乙胺和三-正丙基胺。式II氨基酯比二酰亞胺偶合試劑比活化劑比三級胺的摩爾比分別為1比約0.90-1.50比約0.95-1.50比約2.00至3.00。該摩爾比優選分別為1比約0.95-1.05比約0.95-1.10和比約2.10至2.30。
選擇β-氨基酯，以便使Ra和Rb為烷氧基或烷基硫醇化物基團，或與它們所連接的碳原子一起形成羰基，或形成環狀或非環狀縮醛或硫代縮醛，優選為1，3-二氧戊環基團。R4為C1-6烷基，優選為乙基。
式III手性α-氨基酸并入可官能化的末端殘基Y，其表示或可加工成烷基化基團，該烷基化基團適用于稍后Y所連接的側鏈末端碳在酰胺氮上的環化，因此，Y可選自例如以下的基團鹵素、SMe或OSO2R12，其中R12為C1-6烷基、-(CH2)C(O)OR13或-(CH2)C(O)R13；并且R13在每一存在處為C1-6烷基。X為OH、鹵素或OCOR14，其中R14為C1-6烷基。對于式III手性α-氨基酸的適宜保護基團R1和R2獨立地選自氫或胺-保護基團，其可在標準條件下通過水解或氫解而被移除。這些基團包括但不限于芐氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(BOC)、芴基甲基氧基羰基(FMOC)、芐基(Bn)或對-甲氧基芐基(PMB)。優選基團為Cbz、BOC或Bn基團。Cbz為最優選。
圖式2式IV酰胺的制備
式V化合物是通過使烷基化部分基團Y與酰胺氮的環化以形成吡咯烷酮環而制成的，在該轉變期間，Y充當離去基團。在一項優選實施方案中，烷基化部分基團表示锍鹽(其中R13為C1-6烷基、芐基或被取代的芐基，最優選甲基)，該锍鹽是通過使用本領域已知的硫-烷基化劑(例如C1-6烷基或芐基鹵化物，優選為碘化甲烷)活化甲硫胺酸衍生的酰胺IV(Y＝SMe)所產生的。參閱，例如Freidinger，et al.，J.Org.Chem.1982，47，10。
環化作用是在惰性氣氛例如氮或氬(優選為氮)氣下、在溶劑中通過使化合物IV或其鹽與堿在非質子性溶劑存在下接觸而進行。這些堿可以為例如但不限于碳酸銫、重碳酸銫、碳酸鉀、叔丁醇鈉或六甲基二硅氮化鈉，尤其是碳酸銫。非質子性溶劑包括例如但不限于DMSO、DMF、DMA、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和環丁砜，優選為DMSO和/或DMF。
在Ra和Rb獨立地為C1-6烷氧基或者與它們所連接的原子一起合并以形成環狀或非環狀縮醛或硫代縮醛的情況下，該縮醛基團是根據本領域已知的方法通過去除保護而被移除，以形成羰基。對于縮醛，去除保護可通過水解作用進行，優選在溶劑例如丙酮、丁酮、乙腈和異丙醇或其水溶液中進行，并且優選在丙酮水溶液中進行。其中該縮醛去除保護需要質子酸類，例如硫酸、甲苯磺酸、硝酸、甲磺酸、氫溴酸或鹽酸，鹽酸是最優選的。
圖式3化合物V的還原胺化作用
化合物VI是在兩個步驟中通過還原方式使式V化合物胺化而制成，其方式是(a)將胺NH(R8)(R9)和脫水劑添加至式V在非質子性溶劑中的溶液中，并在-20°至+50℃的溫度下混合，以形成式Va的亞胺/烯胺；和(b)在氫氣壓力下，以鉑催化劑處理式Va亞胺/烯胺的溶液，該鉑催化劑優選含有去活化劑，例如硫，優選為5％ Pt/C/S。胺取代基R8和R9獨立地選自氫和C1-6烷基。式NH(R8)(R9)胺優選為N-甲基-N-異丙胺。脫水劑為路易斯酸/

酸脫水作用促進劑，其包括但不限于鈦試劑，優選為四氯化鈦或四異丙氧化鈦或其混合物(尤其是四異丙氧化鈦)。參閱，例如R.Mattson，et al.，J.Org.Chem.1990，55，2552-2554。非質子性溶劑可選自例如但不限于以下的溶劑二氯乙烷、二氯甲烷、乙腈、DMSO、DMF和N-甲基-吡咯烷酮(優選為二氯甲烷)。優選地，在15-35psig的壓力和5％Pt/S/C下，在相對于化合物V為大約0.5至50％(重量/重量)下，用氫氣處理中間體亞胺/烯胺Va在二氯甲烷中的溶液。最優選范圍為5-10％(重量/重量)。
圖式4式VII的γ-氨基酸或其鹽的制備
使式VI化合物的酯水解以獲得相應的式VII酸或其鹽。水解作用可通過使用本領域公知的方法經堿水解而進行，或者，在高溫下使用酸類水溶液以獲得其相應的式VII的γ-氨基酸。酸水解作用是最優選的。溫度范圍為約40℃至約100℃(約50℃至約70℃的溫度范圍是最優選的)。酸類選自但不限于硫酸、甲苯磺酸、硝酸、甲磺酸、氫溴酸或鹽酸。鹽酸是最優選的。式VII化合物可任選被轉化成其羧酸鹽。VII優選被轉化成其鈉鹽。
圖式5氨基甲酸酯VIII的制備
式VIII氨基甲酸酯類是通過使式VII的γ-氨基酸轉化成具有式VIIa的異氰酸酯；以及使異氰酸酯與式R15OH的醇反應得到式VIII氨基甲酸酯而制成。選擇變量R15以便使氨基甲酸酯形成胺-保護基團，其可在標準水解或氫解條件下移除。這些胺-保護基團優選為N-CO2-叔丁基(得自R15＝叔丁基)或N-CO2-芐基(得自R15＝芐基)或N-CO2-取代的芐基(得自R15＝取代的芐基)。優選的醇為叔丁醇。
VII到異氰酸酯VIIa的轉化可通過數種方法之一進行，意即Curtius-、Hofmann-或Schmidt-Lossen重排。Curtius重排優選是通過使γ-氨基酸VII(或其鹽)與疊氮化二苯基磷酰在醇溶劑(優選為叔丁醇)中，優選但不限于含有甲苯或其它適當非質子性共溶劑，在高于熱重排成異氰酸酯的觸發點的溫度(優選在50℃或高于50℃下)下接觸而進行。
圖式6式IX化合物的制備
式IX化合物是以下述方式制成的使式VIII化合物中的氨基甲酸酯部分基團去除保護，接著使游離胺以式R10C(O)W試劑酰化，其中W為鹵素或R10C(O)，得到式IX化合物。氨基甲酸酯去除保護是通過本領域公知的方法進行的(例如對于R10＝叔丁基，酸去除保護可以硫酸、甲苯磺酸、硝酸、甲磺酸、氫溴酸或鹽酸進行—甲磺酸是最優選的)。然后添加堿(優選為三乙胺)，并使游離胺與式R10C(O)W化合物接觸，其中W為鹵素或R10C(O)，得到結構IX化合物。
圖式7式IX化合物的替代制備
式IX化合物的替代制備包括直接酰化中間體異氰酸酯VIIa(參閱上文圖式5)，其方式是在其相應酸(W＝氫)存在下任選當場添加至酰化劑R10aC(O)W中，其中W為R10aC(O)。優選的，酰化作用是通過將異氰酸酯引入乙酸和乙酸酐的混合物(其中R10a為甲基，并且W為氫)中進行，得到式IX化合物。
圖式7式X化合物的制備
式IX化合物中的R2基團是通過去除保護移除，以得到式X化合物。優選的，如果R2為Cbz，則去除保護是通過氫化作用在鈀催化劑(優選為10％ Pd/C)存在下完成的。
圖式8式I化合物的制備
式I化合物是通過使已去除保護的式X胺與式

