專利名稱：：通過人工酶途徑的生物制氫的制作方法
技術領域：
：本發明涉及農業和能源生產領域的生物技術。更具體地，本發明涉及通過將多糖基本上酶催化成氫和二氧化碳從可再生多糖生產氫。
背景技術：
：氣候的變化和世界化石燃料儲備的最終耗竭威脅著可持續發展(Morris，2006;Hoffertetal.，2002;Farrelletal.,2006)。氫是一種可移動的能源載體，其是充足、清潔的，并且顯然不包含碳。根據美國能源部(2004),未來氫經濟的研究與開發(R&D)重點包括(i)降低氫生產成本，(ii)發現用于高密度氫儲存的可行方法，(iii)建立安全有效的基礎設施，以用于從生產到儲存到使用無縫地輸送氫，(iv)顯著降低燃料電池的成本，并改進其耐久性。與使用化石燃料相比，氫是很有前途的用于儲存能源的替代品。氫可以在燃料電池中使用，燃料電池是一種將反應的化學能直接轉化為電能的電化學裝置。燃料電池是一種高效的產生動力和熱量的裝置。燃料電池提供了顯著降低對化石燃料的依賴的可能性。然而，燃料供給是阻止這種裝置廣泛商業化的主要障礙之一。大部分燃津牛電池通過利用氫作為反應物來運行，所述氫通常通過轉化(轉化)氬化物制備。最經常利用催化蒸汽重整、自熱重整或者催化部分氧化重整將富氫化石燃料重整。但是，對于維持我們能源需求的燃料電池技術來說，需要可再生的氫來源。非化石燃料類的氫產生實例包括利用太陽能或者風能、水電或者地熱能電解水；熱化學水分解；在工業場地的廢氣；生物質的氣化；和在消化有機組分或者吸收日光時產生氫的生物或者光生物系統。與必須以其產生時使用的電不同，氫可以貯存直到需要。然而，氫的低密度意味著低的能量密度，尤其與傳統燃料相比。即使考慮到與傳統產能方法相比燃料電池更高的效率，氫的低能量密度有可能阻礙儲存和運輸方法。多糖是氫的良好儲存方式，這是因為多糖包含約6.2質量％的H2/糖單位，并且當其與水反應時，它可以產生12摩爾的二氫。這樣潛在的氫儲存能力是大約15%。根據美國能源部的目標(SchlapbachandZuttel，2001),具有15%氫儲存能力的材料甚至超過了氫儲存技術的長期目標。為了從多糖和水真正的提取氫，需要發生總反應(6111005+7H20—6C02+12H2,其中C6Hi。Os表示包含于生物質，例如淀粉或者纖維素中的葡聚糖重復單元。已經存在幾種將生物質轉化成氫的范例(1)直接多糖氣化(Antaletal.，2000);(2)直接葡萄糖化學催化(Cortrightetal"2002;Huberetal"2003);(3)厭氧發酵(DasandVeziroglu，2001;HallenbeckandBenemann，2002);和(4)乙醇發酵(Lyndetal"2002;Zhangetal.，2006;ZhangandLynd，2004)，然后乙西享重整(Delugaetal.，2004)。常規化學方法具有低的氫產率(<60%),，500-900K)(Antaletal.，2000;Cortrightetal.，2002;Huberetal.，2003)。厭氧氫發酵以具有33%的最大產率的低效率而眾所周知，(DasandVeziroglu,2001;HallenbeckandBenemann，2002)。乙醇發酵和重整的組合可以產生IO112/葡萄糖單元(83%產率)。考慮到5-10%的發酵損失和大約5。/。的重整損失(Delugaetal.，2004),經過乙醇的實際氫產率可能為約最大產率的75%(最大產率是12H2/葡萄糖單元)。要轉化為氫的固體多糖的儲存和分配將解決現在氫領域的許多挑戰。如果實用的方法和裝置可以直接用于運載移動應用例如車輛，則可以解決數個與氫存儲設備有關的問題。也就是說，將可以避免氫壓縮或者液化的能量損失。此外，用于H2解吸的高溫也不再是必需的。此外，固體氫儲存材料的使用期限和氫補充時間不再是實際應用中的問題。同樣，與氣態氫相比，糖的儲存和分配是非常安全的。從元素氫產生分子氫的生化途徑是已知的。特別是通過光將光系統I(分離的光系統I或者類嚢體中的光系統I)上的電子激發至更高的能量，導致電子貢獻給外源電子載體，其能夠依次將電子轉移給氫化酶。在這個過程中，然后，氧化的光系統I能夠直接或者通過電子傳遞鏈(例如在類嚢體膜上發現的電子傳遞鏈)從電子供體提取一個電子。其中水作為電子供體，所述電子傳遞鏈包括光系統II。同時，兩個被還原的電子載體分子可以給氫化酶提供電子。氫化酶將兩個電子與兩個質子結合以形成氫分子。以前已經-使用好氧產氧光合生物或者來自該生物的亞細胞組分以制備氫氣(Benemannetal.,1973;RosenandKrasna，1980;Raoetal.，1978)。這些參考文獻中報道的無細胞(即，體外)系統的組分需要分離的類嚢體或者來自類嚢體的溶解的光系統I;電子供體，例如水或者人工電子供體例如二碌b蘇糖醇或者抗壞血酸；能夠接受來自光系統I的電子的氫化酶，當電子來源于可以被氫化酶氧化的電子供體時，氬化酶可以催化兩個電子和兩個質子結合形成分子氫；以及能夠從光系統I接受電子并且可以給氫化酶提供電子的外源電子載體。至少兩組產氧光合生物能夠在體內產生氬。這些光合生物包括藍藻和綠藻。藍藻通常使用固氮酶來產生分子氫。這種產生分子氫過程中使用的電子來源于儲存的糖，并用于還原鐵氧化還原蛋白，所述鐵氧化還原蛋白是固氮酶的即時電子供體(Markovetal.，1995)。在藍藻中氫化酶也能催化分子氫產生。在藍藻中，分子氫產生被氧和/或光抑制。