專利名稱：：對應于玉米d9基因的突變等位基因和野生型等位基因的分離的多核苷酸分子和使用方法
技術領域：
：本發明涉及用控制生長和發育的基因對生物體尤其是植物進行遺傳操作。本發明進一步涉及控制生長的基因，包括同源物和突變體形式，由其編碼的蛋白和用這些基因轉化的植物。
背景技術：
：矮化植物對農業已產生重大影響。小麥的矮化變種由于倒伏可能性下降和高產而在北美廣泛使用。可以由使用矮化作物實現的其它利益包括減少所需的殺蟲劑和肥料的量、種植密度較高和勞動力成本降低。鑒于目前人口增加且適于耕作的土地面積減少的趨勢，提高農業生產率一直是一項極為重要的挑戰。矮化作物一直是我們農業生產體系的重要組成部分。增加矮化作物的使用可有助于滿足未來的農業生產要求。然而，所有作物都沒有可利用的商品化可接受的矮化變種。除了使用矮化植物控制林高以外，常規地將合成化學品應用于某些經濟上重要的植物物種，以降低生長。被稱為生長抑制劑的植物生長調節劑用于在多種作物中降低莖伸長，包括棉花、葡萄藤、果樹、花生、小麥和觀賞植物(諸如杜鵑花、菊花、繡球花、一品紅和許多花壇植物)。所有常用的生長抑制劑都是赤霉素生物合成的抑制劑，通過降低伸長限制莖或枝條生長。在美國，最廣泛使用的生長抑制劑為甲哌，其注冊用于棉花。對棉花使用甲哌獲得的益處包括產量增加、落葉改善、應激耐受改善、作物成熟度更均一和更早收獲的能力。以前，生長抑制劑丁酰肼在美國以商標ALAR和KYLAR注冊用9于蘋果、葡萄和花生，但出于對人類健康的考慮其已經禁用于食用作物。盡管農業生產者需要替代丁酰肼的產品，但在美國還沒有注冊用于葡萄、果樹和花生的生長抑制劑。然而，丁酰肼仍廣泛用于某些非食用植物物種。揭示控制植物生長過程如細胞分裂和細胞伸長的分子機制有可能幫助開發高度降低的新植物變種和減l曼植物生長的新方法。這些新植物變種和方法可為農民和園藝家提供對使用合成的生長抑制化學品環境上有利的選擇對象。植物細胞和器官的伸長是植物生長和發育的最關鍵參數之一。然而，該性狀在植物中的調節是一個相當復雜的過程，因為外部因素和內部因素均影響它。最重要的外部刺激是光，其一般對細胞伸長具有抑制性或負面作用(Quail,P.H.(1995)5We"ce268:675-680;Kende等，(1997)尸/朋fCe〃9:1197-1210)。細胞伸長的內控由眾多化學品介導，這些化學品一般^支稱為植物生長調節劑或激素(Kende等，(1997)尸/a"fCe//9:1197-1210)。在經典的植物激素中，植物生長素和赤霉素(GA)均促進細胞伸長，而細胞分裂素和脫落酸各自對細胞伸長均表現出負面作用(Kende等，(1997)P/朋fCe//9:1197-1210)。最近，已鑒定出另一類被稱為油菜素內酯的植物生長調節劑，其也顯著促進植物生長(Yokota,T.(1997)7Ve"血尸/a"f2:137-143;Azpiroz等，(1998)尸/朋fCe〃10:219-230;Choe等，(1998)尸/"WCW/10:231-243)。然而，仍不清楚植物激素單獨地或協同地作用以控制細胞伸長的機制。增進了解介導細胞伸長機制的一種方式是研究其中植物生長這方面被損害的突變體(Klee等，(1991)iev.尸/a"fP/j;as/o/.尸/朋fMo/.Ao/.42:529-551)。已在大多數植物物種(包括玉米)之間鑒定了眾多這樣的突變體，其中已表征了25種以上影響植物高度的單基因突變(Coe等，(1988),載于Corn&Cor"/wpravewe加，G.F.Sprague(編輯)Madison,WI;Sheridan,W.F.(1988)爿朋w.化v.22:353-385)。這些矮化突變體被認為是GA相關的，這主要是因為GA是唯一的植物生長素，其調節玉米高度的作用已被令人信服地證實(Phinney等，(1985)C醇.rop.尸/a"f飾c/z縱尸一'o/.4:67陽74;Fujioka等，(1988)尸roc.A^/.爿cad(7&485:9031-9035)。已在該類玉米突變體中發現了GA反應性和非GA反應性的兩類突變體。盡管已克隆了眾多GA反應性突變體的基因，并發現涉及GA生物合成(Bensen等，(1995)尸teCe//7:75-84;Winkler等，(1995)P/虛C"/7:1307-1317)，但關于非GA反應性玉米突變體中缺陷的性質知之甚少。DELLA蛋白是赤霉素(GA)信號轉導級聯的要旨，用作在提升的GA濃度存在下降解的GA反應的負調節劑(Silverstone等，(2001)CW/10:155-169)。DELLA域蛋白特別令人感興趣，原因在于它們的功能獲得突變體的赤霉素不敏感性矮化表型，這些突變體通過它們的小麥收獲指數的增加而部分地引起"綠色革命"(Peng等，(1999)400:256-261)。N-末端DELLA結構域中的突變經常通過極大地增加GA信號轉導的該負調節劑的穩定性而引起顯性GA-不敏感性表型(Silverstone等,(2001)尸toCe//10:155-169;Gubler等,(2002)戶/朋fP/^Zo/.129:191-200;Itoh等，(2002)尸/朋fCe//14:57-70)。最近，Griff他s等人((2006)尸/a加Ce//18:3399-3414)表明，N-末端I區和II區是DELLA蛋白與擬南芥(力raZncto/^力GIDla相互作用所必需的。