化合物偶合而制成，以獲得式I化合物。此種偶合反應及其進行條件是本領域技術人員已知的。HET為任選被取代的3-14元雜環基或雜芳基環，其具有一個或多個選自N、O或S的雜原子(優選為一至三個雜原子，尤其是一至兩個氮原子)。優選的雜芳基包括但不限于6-取代的喹唑啉-4-基，更優選為6-三氟甲基-喹唑啉-4-基。本文中使用的離去基團(LG)包括但不限于例如以下的基團鹵素、C1-6烷氧基、甲磺酸鹽、九氟烷磺酸鹽(nonaflates)、磺酸鹽、甲苯磺酸鹽和三氟甲磺酸鹽。LG優選為選自鹵素或OSO2R16的離去基團，其中R16為苯基，具有一或多個選自N、S或O的原子的5-至7-元雜芳基，C1-6烷基或3-至7-元環烷基，其全部均任選被一至三個選自鹵素、CF3及C1-6烷基的基團取代。優選離去基團為鹵素，尤其是氯化物。
關于本發明的方法，起始物質是市售可得的或者可容易地由本領域技術人員制備。溶劑、溫度、壓力、具有所需基團的起始物質以及其它反應條件，可容易地由本領域技術人員按適宜方式選擇。該方法可按比例增大，以制備較大量的式I化合物，例如以商業化生產設備制備。
實施例 下述實施例說明本發明化合物和起始物質的實施方案，而非意欲限制權利要求的范圍。
按適宜方式，反應是在干燥氮(或氬)氣氛下進行。對于無水反應，使用得自EM的Dri-Solv溶劑。對于其它反應，使用試劑級或HPLC級溶劑。除非另有描述，否則全部市售所得的試劑均以接收時的情況使用。
LC/MS測量值是使用Shimadzu HPLC/Waters ZQ單一四元質譜儀混合系統獲得的。對于感興趣峰的數據，它們根據正模式電噴霧離子化作用報告。NMR(核磁共振)光譜一般是在Bruker或JEOL 400MHz和500MHz儀器上，在所指示的溶劑中獲得。所有化學位移是以距離具有溶劑共振而作為內標的四甲基硅烷的ppm報告的。1H-NMR光譜數據一般報告如下化學位移，多重性(s＝單重峰，brs＝寬單峰，d＝二重峰，dd＝二個二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，sep＝七重峰，m＝多重峰，app＝表觀)，偶合常數(Hz)和積分。
本領域技術人員將理解本文中所使用的標準縮寫。為了易于參考，縮寫包括但不限于sat.＝飽和的，HPLC＝高性能液相色譜法，AP＝面積百分比，KF＝Karl-Fischer，RT＝室溫(除非另有指定，否則RT為約22℃的溫度)，mmol＝毫摩爾，HRMS＝高分辨質量光譜，TBTU＝四氟硼酸O-苯并三唑-2-基-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓，MTBE＝TBME＝叔丁基甲基醚，EDAC＝N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽，EDC＝N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺，TEA＝三乙胺，DPPA＝疊氮化二苯基磷酰，IPA＝異丙醇，TFA＝三氟乙酸，DCM＝二氯甲烷，THF＝四氫呋喃，DMF＝N，N-二甲基甲酰胺，BOP＝六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻，EtOAc＝乙酸乙酯，DMSO＝二甲亞砜，℃＝攝氏度數，eq＝當量或數當量，g＝克或數克，mg＝毫克或數毫克，mL(或ml)＝毫升或數毫升，h＝小時或數小時，M＝摩爾濃度，N＝當量濃度，min＝分鐘或數分鐘，MHz＝百萬赫茲，TLC＝薄層色譜法，v/v＝體積比體積的比。
＂α＂、＂β＂、＂R＂和＂S＂是本領域技術人員所熟悉的立體化學名稱。
實施例1 N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺
實施例1，步驟1使(1R，2S，5R)-2-芐氧羰基胺基-7-氧代-6-氮雜-雙環并[3.2.1]辛烷-6-羧酸叔丁酯(89.6克，0.24摩爾，參閱P.H.Carter，et al.，PCT申請WO 2005/021500)溶于乙酸乙酯(1.5升)中，并將所形成的溶液以飽和NaHCO3(2 x 0.45升)和飽和NaCl(1 x 0.45升)洗滌。使溶液干燥(Na2SO4)，然后直接過濾進入3頸3升圓底燒瓶中。將溶液以直接氮注入吹掃，然后，在氮大氣下裝填10％ Pd/C(13.65克)。將燒瓶抽氣，再以氫逆充填；將其再重復兩次。使氫鼓泡經過此溶液30分鐘，接著，將反應物在1大氣壓H2下攪拌18小時。將燒瓶抽氣，以氮逆充填，再裝填新催化劑(6克10％ Pd/C)。使氫鼓泡經過此溶液30分鐘，然后，將反應物于1大氣壓H2下攪拌18小時。將燒瓶抽氣，再以氮逆充填。使混合物經過硅藻土過濾；接著，用乙酸乙酯洗滌過濾墊。用乙腈(0.3升)稀釋濾液(～1.6升EtOAc體積)，再相繼裝填L-N-Cbz-甲硫胺酸(68克，0.24摩爾)、TBTU(77克，0.24摩爾)和N，N-二異丙基乙胺(42毫升，0.24摩爾)。將反應物在室溫下攪拌4小時，在此時間內，其從懸浮液改變成透明溶液。通過添加飽和NH4Cl(0.75升)和水(0.15升)使反應猝滅；將混合物以EtOAc(0.75升)再稀釋。將液相混合，分離，再將有機相以飽和Na2CO3(2x 0.9升)和飽和NaCl(1 x 0.75升)洗滌。使溶液干燥(Na2SO4)，過濾，再在真空中濃縮，得到(1R，2S，5R)-2-((S)-2-(芐氧羰基胺基)-4-(甲硫基)丁酰胺基)-7-氧代-6-氮雜-雙環并[3.2.1]辛烷-6-羧酸叔丁酯，為油狀物，將其帶至下一步驟而無需進一步純化。主要吸收峰的LC/MS[M-Boc+H]+＝406.3；[M+Na]+＝528.3。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ7.36(m，5H)，5.11(s，2H)，4.32(m，1H)，4.2(m，1H)，4.0(m，1H)，2.5-2.7(m，3H)，2.25(m，1H)，2.11(s，3H)，2.05(m，4H)，1.9(m，1H)，1.7(m，2H)，1.54(s，9H)。還存在EtOAc[1.26(t)，2.03(s)，4.12(q)]和N，N，N，N-四甲基脲[2.83(s)]。
實施例1，步驟2使(1R，2S，5R)-2-((S)-2-(芐氧羰基胺基)-4-(甲硫基)丁酰胺基)-7-氧代-6-氮雜-雙環并[3.2.1]辛烷-6-羧酸叔丁酯的樣品(假定為0.24摩爾；參閱先前操作)溶于碘甲烷(1,250克)中，并在室溫下攪拌48小時。在真空中濃縮反應物。使殘留物溶于二氯甲烷中，再在真空中濃縮。將其再重復兩次。使所形成的泥狀物溶于二氯甲烷(0.4升)中，并倒入正迅速攪拌的MTBE溶液(4.0升)中。將所形成的黃色固體通過抽氣過濾收集，再在高真空下干燥，得到锍鹽(179克)。將此物質帶至下一步驟而無需進一步純化。主要吸收峰的LC/MS[M-Me2S+H]+＝458.4；[M]+＝520.4。1H-NMR(400MHz，.d4-MeOH)δ7.35(m，5H)，5.09(s，2H)，4.33(m，1H)，4.28(m，1H)，3.98(m，1H)，3.3-3.45(m，2H)，2.97(s，3H)，2.94(s，3H)，2.78(m，1H)，2.0-2.3(m，4H)，1.7(m，2H)，1.52(s，9H)。還存在MTBE[1.18(s)，3.2(s)]和微量的N，N，N，N-四甲基脲[2.81(s)]。
實施例1，步驟3使得自前一步驟的全部锍鹽(假定為0.24摩爾)溶于DMSO(2.0升)中。將所形成的溶液在氮氣和室溫下攪拌，并分次裝填碳酸銫(216克)。將此懸浮液在室溫下攪拌3小時，然后過濾，以移除固體。將溶液分成數份～0.22升，并按下述處理將反應混合物(～0.22升)以乙酸乙酯(1.5升)稀釋，并以水(3 x 0.5升)和鹽水(1 x 0.3升)連續洗滌。使有機相干燥(Na2SO4)，過濾，再在真空中濃縮。獲得所需的(1R，2S，5R)-2-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-7-氧代-6-氮雜雙環并[3.2.1]辛烷-6-羧酸叔丁酯(90.8克，83％)，為微晶性泡沫物，不含四甲基脲雜質。主要吸收峰的LC/MS[M-Boc+H]+＝358.4；[M+Na]+＝480.4。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ7.35(m，5H)，5.12(s，2H)，4.35(m，2H)，4.2(m，1H)，3.6(m，1H)，3.3(m，1H)，2.64(m，1H)，2.28-2.42(m，2H)，2.15(m，1H)，1.7-2.0(m，5H)，1.55(s，9H)。若需要，此物質可通過溶于MTBE(1體積)中，添加至庚烷(3.3體積)中，再收集所形成的沉淀物，而被分離成固體。
實施例1，步驟4于(1R，2S，5R)-2-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-7-氧代-6-氮雜雙環并[3.2.1]辛烷-6-羧酸叔丁酯(108克，0.236摩爾)在THF(1升)中的正在攪拌溶液內，裝填氫氧化鋰單水合物(21.74克，0.519摩爾)。慢慢添加水(0.3升)，以致使溫度不超過20℃。將反應物在室溫下攪拌過夜，并在真空中移除揮發性物質。通過添加1N HCl(450毫升)和NaH2PO4調整pH值至～4。將所形成的白色沉淀物通過過濾收集，并以水(2 x 1升)洗滌。使固體溶于二氯甲烷(1.5升)和水(～1升)中。使有機層干燥(Na2SO4)，過濾，再在真空中濃縮。使殘留物溶于EtOAc(0.7升)中，并將所形成的溶液在回流下加熱1小時。在冷卻至室溫后，分離固體，再通過過濾收集。使這些固體在異丙醇中通過再結晶純化，得到所需的(1R，2S，5R)-2-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(叔丁氧羰基胺基)環己烷羧酸，為白色固體(104.5克，93％產率)。主要吸收峰的LC/MS[M-tBu+H]+＝420.2；[M-Boc+H]+＝376.2；[M+H]+＝476.2。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ7.35(m，5H)，5.11(s，2H)，4.35(m，2H)，3.71(m，1H)，3.45-3.6(m，2H)，2.99(m，1H)，2.41(m，1H)，2.15(m，1H)，2.0(m，2H)，1.6-1.9(m，4H)，1.46(s，9H)。
實施例1，步驟5在3升圓底燒瓶中，裝填(1R，2S，5R)-2-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(叔丁氧羰基胺基)環己烷羧酸(75.5克，0.158摩爾)、EDC·HCl(33.5克，0.175摩爾)、1-羥基苯并三唑(23.6克，0.175摩爾)和二氯甲烷(1升)。將反應物在室溫下攪拌2小時，在此段時間內，其從白色懸浮液改變成透明溶液。使氨(氣體)鼓泡進入溶液中，直到pH值為強堿性(紙)為止，并將反應物攪拌10分鐘；重復添加此氨，并將反應物再攪拌10分鐘。添加水。將有機相以飽和NaHCO3、NaH2PO4和鹽水洗滌，然后在真空中濃縮。將殘留物以乙腈(0.5升)配成漿液，然后濃縮，獲得(1R，2S，5R)-2-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(叔丁氧羰基胺基)環己烷羧酰胺，為白色固體(75.9克，～100％)，將其使用于下一步驟而無需進一步純化。主要吸收峰的LC/MS[M-Boc+H]+＝375.3；[M+H]+＝475.4；[M-tBu+H]+＝419.3。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ7.35(m，5H)，5.11(s，2H)，4.25(m，2H)，3.70(m，1H)，3.6(m，1H)，3.45(m，1H)，2.91(m，1H)，2.38(m，1H)，2.12(m，1H)，1.9-2.05(m，2H)，1.65-1.9(m，4H)，1.46(s，9H)。
實施例1，步驟6將反應以三等份進行，并合并供水溶液處理。在5升3頸圓底燒瓶中，添加(1R，2S，5R)-2-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(叔丁氧羰基胺基)環己烷羧酰胺(25.3克，53毫摩爾)、乙腈(19升)和2.6升水/冰。將混合物攪拌，并冷卻至0℃。添加碘苯二乙酸鹽(25.77克，80毫摩爾)，并將反應物攪拌2小時；添加另外0.5當量的碘苯二乙酸鹽。將反應物攪拌9小時(反應溫度<10℃)。在混合物中，添加8當量N，N-二異丙基乙胺和2當量乙酸酐。在接下來的三十分鐘內，每十分鐘添加4當量N，N-二異丙基乙胺和2當量乙酸酐，直到反應已進行至完成(HPLC)為止。在真空中移除乙腈；自殘留物分離出一些固體，再將其通過過濾收集。以二氯甲烷(3升，接著1升)萃取其余殘留物。相繼以水、飽和NaHCO3和鹽水洗滌有機相。將所收集的固體伴隨著活性碳(15克)添加至有機相中。將混合物在40℃下攪拌30分鐘，然后過濾，再在真空中濃縮。使殘留物溶于EtOAc(1升)中，并將所形成的溶液在75℃下攪拌1小時，然后，使其冷卻至室溫。分離固體，再通過過濾收集。使此固體通過再結晶進一步純化首先，使其溶于0.5升CH2Cl2中，然后在真空中濃縮，接著自1升EtOAc再結晶；將其重復三次。將得自上述母液的固體使用相同方法再結晶三次。使合并的固體自乙腈(0.7升)再結晶兩次，以提供66克(84％)(1R，3R，4S)-3-乙酰胺基-4-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)環己基胺基甲酸叔丁酯(純度>99.5％，通過HPLC)。主要吸收峰的LC/MS[M+H]+＝489.4；[M-tBu+H]+＝433.3。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ7.3-7.4(m，5H)，5.11(s，2H)，4.35(m，1H)，4.15(m，1H)，4.04(m，1H)，3.8(m，1H)，3.6(m，2H)，2.44(m，1H)，2.12(m，1H)，1.87-2.05(m，4H)，1.87(s，3H)，1.55-1.7(m，2H)，1.46(s，9H)。Hofmann重排的立體化學真實性是通過此化合物的X-射線晶體結構分析確認的，如圖1中所示。
實施例1，步驟7在(1R，3R，4S)-3-乙酰胺基-4-((S)-3-(芐氧羰基胺基)-2-氧代吡咯烷-1-基)環己基胺基甲酸叔丁酯(66克，0.135摩爾)在二氯甲烷(216毫升)中的正在攪拌溶液中，添加三氟乙酸(216毫升)。將反應物在室溫下攪拌2小時，再在真空中濃縮。使殘留物溶解在甲醇中，并在真空中濃縮所形成的溶液；將其重復一次。獲得(S)-1-((1S，2R，4R)-2-乙酰胺基-4-胺基環己基)-2-氧代吡咯烷-3-基胺基甲酸芐酯，為油狀物，再直接使用于下文步驟8中。LC/MS實測值[M+H]+＝389.4。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ7.3-7.4(m，5H)，5.12(s，2H)，4.41(br.s，1H)，4.15(m，1H)，4.00(t，J＝9.3Hz，1H)，3.81(t，J＝9.1Hz，1H)，3.65(q，J＝8.4Hz，1H)，3.3-3.4(m，1H)，2.45(m，1H)，1.95-2.24(m，5H)，2.00(s，3H)，1.6-1.8(m，2H)。
實施例1，步驟8在(S)-1-((1S，2R，4R)-2-乙酰胺基-4-胺基環己基)-2-氧代吡咯烷-3-基胺基甲酸芐酯(～0.135摩爾)在甲醇(675毫升)中的正在攪拌溶液中，相繼裝填丙酮(37.8克，4當量)、乙酸鈉(33.2克，3當量)和氰基硼氫化鈉(16.9克，2當量)。將混合物在室溫下攪拌6小時，再過濾。使濾液溶于二氯甲烷(1升)中；以1N NaOH(1升)洗滌此溶液。在0℃下，使在過濾中所收集的固體溶于1N NaOH(1升)中，然后以二氯甲烷(1升)萃取。合并有機萃取液，再以HCl水溶液(200毫升1N HCl+800毫升水)萃取。以飽和NaHCO3(500毫升)，接著以1N NaOH(100毫升)使水相堿化，直到pH11為止。以二氯甲烷(2升)萃取水相。合并有機萃取液，干燥(Na2SO4)，過濾，再在真空中濃縮，得到(S)-1-((1S，2R，4R)-2-乙酰胺基-4-(異丙基胺基)環己基)-2-氧代吡咯烷-3-基胺基甲酸芐酯，為油狀物。LC/MS實測值[M+H]+＝431.45。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ7.3-7.4(m，5H)，5.12(s，2H)，4.31(m，1H)，4.24(t，J＝9.4Hz，1H)，4.11(m，1H)，3.61(t，J＝9.1Hz，1H)，3.52(q，J＝8.6Hz，1H)，3.04(br.s，1H)，2.96(七重峰，J＝6.3Hz，1H)，2.40(m，1H)，2.15(m，1H)，1.92(s，3H)，1.7-1.9(m，5H)，1.65(m，1H)，1.12(app.dd，J＝6.3，1.1Hz，6H)。
實施例1，步驟9(參閱下文替代步驟9)使(S)-1-((1S，2R，4R)-2-乙酰胺基-4-(異丙基胺基)環己基)-2-氧代吡咯烷-3-基胺基甲酸芐酯(～115毫摩爾)在二氯甲烷(600毫升)中的正在攪拌溶液冷卻至0℃，并相繼裝填甲醛(18.6克，37重量％溶液)、三乙胺(23毫升)和三乙酰氧基硼氫化鈉(28.7克)。將混合物在室溫下攪拌30分鐘，再以二氯甲烷(至高達1.2升)稀釋。將此溶液以500毫升飽和NaHCO3+NaOH(飽和NaHCO3，pH至11w/1N NaOH)洗滌三次。以HCl水溶液(200毫升1N HCl+600毫升水)萃取有機層。以飽和NaHCO3(500毫升)，接著以1N NaOH(100毫升)使水相堿化，直到pH11為止。以二氯甲烷(1.2升)萃取水相。合并有機萃取液，干燥(Na2SO4)，過濾，并在真空中濃縮，得到(S)-1-((1S，2R，4R)-2-乙酰胺基-4-(異丙基(甲基)胺基)環己基)-2-氧代吡咯烷-3-基胺基甲酸芐酯，為油狀物，將其直接使用于下文步驟10中。LC/MS實測值[M+H]+＝445.4。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ7.3-7.4(m，5H)，5.12(s，2H)，4.33(br s，1H)，4.25(t，J＝9.2Hz，1H)，4.11(br s，1H)，3.5-3.6(m，2H)，2.77(v br s，2H)，2.41(m，1H)，2.26(s，3H)，2.0-2.1(m，2H)，1.92(s，3H)，1.7-1.9(m，5H)，1.10(app.dd，J＝17，6.4Hz，6H)。
實施例1，步驟10在(S)-1-((1S，2R，4R)-2-乙酰胺基-4-(異丙基(甲基)胺基)-環己基)-2-氧代吡咯烷-3-基胺基甲酸芐酯(～0.115摩爾)在甲醇(600毫升)中的溶液中，添加10％ Pd/C(6克50％潮濕催化劑)。將燒瓶抽氣，并以氫逆充填。將混合物在1大氣壓H2下攪拌2小時，并通過經過硅藻土過濾移除催化劑。使濾液在真空中濃縮，以提供N-((1R，2S，5R)-2-((S)-3-胺基-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(異丙基(甲基)胺基)環己基)乙酰胺，為油狀物，將其帶至下一步驟而無需進一步純化。LC/MS實測值[M+H]+＝311.47。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ4.39(brs，1H)，4.00(m，1H)，3.3-3.5(m，4H)，2.73(m，1H)，2.38(m，1H)，2.25(s，3H)，2.0-2.2(m，3H)，1.94(s，3H)，1.6-1.75(m，4H)，1.07(app.dd，J＝21，6.4Hz，6H)。
實施例1，步驟11向N-((1R，2S，5R)-2-((S)-3-胺基-2-氧代吡咯烷-1-基)-5-(異丙基(甲基)胺基)環己基)乙酰胺(～35克，0.115摩爾)在異丙醇(600毫升)中的溶液中，添加4-氯基-6-(三氟甲基)喹唑啉(32克，0.138摩爾，1.2當量，參閱P.H.Carter，et al.，PCT申請WO 2005/021500)。將混合物在室溫下攪拌過夜，然后添加三乙胺(46克，0.46摩爾，4當量)。將混合物在60℃下攪拌10小時。在減壓下移除溶劑，得到油狀物。與異丙醇的共沸蒸餾進行兩次。使殘留物溶于二氯甲烷(600毫升)中，并以水(250毫升，含有4當量乙酸)萃取。將二氯甲烷(600毫升)添加至合并的含水洗液中，并使混合物冷卻至0℃。添加NaOH水溶液(50重量％)，并攪拌，直到pH值達到11為止。以二氯甲烷(2 x 600毫升)萃取兩次水層。使合并的有機萃取液干燥(Na2SO4)，過濾，并在真空中濃縮，得到標題化合物的非晶型游離堿(99％純度，通過HPLC)。LC/MS實測值[M+H]+＝507.3。1H-NMR(400MHz，d4-MeOH)δ8.82(s，1H)，8.59(s，1H)，8.05(dd，J＝8.8，1.8Hz，1H)，7.9(d，J＝8.7Hz，1H)，5.28(t，J＝8.6Hz，1H)，4.58(br s，1H)，4.06(m，1H)，3.52-3.68(m，2H)，3.43(m，1H)，2.76(br s，1H)，2.55(m，1H)，2.28(s，3H)，2.1-2.3(m，3H)，2.0(s，3H)，2.0(m，1H)，1.65-1.8(m，3H)，1.09(app.dd，J＝24，6.4Hz，6H)。
實施例1，替代步驟9
實施例1，替代步驟9ai向氫化器中，添加(7R，8S)-8-((S)-1-苯基-乙胺基)-1，4-二氧-螺[4.5]癸烷-7-羧酸乙酯4-甲苯磺酸鹽1A(1417克，2.8摩爾，參閱WO2004098516，類似于美國專利6,835,841制備)、乙醇(200標準純度，11.4升)和10％Pd/C催化劑(50％潮濕，284克)。將混合物以氮惰性化，然后，以氫氣(45psig)加壓，再在約40℃下激烈攪拌，直到起始物質被消耗為止(HPLC)。使此懸浮液冷卻，以氮氣吹掃，并趁惰性化時，通過過濾移除催化劑。將用過的催化劑以乙醇(4.3升)洗滌。合并濾液和洗液，再在真空下濃縮至體積為2-3升，同時保持批料在40℃-60℃之間。添加乙酸異丙酯(5升)，并使混合物濃縮至體積為～2升，直到移除大部分乙醇(<0.5％)為止，并且殘留水份含量為<1，000ppm。將批料體積通過添加乙酸異丙酯調整至～7.5升。將混合物加熱至80℃，直到透明為止，接著冷卻至65℃-70℃。添加1的種子晶體(5克)，再使批料冷卻至50℃，歷經2小時，然后再冷卻至20℃，歷經4小時，并保持～10小時。過濾所形成的漿液，并以乙酸異丙酯(2升)洗滌濾餅。使產物在真空及～35℃下干燥，直到使揮發性物質減至低于～1％(LOD)為止。獲得(7R，8S)-8-胺基-1，4-二氧-螺[4.5]癸烷-7-羧酸乙酯4-甲苯磺酸鹽1，為白色結晶性固體(936克，83％產率；HPLC純度99.8％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)8.14-7.89(brs，3H)，7.75(d，J9.0Hz，2H)，7.15(d，J8.0Hz，2H)，4.22-4.04(m，2H)，4.01-3.77(m，4H)，3.55-3.43(m，1H)，3.20-3.13(m，1H)，2.40-2.27(m，4H)，2.21-1.94(m，2H)，1.81-1.51(m，3H)，1.23(t，J7.0Hz，3H)；HPLCWaters XterraMS C184.6毫米x150毫米內徑，3.5微米粒子大小，0.05％ NH4OH(5％ACN，95％ H2O，溶劑A)，至0.05％ NH4OH(95％ ACN，5％ H2O，溶劑B)，5％ B至20％ B，在10分鐘內，改變至95％ B，在25分鐘內，然后改變至5％ B，在1分鐘內；11.1分鐘(氨基酯1)。

實施例1，替代步驟9aii將氨基酯1(63克，0.16M，1當量；已知化合物的還原性去除保護的產物-(參閱例如R.J.Cherney，WO2004/098516和G.V.Delucca & S.S.Ko，WO 2004/110993)放置在圓底燒瓶中，并添加MeCN(500毫升)。然后添加EDAC(33.1克，0.17M，1.1當量)、HOBt·H2O(21.2克，0.16M，1.0當量)和N-Cbz-L-甲硫胺酸(46.7克，0.17M，1.05當量)，接著為TEA(48.0毫升，0.35M，2.2當量)。發現放熱至38℃。將反應物質在室溫下留置攪拌。30分鐘后，HPLC顯示完全轉化，將反應物質以EtOAc(2.5升)稀釋，并以KHCO3(4 x 500毫升，20重量％水溶液)和鹽水(500毫升)洗滌。分離有機相，以MgSO4干燥，濃縮。使殘留物溶于TBME中，再濃縮，得到(7R，8S)-8-{(2S)-2-芐氧羰基胺基-4-甲硫基-丁酰胺基}-1，4-二氧-螺[4.5]癸烷-7-羧酸乙酯2，為粘性半固體(76.2克，98％產率，93AP純度)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.36-7.30(m，5H)，7.03(d，J9.0Hz，1H)，5.66(d，J8.0Hz，1H)，5.10(s，2H)，4.35-4.25(m，2H)，4.19-4.04(m，2H)，3.98-3.86(m，4H)，2.87-2.80(m，1H)，2.55-2.45(m，2H)，2.18(dd，J14.0Hz，7.0Hz，1H)，2.08(s，3H)，2.05-1.67(m，6H)，1.26(t，J7.0Hz，3H)。HPLCYMC-Pack Pro C185微米4.6 x 150毫米，0.05％ TFA(20％ MeOH，80％H2O)至0.05％ TFA(20％ MeOH，80％ MeCN)，0-100％ 10分鐘梯度液.10.01分鐘(化合物2，93.1AP).HRMSm/z 495.2166[計算值C24H35N2O7S 495.2165]。

實施例1，替代步驟9b使甲硫胺酸酰胺2(75.0克，0.15M)溶于MeI(225毫升，3毫升/克)中-發現一部分出氣但未放熱。將反應物質留置于黑暗中攪拌16.5小時。在此段時間后，已形成濃稠淡黃色沉淀物。然后，將燒瓶抽空至200毫米Hg，并移除一部分MeI。將殘留物質在TBME(500毫升)中配成漿液，在30分鐘攪拌后，過濾漿液，以TBME(500毫升)洗滌濾餅。此物質的NMR分析顯示少量MeI余留。將濾餅在TBME(500毫升)中再配成漿液，過濾，以TBME(500毫升)洗滌，并在真空下干燥，得到碘化[(3S)-3-芐氧羰基胺基-3-{(7R，8S)-7-乙氧羰基-1，4-二-氧-螺[4.5]癸-8-基胺甲酰基}-丙基]-二甲基锍3，為自由流動性灰白色固體(93.5克，97％，99面積％純度)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.75(d，J9.0Hz，1H)，7.38-7.27(m，5H)，6.40(d，J7.0Hz，1H)，5.10(s，2H)，4.76-4.65(m，1H)，4.48-4.39(m，1H)，4.14-3.85(m，6H)，3.84-7.73(m，1H)，3.68-3.55(m，1H)，3.21(s，3H)，3.12(s，3H)，2.90-2.83(s，1H)，2.52-1.55(m，8H)，1.24(t，J7.0Hz，3H)。HPLCYMC-Pack ProC18 5微米4.6 x 150毫米，0.05％ TFA(20％ MeOH，80％ H2O)至0.05％TFA(20％ MeOH，80％ MeCN)，0-100％ 10分鐘梯度液.2.45分鐘(I-)，8.14分鐘(化合物3，43.6AP，I-54.6AP).HRMSm/z 509.2341[計算值C25H37N2O7S 509.2321]。