綠藻還可以通過氫化酶光照析出(photoevolve)(即，產生)分子氫。電子傳遞的途徑目前是未知的。已經證明用于該過程電子的來源是內源性發酵的糖(KleinandBetz，1978)。在二氧化碳存在的情況下氫產生停止(VatsalaandSeshadri，1985),提示二氧化碳還原的電子阱與氫化酶相比是光合電子流的更好竟爭物。分子氫(H2)具有很多商業用途。分子氫可以用于生產氨；石油精煉，其中在典型的精煉過程中自始至終使用H2;化學合成工業，當需要碳-碳雙鍵轉化成碳-碳單鍵，或者將碳-碳三鍵轉化成單鍵或者雙鍵時；植物油氫化的食品工業；以及電子線路制備。現在氫還被廣泛用于制造甲醇、肥料、玻璃、精煉金屬、維生素、化妝品、肥皂、潤滑劑和清潔劑。此外，在傳統的燃燒引擎以及在燃料電池兩者中，純氫均是優良的燃料，并且用氧氣氧化時，其只產生水汽。液態氫還可以在例如空間飛行器中用作燃料。目前生產氫燃料的現有技術還面臨許多挑戰，例如有限的產率，需要高能量的輸入，高成本以及額外的純化步驟以確保燃料是足夠清潔的。所需要的是一種大量生產氫的廉價方法，其足以支持燃料電池的廣泛使用以及氫的其他用途。尤其需要的是將可再生原料例如包含多糖的豐富生物質直接轉換成氫的實用方法、組合物、試劑盒和裝置。要求該方法具有對H2的高產率，良好的質量和能效，并且最終要求低成本。
發明內容本發明提供從生物質(biomass)產生氫的方法、組合物和試劑盒。這樣產生的氫可用于很多用途，并且良好地適合用作產生能量的燃料。本發明至少部分地基于酶促反應的整合網絡，所述反應可將來自多糖的葡聚糖單元和水轉化成氫和二氧化碳(葡聚糖)n.^7H20—(葡聚糖)w+12H2+6C02其中(葡聚糖)是脫水葡萄糖單元-C6H!。05-。所述氫來自多糖和水。實質上，本發明依賴于多糖中儲存的能量以分解水并產生氫。多糖可以包括(但不限于)淀粉、纖維素、半纖維素、麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖、0-1，4-葡聚糖、|3-1，3-葡聚糖、^1,6-葡聚糖、a-l，4-葡聚糖、a-l，6-葡聚糖或者任何其他通過糖苷鍵連接的單體糖單元的低聚物。在第一方面，本發明提供用于從多糖生產氫的工藝或方法。通常，該方法包括通過將多糖的至少一部分轉化成6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate)來減少多糖的長度；從6-磷酸葡萄糖產生氫。該方法可以通過許多特異性的化學和酶步驟來進行。例如，減少多糖長度的方法可以包括將多糖的末端葡聚糖單元磷酸化，導致末端單元從其來源的多糖切割和釋放。這種磷酸化作用可以通過任何數量的磷酸化酶實現，所述磷酸化酶可以將多糖中的糖苷鍵偶聯切割以將磷酸基團引入釋放的葡聚糖單元，從而形成6-磷酸葡萄糖。該方法不使用ATP或者其它高能磷酸鍵化合物。此外，可以通過任何合適的方法實現6-磷酸葡萄糖的生產。優選的，從多糖釋放的葡聚糖單元是6-磷酸葡萄糖單元。但是，更典型地，當使用酶促反應時，所述葡聚糖單元是l-磷酸葡萄糖單元，其必須被異構化成6-磷酸葡萄糖單元。可以通過任何合適的化學或者酶法實現異構化。優選酶轉化。同樣地可以通過任何合適的化學或者生化方法從6-磷酸葡萄糖生產氫。根據優選的實施方案，6-磷酸葡萄糖通過酶法被轉化成氫，所述酶法涉及6-磷酸葡萄糖典型地經由6-磷酸葡萄糖酸(6PG)向5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate)的轉化。根據示例性的實施方案，6摩爾6-磷酸葡萄糖向6摩爾5-磷酸核酮糖的轉化產生12摩爾分子氫。可以理解，不論是化學還是生化反應，都有平衡狀態，一旦達到對于特定反應的平衡，凈產物將停止形成。為了在本方法中促進并且最大化氫的產生，通過將5-磷酸核酮糖轉化成各種產物以從所述反應方程式中去除5-磷酸核酮糖。根據本發明，所述產物可以差別很大，目的是驅動反應向使用5-磷酸核酮糖以允許連續的氬產生。減少系統中5-磷酸核酮糖量的方便方法是借助于戊糖磷酸途徑的部分或者全部酶步驟將其除去，所述途徑是本領域公知并被廣泛了解的。顯然，當方法包括氬的酶法生產時，所述方法包括氫化酶的使用。通過所述方法制備的氫可以釋放到大氣中，但優選將其收集，立即使用或者作為燃料源儲存以用于以后的使用。例如，所述方法可以包括將氫從存在于反應容器中的二氧化碳中至少部分地分離。此外，可以將部分或者全部的氫進給入燃料電池以用于發電或者其他能量生產。因此，在示范性的實施方案中，所述方法可以包括(a)提供包括至少一種多糖和水的組合物(例如，混合物)；(b)提供一種以上具有磷酸化酶活性的酶；(c)將至少部分多糖磷酸化以減少多糖的鏈長并產生1-磷酸葡萄糖；(d)提供一種以上具有葡糖磷酸變位酶活性的酶；(e)將在步驟(c)中產生的l-磷酸葡萄糖至少部分異構化為6-磷酸葡萄糖；(f)提供多種有效催化戊糖磷酸途徑步驟的酶；(g)提供一種以上具有氫化酶活性的酶；和(h)從至少部分步驟(e)中產生的6-磷酸葡萄糖形成氫。可以以任何方便的方式，以其常規、基本形式或者按照詳述的實施方案中的描述進行本發明的方法。因此，全部的化學或者生化反應步驟可以在單個反應容器中進行。可選地，可以分別地進行一個或者一些反應。所述方法可以按照間歇法或者連續法進行，同時連續地除去氫和廢物并引入新的原料。