在保守的GRAS結構域中的C-末端突變通常導致功能喪失(Dill等，(2004)尸/朋fCe/n6:1392-1405)，組成型GA生長反應表型值得注意的是，最近鑒定的蕪青(份a抓carapa)突變體^rga7-d(Muangprom等，(200》尸/aW尸/yw'o/.137:931-938)和大麥j/"/c突變體(G油ler等，(2002)尸/朋fP/yAy/o/.129:191-200)除外。為跟上農業生產增加的需求，對于遺傳工程的農業植物，需要改善農藝學特征的新目標。涉及在植物中控制細胞分裂和伸長的蛋白的編碼基因的分離和分子表征將為農業科學家提供操作的新目標。發明概迷提供用于在植物中表達編碼野生型和變體形式的DELLA蛋白的基因的組合物和方法，所述DELLA蛋白由玉米(Zeawa;^)(Zm-D9)基因編碼。該組合物含有編碼野生型和變體形式的Zm-D9蛋白的分離的多核苦酸分子。該組合物還包含玉米D9基因的分離的多核苷酸分子。本發明的多核苷酸分子例如可在轉化植物中用于野生型和變體形式的Zm-D9蛋白的組織優選表達或組成型表達、用于反義抑制Zm-D9基因和用于分離編碼DELLA蛋白的同源多核普酸分子。這些多核苷酸分子用于改變植物生長(尤其是植物的莖和根生長)的方法中，更具體地說，用于降低或增加植物高度的方法中。在本發明的一個實施方案中，所述多核苷酸分子用于生產矮化才直物。提供含有本發明的多核苷酸分子的表達盒。另外提供轉化植物、其植物組織、植物細胞和種子。提供由本發明的多核苷酸分子編碼的分離的蛋白。附圖筒述圖1圖示了Zm-D9MUT1等位基因分離的非GA3反應型植物(左側)和反應型植物(右側)。圖2圖示了玉米矮化8和矮化9基因的染色體定位。燕麥附加系的分析PCR表明，和由遺傳作圖所預測的一樣，推定的Zm-D9基因實際上位于玉米染色體5上。該基因被發現處于與陽性對照Zm-D8PCR產物(已知其位于染色體1上)不同的位置。圖3A-3F圖示了與AC-GFP1(青色多管水母04e^oreacoenz/^cms0GFP)融合的玉米DELLA蛋白的亞細胞定位。圖3A是DSRED(珊瑚屬(Z)^cosoma^.)紅色熒光蛋白)表達對照。圖3B是Zm-D8:ACGFP1。圖3C是A和的B合并。圖3D是DSRED表達對照。圖3E是Zm-D9:ACGFP1。圖3F是D和E的合并。綠色條棒在圖中指示10,圖4圖示了發芽后56天的擬南芥(^4ra6^fop^Columbia12生態型T2才直物，其含有由MS-S2a啟動子驅動的玉米DELLAcDNA。由左至右MS-S2APRO::GUS;MS-S2APRO::ZM-D8;MS-S2APRO::ZM-D9;MS-S2APRO::固TlZM-D9;MS誦S2APRO::ZM-D8MPL;和MS-S2APRO::ZM-D8固T。圖5圖示了擬南芥Tl植物的代表性裂花，其含有由MS-S2a啟動子驅動的玉米DELLAcDNA。由以上花中除去兩個花瓣和兩個萼片。圖6為Zm國D9(SEQIDNO:2)和固T1Zm-D9(SEQIDNO:4)蛋白的氨基酸序列的M酸序列比對。圖7為玉米(ZM)、擬南芥(AT)、蕪菁(BR)、大麥(HoWewmvw/gare)(HV)、稻(O7zara"va)(OS)和小麥(rht-Dla/b)的DELLA蛋白的多重氨基酸序列比對。圖8為Zm-D9(SEQEDNO:l)和MUT1Zm-D9(SEQIDNO:3)的核苷酸序列的核苷酸序列比對。圖9為編碼玉米(ZM)、擬南芥(AT)、蕪菁(BR)、大麥(/ZorafeiW2vw/gare)(HV)、稻(Oo^as加/va)(OS)和小麥(rht-D1a/b)的DELLA蛋白的核苷酸序列的多重核苷酸序列比對。圖10提供了d8和d9基因在經LynxMPSS系統獲得的32個不同組織和發育階段的玉米中的相對表達水平(以ppm表示)(Brenner等,(2000)/WAS97:1665-1670和Brenner等，(2000)iV加B/ofec/mo/18:630-634)。垂直線依據獲得樣品的器官劃分圖表。圖11提供了部分必和D9入門克隆(entryclone)圖譜，該圖譜顯示了所生產的結構域交換嵌合體。A-顯示了必和D9入門克隆的部分圖譜以及每個指示區域中編碼的氨基酸差異。必INDEL的氨基酸序列為SGSGSGQPTDASPPA(SEQIDNO:7)。M777Z)iINDEL氨基酸序列為QPTDASSPAAG(SEQIDNO:8)。B-顯示了基于必等位基因(白色區域)的嵌合體的部分圖譜，MUT1D9區段為灰色。C-顯示了基于A^/77D9等位基因(灰色區域)的嵌合體的部分圖譜，必區段為白色。圖12詳述了T2擬南芥植物在生長期8.00的形態數據(Boyes等，(2001)尸/朋fCe〃13:1499-1510),該植物由MS-S2A啟動子表達天然必和必等位基因的cDNA。上標字母表示依據LSD分析于95%置信水平彼此不是顯著不同的組別。數據為4個獨立轉化事件的8個平行測定(replicates)的平均值。圖13提供了在擬南芥T2和GS3xGaspeFlint玉米TO植物中有關開花過渡的數據。上標字母表示依據LSD分析于95%置信水平彼此不是顯著不同的組別。這些數據為4個獨立事件的8個平行測定的平均值。玉米數據由每個構建體的25個獨立轉化事件的1個平行測定獲得。圖14詳述了必/D9結構域交換Tl擬南芥的形態學和開花時間數據。注意，上標字母表示依據LSD分析于95%置信水平彼此不是顯著不同的組別。