實施例1，替代步驟9c將Cs2CO3(61.5克，0.19M，1.5當量)放置在圓底燒瓶中，并添加無水DMSO(2.4升)。然后分次添加锍鹽3(80.0克，0.13M，1.0當量)。一旦添加完成后，立即將反應物質留置于黑暗中攪拌20小時。接著，將反應物質分離成兩半，并將每一半分別處理將反應物質以EtOAc(2.0升)稀釋，并以鹽水(2升)洗滌，以鹽水(500毫升)洗滌有機相。然后，以EtOAc(500毫升)洗滌合并的水層。接著，將合并的有機相以鹽水(3 x 750毫升)洗滌。將反應物質的第二個一半以相同方式處理，并使合并的有機物質以MgSO4干燥，濃縮，得到(7R，8S)-8-{(3S)-3-芐氧羰基胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基}-1，4-二氧-螺[4.5]癸烷-7-羧酸乙酯4，為淺色油(56.5克，0.13M，～100面積-％純度)，通過NMR分析為純的。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.38-7.30(m，5H)，5.37(br d，J4.0Hz，1H)，5.11(s，2H)，4.27-4.18(m，1H)，4.17-3.82(m，8H)，3.32(td，J10.0Hz，60.0Hz，1H)，3.23(q，J5.0Hz，1H)，2.63-2.57(m，1H)，2.42-2.25(m，2H)，1.94-1.68(m，5H)，1.25(t，J7.0Hz，3H)。HPLCYMC-Pack Pro C18 5微米4.6 x 150毫米，0.05％ TFA(20％ MeOH，80％ H2O)至0.05％ TFA(20％ MeOH，80％ MeCN)，0-100％10分鐘梯度液。8.99分鐘(化合物5，在柱上制成，4.2AP)，9.48(化合物4，74.3AP)。HRMSm/z 447.2127[計算值C23H31N2O7 447.2131]。

實施例1，替代步驟9d使吡咯烷酮4(50.0克，0.11M)溶于丙酮(500毫升)中，并添加1N HCl(500毫升)。然后，將反應物質加熱至65℃。20分鐘后，HPLC顯示完成反應。使反應物質冷卻至室溫，并在回轉式蒸發器上移除丙酮。在此蒸餾期間，產物自溶液沉淀，為白色固體。將其通過過濾分離，并以水洗滌濾餅。接著，使濾餅與甲苯(3 x 300毫升)以共沸方式干燥，得到(1R，2S)-2-((3S)-3-芐氧羰基胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-5-氧代-環己烷羧酸乙酯5，為白色固體(39.8克，88％，97面積-％純度)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.37-7.32(m，5H)，6.65(br d，J4.0Hz，1H)，5.12(s，2H)，4.54-4.47(m，1H)，4.34-4.26(m，1H)，4.18(dq，J 11.0Hz，7.0Hz，1H)，4.09(dq，J11.0Hz，7.0Hz，1H)，3.36-3.20(m，3H)，2.70-2.35(m，6H)，2.05-1.96(m，1H)，1.81(五重峰，J11.0Hz，1H)，1.24(t，J7.0Hz，3H)。HPLCYMC-Pack Pro C185微米4.6 x 150毫米，0.05％ TFA(20％ MeOH，80％ H2O)至0.05％ TFA(20％ MeOH，80％ MeCN)，0-100％ 10分鐘梯度液。8.95分鐘(化合物5)。HRMSm/z 403.1864[計算值C21H27N2O6 403.1869]。

實施例1，替代步驟9e將環己酮5(22.5克，0.06M，1當量)、DMSO(30毫升)和Ti(O-iPr)4(33.7毫升，0.11M，2.04當量)放置在圓底燒瓶中。然后，以一份添加N-異丙基-N-甲胺(11.6毫升，0.11M，2.0當量)。將混合物在室溫下留置攪拌30分鐘，然后在冰/水中冷卻至<3℃。然后，添加MeOH(30毫升)，接著分次添加NaBH4(4.33克，0.11M，2.04當量)-溫度保持<8℃。在添加完成后30分鐘，將反應物質以二氯甲烷(300毫升)，然后以NaOH(1N，40毫升)稀釋。使所形成的漿液經過硅藻土過濾，并以二氯甲烷(100毫升)洗滌濾餅。在減壓下濃縮所形成的液體，并使殘留物溶于EtOAc(500毫升)中。將此溶液以1N HCl(2 x 400毫升)萃取，然后，使合并的水層以Na2CO3堿化。以EtOAc(4 x 250毫升)萃取，得到透明且無色的有機相，使其以Na2SO4干燥，濃縮，得到白色粉末(24.6克，96％，7:1 d.r.)。然后，將此物質在己烷(670毫升)中配成漿液過夜。通過過濾分離固體，并在減壓下干燥，得到(1R，2S，5R)-2-((3S)-3-芐氧羰基胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-5-(異丙基-甲基-胺基)-環己烷羧酸乙酯6，為白色固體(20.9克，81％，24:1 d.r.)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.37-7.28(m，5H)，5.55(d，J4.5，1H)，5.10(s，2H)，4.42(q，J4.5，1H)，4.23-4.12(m，1H)，4.08(dq，J10.5，7.0，1H)，4.02(dq，J10.5，7.0，1H)，3.84(t，J9.0，1H)，3.46-3.36(m，1H)，3.04(七重峰，J6.5，1H)，2.86-2.80(m，1H)，2.63-2.48(m，2H)，2.17(s，3H，Me)，2.10-1.63(m，7H)，1.22(t，J7.0，3H)，1.00(d，J6.5，3H)，0.97(d，J6.5，3H)。HPLCYMC-Pack Pro C18 5微米4.6 x150毫米，0.01M NH4OAc(MeOH水2080)至0.01M NH4OAc(MeOH:水:MeCN 20:5:75)10至100％ 15分鐘梯度液。8.23(化合物6)，8.88(5-epi-化合物6)。HRMS460.2798[計算值C25H38N3O5 460.2811]。

實施例1，替代步驟9f使氨基酯6(9.76克，2.12毫摩爾)溶于2N HCl(80毫升)中，然后，在惰性氣氛下加熱至～55℃。將反應物攪拌20小時，接著冷卻至室溫。將反應溶液以甲苯(數份25毫升)洗滌兩次，通過添加KOH丸粒中和至pH 6-7，然后，以二氯甲烷(數份100毫升)萃取八次。使合并的萃取液干燥(Na2SO4)，過濾，并在減壓下濃縮至50毫升總體積。接著，在添液漏斗中，將濃溶液慢慢添加至甲基叔丁基醚(300毫升)中，歷經15分鐘，并激烈攪拌。將所形成的白色漿液在環境溫度下攪拌1小時，然后冷卻至0℃，并攪拌1小時。過濾產物，并以甲基叔丁基醚(數份25毫升)洗滌兩次。通過與乙腈(300毫升)共沸蒸餾，移除得自濕濾餅的水。使產物在減壓下干燥，以提供(1R，2S，5R)-2-((3S)-3-芐氧羰基胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-5-(異丙基-甲基-胺基)-環己烷羧酸7(7.69克，84％產率)，為白色泡沫物。1H-NMR(400MHz，50℃，CDCl3)δ7.44-7.32(m，5H)，6.10(br.s，1H)，5.19(app.s，2H)，4.42(dd，J＝15.6，7.8Hz，1H)，4.29-4.23(m，1H)，3.68-3.60(m，2H)，3.33-3.27(m，2H)，3.20(br.s，1H)，2.99(br.s，1H)，2.51(s，3H)，2.49-2.45(m，3H)，2.33-2.31(m，1H)，2.00(ddd，J＝9.0，8.6，3.91H)，1.95-1.78(m，2H)，1.36-1.21(m，6H)。LCMSm/z 432.20[計算值C23H34N3O5 432.25]。

實施例1，替代步驟9g在N2下，使氨基酸7(6.3克，14.7毫摩爾，1.0當量)溶于THF(80毫升)中，并分次添加NaH(584毫克，14.7毫摩爾，1.0當量，在礦油中的60重量％分散液)。當添加完成并且氣體釋放已停止時，使反應物質在減壓下濃縮，并使所形成的固體與甲苯(50毫升)共沸，得到白色固體(KF 0.59重量％)。將此固體在N2下，在甲苯(100毫升)中配成漿液，并加熱至90℃。逐滴添加DPPA(3.32毫升，15.3毫摩爾，1.05當量)，歷經～2分鐘。～5分鐘后，所有固體已溶解，10分鐘后，發現白色固體的沉淀。30分鐘后，HPLC分析顯示完成反應。使反應物質冷卻至室溫，然后過濾，以甲苯洗滌濾餅。接著，將液體在90℃下慢慢添加至AcOH/Ac2O(80/20，168毫升)溶液中。45分鐘后，HPLC仍然顯示一些異氰酸酯。在1.15小時時，使反應物質冷卻至室溫，并以甲苯(100毫升)和水(100毫升)稀釋。移除有機層，再以1N HCl(100毫升)洗滌甲苯。然后，使合并的水相以K2CO3(s)堿化，并以NaOH(10N)達到pH12，保持溫度低于20℃。接著，以二氯甲烷(4 x 150毫升)萃取水層，使合并的有機層以K2CO3干燥，濃縮，得到(S)-1-((1S，2R，4R)-2-乙酰胺基-4-(異丙基(甲基)胺基)環己基)-2-氧代吡咯烷-3-基胺基甲酸芐酯8，為白色泡沫物(4.5克，70％，94AP純度)。1H-NMR與得自上述途徑的物質相同(實施例1，步驟9)。HPLCYMC-Pack Pro C18 5微米4.6 x 150毫米，0.05％ TFA(20％ MeOH，80％ H2O)至0.05％ TFA(20％ MeOH，80％ MeCN)，0-100％ 10分鐘梯度液。7.20分鐘(化合物8)，7.85分鐘(尿素二聚體)。HRMS445.2809[計算值C24H37N4O4 445.2815]。
實施例1的替代制備
實施例1，替代制備，步驟1將(7R，8S)-8-胺基-1，4-二氧-螺[4.5]癸烷-7-羧酸乙酯4-甲苯磺酸鹽1(450.1克)和1-乙基-3-(3-二甲基-胺基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(236.3克)、1-羥基苯并三唑水合物(171.9克)、N-芐氧羰基-L-甲硫胺酸(333.4克)和乙腈(3.1升)合并。在此攪拌的混合物中，在低于30℃下三乙胺(249.5克)添加。在反應完成(HPLC)時，將混合物以乙酸乙酯(8.2升)稀釋，并以25％碳酸氫鉀水溶液(2 x 4.5升)，接著以水(4.5升)洗滌。分離有機相，并在減壓下濃縮，獲得(7R，8S)-8-((S)-2-芐氧羰基胺基-4-甲硫基-丁酰基胺基)-1，4-二氧-螺[4.5]癸烷-7-羧酸乙酯2的溶液(14升)。添加碘化甲烷(2.39公斤)，使容器隔離光線，并使混合物在緩慢攪拌下保持約24小時。在濃稠黃色沉淀物中，添加甲基叔丁基醚(2.7升)，并使混合物保持約1小時。通過過濾分離產物，并將濾餅以甲基叔丁基醚(2 x 1.4升)洗滌，然后在真空下干燥，產生碘化[(S)-3-芐氧基-羰基胺基-3-((7R，8S)-7-乙氧羰基-1，4-二氧-螺[4.5]癸-8-基胺甲酰基)-丙基]-二甲基锍3(671.4克，～94％產率)，為灰白色固體(HPLC純度99.9％)。

實施例1，替代制備，步驟2將锍鹽3(619.4克)和碳酸銫(416.8克)以及無水二甲亞砜(6.2升)在裝有洗氣器的反應器中合并，以中和揮發性硫化物。保持劇烈攪拌，直到獲得完全轉化(HPLC)為止。添加乙酸乙酯(12.4升)，接著添加20％鹽水(3升)。分離有機相，以鹽水(2 x 3升)洗滌兩次，蒸發，獲得(7R，8S)-8-((S)-3-芐氧羰基胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-1，4-二氧-螺[4.5]癸烷-7-羧酸乙酯4在乙酸乙酯中的溶液(～0.8升)。添加丙酮(2.55升)，接著添加0.5M鹽酸水溶液(2.3升)。伴隨著良好混合，將溶液加熱至50到60℃，直到完成4轉化成(1R，2S)-2-((S)-3-芐氧羰基胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-5-氧代-環己烷羧酸乙酯5為止(HPLC)。在低于40℃時，使混合物在減壓下濃縮，冷卻至～30℃，添加水(4.1升)。使所形成的漿液冷卻至5到10℃，并攪拌～1小時。過濾產物，并以水(2 x 2.5升)洗滌濾餅。在脫液時，使濾餅在真空烘箱中，在低于40℃下干燥至恒重，獲得環己酮5(272克，70％產率)(HPLC純度98.7％)。

實施例1，替代制備，步驟3使環己酮5(206克)溶于二氯甲烷(1.1升)中，并裝填至氫化器中。添加四異丙氧化鈦(218.2克)和N-異丙基N-甲胺(63.64克)，并將混合物在環境溫度(23至25℃)下攪拌至少5小時。添加鉑催化劑(5％ Pt/S/C，15克，約7.5％，相對于5)，并在～30psig下進行氫化至少6小時，產生(1R，2S，5R)-2-((S)-3-芐氧羰基胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-5-(異丙基-甲基-胺基)-環己烷羧酸乙酯6及其5-epi-異構物(～7％)的混合物。通過過濾移除催化劑，并使濾液在減壓下濃縮至約～600毫升。添加潮濕乙酸乙酯(～3％水，2.0升)，劇烈攪拌，歷經至少1.5小時期間。持續攪拌至少另外6小時。過濾漿液。將濾餅以乙酸乙酯(1.0升)洗滌，拋棄。使合并的濾液和洗液濃縮至～400毫升。添加甲苯(2.0升)，并以2M鹽酸水溶液(2 x 400毫升)洗滌溶液。使水層溫熱至50°到60℃，歷經約20小時，或6的水解作用被視為完成(HPLC)。添加氫氧化鈉水溶液以調整至pH～10，并以甲苯(3 x 600毫升)萃取混合物。拋棄有機相，并通過添加鹽酸水溶液將pH再調整至～6。使水相在減壓下濃縮至～600毫升，并以二氯甲烷(至少3 x 2.0升)萃取。使合并的二氯甲烷層在減壓下蒸發，并連續以THF置換，獲得(1R，2S，5R)-2-((S)-3-芐氧羰基胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-5-(異丙基-甲基-胺基)-環己烷羧酸7(～148克)在THF(～4升)中的溶液。在低于25℃下添加8的種子晶體，接著添加甲醇鈉(81.24克)在甲醇中的25％溶液。攪拌下使漿液保持至少另外16小時。通過過濾分離產物，并以THF(4 x 200毫升)洗滌濾餅，再在真空中、在低于30℃下干燥至恒重。獲得干燥的(1R，2S，5R)-2-((S)-3-芐氧羰基-胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-5-(異丙基-甲基-胺基)-環己烷-羧酸鈉鹽8(139克，～60％產率，得自5)。

實施例1，替代制備，步驟4將氨基酯鈉鹽8(100克)、磷酸二苯酯(3.86克)、叔-BuOH(1275毫升)和甲苯(225毫升)合并，并在減壓下加熱至回流。收集約500毫升餾出物，拋棄，同時連續以甲苯在叔-BuOH中的溶液置換。移除真空，并將餾出物轉換經過裝滿分子篩的柱子滲濾，及使其返回容器。在干燥完成后，將DPPA(52.4毫升；已溶于60毫升甲苯中)在80℃下慢慢添加至漿液中。在完全轉化(HPLC)時，通過真空蒸餾移除叔-BuOH，并連續以甲苯置換。使混合物冷卻至室溫，并以10％ K2HPO4水溶液(1 x 800毫升，1 x 400毫升)和水(400毫升)洗滌兩次。將有機相加熱，并在真空中濃縮至約270毫升。移除真空，并在約80℃下慢慢添加庚烷(1.1升)，接著添加9的種子晶體(～1克)。使漿液慢慢冷卻至室溫，并將{(S)-1-[(1S，2R，4R)-2-叔丁氧羰基胺基-4-(異丙基-甲基-胺基)-環-己基]-2-氧代-吡咯烷-3-基}-胺基甲酸芐酯9通過過濾分離，為白色固體(86.76克，78％產率)。

實施例1，替代制備，步驟5使胺基甲酸叔丁酯9(50克)溶于甲苯(500毫升)和i-PrOH(150毫升)中。然后，將所形成的溶液加熱至60℃。在低于65℃下添加甲磺酸(19.6毫升)。在反應完成(HPLC)時，使混合物冷卻至室溫，在低于25℃下慢慢添加三乙胺(69.4毫升)。接著，在低于25℃下添加乙酸酐。1小時后，在低于25℃下添加乙酸(250毫升)。拋棄甲苯相，并將2-甲基-THF(500毫升)添加至水相中。將混合物激烈攪拌，并以NaOH(25％水溶液)堿化至pH 12。拋棄水相，并將有機層以鹽水(250毫升)洗滌。在減壓下濃縮有機層，再連續以i-PrOH置換。使溶液冷卻，過濾，以提供在i-PrOH溶液中的{(S)-1-[(1S，2R，4R)-2-乙酰胺基-4-(異丙基-甲基-胺基)-環己基]-2-氧代-吡咯烷-3-基}-胺基甲酸芐酯10，將其直接使用于氫化作用。
實施例1，替代制備，步驟6向含有乙酰胺10(～61克)在i-PrOH(～625毫升)中的溶液中，添加10％ Pd/C潮濕催化劑(2.5克)，并使此懸浮液在30psig和約25℃下氫化至少2小時。在完成(HPLC)時，通過過濾移除催化劑，再使濾液濃縮至約550毫升。添加水(8.8毫升)，接著添加在i-PrOH溶液中的5.6N鹽酸(69.5毫升)。使所形成的漿液在室溫下保持過夜。通過過濾分離產物，并將濾餅以i-PrOH(2 x 100毫升)沖洗，再于～50℃下、在真空中干燥至恒重，得到N-[(1R，2S，5R)-2-((S)-3-胺基-2-氧代-吡咯烷-1-基)-5-(異丙基-甲基-胺基)-環己基]-乙酰胺11(55.6克，97％產率)，為其鹽酸鹽(73.6％游離堿檢測，HPLC)。