在實施方案中，用于磷酸化多糖的至少一種酶是磷酸化酶，例如l，4-a-葡聚糖磷酸化酶，a-葡聚糖磷酸化酶，支鏈淀粉磷酸化酶，淀粉磷酸化酶，葡聚糖磷酸化酶(glucanphosphorylase),葡聚糖磷酸化酶(glucosanphosphorylase)，糖原磷酸化酶，麥芽糖糊精磷酸化酶，麥芽糖磷酸化酶，纖維二糖磷酸化酶，纖維糊精磷酸化酶和蔗糖磷酸化酶。在某些實施方案中，用于產生氫的至少一種酶是來自古纟田菌(archaebacterium)尸,ococcws的氛酵。可選的，可以將無機磷酸鹽以超過在該方法中另外產生的無機磷酸的量加入至該方法中。在優選的實施方案中，磷酸鹽在所述系統中不積聚。還優選的在所述方法中不產生或消耗ATP。當本發明的方法包括酶促反應時，還可以參考下列酶功能少部分多糖磷酸化以產生1-磷酸葡萄糖；(b)將至少部分l-磷酸葡萄糖異構化為6-磷酸葡萄糖；和(c)從至少部分6-磷酸葡萄糖形成氫。有利地，所述方法可以在低溫至中等溫度進行，例如10。C-100。C之間。在一些實施方案中，不添加外部化學能源(多糖除外)，向所述系統添加的唯一能量是熱。即，通常，總反應是弱的吸熱反應，因此需要少量的熱輸入。例如，添加的熱能可以從燃料電池獲得。優選地，考慮到溫度是在特定系統中的底物濃度、反應凈熱和熱損失的函數，將所述系統維持在恒溫。在實施方案中，所述方法包括將反應加熱至約10。C-約100。C之間。根據本發明，所述方法的氫產率典型地為至少10摩爾氫/摩爾包含于起始多糖中的脫水葡萄糖單元。在優選的實施方案中，氫的產率是約或至少ll，約或至少11.5,約或至少11.6，約或至少11.7,約或至少11.8，或者約或至少11.9摩爾氫/摩爾包含于起始多糖中的脫水葡萄糖單元。在特別優選的實施方案中，氫的產率是12摩爾H2/摩爾多糖中的脫水葡萄糖單元，相當于100%的理論產量。在本發明過程期間氫產生的最大速率不受限制。但是，其優選至少O.l，至少0.2，至少0.4，至少0.6,至少0.8或者至少1.0(或者更高)mmol/L/hr。在另一個方面，本發明提供用于在體外從多糖有效產生氫的組合物。通常，所述組合物包括(a)至少一種多糖；(b)水；(c)至少一種酶，所述酶能夠催化多糖向6-磷酸葡萄糖的轉化，6-磷酸葡萄糖向6-磷酸葡萄糖酸(6-phsphogluconate)的轉化，以及6-磷酸葡萄糖酸向5-磷酸核酮糖的轉化；(d)至少一種酶，所述酶能夠將NADP+和6-磷酸葡萄糖和/或NADP+和6-磷酸葡萄12糖酸轉化為NADPH和質子；和(e)至少一種酶，所述酶能夠催化NADPH和質子向氫的轉化。在優選的實施方案中，所述組合物還包括多種能夠催化戊糖磷酸途徑的部分或者全部步驟的酶。在某些實施方案中，所述組合物包括下列酶(通過EC編號表征)(i)與EC2.4.1.1具有至少80%，優選至少90%,更優選至少95%同一性的酶；(ii)與EC5.4.2.2具有至少80%，優選至少90%,更優選至少95%同一性的酶；(iii)與ECL1.1.49具有至少80%，優選至少90%，更優選至少95%同一性的酶；(iv)與EC1.1.1.44具有至少80%,優選至少90%,更優選至少95%同一性的酶；(v)與EC5.3.1.6具有至少80%,優選至少90%，更優選至少95%同一'I"生的酶；(vi)與EC5丄3.1具有至少80%，優選至少90%,更優選至少95%同一性的酶；(vii)與EC2.2.1.1具有至少80%，優選至少90%，更優選至少95%同一性的酶；(viii)與EC2.2.1.2具有至少80%，優選至少90%,更優選至少95%同一性的酶；(ix)與EC5.3.1.1具有至少80%，優選至少90%,更優選至少95%同一'性的酶；(x)與EC4.1.2.13具有至少80%,優選至少90%，更優選至少95%同一性的酶；(xi)與EC3.1.3.1l具有至少80%,優選至少90%，更優選至少95%同一性的酶；(xii)與EC5.3.1.9具有至少80%,優選至少90%,更優選的少95%同一性的酶；和(xiii)與EC1.12.1.3具有至少80%,優選的至少90%，更優選的至少95%同一性的酶。在優選的方法和組合物實施方案中，沒有水解酶的存在。在另一方面，本發明提供從一種以上多糖生產氫的試劑盒。通常，本發明的試劑盒包括一個以上容器，各自獨立地包含一種以上以下物質(a)—種以上能夠磷酸化多糖的葡聚糖單元的酶；(b)—種以上能夠將l-磷酸葡萄糖異構化為6-磷酸葡萄糖的酶；(c)一種以上能夠從6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸或者這兩者的氧化產生分子氫的酶。在實施方案中，所述試劑盒包括6-磷酸葡萄糖脫氬酶，6-磷酸葡糖酸鹽脫氬酶，或者這兩者。在實施方案中，所述試劑盒包括一種以上磷酸化酶，一種以上葡糖磷酸變位酶，以及一種以上氫化酶。本發明試劑盒還可以包含如上所述的酶纟且合物。本發明試劑盒還可以提供實施本發明方法(即，從生物質產生氫)需要的部分或者全部供給。因此所述試劑盒可以包含酶、緩沖液、溶劑、容器(例如，一個以上用于收集或者利用從本發明反應方法和系統析出的一些或者全部氫氣)。圖l描述根據本發明的用于將多糖和水轉化為氫和二氧化碳的合成代謝途徑。圖2顯示描述用于通過本發明方法和系統產生并監控H2生產的系統的示意圖。圖3顯示在根據本發明方法中來自2mM淀粉的體積氫生成速率(mmolH2/L/M、時)。具體實施例方式下列說明提供關于本發明系統、方法、組合物和試劑盒的某些實施方案和特征的詳細論述。