ALT-改變；等位基因的表型關系被交換的多態性改變，使得差異性不再顯著。REV-逆轉；多態性使等位基因的表型關系產生統計學顯著的逆轉。MS-S2A啟動子用于驅動所有以上的編碼序列(CDS)。數據為每個構建體的16.3個獨立轉化事件的平均值。在主要生長期8.00時檢測蓮座直徑、高度、長角果長度和長角果寬度(Boyes等，(2001)P/朋fCe〃13:1499-1510)。在主要生長期5.10時檢測至開花的天數和開花時的蓮座葉數。序列表列于附隨序列表中的核苷酸和氨基酸序列使用核苷酸堿基的標準字母縮寫和氛基酸的3字母編碼顯示。核苦酸序列遵循常規標準，從序列的5'末端開始并向前(即排列從左至右)前進至3'末端。只顯示了每個核酸序列的一條鏈，但要理解，任何提到顯示鏈之處均包括互補鏈。氨基酸序列遵循常規標準，從序列的氨基末端開始并向前(即每行由左至右)前進至氣基末端。列于附隨序列表中的核香酸和氨基酸序列使用核苷酸堿基的標準字母縮寫和氛基酸的3字母編碼顯示。核苦酸序列遵循常規標準，從序列的5'末端開始并向前(即每行由左至右)前進至3'末端。只顯示了每個核酸序列的一條鏈，但要玻解，任何提到顯示鏈之處均包括互補鏈。氨基酸序列遵循遵循常規標準，從序列的氨基末端開始并向前(即每行由左至右)前進至羧基末端。SEQIDNO:1顯示了Zw-D9基因的野生型等位基因的全長編碼序列。SEQIDNO:2顯示了由SEQIDNO:1編碼的Zm-D9氨基酸序列。SEQIDNO:3顯示了沒有終止密碼子的Zm-D9基因的野生型等位基因的全長編碼序列。SEQIDNO:3的核苷酸1-1875對應于SEQIDNO:1的核苷酸1-1875。如有需要，可以將終止密碼子加入SEQIDNO:3的核苷酸序列或任何其它沒有終止密碼子的編碼序列的3'末端。這樣的終止密碼子包括例如TAA、TAG和TGA。SEQE)NO:4顯示了Zw-D9基因的突變等位基因(MUTl)的全長編碼序列。SEQIDNO:5顯示了由SEQIDNO:4編碼的Zm-D9氨基酸序列。SEQIDNO:6顯示了沒有終止密碼子的Zw-D9基因的突變等位基因(MUTl)的全長編碼序列。SEQIDNO:6的核苷酸1-1866對應于SEQIDNO:4的核苷酸1-1866。必INDEL的氨基酸序列為SEQIDNO:7。INDEL的氨基酸序列為SEQIDNO:8。發明詳迷本發明涉及改變植物生長的組合物和方法。所述組合物包括含有玉米D9基因(其在本文被稱為Zm-D9基因)的野生型和突變等位基因的全長編碼序列的分離的多核苷酸分子。盡管已在遺傳學上描述了Zm-D9(Winkler和Freeling(1994)尸/朋to193:341-348)，但以前還沒有在分子水平上表征該基因。本發明還提供由Zm-D9的野生型和突變等位基因編碼的DELLA蛋白的M酸序列。本發明的方法涉及用編碼野生型和變體形式的、由Zm-D9編碼的玉米DELLA蛋白的多核苷酸分子轉化植物。本發明的多核苷酸分子可用于在^f直物中改變莖或桿(stalk)的生長，以便產生莖或桿改變的轉化植物。更具體地說，所述多核苷酸分子可用于降低或增加莖或桿的高度，以便產生林高或林型降低或提高的植物。多核苷酸分子以需要的方式還用于在轉化植物中改變根的結構和其它農業性狀。這樣的農業性狀包括但不限于結軒(seedset)、種子數、可收獲的產量、穗長度、干旱耐受性、水利用效率、氮利用效率、倒伏抗性、葉面積、氮累積、光合能力以及碳和氮分配。因此，本發明提供轉化植物、植物細胞、植物組織和種子。所述多核苷酸分子還用于構建隨后轉化入目標植物和植物細胞中的表達盒、用作分離其它D9樣基因的探針、用作分子標記等。本發明的組合物包括天然野生型和MUT1Zm-D9多核苷酸分子及其變體和片段。該組合物還包括天然野生型和MUT1Zm-D9多核苷酸分子的對應氣基酸序列，以及這些氨基酸序列的片段和變體。Zm-D9序列示于SEQIDNO:1-6。核苷酸序列或對應的反義序列用于調節植物或植物細胞中的Zm-D9蛋白的表達。也就是說，所述編碼序列可用于增加表達，而反義序列可用于降低表達。已知DELLA蛋白調節植物細胞伸長，可用于改變例如植物細胞伸長、林高和根伸長。參見Itoh等，(2002)P/awCe〃14:57刁0;Achard等，(2003)尸/朋fCd/15:2816-2825;以及Fu和Harberd(2003)A^w^421:740-743;所有這些文獻都在此引入作為參考。因此，本發明的多核苷酸分子用于改變植物生長的方法。在本發明的一個實施方案中，本發明的多核苷酸分子用于改變^t物生長的方法中。為此，本發明的多核普酸分子可用于與眾多植物啟動子中的4壬一種有效連接的表達盒或多核苷酸構建體。可^皮本發明方法影響的柏物生長方面包括f旦不限于以下的一項或多項4朱高；莖或桿高度；檔:物莖或桿代謝活性、根結構的一個或多個方面(例如根深度、根角度、根分枝、根尖數量、節位根直徑、節位根體積、根代謝活性)；細胞和器官的大小、形狀和數量；細胞分裂速率；細胞伸長速率；植物、其器官、組織和細胞的生長速率；器官生長(organinitiation)的時間和位置；壽命等等。本發明的方法包括用本發明的多核苷酸分子轉化植物，以降低植物生長。在本發明的一個實施方案中，用與在^i物中驅動表達的啟動子有效連接的MUT1Zm-D9多核苷酸分子轉化植物。該多核苷酸分子含有示于SEQIDNO:4或6的核苷酸序列、編碼示于SEQIDNO:5的多肽的核香酸序列，或者任何這些多核苷酸分子的片段或變體，所述片段或變體編碼的多肽保留與天然MUT1Zm-D9多肽基本相同的生物活性。