實施例1，替代制備，步驟7向在MeCN(400毫升)中的6-三氟甲基-喹唑啉-4-醇12(20.1克)中，添加甲醇鈉在甲醇中的5.5M溶液(17.0毫升)。使所形成的懸浮液在減壓下蒸餾，并連續以MeCN置換，以移除甲醇。在低于50℃下向漿液中添加DMF(1.4克)，接著添加氯化草酰(13.0毫升)。在反應完成(HPLC)時，在減壓下移除過量試劑，得到～400毫升漿液。使混合物冷卻至室溫，并以10％ K2HPO4水溶液(1 x 1.0升，1x0.5升)洗滌，得到約450毫升潮濕MeCN溶液中的4-氯基-6-三氟甲基-喹唑啉13(～21.2克)，將其直接使用于后續偶合反應中(HPLC純度99.8％)。
實施例1，替代制備，步驟8向乙酰胺11(28.5克，HCl鹽，73.6％游離堿檢測)、乙腈(100毫升)、N，N-二-異丙基-N-乙胺(61毫升)的混合物中，在室溫下添加13(～21.2克)在MeCN(～450毫升)中的溶液。使均勻混合物保持過夜。在反應完成(HPLC)時，使混合物在真空中濃縮至約125毫升。添加乙酸的9.5％水溶液(240毫升)，并以二氯甲烷萃取水相。分離水相，添加甲基叔丁基醚(450毫升)，接著添加2N氫氧化鋰水溶液，以調整至pH>11.5。分離有機層，以水洗滌，過濾。將約一半的醚相以甲基叔丁基醚(～250毫升)稀釋，再在真空中濃縮。在低于60℃下慢慢添加庚烷(45毫升)，接著添加實施例1的種子晶體(0.4克)。添加另外的庚烷(125毫升)，并使混合物慢慢冷卻至室溫，使所形成的漿液保持過夜。通過過濾分離產物，將濾餅以庚烷洗滌，再在真空中干燥至恒重，得到N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基胺基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)-喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺14(15.0克，85％產率)。
關于實施例1的結晶操作 實施例1，雙-BSA鹽的制備和純化使得自實施例1步驟11的全部非晶型游離堿溶于甲醇(600毫升)中。將所形成的溶液在60℃下加熱，并添加苯磺酸(2.5當量)。使混合物冷卻至室溫，并通過過濾收集所形成的白色固體，得到標題化合物的雙-苯磺酸鹽(95克，86％)。此物質為>99％純，通過HPLC。使此物質從80/20 EtOH/H2O中通過再結晶進一步純化，其提供不含任何殘留甲醇的鹽。HPLC純度＝99.8％。1H NMR(500MHz，D2O)δppm 8.75(1H，s)，8.66(1H，s)，8.25(1H，d，J＝8.80Hz)，7.90(1H，d，J＝8.80Hz)，7.75(4H，d，J＝8.25Hz)，7.43-7.57(6H，m)，5.42(1H，t)，4.33-4.44(1H，m)，4.09-4.19(1H，m)，3.83-3.91(1H，m)，3.74-3.83(2H，m)，3.61(1H，t，J＝11.55Hz)，2.75(3H，d，J＝6.60Hz)，2.61-2.70(1H，m)，2.31-2.44(1H，m)，2.20-2.27(1H，m)，2.17(2H，d，J＝12.10Hz)，1.94-2.04(1H，m，J＝12.65Hz)，1.90-1.95(3H，m)，1.72-1.91(2H，m)，1.37(3H，d，J＝6.05Hz)，1.29(3H，d，J＝6.60Hz)。差示掃描量熱法使用了10℃/分鐘的加熱速率，并且顯現出熔解/分解吸熱峰，其中開始溫度為297.6℃，而尖峰溫度為299.1℃。
實施例1，游離堿的結晶使N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺的非晶型游離堿的樣品(1克)溶于二氯甲烷(5毫升)中。在溶液中裝入庚烷(30毫升)，然后溫熱以蒸餾二氯甲烷。使溶液冷卻至40℃；沉淀出白色固體。將此懸浮液加熱至90℃，并攪拌2小時。使此懸浮液冷卻至室溫，過濾，得到標題化合物的純游離堿。通過1H-NMR顯現無殘留溶劑。
實施例2 N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺的結晶型 N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺的各種結晶型，包括游離堿與鹽型式及其溶劑合物，是按下述制備和表征的。
表征型式的操作 單晶數據 數據是在Bruker-Nonius(BRUKER AXS公司，5465 East CherylParkway Madison，WI 53711 USA)CAD4序列衍射儀上收集的。單位晶胞參數是經過25個高角度反射的實驗衍射儀設定的最小平方分析獲得的。強度是使用Cu Kα放射(λ＝1.5418

)，在恒溫下，以θ-2θ可變掃描技術測量的，并且僅對Lorentz-極化因子校正。背景計數是在掃描極端處，對一半掃描時間收集的。或者，單晶數據是在Bruker-Nonius KappaCCD 2000系統上，使用Cu Kα放射(λ＝1.5418

)收集的。所測量強度數據的標引(indexing)和處理是以在收集程序套裝中的HKL2000軟件包裝(Otwinowski，Z.& Minor，W.(1997)in Macromolecular Crystallography，eds.Carter，W.C.Jr & Sweet，R.M.(Academic，NY)，Vol.276，pp.307-326)進行(收集數據集與處理使用者界面收集數據集軟件，R.Hooft，Nonius B.V.，1998)。或者，單晶數據是在Bruker-AXS APEX2CCD系統上，使用Cu Kα放射(λ＝1.5418