它不是旨在窮舉所有這類實施方案和特征，而是提出以讓讀者更好的理解所選擇的示例性實施方案和特征。為了讓讀者更好的理解本發明，現在定義和/或討論某些術語。此處未描述或者定義的術語應纟皮理解為按照本領域它們正常和習慣性的方式使用。關于"多糖"其表示任何比單體大的葡聚糖單元的低聚物或14者聚合物。多糖因此可以與"低聚糖"、"葡聚糖"、"糖低聚物"和"糖聚合物"互換使用。多糖可以包括(但不限于)淀粉、纖維素、半纖維素、果膠、麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖、p_i，4-葡聚糖、|3-1,3-葡聚糖、P-l,6-葡聚糖、a-l，4-葡聚糖、a-l，6-葡聚糖或者任何其他通過糖苷鍵連接的單體糖單元的低聚物。還可以使用任意數量多糖的混合物，并且這類混合物也包括在術語"多糖"中。如此處所用，"酶"是催化(即，加速)化學和生化反應的蛋白催化劑。如此處所用，，"酶"旨在包括單個酶、包括一種以上酶的混合物或者酶配合物。如此處所用，"酶單位，，(或者"單位")定義為每分鐘催化l微摩爾(pm)底物轉化的酶的量。用于定義酶單位的目的的條件是溫度為30。C,以及產生最大底物轉化率的pH值和底物濃度。酶委員會編號(EnzymeCommissionnumber)(EC編號)是基于酶催化的化學反應對酶的數字分類法。為了本發明的目的，也使用EC編號指定酶。當此處酶用EC編號表征時，應當理解可以有來自不同來源或者生物體的多種酶，所述酶均催化相同的反應。本發明不限于任何特定的酶或者酶的來源，而是途徑中的特定酶催化反應，這將如下文所述。例如術語"用EC2.4.1.1表征的酶"是指至本申請提交日為止，根據至少一個本領域公認的酶信息系統(例如BRENDA或者KEGG)具有EC編號2.4.1.1的任何氨基酸序列。本領域已知，兩種酶之間的"同一性"通過比4交一種酶的氨基酸序列與第二種酶的序列來確定。可以通過本領域公知的程序，例如利用BLAST(國家生物技術信息中心的BasicLocalAlignmentSearchTool)來確定同一性。當酶的同一性與酶EC編號一起敘述時，根據本說明，它應被理解為有許多不同的都具有相同的EC編號的氨基酸序列。因此，例如術語"與EC2.4.1.1具有至少90%同一性的酶，，是指至本申請提交日為止，根據計算與至少一個本領域公認的酶信息系統(例如BRENDA或者KEGG)的EC編號為2.4.1.1的至少一種氨基酸序列具有90%或者更高序列同一性的氨基酸序列。除非另外指出，用于說明書和權利要求中的所有表達組分濃度、反應條件、化學計算法等等的數字應被理解為在所有情況下都可以被術語"約"修飾，其表示該指定的值包括所有高于或者低于所述值5%和/或在獲得所述值的方法固有的誤差水平內的值。因此，除非相反的指明，在下面說明書和附屬權利要求中提出的數字參數是近似值，該值可能至少根據特定的分析技術而改變。盡可能精確地報告提出的數值。但是，任何數值固有地包含由在它們各自試驗測量中發現的標準偏差引起的一定的誤差。在所述方法某些實施方案的典型酶使用以及本發明系統、組合物和試劑盒實施方案的使用中，本發明通過下列總(凈)反應將可用葡聚糖重復單元-C6HK)Os-表示的多糖(可用葡聚糖重復單元-C6HK)05-表示)酶促地轉化為氫和二氧化碳-C6H10O5-(s)+7H20(1)—12H2(g)+6C02(g)[Eq.la]注意5摩爾H2產自葡聚糖重復單元，而另夕卜7摩爾H2來自反應的水。標記(s)、(l)和(g)表示化學物質分別處于固相、液相和氣相。應理解根據選擇的特定多糖以及溫度和其他條件，典型地將多糖懸浮于、基本溶解于或者完全溶于液相。圖l顯示包括13個可逆酶促反應的合成酶途徑a)由磷酸化酶催化的鏈縮短磷酸化反應產生l-磷酸葡萄糖(Eq.2);b)通過葡糖磷酸變位酶催化l-磷酸葡萄糖(G-l-P)轉化為6-磷酸葡萄糖(G-6-P)(Eq.3);c)包含10種酶的戊糖磷酸途徑(Eq.4);和d)由氫化酶催化的從NADPH產生氫(Eq.5)。(C6H10O5)n+H20+Pih(C6H^05)n-卄G畫1國P[Eq.2]G畫l-P<■>G-6-P[Eq.3]G-6-P+12NADP++6H20"12NADPH+12H++6C02+Pi[Eq.4]12NADPH+12H+"12H2+12NADP+[Eq.5]在實施方案中，本發明的酶途徑包括3個主要部分(a)(1)由磷酸化酶催化的多糖鏈縮短磷酸化，然后是(a)(2)由葡糖磷酸變位酶催化的從l-磷酸葡萄糖至6-磷酸葡萄糖的轉化；(b)戊糖磷酸途徑，包括氧化階段，其將G-6-P轉化為核酮糖-5-P、C02和NADHP;和非氧化階段，其可將核酮糖-5-P再生為G-6-P;和(c)由氫化酶催化的乂人NADPH產生氫。通過葡聚糖磷酸化酶的鏈縮短和從G-1-P向G-6-P的轉化的組合能夠利用儲存于多糖糖苷鍵中的能量。相反，多糖糖苷鍵的常規水解耗散了這種能量。因為可以同時從液體溶液中去除氣態反應產物(H2和C02),所述反應可以被有效的驅動向產生氫的方向進行，而在并發反應途徑中多糖鏈;波同時縮短。通常，總反應可以寫作(葡聚糖)n+aH20—(葡聚糖)w+bH2+cC02[Eq.lb]其中系數b定義了從起始多糖獲得的氫產量。熱力學上，Eq.l表示的反應是自發過程(AG。=-48.9kJ/mol)，并且是吸熱反應(AH。=595.6kJ/mol)(AtkinsandDePaula,2005)。