通過在^i物中表達該MUTlZm-D9多核苷酸分子，可以產生抹型降低的植物一矮化植物。因此，本發明的方法用于生產作物的矮化變種。通過這些方法獲得具有改良的農業性狀的矮化作物，所述改良的農業性狀例如為倒伏可能性下降、水利用效率增加、生命周期下降、收獲效率增加和每單位面積的產量增加。所述"矮化"意指非典型地小。所述"矮化植物"意指非典型地小的植物。一般而言，這樣的"矮化植物"的抹型或高度由典型植物的林型或高度降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%以上。一般而言，但非獨有地，這樣的矮化植物的特征在于與典型植物相比時莖、桿或干的長度下降。本發明包括分離的或基本純化的多核苷酸分子或蛋白質組合物。"分離"或"純化"的多核苷酸分子或蛋白或其生物活性部分，基本上或實質上不含通常與在其天然環境中存在的多核苷酸分子或蛋白伴隨或相互作用的組分。因此，當通過重組技術生產時，分離或純化的多核苷酸分子或蛋白基本上不含其它細胞材料或培養基，或者在化學合成時基本上不含化學前體或其它化學品。"分離"的多核苷酸分子最好不含在該多核苷酸分子所來自的生物基因組DNA中天然側接該多核苷酸的序列(即位于該多核苷酸的5'和3'末端的序列)(最好為蛋白編碼序列)。例如，在不同的實施方案中，分離的多核苷酸分子可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的以下核苦酸序列其在該多核苷酸所來源的細胞基因組DNA中天然側接該多核苷酸。基本上不含細胞物質的蛋白質包括具有少于約30%、20%、10%、5%或1%(以干重計)污染蛋白的蛋白制品。當本發明的蛋白或其生物活性部分為重組產生時，培養基中最好提供少于約30%、20%、10%、5%或1%(以干重計)的化學前體或非目標蛋白化學品。本發明也包括所公開的多核苷酸分子和由此編碼的蛋白的片段和變體。所述"片^:"是指部分多核苷酸分子或部分氨基酸序列及由此編碼的蛋白。多核苷酸分子片段可編碼保留本文公開的野生型和MUT1Zm-D9蛋白的生物活性并因此保留赤霉素反應型抑制活性的蛋白片段。或者，用作雜交探針的多核苷酸分子片段通常不編碼保留生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列片段的范圍可為至少約20個核苦酸、約50個核苷酸、約100個核普酸，直至編碼本發明蛋白的全長多核苷酸分子。除非另有說明或由文中顯而易見，否則術語"Zm-D9"意在包括含有Zm-D9基因的野生型和MUT1等位基因及其片段和變體的多核普酸分子。優選地，Zm-D9基因的野生型和MUT1等位基因的這些片段和變體編碼的Zm-D9蛋白保留如本文公開的全長野生型或MUT1Zm-D9蛋白的生物活性。術語"Zm-D9"在本文還可以用于指由本發明的Zm-D9多核苷酸分子編碼的蛋白。編碼本發明的Zm-D9蛋白的生物活性部分的Zm-D9多核苷酸分子片段編碼至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、18400、450、500、550或600個連續氨基酸，或直到本發明的全長野生型或MUT1Zm-D9蛋白中存在的氨基酸總數(例如SEQIDNO:2和5分別為625和622個氨基酸)。用作雜交探針或PCR引物的Zm-D9多核普酸分子片段通常不需要編碼Zm-D9蛋白的生物活性部分。因此，Zm-D9多核苷酸分子片段可以編碼野生型或MUT1Zm-D9蛋白的生物活性部分，或者其可以為使用以下公開的方法可用作雜交探針或PCR引物的片段。Zm-D9蛋白的生物活性部分可如下制備分離本發明的其中一個Zm-D9多核苷酸分子、Zm-D9蛋白的一部分(例如通過體外重組表達)，并評價Zm-D9蛋白的Zm-D9部分的活性。為Zm-D9核普酸序列片段的多核苷酸分子包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、I，IOO、1,200、1,300、1,4001,500、1,600、1,700、1,800或1,850個連續核苷酸，或直至本文所公開的全長Zm-D9多核苷酸中存在的核苷酸數(例如對于SEQIDNO:1、3、4和6分別為1878、1875、1869和1866個核普酸)。"變體"是指基本上相似的序列。對多核苷酸分子而言，變體是在天然多核苦酸分子中的一個或多個內部位點包含一個或多個核苷酸的缺失和/或添加的變體，和/或在天然多核苦酸中的一個或多個位點包含一個或多個核苷酸的取代的變體。本文所用的"天然"多核苷酸分子或多肽分別含有天然的核苷酸序列或氨基酸序列。對多核苷酸分子而言，保守變體包括那些由于遺傳密碼兼并性而編碼本發明的其中一個Zm-D9多肽的氨基酸序列的序列。諸如這些的天然等位基因變體可使用眾所周知的分子生物學技術進行鑒定，例如采用以下概述的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術。變體多核苷酸分子還包括合成的衍生多核苷酸，例如通過例如使用定點誘變產生的但仍編碼本發明的Zm-D9蛋白的那些多核普酸。一般來說，通過本文它處描述的序列比對程序和參數測定，本發明的特定多核苦酸分子的變體與特定多核苷酸分子具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、19%%、97%、98%、99%以上的序列同一性。