)收集的。所測量強度數據的標引和處理是以APEX2軟件包裝/程序套裝(APEX2數據收集與處理使用者界面APEX2使用者手冊，v1.27；BRUKER AXS公司，5465 EastCheryl Parkway Madison，WI 53711 USA)進行。
當需要時，晶體是在數據收集期間，在Oxford低溫系統(OxfordCryosystems Cryostream冷卻器J.Cosier與A.M.Glazer，J.Appl.Cryst.，1986，19，105)的冷流體中冷卻的。
結構是通過直接方法解析的，并以所發現的反射為基礎，使用以下的任一種精化(refine)，SDP(SDP，結構測定包裝，Enraf-Nonius，Bohemia NY 11716。散射因子，包括f′與f＂，在SDP軟件中，取自＂國際結晶學表＂，Kynoch出版社，Birmingham，England，1974；第IV卷，表2.2A與2.3.1)包裝軟件，其伴有少許局部修正，或者結晶學包裝MAXUS(maXus解決和精化軟件套裝S.Mackay，C.J.Gilmore，C.Edwards，M.Tremayne，N.Stewart，K.Shankland.maXus關于得自衍射數據或SHELXTL4的晶體結構解決與精化的計算機程序。所導出的原子參數(坐標和溫度因子)是經過全矩陣最小平方精化的。在精化中被降至最少的函數為∑w(|Fo|-|Fc|)2。R定義為∑‖Fo|-|Fc‖/∑|Fo|，而Rw＝[∑w(|Fo|-|Fc|)2/∑w|Fo|2]1/2，其中w為以所發現強度的誤差為基礎的適當的加權函數。差異圖是在所有精化階段下檢驗的。氫是在理想化位置上以均向性溫度因子引進的，但未改變氫參數。
X-射線粉末衍射數據(PXRD) PXRD數據是使用Bruker C2 GADDS獲得的。放射為Cu Kα(40KV，50mA)。樣品-檢測器距離為15厘米。將粉末樣品放置在1毫米或更小直徑的密封玻璃毛細管中；將毛細管在數據收集期間旋轉。收集3≦2θ≦35°的數據，其中樣品曝露時間為至少2000秒。將所形成的二維衍射弧積分，以產生傳規的一維PXRD圖，其在3至35度的2θ的范圍內具有步階大小為0.02度的2θ。將約200毫克裝填至Philips粉末X-射線衍射(PXRD)樣品支持器中。將樣品轉移至Philips MPD單元(45KV，40mA，Cu Kα)中。數據是在室溫下，在2至32的2-θ范圍內收集的(連續掃描模式，掃描速率0.03度/秒，自動發散和抗散射狹縫，接收狹縫0.2毫米，樣品轉子ON) 差示掃描量熱法(DSC) DSC實驗是在TA InstrumentsTM Q1000或2920型中進行的。將樣品(約2-6毫克)在鋁淺盤中稱重，并精確地記錄至百分之一毫克，再轉移至DSC。儀器是用氮氣以50毫升/分鐘吹掃。在10℃/分鐘加熱速率下，在室溫和300℃之間收集數據。圖形是以吸熱峰向下行制成的。
熱重分析(TGA) TGA實驗是在TA InstrumentsTM Q500或2950型中進行的。將樣品(約10-30毫克)置于預先稱量皮重的鉑淺盤中。樣品的重量是通過儀器精確地測量的，并記錄至千分之一毫克。將爐子用氮氣以100毫升/分鐘吹掃。在10℃/分鐘加熱速率下，在室溫和300℃之間收集數據。
型式的制備與分析 這些實施例的單位晶胞數據和其它性質呈現于表1中。單位晶胞參數得自單晶X-射線結晶學分析。單位晶胞的詳細說明可參閱Stout &Jensen，X-Ray Structure Determinationa Practical Guide，(MacMillian，1968)的第3章。
實施例2a、b、c、d、e、f、g和h的部分原子坐標分別呈現于表2、3、4、5、6、7、8和9中。
此外，實施例2a、b、d、e、f、g的h的特性粉末X-射線衍射吸收峰位置(度2θ±0.1)@RT呈現于表10中。其全部均以高質量圖為基礎，以衍射儀(Cu Kα)收集，使用旋轉毛細管，其中2θ是用NIST其它適當標準校準的。
最后，圖1、2、3、4、5、6和7分別呈現了實施例2a、b、d、e、f、g和h的XRPD圖。圖8和9分別揭示實施例2a的DSC和TGA分析，而圖10、11和12分別揭示實施例2f的DSC、TGA和水份吸著等溫線波譜。
型式制備、XRD、DSC和TGA表征 實施例2a，N-1型式，二苯磺酸鹽 使N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺二-苯磺酸鹽從乙酸乙酯、乙醇、甲醇和丙酮中結晶。型式N-1二苯磺酸鹽為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺二-苯磺酸鹽的不含溶劑(無水或溶劑的分子)型式。型式N-1二苯磺酸鹽的特征為XRD圖，該XRD圖符合由單晶結構數據所產生的模擬圖。型式N-1二苯磺酸鹽的特征為DSC熱分析圖，其具有熔解/分解吸熱峰，該吸熱峰通常在約296℃下開始。型式N-1二苯磺酸鹽的特征為TGA熱曲線，其在達到約280℃下具有可忽略的重量損失(與非溶劑化型式一致)。
實施例2b，DC-1型式 使N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(約0.5克)的油狀類凝膠(非晶型)游離堿的樣品，在BSA鹽的樣品萃取后，溶解于二氯甲烷(約3毫升)中。在此溶液中，添加約5毫升庚烷，并將所形成的油狀混合物在開口燒杯中、在20-25℃下通過磁攪拌棒激烈攪拌。蒸發溶劑后，獲得白色固體。使固體再懸浮于約5毫升庚烷和0.2毫升二氯甲烷的混合物中，并在25℃下攪拌7天。過濾所形成的漿液，風干，以提供N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，型式DC-1。型式DC-1的特征為每摩爾N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿有一摩爾二氯甲烷。型式DC-1的特征為XRD圖，其符合由單晶結構數據所產生的模擬圖。
實施例2c，THOO-1型式 使N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，游離堿，1毫克，溶解于80微升THF中。將溶劑通過Speed-vac(Speed Vac Plus，SC250DDA，Savant/熱電子公司)在高真空和22℃下歷經16小時移除。將總共100微升MIBK/庚烷(1/2體積比)添加至此孔中。在環境溫度(20-25℃)下保持2周后，在此孔中發現結晶。型式THOO的特征為每一摩爾N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿有一摩爾THF。
實施例2d，E-1型式 使N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿，由乙醇和庚烷的溶液結晶。型式E-1的特征為每一摩爾N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿有一摩爾乙醇。型式E-1的特征為XRD圖，其符合由單晶結構數據所產生的模擬圖。
實施例2e，A-1型式 使N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿以超過150毫克/毫升的濃度懸浮丙酮中。使此懸浮液在室溫下達到平衡，以提供稍微稀的懸浮液。過濾一部分此懸浮液，并將濾液與此懸浮液兩者在5℃下冷凍，以提供單丙酮溶劑合物的結晶(A-1)。型式A-1的特征為每一摩爾N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿有一摩爾丙酮。型式A-1游離堿的特征為XRD圖，其符合由單晶結構數據所產生的模擬圖。
實施例2f，N-2型式 使從BSA鹽樣品中萃取的N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺的油狀似凝膠(非晶型)游離堿樣品(約0.5克)懸浮于庚烷(約5毫升)中。將燒瓶以金屬刮勺刮搔，并將此懸浮液于25℃下通過磁攪拌棒激烈攪拌。攪拌24小時后，獲得結晶性粒子的白色漿液。過濾漿液，并使濕濾餅在真空中干燥(40℃)，以提供游離堿的純N-2型式(通過PXRD確認)。型式N-2的特征為XRD圖，其符合由單晶結構數據所產生的模擬圖。型式N-2為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的不含溶劑(無溶劑合物分子，或無水或溶劑的分子)型式。型式N-2的特征為DSC熱分析圖，其具有通常開始于約158℃至約162℃的熔解吸熱峰。型式N-2的特征為TGA熱曲線在達到約145℃下具有可忽略的重量損失，其與單晶結構數據一致。重量損失系符合外來溶劑。水份吸著等溫線的特征為在約25％至約75％ RH的范圍內、在25℃下重量增加0.15％，這表示N-2型式為輕微吸濕性(我陳述為極輕微或非吸濕性)。
實施例2g，型式AN-3 將N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿的懸浮液以～200毫克/毫升制備于乙腈中，并使其在室溫下達到平衡，以提供稍微稀的懸浮液。過濾一部分此懸浮液，并使濾液與此懸浮液兩者在5℃下冷凍，以提供乙腈溶劑合物的結晶(AN-3)。型式AN-3的特征為每一摩爾N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺游離堿有一摩爾乙腈。型式AN-3的特征為XRD圖，其符合由單晶結構數據所產生的模擬圖。
實施例2h，型式H4-1，HCl 使N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺的游離堿的樣品(約0.2克)溶于乙醇(約1毫升)中。向該游離堿溶液中添加約310微升在乙醇中的HCl溶液(約1.25M濃度)。將此溶液以少量HCl鹽的結晶漿液接種。向所形成的混濁溶液中添加3毫升庚烷。在20-25℃下攪拌的同時，歷經1-2小時逐漸形成白色漿液。將漿液在20℃下再攪拌12小時，過濾，并以庚烷洗滌。使濕濾餅在真空中干燥(40℃)，以提供HCl鹽四水合物，型式H4-1，HCl。型式H4-1，HCl的特征為每摩爾N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺鹽酸鹽具有4摩爾水。型式H4-1，HCl鹽四水合物的特征為SRD圖，其符合由單晶結構數據所產生的模擬圖。
表1 單位晶胞參數
表1(續) 單位晶胞參數 表1中使用的變量定義如下 T＝結晶學數據的攝氏溫度(RT為室溫，其為約+22℃) V＝單位晶胞的體積 Z′＝每不對稱單位的藥物分子數目 Vm＝V(單位晶胞)/(每晶胞的Z藥物分子) sg＝空間群 dcalc＝計算的晶體密度 表2 實施例2a型式N-1，二苯磺酸鹽的原子坐標 表3 實施例2b，型式DC-1的原子坐標 表4 實施例2c，型式THOO-1的原子坐標 表5 實施例2d，型式E-1的原子坐標 表6 實施例2e，型式A-1的原子坐標 表7 實施例2f，型式N-2原子坐標 表8 實施例2g，型式AN-3原子坐標 表9 實施例2h，型式H4-1，HC1原子坐標 表10 關于實施例2a、b、d、e、f、g和h的特性粉末x-射線衍射吸收峰位置(度2θ±0.1@＠RT，以高質量圖為基礎，以衍射儀(Cu Kα)收集，使用旋轉毛細管，其中2θ以NIST其它適當標準作校準。
比較藥理學特性 將實施例1與WO2005021500(相當于美國專利號7,163,937，授予本案申請人)中所發現化合物的藥理學特性作比較的檢測和數據提供于下文。
人類末梢血液單核細胞結合(＂CCR2結合＂) 還參閱Yoshimura，et al.，J.Immunol.1990，145，292。人類CCR2結合檢測是以人類末梢血液單核細胞(hPBMC)，使用125I-人類MCP-1作為示蹤劑配位體而建立的。hPBMC使用具有Ficoll-Hypaque(MediatechCellgro)的標準方案從人類leukopak(Biological Specialty公司)中分離的。將分離的hPBMC洗滌，并在結合緩沖劑(RPMI-1640，0.1％ BSA，20mM Hepes，pH 7.4)中稀釋至1 x 107/毫升。將125I-MCP-1(NEN/PerkElmer)在結合緩沖劑中稀釋至0.45nM。在結合緩沖劑中，將化合物在結合檢測中所用最終濃度的3-倍下稀釋。結合檢測使用96-孔濾板(Millipore)進行。總125I-MCP-1結合按下述評估在總體積為150微升的各反應物中，添加5 x 105個細胞、0.15nM125I-MCP-1和使最終濃度范圍為0至100nM的化合物。使板在室溫下培養30分鐘，接著使用真空歧管過濾(Millipore)，以RPMI-1640，0.1％ BSA，0.4M NaCl，20mM Hepes，pH7.4三次洗滌。洗滌后，使板在室溫下風干60分鐘。接著添加25微升Microscint20至各孔中。將板密封，并在Trilux上計數1分鐘。非特異性結合是在300nM冷MCP-1(PeproTech公司)存在下測定的。特異性125I-MCP-1以全部和非特異性結合間的差異計算。所有條件均重復測試。IC50定義為降低特異性結合達50％所需競爭化合物的濃度。
hERG通量 使穩定地表達hERG通道的HEK293細胞在培養器上，在經補充10％Sigma牛胎兒血清、非必須氨基酸、2mM L-谷氨酰胺和500微克/毫升G418的Dulbecco氏改良Eagle氏培養基中生長(37℃，5％ CO2)。使用細胞分解緩沖劑從燒瓶中萃取細胞，然后將其以每孔(20微升)2 x 104個細胞的密度，在10％血清培養基中，覆蓋至384-孔Corning聚-D-離胺酸涂覆的黑色/透明板中，并在37℃下，在5％ CO2培養器中培養15-24小時，直到獲得細胞的融合單層為止。
BTC-AM染料(Molecular Probes，Eugene，OR)的2mM儲備液是在100％ DMSO中制成的，然后在檢測當天，以1:1添加至DMSO中的10％(w/v)普朗尼克(pluronic)酸內。然后，將染料在hERG外部EP緩沖劑(140mM NaCl，4.0mM KCl，1.8mM CaCl2，1.0mM MgCl2，10mM HEPES，pH7.3和10mM葡萄糖；所有緩沖劑成份均得自Sigma化學公司)中稀釋。將此BTC染料混合物(30微升)添加至細胞中，并產生2.5μM的最終裝填濃度。使細胞在21℃下培養45分鐘。
將待測化合物以60微升稀釋至10mM DMSO。然后在1:2比例下，在DMSO中，在384-孔板的行1-10和11-20內，連續地稀釋這些化合物。預備檢測板是通過從DMSO連續地經稀釋板點取2.5微升而產生的，其是在Velocity 11 BioCel上制成的。含水板是通過添加48微升EP緩沖劑而產生的，然后稀釋30-45分鐘，接著在FLIPR上讀取檢測。在染料裝填后，將稀化合物水溶液添加至三個重復板(10微升)的細胞中，產生80μM至0.156nM的十點濃度范圍。檢測中的最后DMSO濃度為1％。制備預備檢測含水板，并在Cybio液體處理器上稀釋。
裝填染料的細胞是在FLIPR384(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上讀取，其使用氬激光的488nm線激發染料。發射光使用540±30nm帶通道濾波器過濾。hERG通道是通過添加含有66mM K2SO4和1.3mMTl2SO4(Sigma/Aldrich)的20微升/孔EP緩沖劑刺激而開啟的。對于各板，每秒收集數據，歷經12秒期間，此時添加含Tl+的刺激緩沖劑。每秒進行數據收集，歷經48秒，然后每三秒持續進行另外的2分鐘。
檢測的動態范圍是從空白試驗與總體試驗孔測定的。總體試驗孔(行21和22)確定板(還存在待測化合物)的最大hERG活化作用，而空白試驗孔(行23和24)確定100％ hERG抑制。空白試驗孔含有400nM的標準hERG抑制劑多非利特(dofetilide)(Ficker，et al.，1998)或E-4031的任一種。首先將各樣品孔中的原始數據點校正細胞/信號偏差、陰性對照組(空白試驗)背景，并使用在線FLIPR軟件對陽性對照組(總體試驗)作標準化。然后，使用Excel Fit(ID Business Solutions有限公司，Surrey，UK)，以單側邏輯方程式(Y＝A+((B-A)/1+((C/X)∧D)))，其中A＝最大抑制)對hERG Tl+通量數據的待測化合物濃度應答曲線進行擬合。通過將待測化合物在給定條件下對Tl+通量的熒光最高變化幅度進行擬合來分析數據。化合物的效能(IC50值)是由自三份重復孔的平均值計算的。
鈉通道，位置2結合檢測 還參閱W.A.Catterall，et al.，J.Biol.Chem.1981，256，8922。標準結合緩沖劑含有50mM HEPES、50mM Tris-HCl，pH 7.4、130mM氯化膽堿、5.4mM KCl、0.8mM MgCl2、5.5mM葡萄糖、40微克/毫升LqT。通過將突觸體(由Wistar大鼠腦部制得)添加至反應混合物中而啟動結合反應，該反應混合物中含有在標準結合緩沖劑中的5nM[3H]-蝦膜毒素以及所需濃度的待測化合物。然后將樣品混合，并在37℃下培養60分鐘。通過添加含有50mM HEPES、50mM Tris-HCl，pH 7.4、1.8mM CaCl2、0.8mM MgCl2和1毫克/毫升牛血清白蛋白的冰冷洗滌緩沖劑而使反應停止。立即將突觸體收集至玻璃纖維濾器上，并用洗滌緩沖劑洗滌3次。殘留在濾器上的[3H]-蝦膜毒素的放射活性是使用液體閃爍分光計計數的。
平行人工膜滲透性檢測(PAMPA) 平行人工膜滲透性檢測(PAMPA)包括稱為胃腸道(GIT)脂質的特殊調配的卵磷脂為基料的脂質組合。使用該GIT脂質，以便在類似于Caco-2檢測中所使用的夾層板組裝中形成膜。當通過已知會被動地吸收到人中的標準化合物測量時，GIT脂質非常類似于體內的膜組合物和性能。PAMPA被廣泛地用作發現化合物滲透性篩選的體外模型。將化合物經過PAMPA膜的通過的速率用于測定滲透系數(Pc)，其可能與化合物的體內被動滲透性有關。
特定化合物的滲透系數(Pc)是在具有頂端以及底外側pH為7.4的pH依賴性環境中檢驗的。所有實驗均是在三份重復測定中進行的。
將化合物(在100％ DMSO中的10mM儲備液)在pH7.4供體孔緩沖劑(pION目錄#110151)中以1:100稀釋，得到在1％ DMSO中的100μM檢測溶液。將在供體孔緩沖劑中稀釋的化合物轉移至Whatman單濾器板中，并在將200微升分配到檢測板(pION目錄#110163)的供體孔中之前過濾。通過將4微升脂質溶液(pION目錄#110169)吸取到濾板(VWR目錄#13503)上而形成PAMPA膜。然后，將該膜用pH 7.4的200微升受體孔緩沖劑(pION目錄#110139)覆蓋。合并PAMPA檢測板(供體側和受體側)，并使其在室溫下培養4小時。接著將板拆開，并將分光光度計板(VWR目錄#655801)填充(150微升/孔)。供體、受體、參比和空白試驗板是在SpectraMax UV板讀取器中讀取的。通過pION軟件捕獲數據，該軟件分析光譜并產生Pc值。