當從液體反應溶液中連續去除氣體產物(H2和C02)時，根據勒夏特列原理(LeChatelier'sprinciple),總反應(Eq.1)(正向)變得有利。因此，優選當形成氣體產物時去除至少一種氣體產物；尤其優選以兩種產物(H2和C02)形成的相同速率去除它們，以避免聚積并有利于多糖的完全轉化。更多消耗的水(Eq.113中&〉7)不會產生更多的氫，反而會趨于引起常見的葡聚糖水解，產生更短的鏈，伴隨能量耗散入溶液。多糖鏈縮短底物的磷酸化(Eq.2)利用儲存于多糖糖苷鍵中的能量(15.5kJ/mol糖苷鍵)以產生活化的磷酸化單糖(G-l-P)而不消耗ATP。實質上，將儲存于多糖的能量傳遞到水分子以將它們打斷并以氫的形式釋放能量。通過利用基本上不含水解酶(例如，用于淀粉的淀粉酶，或者用于纖維素的纖維素酶)的溶液，即使存在過量的水，多糖水解也可最小化。因此，在本發明優選的實施方案中，液體溶液不包含顯著量的活性水解酶。兩個糖香單元之間的任意糖苷鍵均包含化學鍵能。多糖和低聚糖的糖苷鍵的簡單水解耗散糖苷鍵的鍵能。實質上，磷酸化酶可以通過底物磷酸化儲存能量。磷酸化酶是催化l-磷酸葡萄糖產生的變構酶。更通常地，磷酸化酶是催化來自無機磷酸鹽的磷酸基添加到受體的酶。磷酸化酶包括EC2.4.1.1(1，4-a-葡聚糖磷酸化酶，a-葡聚糖磷酸化酶，支鏈淀粉磷酸化酶，淀粉磷酸化酶，葡聚糖磷酸化酶(glucanphosphorylase),葡聚糖磷酸化酶(glucosanphosphorylase),糖原磷酸化酶，麥芽糖糊精磷酸化酶)；EC2.4.1.8(麥芽糖磷酸化酶)；EC2.4.1.20(纖維二糖磷酸化酶)；EC2.4.1.49(纖維糊精磷酸化酶)；和EC2.4.1.7(蔗糖磷酸化酶)。有效的磷酸化酶還可以選自與該^殳落描述的酶具有至少80%同一性，<尤選至少90%同一性的酶。對于包含a-1，4-糖苷4建的底物，例如淀粉，磷酸化反應如下(1，4-a隱D-葡糖基)n+Pi+H20—(1，4-a-D-葡糖基)n.i+G-1國P麥芽糖+Pi+H20—葡萄糖+G-1-P對于包含(3-l，4-糖苷鍵的底物，例如纖維素，磷酸化反應如下(1，4-P-D-葡萄糖基)n+Pi+H20—(1，4-P-D-葡萄糖基)n-i+G-1畫P纖維二糖+Pi+H20—G-l-P+葡萄糖在一系列由磷酸化酶介導的磷酸解反應后，可逆地產生大量的G-1-P。G-l-P的去除將導致鏈縮短反應。葡糖磷酸變位酶是一種通過改變磷酸根離子的位置，在G-1-P和G-6-P之間進行轉化的產生葡萄糖異構體的酶。葡糖磷酸變位酶的一個實例是用EC5.4.2.2表征的酶，或者與該酶具有至少80%同一性，優選至少90%同一性的酶。氫化酶是催化分子氫(H2)可逆氧化的酶。氫化酶在厭氧代謝中起著重要作用。氫吸收(H2氧化)與電子受體例如氧、硝酸鹽、硫酸鹽、二氧化碳和富馬酸的還原有關，而質子還原(H2析出)在丙酮酸鹽發酵方面以及在多余電子的清除方面非常重要。氫化酶可以按照下列反應從NADPH產生氫氣NADPH+H+—NADP++H2氫化酶的一個實例是用EC1.12.1.3表4i的酶，或者與該酶具有至少80%同一性，優選至少90%同一性的酶。本發明的一些實施方案使用從超嗜熱古細菌尸Fococcws/w/c^w分離的氬化酶(BryantandAdams,1989;MaandAdams,1994;Maetal.，1994;Ped醒ietal"1995;Maetal"2000)。盡管NADPH還原反應不是自發驅動的，但是特殊的尸;;racoccz^/wWosw氫化酶l可以在體外催化NADPH還原以產生氫。戊糖磷酸途徑由將G-6-P轉化為核酮糖-5-P的氧化階段和將從核酮糖-6-P再生G-6-P非氧化階段組成G-6-P+2NADP++H20—核酮糖-5-P+2H++C02+2NADPH核酮^f唐-5-P—5/6G-6-P通常，多種活化戊糖磷酸途徑的酶的選擇屬于普通技術人員的技能。在實施例l中(參見表l)描述了一種特定的實施方式。其他實施方式使用相似的酶，例如與表1所列的戊糖磷酸途徑酶(EC編號l.1.1.49,1.1.1,44,5.3.1.6，5.1.3.1,2.2.1.1,2.2.1.2，5.3.1.1,4.1.2.13，3.1.3.11和5.3.1.9)具有至少80%,優選至少90%序列同一性的酶。在一些實施方案中，直接向多糖水溶液中添加酶。要添加的酶量依賴于所期望的反應溫度和停留時間。通常每種特定的酶都有一個濃度，在該濃度之上在反應速率方面不發生進一步的增加。根據整體經濟性確定最佳酶量。可以將酶純化(但純化不是必須的)，并且它們可以以具有所期望功能的酶的混合物或者酶配合物的形式存在。可以以裂解細胞的形式添加酶，所述裂解細胞在先前的發酵過程中產生酶。在這種情況下，還存在向反應器中加入的細胞片段。在一些實施方案中，無機磷酸鹽(Pi)和輔酶(NADPH)在系統中連續地循環。即，這些物質以相同的速率^皮產生和消耗。如果需要，在所述方法開始時可以添加少量無機磷酸鹽以引發磷酸化。同樣，如果需要(由于副反應或者其他原因)，在所述方法中的任一點都可以添力口額外的Pi和/或NADPH。不認為溶液的pH是特別重要的，但pH可能以潛在不同方式影響每種酶的活性。還注意到在本發明途徑中產生H2的反應消耗質子，而質子的濃度受溶液pH的控制。指定特定選擇的酶，根據H2產量或者生產速率，本領域普通技術人員可以輕易地進行常規實驗來確定系統最適pH，或者確定優選的pH值范圍。