本發明的特定多核苷酸分子的變體(即參比多核苷酸)還可以通過比較變體多核苷酸分子編碼的多肽與參比多核香酸編碼的多肽之間的序列同一性百分率來評價。因此，例如，公開了編碼與SEQIDNO:2和/或5的多肽具有給定序列同一性百分率的多肽的分離多核苦酸分子。可利用本文它處描迷的序列比對程序和參數來計算任何兩個多肽之間的序列同一性百分率。對于任意給定的本發明多核苷酸分子對，在通過比較它們編碼的兩個多肽所共有的序列同一性百分率來評價它們時，兩個編碼多肽之間的序列同一性百分率至少為約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性。"變體"蛋白是指通過在天然蛋白中的一個或多個內部位點缺失或添加一個或多個氨基酸和/或在天然蛋白中的一個或多個位點具有一個或多個M酸取代而從天然蛋白衍生而來的蛋白。本發明包括的某些變體蛋白是有生物活性的，也就是說它們仍具有所需的天然蛋白生物活性，即如本文所述的野生型或MUT1Zm-D9蛋白活性。這些變體可由例如遺傳多態性或人工操作獲得。通過本文它處所述的序列比對程序和參數測定，本發明的天然Zm-D9蛋白的生物活性變體與天然蛋白的M酸序列具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性。本發明蛋白的生物活性變體與該蛋白的差異可少至1-15個氨基酸殘基，少至1-10個、例如6-10個氛基酸殘基，少至5個氨基酸殘基，少至4個、3個、2個乃至1個氨基酸殘基。本發明的蛋白可通過包括氨基酸取代、缺失、截短和插入在內的多種方法改變。用于這些操作的方法一般是本領域已知的。例如，Zm-D9蛋白的M酸序列變體和片段可通過DNA突變來制備。用于寸秀變和多核苷酸改變的方法在本領域眾所周知。參見例如Kunkel(1985)Prac.Wa".JcadScZ.82:488-492;Kunkel等，(1987)M"/zo必i"五wz3^0/.154:367-382;美國專利第4,873,192號；Walker和Gaastra編輯，(1983)rec/m/拜sMo/ecw/ar腸/ogy(MacMillanPublishingCompany,NewYork),以及其中援引的參考文獻。關于不影響目標蛋白生物活性的適宜氨基酸取代的指導可見于Dayhoff等，(1978)/4Waso/iVofe/wSe《MewceSfrwcfwre(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的才莫型，該文獻通過引用結合到本文中。保守取代可能最佳，例如一個氨基酸#:另一個具有類似特性的氨基酸替換。因此，本發明的基因和多核苷酸分子既包括天然序列，也包括突變形式。同樣，本發明的蛋白包括天然蛋白及其變體和修飾形式。這些變體仍具有所需的野生型或MUT1Zm-D9活性。顯然，在編碼變體的DNA中產生的突變一定不能使序列處于讀框之外，且最好不能形成可產生二級mRNA結構的互補區。參見EP專利申請公開號75,444。預期本文所包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不會產生蛋白特征的徹底改變。不過，在難以提前預測取代、缺失或插入的確切作用時，本領域技術人員會認識到，可通過常規篩選測定來評價這些作用。也就是說，可通過轉基因植物的植物或根形態改變，例如監測用本發明的Zm-D9多核苷酸分子轉化的植物的莖和/或根伸長的改變，評價該活性。參見例如以下的實施例1和圖4。變異的多核苷酸分子和蛋白還包括來源于諸如DNA改組的突變和重組方法的序列和蛋白。采用該方法，可對一個或多個不同的Zm-D9編碼序列進行操作，以得到具有需要特性的新Zm-D9。以此方式可從相關序列多核苷酸群產生重組多核苷酸文庫，所述多核苷酸群^^有的序列區具有顯著的序列同一性，并可在體外或體內同源重組。例如，使用該方法，編碼目標結構域的序列基序可在本發明的Zm-D9基因和其它已知的Zm-D9基因之間改組，以獲得編碼具有改良的目標特性(例如就酶而言增加的Km)的蛋白的新基因。這種DNA改組的策略在本領域是已知的。參見例如Stemmer(1994)尸rac.7《加/.爿cadt/&491:10747-10751;Stemmer(1994)M^re370:389-391;Crameri等，(1997)A^we所oto:/2.15:436-438;Moore等，(1997),Mo/.說o/.272:336-347;Zhang等，(7^7,Ato/.爿o^.t7&494:4504-4509;Crameri等，(1998)逾訓391:288-291;和美國專利第5,605,793和5,837,458號。本發明的多核苷酸分子可用于從其它生物、特別是其它植物、更特別地是其它單子葉植物分離相應序列。以此方式，可使用諸如PCR、雜交等方法，基于其與本文所列出序列的序列同源性對這些序列進行鑒定。本發明包括基于其與本文列出的完整Zm-D9序列或其變體和片段的序列同一性而分離出來的序列。這些序列包括為所公開序列的直系同源物的序列。"直系同源物"是指來源于共同祖先基因的基因，其作為物種形成的結果而存在于不同物種中。當存在于不同物種中的基因的核苷酸序列和/或其編碼的蛋白序列共享至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性時，這些基因被認為是直系同源物。