CCR2趨化性 人類CCR2趨化性檢測是使用人類單核血球細胞系THP-1進行的。在37℃下，在不含酚紅、不含BSA的RPMI-1640(pH 7.4)中，首先將THP-1細胞用熒光染料鈣黃綠素-AM標記30分鐘，同時每15分鐘輕輕混合。然后洗滌標識的細胞，并以1 x 105/毫升再懸浮于趨化性緩沖劑(不含酚紅的RPMI-1640，0.1％ BSA，pH 7.4)中。將待測化合物在趨化性緩沖劑中稀釋，以致使最終檢測濃度范圍為0.01nM至1μM。將配位體MCP-1(PeproTech公司)在趨化性緩沖劑中稀釋至20nM。為進行此檢測，將等體積的待測化合物稀釋液與等體積的標識的THP-1細胞混合(混合物1)，并將等體積的待測化合物稀釋液與等體積的稀MCP-1配位體混合(混合物2)。使兩種混合物獨立地在37℃下培養10分鐘，接著輕輕混合。然后在趨化性板(Becton Dickinson)中，通過將50微升混合物1置于頂部室中并將225微升混合物2置于底部室中來測定MCP-1-誘導的趨化性。將板用蓋子覆蓋，并在37℃下培養30分鐘。30分鐘后，在Cytofluor上讀板。所有條件均重復測試。對于信號對噪聲的測定，將單獨50微升標識的THP-1細胞(5 x 104/孔)置于頂部室中，并將單獨225微升配位體MCP-1置于底部室中(最終濃度為10nM)。通過待測化合物的分級濃度所達到的抑制作用是以不含化合物的MCP-1對照組的百分比計算的。IC50被定義為達到細胞趨化性的50％抑制作用所需要待測化合物的濃度。
hERG貼片夾持 將全細胞貼片夾持用于直接測量在穩定地表達克隆的hERG鉀通道α亞單位的HEK-293細胞中的hERG電流。在室溫下、在pH 7.4的緩沖水溶液中測試化合物。從-80mV至+20mV的保持電位施加重復性試驗脈沖(0.05Hz)達2秒，再在試驗脈沖之后通過使電壓步至-65mV而引出尾電流。通過測量尖峰尾電流的抑制來計算化合物的作用。
鈉通道貼片夾持 將全細胞貼片夾持用于直接測量在表達人類心臟鈉通道SCN5A的HEK-293細胞中向內鈉電流。在不含蛋白質的緩沖水溶液中測試化合物。為了測定穩定狀態的抑制作用，使用下述電壓方案每5秒引出鈉電流將細胞保持在-90mV的電位下，并經歷60毫秒步至-20mV。在試驗脈沖至-20mV期間，通過測量峰電流的抑制來計算其作用。通過在1Hz和4Hz頻率下的刺激來評估抑制的速率依賴性。
大鼠的單一劑量藥物動力學 將雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300克)用于藥物動力學研究。在經口服藥之前使大鼠禁食過夜，并在服藥后4小時喂食。從頸靜脈收集血液樣品(～0.3毫升)至含K2EDTA的管中，然后在4℃下離心(1500-2000xg)，以獲得血漿。在口服生物利用率研究中，使2組動物(每組N＝2-3)接受待測化合物，無論是通過通過頸靜脈以靜脈內(IV)灌注(歷經10分鐘)或者通過口腔灌食法。在服藥后0.17(僅針對IV)、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8和24小時時獲得序列血液樣品。將通過在4℃下離心(1500-2000xg)獲得的血漿樣品在-20℃下儲存，直到通過LC/MS/MS分析。
猴的單一劑量藥物動力學 在雄性獼猴屬猴中以交叉設計評估各種待測化合物的藥物動力學。在經口服藥之前使猴子禁食過夜，并在服藥后4小時喂食。使一組1-3只動物(3至5公斤)通過股靜脈經IV灌注(歷經10分鐘)以及通過口腔灌食法接受化合物，各治療之間清洗1周。在服藥后0.17(僅IV)、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8和24小時時，從股動脈收集序列血液樣品(～0.3毫升)，并在4℃下離心(1500-2000xg)，以獲得血漿。將樣品在-20℃下儲存，直到通過LC/MS/MS分析。
藥物動力學檢測的數據分析 藥物動力學參數是通過血漿濃度對時間數據的非隔室分析法(KINETICATM軟件，4.2版，InnaPhase公司，Philadelphia，PA)獲得的。峰濃度(Cmax)與Cmax的時間是直接由實驗觀察記錄的。從零時間至最后取樣時間的曲線下面積(AUC(0-T))是使用線性和對數梯形總和的組合計算得到的。總血漿清除率(CLTp)、分布的穩態體積(Vss)、表觀清除半生期(T1/2)和平均滯留時間(MRT)是在靜脈內施用后估計的。T1/2的估計是使用具有可計量濃度的3個時間點的最小值施行的。絕對口服生物利用率(F)是以口服和IV劑量后的劑量標準化AUC值的比例估計的。
當在上述檢測中測量時，發現下文各化合物的數據。
表11.比較體外數據 表12a.其它比較體外數據 表12b.在大鼠中的比較體內藥物動力學數據 表12c.在猴中的比較體內藥物動力學數據 實用性 使用本領域技術人員已知的檢測，證實實施例的代表性化合物為趨化因子受體活性的調節劑。在本部分中，我們描述了這些檢測法并且給予其文獻參考資料。更多的檢測被描述于本文前述標題為＂比較藥理學特性＂的部分中。由于在這些MCP-1拮抗作用的檢測中顯現活性，因此預期實施例的化合物可用于治療與趨化因子及其同源受體有關的人類疾病。當在特定檢測中測量時，在這些檢測中活性的定義為在濃度上證實IC50為30μM或較低的化合物。
MCP-1結合至人類PBMC的拮抗作用 (Yoshimura，et al.，J.Immunol.1990，145，292) 在此處描述的MCP-1結合至人類PBMC(人類末梢血液單核細胞)的拮抗作用中，實施例中描述的至少一種化合物具有活性。
將微孔濾器板(#MABVN1250)用100微升結合緩沖劑(0.5％牛血清白蛋白；20mM HEPES緩沖劑和5mM氯化鎂在RPMI 1640培養基中)，在室溫下處理三十分鐘。為了測量結合作用，將50微升結合緩沖劑(使用或未使用已知濃度的化合物)與50微升的125-I標識的人類MCP-1(以獲得最終濃度為150pM放射配位體)以及含有5 x 105個細胞的50微升結合緩沖劑合并。用于此結合檢測的細胞可包括通過Ficoll-Hypaque梯度離心所分離的人類末梢血液單核細胞、人類單細胞(Weiner，et al.，J.Immunol.Methods.1980，36，89)或者表達內源受體的THP-1細胞系。將化合物、細胞和放射配位體的混合物在室溫下培養三十分鐘。將板置于真空歧管上，施加真空，再將板用含有0.5M NaCl的結合緩沖劑洗滌三次。將塑料邊緣從板上移除，使板風干，將孔穿孔，計數。結合的百分抑制是使用不存在任何競爭化合物獲得的總計數以及通過添加100nM MCP-1替代待測化合物所測得的背景結合而計算得到的。
MCP-1-誘導的鈣流入量的拮抗作用 (Sullivan，et al.，Methods Mot.Biol.，114，125-133(1999) 在此處描述的MCP-1-誘導的鈣流入量檢測的拮抗作用中，實施例中描述的至少一種化合物具有活性。
鈣移動系使用熒光Ca2+指示劑染料Fluo-3測量的。在37℃下使細胞以8 x 105個細胞/毫升在磷酸鹽緩沖鹽水中培養60分鐘，該磷酸鹽緩沖鹽水含有0.1％牛血清白蛋白、20mM HEPES緩沖劑、5mM葡萄糖、1％牛胎兒血清、4μM Fluo-3 AM和2.5mM羧苯磺胺。用于此種鈣檢測的細胞可包括如由Weiner，et al.，J.Immunol.Methods，36，89-97(1980)所述分離的人類單細胞或者表達內源CCR2受體例如THP-1與MonoMac-6的細胞系。然后，將細胞在含有0.1％牛血清白蛋白、20mMHEPES、5mM葡萄糖和2.5mM羧苯磺胺的磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌三次。以最終濃度2-4 x 106個細胞/毫升使細胞再懸浮于含有0.5％牛血清白蛋白、20mM HEPES和2.5mM羧苯磺胺的磷酸鹽緩沖鹽水中。將細胞覆蓋于96-孔黑色壁微板(100微升/孔)中，并使板在200xg下離心5分鐘。將不同濃度的化合物添加至孔(50微升/孔)中，再在5分鐘后添加50微升/孔的MCP-1，得到10nM的最終濃度。利用熒光成像板讀取器檢測鈣移動。以氬激光(488nM)使細胞單層激發，并測量細胞結合的熒光達3分鐘(對前90秒為每秒鐘，而對后90秒為每10秒鐘)。數據系以任意熒光單位產生，而對各孔的熒光改變是以最高-最低差別測得的。化合物依賴性的抑制是相對于單獨MCP-1的應答計算得到的。
MCP-1-誘導的人類PBMC趨化性的拮抗作用 (Bacon，et al.，Brit.J.Pharmacol.1988，95，966) 在此處描述的MCP-1-誘導的人類PBMC趨化性檢測的拮抗作用中，實施例中描述的至少一種化合物具有活性。
將Neuroprobe MBA96-96-孔趨化室、Polyfiltronics MPC 96孔板和Neuroprobe不含聚乙烯基吡咯烷酮的聚碳酸酯PFD58-微米濾器在37℃培養器中溫熱。使剛通過標準聚蔗糖密度分離方法分離的人類末梢血液單核細胞(PBMC)(Boyum，et al.，Scand.J.Clin.LabInvest.Suppl.1968，97，31)以1 x 107c/毫升懸浮于DMEM中，并在37℃下溫熱。還將人類MCP-1的60nM溶液在37℃下溫熱。待測化合物的稀釋液是在DMEM中以所需濃度的2x制成的。將PBMC懸浮液與60nm MCP-1溶液以1:1混合在具有預先溫熱的DMEM的聚丙烯管中，使用或未使用待測化合物的稀釋液。使這些混合物在37℃管溫熱器中溫熱。為了開始檢測，將MCP-1/化合物混合物添加至Polyfiltronics MPC 96孔板的孔中，該板已被置于Neuroprobe趨化室的底部中。各孔的大約體積為400微升，并且在分配后應為正彎月面。將8微米濾器輕輕地置于96孔板的頂部，使橡膠墊片連接至上方室的底部，并將該室組裝在一起。將200微升體積的細胞懸浮液/化合物混合物添加至上方室的適當孔中。將上方室以板封閉器覆蓋，并將組裝好的單元置于37℃培養器中45分鐘。培養后，移除板封閉器，并吸出所有殘留細胞懸浮液。將此室拆開，并輕輕地移除濾器。在將濾器保持為90度角時，使用磷酸鹽緩沖鹽水的溫和液流，洗離未遷移的細胞，并將濾器頂部用橡膠刮板的尖端擦拭。再重復此洗滌兩次。使濾器風干，然后完全浸沒在Wright Geimsa著色料中45秒。通過浸泡在蒸餾水中7分鐘，洗滌濾器，然后在剛蒸餾的水中再洗滌15秒。使濾器再一次風干。通過目視顯微鏡法對濾器上的遷移的細胞定量。
哺乳動物趨化因子受體提供用于干擾或促進哺乳動物(例如人類)中免疫細胞功能的靶標。抑制或促進趨化因子受體功能的化合物特別可用于為提供治療目的而調節免疫細胞功能。因此，本發明涉及可用于預防和/或治療極多種炎性、傳染性和免疫調節病癥和疾病的化合物，該病癥和疾病包括哮喘和過敏性疾病，被致病微生物(其通過定義系包括病毒)感染，以及自身免疫病理學疾病，例如風濕性關節炎和動脈粥樣硬化。
例如，可施用抑制哺乳動物趨化因子受體(例如人類趨化因子受體)的一種或多種功能的本發明化合物，以抑制(意即降低或防止)發炎或傳染病。結果，一種或多種炎性過程，例如白血球遷移、粘附、趨化性、胞裂外排(例如酶、組胺的胞裂外排)或炎性介質釋放，均被抑制。
同樣地，施用促進哺乳動物趨化因子受體(例如人類趨化因子)的一種或多種功能的本發明化合物，以刺激(誘發或增強)免疫或炎性應答，例如白血球游出、粘附、趨化性、胞裂外排(例如酶、組胺的胞裂外排)或炎性介質釋放，導致炎性過程的有利刺激。例如，可添補嗜酸性細胞以對抗寄生蟲感染。此外，如果人們意欲遞送足量化合物以通過誘導趨化因子受體內部化作用而造成細胞中受體表達的損失，或者以造成細胞遷移的方向錯誤的方式遞送化合物，則前述炎性、過敏性和自身免疫疾病的治療也可考慮在本發明的化合物中，其會促進哺乳動物趨化因子受體的一種或多種功能。
除了靈長類動物例如人類之外，多種其它哺乳動物也可根據本發明的方法進行治療。例如，可以治療哺乳動物，包括但不限于乳牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、天竺鼠、大鼠，或其它牛、羊、馬、犬、貓科動物、嚙齒動物或小鼠物種。但是，此方法還可實施在其它物種上，例如鳥類物種。在上述方法中治療的受試者是想要在其中調節趨化因子受體活性的雄性或雌性哺乳動物。本文中使用的＂調節＂意欲涵蓋拮抗作用、激動作用、部分拮抗作用和/或部分激動作用。
CCR5結合與功能性檢測 細胞衍生與細胞培養物穩定地表達內源CC趨化因子受體5(CCR5)的HT1080細胞庫是使用由Harrington、Sherf和Rundlett所概述的方法發育的(參閱美國專利US 6,361,972和US 6,410,266)。最高表達的克隆是使用重復性流動細胞計數法分離的，接著亞克隆。然后，將這些細胞以3 x 105個細胞/孔在6-孔培養皿中培養，并以含有嵌合HA-標記的G蛋白質Gqi5的DNA載體轉染(分子裝置；得自酶的15微升Ex-Gen中的5微克線性化載體DNA被用于該轉染)。轉染后兩天，將孔合并，并覆蓋至P100板中。覆蓋后七天，選取菌落，展開，并通過蛋白質印跡法(Western blot)分析Gqi5含量。選擇具有Gqi5(得自轉染)和CCR5(內源)的高度表達的克隆(稱為3559.1.6)，并使用于下文所述的實驗。在37℃和5％ CO2下、在增濕氣氛中，用經補充10％滲析的牛胎兒血清、2％青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺和500微克/毫升潮霉素B(最終濃度)的α-MEM培養HT1080細胞(克隆3559.1.6)。
膜制劑使含有1 x 108個HT1080細胞(克隆3559.1.6)的細胞丸粒再懸浮于5毫升冰冷膜制備緩沖劑(50mM HEPES，5mM MgCl2，1mMCaCl2)中，再在冰中、在Polytron均化器上高速均化20秒。將勻漿物用另外25毫升膜制備緩沖劑稀釋，再離心12分鐘(48,000xg，在4℃下)。在如前述再均化之前，使細胞丸粒再懸浮于5毫升膜制備緩沖劑中。將勻漿以5毫升細胞膜制備緩沖劑稀釋，并檢測CCR5蛋白質濃度。
結合檢測將得自上述膜制劑的剛制成的勻漿物在結合緩沖劑(50mM HEPES，5mM MgCl2，1mM CaCl2，0.1％ BSA；檢測前添加一份完全蛋白酶抑制劑片劑)中稀釋，以達到10微克/孔的最后蛋白質濃度(得自Corning公司的固體白色96-孔板)。將此膜制劑與WGA-SPA珠粒(Amerhsam；預先浸泡于結合緩沖劑中)混合，以獲得200微克/孔的濃度。然后，將膜/SPA珠粒混合物(100微升/孔)添加至板中，該板已用2微升含有不同濃度待測物的DMSO預加斑點(對于陰性對照組為純DMSO；對于待測對象為不同濃度的本發明實施例；500nM MIP-1β作為陽性對照組)。結合檢測是通過添加50微升[125I]-MIP-1β(PerkinElmer；將物質在結合緩沖劑中稀釋，以致添加50微升/孔獲得0.1nM[125I]-MIP-1β的最終濃度)誘發。將板密封，使其在室溫下靜置4-6小時，然后在PackardTopCount上計數。計算待測對象的百分結合，使用陰性和陽性對照組以確定各實驗的窗口。
熒光計成像板讀取器(FLIPR)-為基礎的功能性檢測將HT1080細胞(克隆3559.1.6)以10,000個細胞/孔(30微升)覆蓋于384-孔板(黑色/透明底部Biocoat PDL，Beckton Dickinson)中，并裝填30微升/孔的Fluro-4AM熒光染料(通過將1毫克Fluro-4 AM溶解于440微升DMSO中，并在用10毫升Hanks緩沖劑進一步稀釋之前，用100微升普朗尼克(pluronic)溶液稀釋而制成)。將細胞在洗滌三次之前，在37℃和5％ CO2下培養30分鐘，開懸浮于檢測緩沖液(20mM HEPES，1.2mM CaCl2，5mM MgCl2，2.5毫米羧苯磺胺(probenecid)，0.5％ BSA，1x Hanks)中。將待測對象在DMSO中連續稀釋，然后在添加至細胞(10微升/孔)中之前，用檢測緩沖液1:10稀釋。使用FLIPR，讀取板的通量誘發(意即激動劑活性)(10-70秒)。接著將細胞用激動劑溶液(30微升/孔；通過將30微升的100微摩爾濃度MIP-1β稀釋在100毫升檢測緩沖液中而制成；此方案在此檢測中給予5nM MIP-1β的最終濃度)進一步裝填，再使用FLIPR讀取板達一分鐘。相對于0.4％ DMSO/緩沖劑陰性對照組測定待測對象的拮抗劑活性。
可以用趨化因子受體功能抑制劑治療的人類或其它物種的疾病或癥狀，包括但不限于炎性或過敏性疾病和癥狀，包括呼吸過敏性疾病，例如哮喘、過敏性鼻炎、過敏性肺病、過敏性肺炎、嗜酸性蜂窩組織炎(例如Well氏綜合征)、嗜酸細胞性肺炎(例如Loeffler氏綜合征、慢性嗜酸細胞性肺炎)、嗜酸細胞性筋膜炎(例如Shulman氏綜合征)、延遲型過敏、組織間隙肺臟疾病(ILD)(例如特發性肺纖維變性或與ILD有關的風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、關節粘附脊椎炎、系統性硬化、Sjogren氏綜合征、多肌炎或皮肌炎)；全身過敏或過敏性應答、藥物過敏反應(例如對青霉素、頭孢菌素類)、由于攝食受污染色氨酸所引發的嗜酸細胞增多性肌痛綜合征、昆蟲螫傷過敏反應；自身免疫疾病，例如風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、青少年型糖尿病；腎小球性腎炎、自身免疫性甲狀腺炎、Behcet氏疾病；移植排斥(例如在移植時)，包括同種異體移植排斥或移植物-對-宿主疾病；炎性腸疾病，例如克羅恩氏病與潰瘍性結腸炎；脊椎關節病；硬皮病；牛皮癬(包括T-細胞介導的牛皮癬)，以及炎性皮膚病，例如皮炎、濕疹、異位性皮炎、過敏性接觸性皮膚炎、蕁麻疹；血管炎(例如壞死性、皮膚和過敏性血管炎)；嗜酸細胞性肌炎、嗜酸細胞性筋膜炎；伴有皮膚或器官的白血球浸入的癌癥。可以治療其中不想要的炎性應答期望被抑制的其它疾病或癥狀，其包括但不限于血管炎、易受傷害性斑塊、靜脈新血管內膜增生再灌注損傷、滲析-移植物新血管內膜增生、動脈-靜脈旁路血管內膜增生、動脈粥樣硬化、某些血液學惡性病癥、細胞因子誘導的毒性(例如敗血性休克、內毒素休克)、多肌炎、皮肌炎。人類或其它物種中可以用趨化因子受體功能抑制劑治療的傳染性疾病或癥狀包括但不限于HIV。
可以用趨化因子受體功能的抑制劑治療的人類或其它物種的疾病或癥狀，包括但不限于免疫抑制，例如在具有免疫缺陷綜合征的個體中的免疫抑制，例如AIDS或其它病毒感染，進行放射療法、化學療法，對于自身免疫疾病的療法或藥物療法(例如皮質類固醇療法)的個體，以上療法會造成免疫抑制；由于先天性缺乏受體功能或其它原因所致的免疫抑制；以及感染疾病，例如寄生蟲疾病，包括但不限于蠕蟲感染，例如線蟲(圓形蟲)；(鞭蟲病、蟯蟲病、蛔蟲病、鉤蟲病、類圓線蟲病、旋毛蟲病、絲蟲病)；吸蟲(血吸蟲)(血吸蟲病、支睪吸蟲病)、絳蟲(帶蟲)(包蟲病、肥胖絳蟲病(Taeniasis saginata)、囊蟲病)；內臟蠕蟲、內臟游走性幼蟲(例如弓蛔蟲屬)、嗜酸細胞性胃腸炎(例如異尖屬、鼠海豚線蟲屬)、皮膚游走性幼蟲(巴西鉤蟲、犬鉤蟲)。因此，本發明化合物可用于預防和治療極多種炎性、感染性和免疫調節性病癥和疾病。
此外，如果人們意欲遞送足量化合物以通過誘導趨化因子受體內部化作用而造成細胞中受體表達的損失，或者以造成細胞遷移的方向錯誤的方式遞送化合物，則前述炎性、過敏性和自身免疫疾病的治療也可考慮用于促進趨化因子受體的功能。
另一方面，本發明可用以評估G蛋白質偶合受體的推斷特異性激動劑或拮抗劑。本發明涉及利用這些化合物在調節趨化因子受體活性的化合物的篩選檢測的制備和實施中的用途。再者，本發明化合物可用于確立或測定其它化合物對趨化因子受體的結合位置，例如在一檢測中通過競爭性抑制或作為參比，以將其已知活性與具有未知活性的化合物作比較。當開發出新檢測或方案時，根據本發明的化合物可用以測試其有效性。具體地說，這些化合物可以提供于市售藥盒中，例如供使用于涉及前述疾病的醫藥研究上。本發明化合物還可用于評估趨化因子受體的推斷特異性調節劑。此外，通過作為不會結合化合物的實例，或者作為在可幫助確定相互作用特定位置的受體上具有活性的化合物的結構變型，人們可利用本發明的化合物來檢驗不被認為是趨化因子受體的G蛋白質偶合受體的特異性。