換言之，本發明方法可以包括在反應期間調節一種以上參數以保持參數或者最優化參數。對于一些實施方案優選的pH值示例性范圍是pH二2-12,更優選4-9,和最優選中性pH,例如pH6-8。不認為溫度對本發明非常重要。尤其當選擇嗜中溫的酶時，低至中等溫度是合適的。通常可以在約10。C至約100。C,優選約2025。C至約75。C的一個以上溫度下方便地實施本方法。選擇的每種酶都具有其自身各自的溫度-活性函數，并且整體最優化溫度將是所選擇特定酶的函數。本領域技術人員將意識到甚至可以使用10。C-100。C以外的溫度，例如當選擇嗜熱或者嗜冷的酶時。在一些實施方案中，不添加外部能量，而溫度將成為底物濃度、反應凈熱和系統熱損失的函數。壓力對于本發明來說也不重要，但技術人員將承認反應壓力可以影響物質的平衡分布。高壓例如數個大氣壓將趨于抑制氣體產物析出。相反地，低的系統壓力將趨于推動平衡移向產物(氫和二氧化碳)。為了方便起見，優選在大氣壓下進行反應。所述方法可以在真空下進行。同樣，可以在除產生或者消耗的氣體之外的氣體，例如空氣、氮、氦、氬等的存在下進行所述方法。所述方法可以在間歇反應器、連續反應器或者上述兩者的一些組合中進行。可以使用各種攪拌(混合)方式，或者不含內混合的活塞流反應器也是有效的。本領域已知，可以將未轉化的反應物(多糖)循環至反應器進口。根據Eq.lb[(葡聚糖)n+aH20^(葡聚糖)^+bH2+cC02],本領域普通技術人員將理解可以優化所述方法，而無需過度實驗，這樣在整體基礎上系數a可以是約7，b可以是約12,和c可以是約6。在一些實施方案中，確實發生一些副反應，降低了H2的產率。在其他實施方案中，對H2的氫原子選擇性非常高(至少約90%)，但多糖未完全轉化為產物，導致較低的產率。有時經濟性規定以稍微低于其可獲得的最高產率來運行本方法。還可以進行優化以提高總反應速率和部分或者全部酶的穩定性。這種優化可以包括，例如，通過代謝工程和建才莫的酶組分優化；用重組的嗜熱或者甚至超嗜熱的酶代替嗜中溫的酶；蛋白工程化以提高酶活性和/或選擇性；更高濃度的酶和底物；方法參數例如pH和溫度的改變；通過添加劑穩定酶；酶固定；開發最小微生物以建立產生H2的體內酶系統。進行這種優化屬于酶領域普通技術人員的技能，本發明旨在包括這類實驗。可以使用統計學實驗設計來探究整體的響應面(globalresponsesurface),并建立Hs產率和速率相對于方法和酶因素的才莫型以及相互作用。如上所述，本發明的一個方面是用于實施本發明所述方法的試劑盒。通常，所述試劑盒是用于產生和收集氫氣的試劑盒。本發明的試劑盒包括為實施本發明方法的一個以上實施方案所必需的部分或者全部組分。因此，本發明的試劑盒可以包括一種以上以下物質(a)—種以上具有部分磷酸化酶活性的酶；(b)—種以上具有部分葡糖磷酸變位酶活性的酶；(c)一種以上具有部分氫化酶活性的酶；(d)用于使多糖、水以及來自要素(a)、(b)和(c)的酶組合的容器；(e)用于將所述容器加熱到約10至100。C的裝置；和(f)收集或者利用從所述容器析出的部分氬氣的裝置。本發明試劑盒還可以包含如上所述的酶組合物。可將酶、試劑和添加劑(如果需要)和其他組分設置在所述試劑盒內的一個以上的合適容器中。所述試劑盒可以包括足夠的組分以單次或者多次實施本發明方法。可以由任意合適的材料，例例如塑料、玻璃和金屬制造試劑盒。氫具有許多潛在用途。可以將分子氳用于氨的生產；石油精煉，其中在典型的精煉過程中自始至終使用H2;化學合成工業，當需要碳-碳雙鍵轉化成碳-碳單鍵或者將碳-碳三鍵轉化成單鍵或者雙鍵時；用于植物油氫化的食品工業；以及電子線路制造。現在還將氫廣泛用于制造曱醇、肥料、玻璃、精煉金屬、維生素、化妝品、肥皂、潤滑劑和清潔劑。此外，純氫在傳統的燃燒引擎和在燃料電池中均是優良的燃料，并且用氧氣氧化時，其只產生水汽。液態氫還可以用作燃料，例如用于空間飛行器。可以從其他物質(例如，二氧化碳)完全或者部分地分離由本發明方法產生的氫，或者所述氫可以與其他物質聯用。當需要從H2中分離至少部分C02時，各種分離技術是已知的。一種此類技術使用分子篩分離。例如還可以使用低溫蒸餾從H2分離C02。如本領域已知，直接使用H2/C02混合物的實例是利用醋酸梭菌(C/oWnWz'wm"ce"cwm)從H2和(302產生乙酸鹽。其他生物化學地或者化學地轉化各種濃度的H2/CO2混合物的方法也是已知的。實施例現在將參考下列非限制性的實施例進一步表征和描述本發明，其僅僅旨在說明本發明，而不應被理解為以任何方式限制本發明。總之，下列段落將描述證明本發明實施方案的說明性的酶選纟奪和實驗步驟。實施例1:從淀粉和水酶法生產H2和C02為了舉例說明本方法、系統和組合物的實際性質，以根據本發明的方法將淀粉轉化為氫和二氧化碳。在裝備有用冰冷卻的除潮器的連續流式系統中進行實驗。除非另作說明，所有化學制劑和酶均購自Sigma-AldrichCo.(U.S.A.)。在表l中列出了所有的酶和它們的催化反應。常規反應器的工作體積是2mL。用氦以50mL/min的流速的連續地將所述系統凈化。利用Polyscience(Niles，IL)循環式水浴鍋將加套反應器的溫度維持在30。C。表l:酶和催化反應<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>圖2顯示說明本發明氫電池系統的圖，將其如此設計利用基于FigaroTGS822的傳感器監控112，并利用改良的Hersh原電池監控02。