直系同源物的功能在種間通常是高度保守的。因此，本發明包括編碼Zm-D9蛋白并在嚴格條件下與本文公開的Zm-D9序列或其變體或片段雜交的分離多核苷酸分子。在PCR方法中，可設計寡核苦酸引物用于PCR反應，以由提取自任何目標植物的cDNA或基因組DNA擴增相應的DNA序列。設計PCR引物和PCR克隆的方法一般是本領域已知的，公開于Sambrook等,(1989)M/ecw/"rC7ow'"gv爿丄aZoratoyM"w"/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)。另參見Innis等編輯，(1990)尸C7frofocoAs:爿Gw/cfeto她Us朋d^p/Zca".o似(AcademicPress,NewYork);Innis和Gelfand編輯，(1995)PCiSfra吻.es(AcademicPress,NewYork);.以及Innis和Gelfand編輯,(1999)PCiA/"/20AMa"wa/(AcademicPress,NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于使用配對引物、嵌套引物、單特異性引物、簡并引22物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。在雜交技術中，使用全部或部分的已知多核苷酸分子作為探針，其與存在于所選生物的克隆基因組DNA片段或cDNA片段(即基因組或cDNA文庫)群中的其它相應的多核苷酸選擇性雜交。雜交探針可以為基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可用諸如32P的可檢測基團或任何其它可檢測標記物標記。因此，例如，可通過標記基于本發明的Zm-D9多核苷酸的合成寡核苷酸來制備雜交探針。制備雜交探針以及構建cDNA和基因組文庫的方法是本領域公知的，公幵于Sambrook等,(1989)M/ecw/orC7om'"g:爿Z^oraf"Mwwa/(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)。例如，本文^^開的完整Zm-D9多核苷酸分子或其一個或多個部分可以用作能夠與相應Zm-D9多核苷酸分子和信使RNA特異性雜交的探針。為了在多種條件下實現特異性雜交，這些探針包括在Zm-D9多核苦酸序列中的獨特序列，其優選為至少約10個核苷酸長，最優選為至少約20個核苷酸長。這些探針可用于通過PCR擴增選定植物的相應Zm-D9多核苦酸分子。該技術可用于從需要的植物中分離另外的編碼序列，或作為診斷測定來確定植物中編碼序列的存在情況。雜交技術包括平板DNA文庫(或者為噬菌斑或者為菌落；參見例如Sambrook等,(1989)Mo/ecw/arC7om."g:爿丄a6oratoyMawwa/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork))的雜交篩選。這些序列的雜交可以在嚴格條件下進行。所述"嚴格條件"或"嚴格雜交條件，，是指探針與其靶標序列的雜交程度在檢測上高于與其它序列的雜交程度的條件(例如至少為背景的2倍)。嚴格條件是序列依賴性的，在不同環境下將有差異。通過控制雜交嚴格性和/或洗滌條件，可鑒定出與探針100%互補的靶序列(同源探測)。或者，可調整嚴格條件，以允許在序列中存在某些錯配，以便檢測較低程度的相似性(異源探測)。一般來說，探針長度少于約iooo個核普酸，長度最好少于約500個核苷酸。典型地，嚴格條件是指這樣的條件其中鹽濃度小于約1.5MNa離子，典型地為約0.01-1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，pH7.0至8.3,溫度對短探針(例如10-50個核苷酸)為至少約30。C，而對長探針(例如大于50個核香酸)為至少約60。C。嚴格條件還可以通過加入諸如甲酰胺的去穩定劑來實現。示例性的低嚴格條件包括用含30-35%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液于37。C雜交，并用1X陽2XSSC(20XSSC-3.0MNaC1/0.3M檸檬酸三鈉)于50畫55。C洗滌。示例性的中等嚴格條件包括用40-45%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS于37。C雜交，并用0.5X-1XSSC于55-60°C洗滌。示例性的高嚴才各條件包括用50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS于37。C雜交，并用O.IXSSC于60-65°C洗滌。任選地，洗滌緩沖液可包含約0.1%至約1%SDS。雜交持續時間一般低于約24小時，通常約4小時至約12小時。洗滌持續時間至少為足以達到平衡的時間長度。特異性通常隨雜交后洗滌而變，關鍵因素是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對DNA-DNA雜和體而言，Tm可運用Meinkoth和Wahl(1984)v4加/.說oc/ew.138:267-284的等式Tm=81.5。C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(。