本文公開的化合物可用于治療或預防選自以下的病癥風濕性關節炎、骨關節炎、敗血性休克、動脈粥樣硬化、動脈瘤、發熱、心血管作用、血液流動性休克、敗血病綜合征、缺血再灌注后的損傷、瘧疾、克羅恩氏病、炎性腸疾病、分支桿菌(mycobacterial)感染、腦膜炎、牛皮癬、充血性心力衰竭、纖維變性疾病、惡病質、移植物排斥、自身免疫疾病、皮膚炎性疾病、多發性硬化、輻射損傷、氧過多肺胞傷害、HIV、HIV癡呆癥、非胰島素依賴性糖尿病、哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮炎、特發性肺纖維變性、大泡型類天皰瘡、蠕蟲寄生蟲感染、過敏性結腸炎、濕疹、結膜炎、移植、家族性嗜酸細胞增多、嗜酸性蜂窩組織炎、嗜酸細胞性肺炎、嗜酸細胞性筋膜炎、嗜酸細胞性胃腸炎、藥物誘導的嗜酸細胞增多、膽囊纖維變性、Churg-Strauss綜合征、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、結腸癌、Felty氏綜合征、肉狀瘤病、葡萄膜炎、阿耳滋海默氏、腎小球性腎炎和系統性紅斑狼瘡、食管鱗狀細胞癌、神經性疼痛和肥胖。
另一方面，該化合物可用以治療或預防炎性病癥，選自風濕性關節炎、骨關節炎、動脈粥樣硬化、動脈瘤、發熱、心血管作用、克羅恩氏病、炎性腸疾病、牛皮癬、充血性心力衰竭、多發性硬化、自身免疫疾病、皮膚炎性疾病。
另一方面，該化合物用以治療或預防炎性病癥，選自風濕性關節炎、骨關節炎、動脈粥樣硬化、克羅恩氏病、炎性腸疾病和多發性硬化。
另一方面，本文公開的實施例可用于治療多種癌癥，包括但不限于下述 癌瘤，包括以下的癌瘤，膀胱(包括加速與轉移性膀胱癌)、乳房、結腸(包括結腸直腸癌)、腎臟、肝臟、肺臟(包括小與非小細胞肺癌以及肺臟腺癌)、卵巢、前列腺、睪丸、尿生殖道、淋巴系統、直腸、喉、胰臟(包括外分泌胰癌)、食道、胃、膽囊、子宮頸、甲狀腺和皮膚(包括鱗狀細胞癌)； 淋巴樣血統的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴球白血病、急性淋巴胚細胞白血病、B-細胞淋巴瘤、T-細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、有毛細胞淋巴瘤、組織胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤； 髓樣血統的造血腫瘤，包括急性與慢性骨髓性白血病、脊髓發育不良綜合征、髓樣白血病以及前骨髓細胞白血病； 中樞與末梢神經系統的腫瘤，包括星細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤和神經鞘瘤； 間葉來源的腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；以及 其它腫瘤，包括黑色素瘤、著色性干皮病(xenoderma pigmentosum)、角質棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原細胞瘤、甲狀腺濾胞癌和畸胎癌。
在另一項實施方案中，本文公開的是治療癌癥的方法，其中癌癥選自乳癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤。此外，本文公開的化合物可用于治療卵巢癌和多發性骨髓瘤。
本發明提供了用于治療多種非癌性增生疾病的方法。
預防和治療炎性、傳染性及免疫調節病癥和疾病，包括哮喘和過敏性疾病，以及自身免疫病理學疾病，例如風濕性關節炎和動脈粥樣硬化以及上文所指出的病理學疾病的合并治療法是通過本發明化合物與其它已知用于此用途的化合物的組合進行說明。例如，在發炎的治療或預防中，本發明化合物可并用消炎或止痛劑，例如阿片制劑激動劑、脂肪氧化酶抑制劑、環氧化酶-2抑制劑、白細胞介素抑制劑(例如白細胞介素-1抑制劑)、腫瘤壞死因子抑制劑、NMDA拮抗劑、氧化氮的抑制劑或氧化氮合成的抑制劑、非甾體抗炎劑、磷酸二酯酶抑制劑或細胞因子抑制用抗炎劑，例如并用以下化合物，例如對乙酰氨基酚、阿司匹林、可待因、芬太尼、布洛芬、吲哚美辛、酮咯酸、嗎啡、萘普生、非那西丁、吡羅昔康、甾體止痛劑、舒芬太尼(sufentanyl)、sunlindac、干擾素α等。同樣地，本發明化合物可伴隨以下藥物一起施用疼痛緩解劑；增效劑，例如咖啡因、H2-拮抗劑、二甲硅油、氫氧化鋁或鎂；解除充血劑，例如去氧腎上腺素、苯丙醇胺、偽麻黃堿、羥甲唑啉、麻黃堿、萘甲唑啉、賽洛唑啉、丙己君或左旋脫氧-麻黃堿；以及鎮咳藥，例如可待因、二氫可待因酮、卡拉美芬、咳必清(carbetapentane)或右美沙芬(dextramethorphan)；利尿劑；以及鎮靜或非鎮靜抗組胺藥。同樣地，本文公開的化合物可并用其它藥物，此藥物用于治療/預防/抑制或改善本發明化合物對其有用的疾病或癥狀。這些其它藥物可通過其常用途徑和量與本發明化合物同時或相繼地施用。當化合物與一種或多種其它藥物同時使用時，可使用含有除了本發明化合物以外的此種其它藥物的醫藥組合物。因此，該醫藥組合物包括除了本發明公開內容的化合物以外，還含有一種或多種其它活性成份。
可與本發明化合物并用的其它活性成份的實例，無論是分別或在相同醫藥組合物中施用，包括但不限于(a)整聯蛋白(integrin)拮抗劑，例如用于選擇蛋白ICAM和VLA-4的那些；(b)類固醇類，例如倍氯米松、甲基氫化潑尼松、倍他米松、潑尼松、地塞米松及氫基可的松；(c)免疫抑制劑，例如環孢素、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素及其它FK-506型免疫抑制劑；(d)抗組胺類(H1-組胺拮抗劑)，例如溴苯那敏(bromopheniramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、曲普利啶、氯馬斯汀、苯海拉明、二苯拉林、曲吡那敏、羥嗪、甲地嗪、異丙嗪、異丁嗪(trimeprazine)、阿扎他定、賽庚啶、安他唑啉、非尼拉敏新安替根、阿司咪唑、特非那定、氯雷他定(loratadin)、西替利嗪、非索非那定、脫羰基乙氧基氯雷他定等；(e)非甾體抗哮喘劑，例如b2-激動劑(特布他林、間羥異丙腎上腺素(metaproterenol)、非諾特羅、新異丙腎上腺素、沙丁胺醇(albuteral)、比托特羅和吡布特羅)、茶堿、色甘酸鈉、阿托品、異丙托溴銨、白三烯素拮抗劑(扎魯司特、孟魯司特、普侖司特、伊拉司特、泊比司特、SKB-102，203)、白三烯素生物合成抑制劑(齊留通、BAY-1005)；(f)非甾體抗炎藥(NSAID)，例如丙酸衍生物(阿明洛芬、苯薩丙吩(benxaprofen)、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非諾洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚洛吩(indoprofen)、酮洛芬、咪洛芬、萘普生(naproxen)、奧沙普秦、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫噁洛芬)，乙酸衍生物(吲哚美辛、阿西美辛、阿氯芬酸、環氯茚酸、雙氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、芬替酸、呋羅芬酸、異丁芬酸、伊索克酸、oxpinac、舒林酸、硫平酸、托美丁、齊多美辛和佐美酸)，滅酸衍生物(氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟酸和托芬那酸)，聯苯基羧酸衍生物(二氟尼柳和氟苯柳)，昔康類(伊索昔康、吡羅昔康、舒多昔康和替諾昔康)，水楊酸酯類(乙酰水楊酸、柳氮磺吡啶)，以及吡唑酮類(阿扎丙宗、bezpiperylon、非普拉宗、莫非布宗、羥布宗、保泰松)；(g)環氧化酶-2(COX-2)抑制劑；(h)磷酸二酯酶IV型(PDE-IV)抑制劑；(i)趨化因子受體的其它拮抗劑；(j)膽固醇降低劑，例如HMG-COA還原酶抑制劑(洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀及其它他汀類)，多價螯合劑(考來烯胺和考來替泊)，煙酸(nicotonic acid)，非諾貝酸衍生物(吉非貝齊、氯貝丁酯(clofibrat)、非諾貝特和苯扎貝特)，以及普羅布考；(k)抗糖尿病劑，例如胰島素、磺酰脲類、雙胍類(二甲雙胍)、a-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖)和格列酮類(曲格列酮和吡格列酮)；(1)干擾素制劑(干擾素α-2a、干擾素-2B、干擾素α-N3、干擾素β-1a、干擾素β-1b、干擾素γ-1b)；(m)抗病毒化合物，例如依法韋侖(efavirenz)、奈韋拉平、茚地那韋、更昔洛韋、拉米夫定、泛昔洛韋和扎西他濱；(o)其它化合物，例如5-氨基水楊酸及其前體藥物，抗代謝物例如硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤，以及細胞毒性癌癥化學治療劑。本發明化合物比第二種活性成份的重量比可以改變，并且將根據各成份的有效劑量而定。
通常，將使用每一種的有效劑量。因此，例如，化合物與NSAID并用時，本發明化合物比NSAID的重量比的一般范圍為約1000:1至約1:1000，或者，從約200:1至約1:200。本發明化合物與其它活性成份的組合通常也在前述范圍內，但在各情況中，應使用各活性成份的有效劑量。
在治療癌癥中，化學治療劑和/或其它治療法(例如放射療法)的組合通常是有利的。第二種(或第三種)藥劑可具有與主要治療劑相同或不同的作用機制。使用細胞毒性藥物組合可能是特別有用的，其中施用的兩種或多種藥物是以不同方式或在細胞循環的不同階段中發生作用，和/或其中兩種或多種藥物具有重疊毒性或副作用，和/或其中被合并的藥物在治療通過患者所顯示的特定疾病狀態上各自具有證明的效果。
因此，本文公開的化合物(或本文公開的其它化學式)可并用其它抗癌和細胞毒劑一起施用，并且可用于治療癌癥或其它增生性疾病。本文的發明進一步包括本文中的化合物(或本文公開的其它化學式)在制備用于治療癌癥的醫藥中的用途，和/或其包括本文化合物與說明書一起的包裝，該說明書是指示化合物可并用其它抗癌或細胞毒劑以及用于治療癌癥的治療法。本發明進一步包括化合物與一種或多種其它藥劑呈藥盒形式的組合，例如在該藥盒中它們被包裝在一起，或置于將被作為藥盒一起銷售的分離包裝中，或在該藥盒中它們被包裝以一起調配。
第二種(或多種)抗癌劑可選自下列的任一種或多種 烷基化劑(包括氮芥類、烷基磺酸鹽/酯類、亞硝基脲類、乙撐亞胺(ethylenimine)衍生物和三氮烯類)；抗血管生成劑(包括間質金屬蛋白酶抑制劑)；抗代謝物(包括腺苷脫胺酶抑制劑、葉酸拮抗劑、嘌呤類似物和嘧啶類似物)；抗生素或抗體(包括單克隆抗體、CTLA-4抗體、蒽環類抗生素)；芳香酶抑制劑； 細胞循環應答改變劑；酶；法呢基蛋白質轉移酶抑制劑； 激素和抗激素劑以及類固醇(包括合成類似物、糖皮質激素類、雌激素/抗雌激素劑[例如SERM]、雄激素/抗雄激素劑、黃體激素、黃體酮受體激動劑以及促黃體生成激素釋放[LHRH]激動劑與拮抗劑)；胰島素樣生長因子(IGF)/胰島素樣生長因子受體(IGFR)系統調節劑(包括IGFR1抑制劑)；整聯蛋白發出信號抑制劑；激酶抑制劑(包括多激酶抑制劑和/或Src激酶或Src/abl的抑制劑、周期素依賴性蛋白激酶[CDK]抑制劑、panHer、Her-1和Her-2抗體，VEGF抑制劑，包括抗-VEGF抗體，EGFR抑制劑、有絲分裂原活化蛋白質[MAP]抑制劑、MEK抑制劑、極光體(Aurora)激酶抑制劑、PDGF抑制劑以及其它酪氨酸激酶抑制劑或絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑； 微管破裂劑，例如ecteinascidin或其類似物及衍生物；微管穩定化劑，例如紫杉烷類，以及天然產生的epothilones及其合成和半合成類似物； 微管結合、去穩定化劑(包括長春花生物堿)；以及 拓撲異構酶抑制劑；異戊烯基蛋白質轉移酶抑制劑；鉑配位絡合物；信號轉導抑制劑；以及其它作為抗癌使用的藥劑，和細胞毒劑例如生物應答改變劑、生長因子和免疫調節劑。
此外，本發明化合物可其它治療劑一起調配或共同施用，該其它治療劑是針對它們在尋求解決與前述癥狀有關的副作用的特定實用性來選擇的。例如，本發明化合物可與數種藥劑一起調配，以預防惡心、過敏性和胃刺激，例如止吐藥，以及H1和H2抗組胺藥。
上述其它治療劑，當與本發明化合物合并使用時，可例如以Physicians’Desk Reference(PDR)中所指示的量使用，或如本領域普通技術人員確定的其它量使用。
這些化合物是以治療有效的量施用于哺乳動物。所謂＂治療有效量＂，是指本發明公開內容的化合物當單獨或并用另一種治療劑施用于哺乳動物時，有效預防或改善疾病狀態或疾病進展的量。
劑量與配方 本公開內容的化合物可以口服劑型施用，所述劑型例如片劑、膠囊劑(其各自均包括持續釋放或定時釋放配方)、丸劑、粉末劑、顆粒劑、酏劑、酊劑、混懸劑、糖漿劑和乳劑。它們也可以靜脈內(推注或灌注)、腹膜腔內、皮下或肌內形式施用，全部均使用醫藥領域技術人員公知的劑型。它們可以單獨施用，但通常與醫藥載體一起施用，所述醫藥載體根據所選定的施用途徑和標準醫藥實踐作選擇。
本發明化合物的劑量服用法將當然地會根據例如以下的已知因素而改變特定藥劑的藥效學特性及其施用模式和途徑；接受者的物種、年齡、性別、健康狀況、醫療狀況和體重；病征的性質與程度；共同治療的種類；治療頻率；施藥途徑，患者的腎和肝功能，以及期望的作用。醫師或獸醫可決定和開立所需藥物的有效量，以預防、抗衡或遏制病癥的發展。
以下述作為一般指引，各活性成份的每日口服劑量，當用于指定的作用時，其范圍是在約0.001至1000mg/kg體重之間，或在每天約0.01至100mg/kg體重之間，或者，在約1.0至20mg/kg/天之間。在以恒定速率灌注期間，靜脈內方式的劑量為約1至約10mg/kg/分鐘。本發明化合物可以單次日服劑量施用，或者總日服劑量可以每日分成二、三或四次的劑量施用。在一項實施方案中，無論是每日施用一次還是以分離劑量每日施用兩次，活性成份的每日口服劑量為3至600毫克之間。或者，活性成份可以10-20毫克的劑量施用，每日投藥兩次，或以40至100毫克，每日投藥一次。或者，活性成份可以每天以12.5毫克的劑量施用，或每天一次75毫克。或者，活性成份可以3、10、30、100、300和600毫克的劑量施用，每天施用一次或兩次。
本發明化合物可以以鼻內形式通過局部使用適宜的鼻內載劑施用，或通過經皮途徑使用透皮貼片施用。當以經皮遞送系統的形式施用時，劑量施用將當然地在整個劑量服用中是連續的，而非間歇性的。
這些化合物通常與適宜的醫藥稀釋劑、賦形劑或載體(在本文中總稱為醫藥載體)混合施用，它們是適當地針對所意欲施用的形式來選擇，意即口服片劑、膠囊劑、酏劑、糖漿劑等，并且與常用的醫藥實踐一致。
例如，對于呈片劑或膠囊形式的口服施用而言，活性藥物成份可與口服、無毒性、藥學上可接受的惰性載體合并，該載體例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露醇、山梨醇等；對于呈液體形式的口服施用而言，口服藥物成份可與任何口服、無毒性藥學上可接受的惰性載體合并，例如乙醇、甘油、水等。再者，當想要或必要時，也可將適宜的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑并入混合物中。適宜的粘合劑包括淀粉，明膠，天然糖類例如葡萄糖或β-乳糖，玉米增甜劑，天然和合成樹膠例如阿拉伯膠、西黃蓍膠或海藻酸鈉，羧甲基纖維素，聚乙二醇，蠟類等。在這些劑型中使用的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。
本發明化合物也可以脂質體遞送系統的形式施用，該脂質體遞送系統例如小單層狀泡囊、大單層狀泡囊和多層狀泡囊。脂質體可制自多種磷脂類，例如膽固醇、硬脂酰胺或磷脂酰膽堿。
本發明化合物也可與作為可靶向的藥物載體的可溶性聚合物偶合。這些聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羥基丙基甲基丙烯酰胺-酚、多羥基乙基天門冬胺酰胺酚或被棕櫚酰基殘基取代的聚氧化乙烯-聚賴氨酸。再者，本發明化合物可以與可用于實現藥物控制釋放的生物可降解聚合物種類偶合，該聚合物例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己內酯(polyepsilon caprolactone)、聚羥丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基酰化物和水凝膠的交聯或兩親性嵌段共聚物。
適用于施用的劑型(醫藥組合物)每劑量單位可含有約1毫克至約100毫克的活性成份。在這些醫藥組合物中，以組合物的總重量為基準，活性成份通常是以約0.5-95重量％的量存在的。
明膠膠囊劑可含有活性成份和粉末狀載體，例如乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。可使用類似稀釋劑，以制造壓制片劑。片劑和膠囊劑可被制緩釋產物，以提供藥物歷經數小時期間的連續釋放。壓制片劑可經糖包衣或薄膜包衣，以掩蓋任何令人不愉快的味道并保護片劑與大氣隔離，或經腸溶性物質包衣，以在胃腸道中選擇性崩解。
供口服施用的液體劑型可含有著色和矯味劑，以增加病人可接受性。
一般而言，水、適合的油、鹽水、含水右旋糖(葡萄糖)和相關的糖溶液以及二醇類例如丙二醇或聚乙二醇是胃腸外用溶液的適宜載體。供胃腸外施用的溶液可含有活性成份的水溶性鹽，適宜的穩定劑，以及需要時的使用的緩沖物質。抗氧化劑例如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸，無論是單獨或組合，均是適宜的穩定劑。還使用的是檸檬酸及其鹽類，以及EDTA鈉。此外，胃腸外用溶液可含有防腐劑，例如苯扎氯銨、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、以及三氯叔丁醇。
適當醫藥載體描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company中，它是本領域的標準參考書。
供本發明化合物施用代表性的有用的醫藥劑型可以說明如下 膠囊 大量單位膠囊可通過充填標準的兩片式硬明膠膠囊而制成，每粒含有100毫克粉末狀活性成份、150毫克乳糖、50毫克纖維素和6毫克硬脂酸鎂。
軟明膠膠囊 可制備活性成份在可消化油例如大豆油、棉籽油或橄欖油中的混合物，并通過容積式泵注入明膠中，以形成含有100毫克活性成份的軟明膠膠囊。這些膠囊應經洗滌并干燥。
片劑 片劑可通過常規操作制成，由此其劑量單元為100毫克活性成份、0.2毫克膠體二氧化硅、5毫克硬脂酸鎂、275毫克微晶性纖維素、11毫克淀粉以及98.8毫克乳糖。可使用適宜的包衣材料以增加可口性或延遲吸收。
可注射液 適合于通過注射施用的胃腸外組合物可外通過將1.5重量％的活性成份在10體積％的丙二醇與水中攪拌而制成。該溶液應當用氯化鈉形成等滲性并滅菌。
混懸劑 可制備含水混懸劑以供口服施用，由此每5毫升含有100毫克細分化的活性成份、200毫克羧甲基纖維素鈉、5毫克苯甲酸鈉、1.0克山梨醇溶液(美國藥典)以及0.025毫升香草醛。
在本發明化合物與例如其它抗凝血劑合并的情況中，日服劑量可為每千克病人體重為約0.1至100毫克的式I化合物，以及約1至7.5毫克的第二種抗凝血劑。對片劑劑型而言，本發明化合物一般可以每劑量單位約5至10毫克的量存在，而第二種抗凝血劑的量為每劑量單位約1至5毫克。