在反應池和電解池之間連接有C02分析器(未顯示)。在氣流中監控氧以及氫和二氧化碳。利用FigaroTGS822氧化錫傳感器測量氫析出，所述傳感器通過橋式放大器與KeithleyModel2000萬用表(KeithleyInstruments,Cleveland,OH)連4妻。利用與Keithley自變換量程皮安計連接的改良Hersh原電池監控氧濃度，所述原電池利用24%KOH作為電解質。利用與Keithley2000萬用表連接的LI-CORC02AnalyzerModelLI-6252測量二氧化碳的產生。萬用表和皮安計通過IEEE488通用接口板與電腦連接。按照電化學等價的法拉第定律，利用與串聯電解池連接的Keithley220可編程電源進行用于標定氫和氧的電解。利用分析氣體混合物進行用于二氧化碳的標定，所述混合物包括在氦中的735ppm二氧化碳和1000ppm氧(AirLiquideAmericaCorp.,Houston,TX)。利用ASYST4.0專欠4牛(ASYSTTechnologies,Inc.,Rochester,NY)進行數據收集和分析。如下所示計算氫(YH》和二氧化碳(Yc。2)的綜合摩爾/摩爾產率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中fH2和rco2是每小時每升反應體積以毫摩計的H2或者C02的體積產生速率，△GE是以mM計的葡萄糖當量的凈消耗。可以利用Sigma葡萄糖HK試劑盒測量剩余的G-6-P。將混合物在35。C下孵育5分鐘，測定340nm處吸光度的變化。通過添加稀H2S04并在12rC下水解l小時，將剩余的淀粉、G-l-P和G-6-P水解成葡萄糖。利用葡萄糖HK試劑盒測量中和的葡萄糖溶液。溶液包含在2.0mL0.1MHEPES緩沖液(pH7.5)中的l單位的各戊糖磷酸循環酶，約70單位的P.furiosus氬化酶，10單位的a-葡聚糖磷酸化酶，10單位的葡糖磷酸變位酶，4mM磷酸鹽，0.5mM硫胺素焦磷酸，2mMNADP+，10mMMgCl2和0.5mMMnCl2。實驗在大約30。C進行。圖3顯示來自2mM淀粉的體積氫產生速率(mmolH2/L/hr)。氫和C02的綜合產率(mol/mol)分別是5.19112/葡聚糖單位和5.37C02/葡聚糖單元。來自淀粉的氫和C02產率大約是理論產率的43%和86%。一般認為氫產率的降低主要是由于不完全轉化，和代謝產物例如NADPH的可能的積聚。盡管此處已經詳細地描述了示意性實施方案及其各種改進，但本領域技術人員將理解本申請不需要限于這些精確的實施方案和所描述的改進，在不脫離所附權利要求限定的本發明范圍或者精神的條件下還可以進行各種變化和進一步的改進。其他實施方案對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，包括未提供此處闡述的全部特征和優點的實施方案。參考文獻AlperJ.，Science2003，299:1686-1687.AtkinsP.W.,PhysicalChemistry(fourthedition).NewYork:W.H.Freeman&Co.;1990.AtkinsP.W.andDePaulaJ.ElementsofPhysicalChemistry(4thedition).NewYork:W.H.Freeman&Co.(2005)，605-613.Benemannetal"Proc.Nat.Aead.ScLUSA70:2317，1973.BergJ.M.etal"Biochemistry(fifthedition).NewYork:W.H.Freeman&Co.;2002.BryantF,O.andAdamsM.W.W，J.Biol.Chem.1989，264:5070-5079.CortrightR.D.etal"Nature2002，418:964-967.DelugaG.A.etal"Science2004，303:993-997.FarrellA.E.etal.,Science2006，311:506-508.HoffertM丄etal.，Science2002，298:981-987.HuberG.W.etal"Science2003，300:2075-2077.KleinandBetz，PlantPhysiol.61:953,1978.LyndL.R.etal"Microbiol,Mol.Biol.Rev.2002，66:506-577.LyndL.R.etal"Curr.Opin.Biotechnol.2005,16:577-583.LyndL.R.etal.，inCellulosome.EditedbyKataevaIA:NovaSciencePublishers,Inc.;2006.MaK.andAdamsM.W.，J.Bacteriol.1994,176:6509-6517.MaK.etal,，FEMSMicrobiol.Lett.1994，122:245-250.MaK.etal"J.Bacteriol.2000,182:1864-1871.Markovetal.，AdvancesinBiochemicalEngineeringandBiotechnology52:60，1995.MorrisD.