/o曱酰胺)-500/L來估算；其中M是單價陽離子的摩爾濃度，。/。GC為DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核普酸的百分比，％甲酰胺為雜交溶液中的曱酰胺百分比，L為雜和體的堿基對長度。Tm是指50%互補耙標序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子強度和pH下)。每有1%錯配，Tm就降低約l。C;因此，可調整Tm、雜交和/或洗滌條件，以與所需同一性的序列雜交。例如，如果要尋找>90%同一性的序列，則可將Tm降低10。C。通常，在確定的離子強度和pH下，選擇比特定序列與其互補物的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C的嚴格條件。但是，非常嚴格的條件可使用比熱解鏈溫度(Tm)低l、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可使用比熱解鏈溫度(Tm)低246、7、8、9或10。C的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可使用在比熱解鏈溫度CIm)低ll、12、13、14、15或20。C的雜交和/或洗滌。一般技術人員會理解，使用該等式、雜交和洗滌組成及所需Tm，固有地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴格性變化。如果所需錯配程度使Tm低于45°C(水溶液)或32。C(曱酰胺溶液)，則最好增加SSC濃度，以便可使用豐支高的溫度。核酸雜交的廣泛指引見于Tijssen(1993)丄Worato7他c/e/ciVo6es，第I部，笫2章,(Elsevier,NewYork)和Ausubel等編輯，(1995)C群eW尸rafoco/sM/ecw/ar第2章,(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork)。參見Sambrook等，(1989)M/ecw/crrC7om'"g:」丄cr6orato^yM"wa/(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。以下術語用于描述兩個或多個多核苷酸或多肽之間的序列關系(a)"參考序列",(b)"比較窗",(c)"序列同一性"，和(d)"序列同一性百分率"。(a)本文所用的"參比序列"是用作序列比4史基礎的確定序列。參比序列可以是特定序列的一部分或全部；例如，作為全長cDNA或基因序列的區段，或者完整的cDNA或基因序列。(b)本文所用的"比較窗"是指多核苷酸序列的連續和特定區段，其中比較窗中的多核苷酸序列與參比序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以對兩個多核苷酸進行最優比對。通常，比較窗長度為至少20個連續核苷酸，任選地可為.30個、40個、50個、100個或更長。本領域技術人員應理解，為避免由于在多核苷酸序列中《、有空位而與參比序列具有高相似性，通常引入空位罰分，并由匹配數中扣除。用于比較的序列比對方法在本領域眾所周知。因此，可使用數學算法完成任何兩個序列之間的序列同一性百分率測定。這些數學算法的非限制性實例為Myers和Miller,(1988)4:11-17的算法；25Smith等，(1981)A/v.^;p/.Ma仇2:482的局部比對算法；Needleman和Wunsch，(1970)丄A/o/.5zo/.48:443-453的全局比對算法Pearson和Lipman,(1988)尸raciVa".jcad85:2444-2448的局部檢索比對算法Karlin和Altschul，(1990)Prac.爿cadScz'.[/&4872264的算法，由Karlin和Altschul，(1993)尸roc.A^f/.爿o^.Sc,'.[/&490:5873-5877修改。這些數學算法的計算機實現可用于序列比較，以確定序列同一性。這些實現包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可從Intelligenetics,MountainView,California獲得)；ALIGN程序(版本2,0)及GCGWisconsinGenetics軟件包第10版中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可從AccelrysInc.,9685ScmntonRoad,SanDiego,California,USA獲得)。使用這些程序的比對可使用默認參數進行。CLUSTAL程序充分描述于Higgins等(1988)Gewe73:237-244(1988);Higgins等，(1989)5:151-153;Corpet等，(1988)M/c/e/c爿cZAi饑16:10881-90;Huang等，(1992)8:155-65和Pearson等，(1994)A^A.Mo/.24:307-331。ALIGN程序基于上述Myers和Miller，(1988)的算法。