在兩種或多種前述第二種治療劑和實施例的化合物一起施用的情況下，鑒于治療劑在組合施用時的增效或協同作用，通常各成份在典型日服劑量和典型劑型中的量相對于當該藥劑單獨施用時的常用劑量可被降低。
特別是當以單一劑量單位提供時，在所合并的活性成份之間可能存在化學相互作用。因此，當實施例的化合物與第二種治療劑合并在單一劑量單位中時，將它們調配成這樣，即雖然將活性成份合并在單一劑量單位中，但活性成份間的物理接觸被降至最低(意即減少)。例如，可將一種活性成份用腸溶性物質包衣。通過腸溶性衣包裹其中一種活性成份，則不僅能夠使所合并活性成份間的接觸降至最低，而且能夠控制這些成份中的一種在胃腸道中釋放，以致使這些成份中的一種不會在胃中釋放，而是在腸中釋放。其中一種活性成份還可用一種物質包衣，其會在整個胃腸道中達到持續釋放，并且還會使所合并活性成份間的物理接觸降至最低。再者，此持續釋放成份可另外用腸溶性物質包衣，以致使此成份的釋放僅發生于腸中。再另一種方法涉及組合產物的調配，其中將一種成份包裹持續和/或腸溶性釋放的聚合物，而另一種成份也包裹聚合物，例如低粘度級的羥丙甲基纖維素(HPMC)或者本領域已知的其它適宜物質，以便將各活性成份進一步分離。此聚合物包衣用于形成與另一種成份相互作用的額外屏障。
使本發明組合產物成份間的接觸降至最低的這些以及其它方式，無論是以單一劑型施用或以分離的形式但同時通過相同方式施用，一旦了解本發明公開內容后，均將是本領域技術人員容易了解的。
此外，本文公開的某些化合物可作為其它化合物的代謝物使用。因此，在一項實施方案中，化合物可以以基本上純凈化合物使用，然后其也可被摻入醫藥組合物中，或可以以代謝物使用，該代謝物是在該化合物的前體藥物施用后產生的。在一項實施方案中，化合物可通過使用于治療如本文中所述的病癥而以代謝物使用。
本文中使用的＂基本上純凈＂意欲包括具有純度大于約90重量百分比的化合物，包括約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100百分比。
作為一項實施例，本文公開的化合物可以是基本上純凈的，具有大于約90百分比(重量比)的純度，其中剩余小于約10百分比的物質包括化合物的其它代謝物，化合物的前體藥物，和/或由于其制備而產生的反應和/或操作雜質。
顯然，根據上文教導，本發明的許多修飾和變型是可能的。因此，應理解的是，在隨文所附權利要求的范圍內，本發明可以按不同于本文中所詳述的方式實施。
體內檢測和效果 N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺(也被稱為＂實施例1＂)是在如下文所述的下述體內檢測中評估的。
部分1.獼猴屬猴的皮內(ID)MCP-1激發模型 方法 MCP-1的皮內注射會造成單核細胞浸潤到注射位置。此模型最初開用于評估CCR2拮抗劑對單核細胞浸潤至用人類MCP-1所注射皮膚組織中的抑制作用。
如下文所述，使各猴每日一次服用實施例1或其載劑對照物(0.5％[w/v]羧甲基纖維素)，歷經三天。在第3天服藥后，在背側胸部上的分離位置處，立即使所有動物接受至少2次10微克(50微升/注射)人類MCP-1(R&D系統)的皮內注射，以及至少2次其DPBS對照組(50微升/注射)的皮內注射。所有位置的真皮切片檢查均在MCP-1(或DPBS)激發后大約18小時獲得。使切片檢查進行半定量組織學評估。皮膚樣品的代表性切片是通過光學顯微鏡檢查法檢驗的，注意微小損傷和細胞浸潤，并將其發生率以表列出。
在研究1中，將實施例1以0、6.5、13或26mg/kg的劑量口服施用于3只獼猴屬猴的組(每性別每組1或2只)。在研究2中，首次用于實驗的動物是以0-、10-或30-mg/kg的劑量在2或4只動物的組(對載劑服藥組，為1只/性別；對實施例1-服藥組，為2只/性別)中，用以評估實施例1。
對于兩項研究，除了切片檢查分析以外，收集血液，并評估全血液計數與細胞分類。還評估血漿樣品的化合物濃度以及血清樣品的系統炎性介質含量。
結果 在第一項研究中，單核細胞添補至載劑處理的對照動物的皮膚誘導的MCP-1為2.7±0.3(在0至4的規模下，表13)。在26mg/kg下，實施例1會抑制浸潤(56％)。13和6.5mg/kg的兩種較低劑量達到較低水平的抑制。該化合物也會抑制其它細胞類型的浸潤，例如嗜酸粒細胞與中性粒細胞。化合物在18小時時血漿濃度，及其與抑制水平和Cyno趨化性IC90值的關系總結于表13中。
使用兩種方法以在體外趨化性檢測中測定實施例1的抑制效果。第一種方法使用猴PBMC，而第二種方法使用以Cyno CCR2穩定地轉染的L1.2細胞。已發現前者為高度地可變(IC50＝5.5±10nM)，第二種獲得較高平均值，但更加一致(IC50＝11.4±8nM)。以此第二個數值為基準，26mg/kg劑量會在服藥后18小時時造成游離血漿濃度為2X趨化性IC90(表13)。
表13 獼猴屬猴中實施例1于單核細胞及其它細胞類型應答MCP-1攻擊的浸潤的作用的總結 a獼猴屬PBMC為基礎的趨化性 b使用穩定地表達獼猴屬CCR2的L1.2細胞的趨化性 第二項研究是在首次用于實驗的猴中進行的。與第一項研究作比較，實施例1是在30mg/kg(高劑量)下，抑制單核細胞浸潤達到較大程度(91％)，而在10mg/kg下獲得87％的抑制(表14)。
表14 獼猴屬猴中實施例1對于單核細胞及其它細胞類型應答MCP-1攻擊的浸潤的作用的總結 a獼猴屬PBMC為基礎的趨化性檢測 b使用穩定地表達獼猴屬CCR2的L1.2細胞的趨化性檢測 在兩項研究中，與載劑對照組相比，血清炎性介質變化的評估顯示在實施例1-治療組中MCP-1含量的增加(～3倍)。此外，與載劑對照組相比，全血液計數(CBC)分析顯示在實施例1-治療組中中性粒細胞的增加(～3倍)。
進行hCCR2KI小鼠研究，在使用細胞分類計數為基礎和流動細胞計數為基礎的操作法的巰基乙酸酯(TG)腹膜炎模型中，評估實施例1對單細胞/巨噬細胞浸潤的作用。
部分2.人類CCR2敲入(hCCR2KI)小鼠的表征 方法 hCCR2KI小鼠是通過用人類CCR2編碼序列置換小鼠CCR2基因以基因方式設計的。小鼠得自California San Francisco大學的Gladstone心血管疾病研究所。
使用標準PCR(基因特異性和定量)方法，以區別野生型(小鼠CCR2基因)與靶向的等位基因(人類CCR2基因)，并以耳部或尾部樣品測定人類CCR2基因復制數目和小鼠CCR2基因復制數目。還進行從血液白血球分離的總RNA的RT-PCR分析，以測定人類和小鼠CCR2mRNA的表達水平。使用流動細胞計數分析，以測定人類或小鼠CCR2蛋白質在血液單細胞表面的表達。在TG-所誘導的腹膜炎模型中，使用腹膜腔中蓄積的單細胞/巨噬細胞的FACS分析(參閱部分3)，以測定人類CCR2在這些小鼠中的功能性。
結果 hCCR2KI小鼠是通過用人類CCR2編碼序列置換小鼠CCR2基因以基因方式設計的。在實施例1的體內評估中使用這些動物之前，進行這些小鼠的基因型與表現型特征鑒定。耳部或尾部樣品的PCR為基礎的基因型研究(基因特異性和定量)檢測了兩份復制的人類CCR2基因和不同量的PCR產物，顯示存在小鼠CCR2基因的0至2份復制。使用從這些KI小鼠的血液白血球所分離的總細胞RNA，使用經設計以檢測小鼠CCR2mRNA的引物組，相對定量RT-PCR分析檢測出人類CCR2mRNa與最低限度含量的PCR產物。當在CCR2KI小鼠，人類CCR2，而非小鼠CCR2中，使用流動細胞計數分析以檢測蛋白質表達時，表面蛋白質是通過分別用特異性抗-人類CCR2和抗-小鼠CCR2抗體使全血液細胞分離物染色而被檢出的。
當血漿穩態水平覆蓋人類CCR2趨化性的IC90，但低于抑制小鼠CCR2趨化性所需要的含量時，hCCR2-選擇性拮抗劑會在這些hCCR2KI小鼠中，但不在野生型小鼠中，阻斷單細胞浸潤。再者，在模擬hCCR2KI環境(小鼠MCP-1/人類CCR2)的體外檢測中，實施例1會抑制小鼠MCP-1結合至表達hPBMC的人類CCR2(IC50＝2.2±1.2nM)，以及5THP-1細胞的小鼠MCP-1-誘導的/人類CCR2所介導的趨化性(IC50＝0.6±0.3nM)。
部分3.在hCCR2KI小鼠中的48-小時巰基乙酸酯(TG)-誘導的腹膜炎模型 方法 將hCCR2KI小鼠(C57BL/6-SVJ129)以腹膜腔內方式注射1毫升巰基乙酸酯(TG)(Hardy Diagnostics)。對于各研究，使用每組八只雄性小鼠。在TG注射前1小時，以口服方式服用實施例1。所使用的載劑為水中的0.01N HCl。TG注射后四十八小時，通過注射5毫升PBS/10mMEDTA/10％ BSA至腹膜腔中進行腹膜灌洗。
對于48-小時TG腹膜炎研究，一天兩次服用實施例1，其中第一次服用是在TG注射前一小時。總腹膜細胞計數是在分離的細胞上通過細胞計數器獲得的。進行細胞離心涂片(Cytospins)以測定分類白血球計數。將細胞以Wright-Giemsa染料(Sigma-Aldrich)染色3分鐘，然后用去離子水沖洗5分鐘。分類計數是以每樣品所計數的總共200個細胞為基準計算得到的。在各研究結束時，自后眶竇收集血液于EDTA中，以測定藥物濃度。
對于流動細胞計數分析，將腹膜滲出物細胞(1x106)用FACS緩沖劑(PBS/0.5％ BSA)洗滌一次，并且再懸浮于FACS緩沖劑中。使細胞在冰上用Fc-阻斷抗體(BD Pharmingen)培養15分鐘，接著添加下列抗體(BDPharmingen)PE共軛抗-F4/80、FITC共軛抗-Ly6c和Alexa 647共軛抗-hCCR2。在冰上45分鐘后，使細胞在冰上通過BD Cytofix固定15分鐘，用FACS緩沖劑洗滌兩次，并且再懸浮于200微升FACS緩沖劑中。對于各樣品獲得細胞事件(40,000)，并且使用FloJo軟件(TreeStar)分析數據。設定FSC/SSC門，以包含所有單細胞(低SSC，較高FSC)，同時將粒性細胞排除在分析之外。然后，將此選通的群體分析Ly6C(FITC)、F4/80(PE)表達。腹膜單細胞/巨噬細胞數目是用下述方式測定，將通過細胞計數器所獲得的總腹膜細胞計數，與通過得自流動細胞計數的F4/80+細胞所確認的單細胞/巨噬細胞的百分比相乘。平均值間差異的統計學顯著性是使用成對的雙-尾式t試驗法分析的，具有p值低于0.05的顯著性。
結果 實施例1是在hCCR2 KI小鼠TG腹膜炎模型中評估的，以測定其在抑制單細胞/巨噬細胞浸潤中的EC50。給小鼠施用巰基乙酸酯，并且口服給予實施例1為1、5或25mg/kg，BID。TG治療后四十八小時，獲得腹膜灌洗物，以供細胞浸潤分析。實施例1顯示通過細胞計數器所獲得的總腹膜白血球數目的劑量依賴性降低(圖15)。以通過灌洗物樣品形態學評估的分類白血球計數為基準，實施例1證實了單細胞/巨噬細胞流入量的劑量依賴性抑制作用。1、5、25mg/kg的劑量分別獲得20％、62％和69％的抑制作用。在5和25mg/kg下達到統計學顯著的抑制作用(圖15)。在兩項分別的研究中，對于抑制單細胞/巨噬細胞浸潤的平均EC50被估計為3.0±0.9nM。
添補的單細胞/巨噬細胞浸潤物還通過流動細胞計數法定量。為了對添補的單細胞/巨噬細胞與留置的巨噬細胞和粒性細胞之間作區分，使用F4/80和Ly6C單細胞/巨噬細胞表面標記物的染色，以確定添補的單細胞/巨噬細胞。通過此方法發現單細胞/巨噬細胞浸潤的類似劑量依賴性抑制作用，其中全部三種劑量均顯示統計學顯著性的抑制作用(圖16)。1、5、25mg/kg的劑量分別獲得38％、71％和86％的抑制作用。在兩項分別的研究中，地于抑制單細胞/巨噬細胞浸潤，通過此分析的平均EC50被估計為2.2±0.5nM。
為了在48-小時巰基乙酸酯腹膜炎模型中使用hCCR2敲入的小鼠以通過實施例1評估受體占據的體內水平，測量了實施例1和小鼠CCR2配位體MCP-1兩者的血漿水平。對于此評估要注意的是，僅CCR2及其主要配位體MCP-1被考慮在內。在競爭性抑制劑存在下，配位體的受體占據是通過Gaddum方程確定的 由于實施例1是MCP-1結合至CCR2的競爭性抑制劑，因此小鼠MCP-1/CCR2受體復合物與實施例1/CCR2受體復合物兩者的量可使用小鼠MCP-1與蛋白質-未結合實施例1兩者在血漿中的血清水平測得。小鼠MCP-1結合至hCCR2的Kd為0.91+/-0.08nM(n＝8)，其是在冷競爭配位體結合實驗中使用125I-人類MCP-1測得的。實施例1結合至hCCR2的平均Ki為1.2nM。小鼠MCP-1/CCR2受體復合物的分數是使用上述方程的形式測定的。為測定實施例1/CCR2復合物的分數，該方程重新定義為 最后，不含CCR2的量系測定自 [CCR2]總計＝[CCR2]不含+[小鼠MCP-1/CCR2]+[實施例1/CCR2] 如表15中所示，在48小時時單細胞/巨噬細胞浸潤至腹膜中的抑制百分比，反映了實施例1/CCR2受體復合物的百分比(實施例1-占據的CCR2)。
表15 在48-小時TG腹膜炎模型中，hCCR2 KI小鼠血液中體內受體占據的測定 a FACS為基礎的總單細胞/巨噬細胞的分析 部分4.長期有效性研究 方法 為了研究實施例1對多發性硬化的EAE(實驗自身免疫腦脊髓炎)模型的作用，使用每組10只小鼠。在第0天，使hCCR2 KI小鼠皮下方式免疫，使用總共200微升的在不完全Freund氏佐劑(IFA)(Sigma-Aldrich)中的、以1:1與300微克結核分支桿菌(H37Ra)(Becton-Dickinson)混合的300微克髓磷脂寡樹突膠質細胞糖蛋白(MOG)35-55(GenemedSynthesis)。在第0天(免疫作用后兩小時)和第2天，將小鼠以腹膜腔內方式注射100微升的400毫微克百日咳毒素。在第10天開始臨床記分，在整個研究中每周持續三次，并且以0-5的等級為基礎0，沒有疾病跡象；0.5，部分尾部虛弱；1，下垂尾或搖擺步態并有尾部緊張性；1.5，搖擺步態并有尾部虛弱；2，搖擺步態并有下垂尾(失調)；2.5(失調并有部分肢體癱瘓；3，一個肢體完全癱瘓；3.5，一個肢體完全癱瘓并且第二個肢體部分癱瘓；4，兩個肢體完全癱瘓；4.5，垂死；5，死亡。在第1天起始以55mg/kg口服實施例1(每天兩次)。
結果 在所進行三項研究的兩項中，實施例1顯著地降低臨床評分(p<0.05)(圖17)。對于實施例1，在125I-小鼠MCP-1結合至hCCR2-表達細胞、hPBMC(模擬hCCR2 KI環境)上，IC50為2.2nM。以此IC50值為基準，55mg/kg劑量會造成游離血漿峰谷濃度為結合IC90的～2-倍。在第22天，在以實施例1對載劑所治療的小鼠之間，脊髓的組織學評估并未證實總炎性細胞浸潤的顯著差異。在用化合物治療的小鼠中發現明顯的中性粒細胞浸潤。
權利要求
1.一種化合物，N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺，或其藥學上可接受的鹽。
2.權利要求1的化合物，其為N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺或其藥學上可接受鹽的結晶型式。
3.權利要求1-2的結晶型式，其包括N-2型式。
4.權利要求1-3的結晶型式，其特征為基本上等于下列的單位晶胞參數
晶胞尺寸
a＝11.8427(3)
b＝18，1503(7)
c＝12.7923(4)
α＝90
β＝105.362(2)
γ＝90
空間群P21
分子/單位晶胞2
其中所述晶體是在約+22℃的溫度下。
5.權利要求1-4的結晶型式，其特征為包含三個或更多個2θ值
的粉末x-射線衍射圖，該2θ值選自7.2、8.7、9.7、12.5、12.8、13.3、16.0、16.6、18.2和18.8，在約22℃的溫度下。
6.權利要求1-5的結晶型式，其進一步特征為包含四個或更多個2θ值
的粉末x-射線衍射圖，該2θ值選自7.2、8.7、9.7、12.5、12.8、13.3、16.0、16.6、18.2和18.8，在約22℃的溫度下。
7.權利要求1-6的結晶型式，其特征為基本上如列示于表7中的部分原子坐標。
8.權利要求1-7的結晶型式，其具有基本上根據圖2的粉末x射線衍射圖。
9.一種藥物組合物，其包含如權利要求1-8的化合物和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
10.在哺乳動物中治療疾病的方法，該方法包括給該哺乳動物施用治療有效量的權利要求1-9的化合物，其中該疾病選自糖尿病、肥胖、代謝綜合癥、中風、神經性疼痛、缺血性心肌病、牛皮癬、高血壓、硬皮病、骨關節炎、動脈瘤、發熱、心血管疾病、克羅恩氏病、充血性心力衰竭、自身免疫疾病、HIV感染、與HIV有關的癡呆癥、牛皮癬、特發性肺纖維變性、移植物動脈硬化、物理或化學誘導的腦部創傷、炎性腸疾病、肺泡炎、結腸炎、系統性紅斑狼瘡、腎毒血清腎炎、腎小球性腎炎、哮喘、多發性硬化、動脈粥樣硬化、血管炎、易受傷害性斑塊、風濕性關節炎、再狹窄、靜脈新血管內膜增生、滲析-移植物新血管內膜增生、動脈-靜脈旁路血管內膜增生、器官移植、慢性同種異體移植腎病和癌癥。
11.權利要求10的方法，其中該疾病選自糖尿病、肥胖、克羅恩氏病、系統性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎、多發性硬化、動脈粥樣硬化、再狹窄和器官移植。
12.權利要求10-11的方法，其中該疾病選自多發性硬化、動脈粥樣硬化、克羅恩氏病和糖尿病。
13.權利要求10-12的方法，其中該疾病為糖尿病。
14.權利要求10-12的方法，其中該疾病為動脈粥樣硬化。
15.權利要求10-12的方法，其中該疾病為克羅恩氏病。
16.權利要求10-12的方法，其中該疾病為多發性硬化。
17.制備具有下式(VI)的化合物或其鹽的方法
該方法包括
使式V化合物與式NH(R8)(R9)的胺進行還原性胺化，得到式VI化合物，所述還原性胺化包括以下步驟
(a)將胺與脫水劑在溫度約-20°至約+50℃下，添加至在非質子性溶劑中的式V化合物中，以形成式Va的亞胺/烯胺化合物；
和
(b)以氫氣壓力處理式Va的亞胺/烯胺化合物與鉑催化劑5％Pt/S/C的溶液，得到式VI酯化合物；
其中
R1和R2獨立地為氫或選自以下的胺-保護基團BOC、Cbz或芐基；
R4為C1-6烷基；并且
R8和R9獨立地為氫或C1-6烷基。
18.權利要求17的方法，其中
式V化合物是
或其鹽；
式Va化合物是
或其鹽，并且
式VI化合物是
或其鹽。
19.一種化合物，其選自
和
或者
(ii)該(i)的鹽。
全文摘要
本發明提供MCP-1受體活性的新穎拮抗劑或部分激動劑/拮抗劑N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺或其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或前體藥物，其具有所需藥理學特性的令人意外的組合；還提供本發明化合物的結晶型式及；含有它們的醫藥組合物以及使用它們作為藥劑以治療炎性疾病、過敏性、自身免疫、代謝、癌癥和/或心血管疾病。本公開內容還提供制備式(I)化合物的方法，該化合物包括N-((1R，2S，5R)-5-(異丙基(甲基)氨基)-2-((S)-2-氧代-3-(6-(三氟甲基)喹唑啉-4-基氨基)吡咯烷-1-基)環己基)乙酰胺其中R1、R8、R9、R10和上式(a)均如本文中所述。本文還提供可用于所述方法的中間體的化合物。
文檔編號C07D403/12GK101511822SQ200780032762
公開日2009年8月19日 申請日期2007年7月26日 優先權日2006年7月28日
發明者M·G·楊, R·J·榭尼, M·D·伊思特蓋特, J·穆斯爾希丁諾格盧, S·J·普拉沙德, 肖自力 申請人:百時美施貴寶公司