，J.Sci.FoodAgric.86:1743-1746(2006).MuirM.etal"J.Bacteriol.1985，163:1237-1242.NelsonD.L.andCoxM.M.，LehningerPrinciplesofBiochemistry(thirdedition).NewYork:WorthPublishers;2000.PedroniP.etal"Microbiol.1995，141:449-458.Raoetal"Biochimie60:291，1978.RosenandKrasna,Photochem.Photobiol.31:259，1980.UnitedStatesDepartmentofEnergy:"BasicResearchNeedsfortheHydrogenEconomy"(2004)publishedathttp:〃www.sc.doe.gov/bes/hydrogen.pdf.VatsalaandSeshadH,Proc.IndianNat'lScLAcad.B51:282,1985.WoodwardJ.etal"Nat.Biotechnol.1996，14:872-874.WoodwardJ.etal"Nature2000，405:1014-1015.WoodwardJ.etal"EnergyFuels2000,14:197-201.ZhangY.-H.P.andLyndL.R.,Appl.Environ.Microbiol.2004，70:1563-1569.ZhangY.-H.P.andLyndL.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2005,102:7321-7325.ZhangY.-H.P.andLyndL.R.，Appl.Microbiol.Biotechnol.2006，70:123-129，權利要求1.一種從多糖生產氫的體外無細胞方法，所述方法包括通過將至少一個葡聚糖單元轉化為5-磷酸核酮糖來減少多糖的葡聚糖單元數量；和從將葡聚糖單元轉化為5-磷酸核酮糖中產生氫。2.根據權利要求l所述的方法，其中將至少一個葡聚糖單元轉化為5-磷酸核酮糖包括將葡聚糖單元酶促地轉化為1-磷酸葡萄糖；將1-磷酸葡萄糖酶促地轉化為6-磷酸葡萄糖；將6-磷酸葡萄糖酶促地轉化為6-磷酸葡萄糖酸；和將6-磷酸葡萄糖酸酶促地轉化為5-磷酸核酮糖。3.根據權利要求2所述的方法，其中氫的產生與6-磷酸葡萄糖向5-磷酸核酮糖的轉化酶偶聯。4.根據權利要求2所述的方法，進一步包括將5-磷酸核酮糖轉化為一種以上反應產物。5.根據權利要求l所述的方法，其中通過氫化酶產生氫。6.根據權利要求l所述的方法，其中所有步驟在單個反應容器中進行。7.根據權利要求l所述的方法，其中所述多糖包括淀粉。8.根據權利要求l所述的方法，其中所述多糖包括纖維素。9.根據權利要求l所述的方法，其中所述多糖包括半纖維素。10.根據權利要求l所述的方法，其中所述多糖不是淀粉或者纖維素。11.根據權利要求l所述的方法，進一步包括至少部分地將所述氫從所述方法產生的二氧化碳中分離。12.根據權利要求ll所述的方法，進一步包括進給至少部分氫至燃料電池中。13.根據權利要求l所述的方法，進一步包括從氫發電。14.根據權利要求l所述的方法，其中氫的產率為至少IO摩爾氬/摩爾包含于起始多糖中的脫水葡萄糖單元。15.根據權利要求l所述的方法，其中氫產生的最大速率是至少0.4mmol/L/hr。16.根據權利要求l所述的方法，其中所述方法包括(a)提供包括多糖和水的混合物；(b)提供一種以上具有磷酸化酶活性的酶；(c)將至少部分多糖磷酸化以產生1-磷酸葡萄糖和縮短的多糖；(d)提供一種以上具有葡糖磷酸變位酶活性的酶；(e)將在步驟(c)中產生的至少部分l-磷酸葡萄糖異構化為6-磷酸葡萄糖；(f)提供多種有效催化戊糖磷酸途徑步驟的酶；(g)提供一種以上具有部分氫化酶活性的酶；和(h)從至少部分在步驟(e)中產生的6-磷酸葡萄糖形成氫。17.—種用于在體外從多糖有效生產氫的組合物，所述組合物包括(a)多糖；(b)水；(c)能夠催化多糖向6-磷酸葡萄糖轉化的一種或多種酶；(d)能夠催化NADPH和質子向氫轉化的一種或多種酶；和(e)多種能夠催化戊糖磷酸途徑步驟的酶。18.—種用于從多糖生產氫的試劑盒，所述試劑盒包括(a)—種以上具有磷酸化酶活性的酶；(b)—種以上具有葡糖磷酸變位酶活性的酶；(c)一種以上具有氫化酶活性的酶；(d)用于使多糖、水以及來自要素(a)、(b)和(c)的酶組合的谷為，(e)用于將所述容器加熱到10。C-100。C之間的裝置；和(f)用于收集或者利用從所述容器析出的部分或者全部氫氣的裝置。19.根據權利要求18所述的試劑盒，其中氫的產率為至少10摩爾氫/摩爾包含于起始多糖中的脫水葡萄糖單元。20.根據權利要求18所述的試劑盒，進一步包括用于從氫氣發電的裝置。全文摘要本發明包括一種體外酶法，該方法在溫和條件下只利用酶和水將可再生多糖有效地轉化成高產率的氫。該方法包括多種酶(1)磷酸化酶，(2)葡糖磷酸變位酶，(3)氫化酶和(4)參與戊糖磷酸途徑的酶。該方法的優選實施方案只產生凈產物氫和二氧化碳，即是從低成本原料以非常大的量產生氫的廉價方法。文檔編號C07H1/06GK101490071SQ200780026279公開日2009年7月22日申請日期2007年5月12日優先權日2006年5月12日發明者喬納森·米埃倫斯,珀西瓦爾·毅恒·張申請人:弗吉尼亞暨州立大學知識產權公司