當用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可使用PAM120加權殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4。Altschul等，(1990)7.Afo/.Ao/.215:403的BLAST程序基于上述Karlin和Altschul,(1990)的算法。BLAST核苷酸檢索可用BLASTN程序進行，記分=100,字長-12,以獲得與編碼本發明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可用BLASTX程序進行，記分=50,字長=3，以獲得與本發明的蛋白或多肽同源的氛基酸序列。為了獲得用于比較目的的有空位比對，可如Altschul等，(1997)Wwc/eZc4c/&i^s.25:3389所述使用GappedBLAST(在BLAST2.0中)。或者，可使用PSI-BLAST(在BLAST2.0中)進行迭代檢索來檢測分子間遠緣關系。參見上述Altschul等，(1997)。當使用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST時，可使用各自程序的默認參數(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。也可通過目測人工進行比對。除非另有陳述，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用笫10版GAP使用以下參數獲得的值核苷酸序列的°/。同一性和％相似性使用空位加權50、長度加權3和nwsgapdna.cmp打分矩陣酸序列的％同一性和％相似性使用空位加權8、長度加權2和BLOSUM62打分矩陣；或其任何等價程序。所述"等價程序"意指，當與GAP第10版生成的對應比對相比較時，對于任意2個正被討論的序列，產生具有相同核苷酸或氛基酸殘基匹配和相同百分比序列同一性的比對的任意序列比對程序。GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)J.Mo/.Ao/.48:443-453的算法來尋找使匹配數最大并使空位數最小的兩個全序列的比對。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并建立具有最大匹配堿基數和最少空位的比對。它允許在匹配堿基單元中提供空位《1入罰分和空位延伸罰分。GAP必須使匹配空位引入罰分數對其插入的每個空位有利。如果選擇的空位延伸罰分大于O，則GAP必須還使空位長度乘以空位延伸罰分對插入的每個空位有利。在GCGWisconsinGenetics軟件包第IO版中，默認的空位引入罰分值和空位延伸罰分值對蛋白序列分別為8和2。對于核苷酸序列，默認的空位引入罰分為50,而默認的空位延伸罰分為3。空位引入和空位延伸罰分可以選自0-200的整數表示。因此，例如，空位引入和空位延伸罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65以上。GAP代表了最好的序列比對家族的一員。該家族可能有很多成員，但其它成員都不具有更好的質量。GAP表現出四個方面的序列比對優勢質量、比值、同一性和相似性。質量是為了比對序列而最大化的量度。比值是質量除以更短區段的堿基數。同一性百分率是實際匹配的符號的百分率。相似性百分率是相似符號的百分率。與空位相對的符號被忽略。當某對符號的打分矩陣值大于等于相似性闊值0.50時，記錄相似性。在第10版GCGWisconsinGenetics軟件包中所用的打分矩陣為BLOSUM62(參見Henikoff和Henikoff(1989)尸rac.A^/.ZcW.Sc/.OS^89:10915)。(c)本文使用的在兩個多核苷酸或多肽序列背景下的"序列同一性，，或"同一性"是指在特定比較窗內比對獲得最大對應時兩個序列中相同的殘基。當序列同一性百分率用于指蛋白時，則認為不一致的殘基位置通常差異在于保守氨基酸取代，在保守氨基酸取代中，氨基酸殘基被其它具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)的絲酸殘基取代，從而不改變分子的功能特性。當序列差異在于保守取代時，可上調序列同一性百分率，以校正取代的保守性質。因這些保守取代而不同的序列^f皮稱為具有"序列相似性，，或"相似性"。進行這種調整的方法是本領域技術人員眾所周知的。典型地，其包括將保守取代記錄為部分而不是完全錯配，從而提高了序列同一性百分率。因此，例如，在相同氨基酸被給予記分1而非保守取代被給予記分0的情況下，保守取代被給予介于0和1之間的記分。保守取代的記分可通過例如用PC/GENE程序(Intelligenetics,MountainView,California)執行來計算。(d)本文所用的"序列同一性百分率"是指通過在比較窗內比較兩個最優比對序列而確定的值，其中比較窗中的多核苷酸序列部分與參比序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以優化兩個序列的比對。如下計算百分率測定兩個序列中存在相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數，獲得匹配位置數，用該匹配位置數除以比較窗中的總位置數，并將結果乘以100,獲得序列同一性百分率。術語"多核香酸"的應用并不限定于本發明為含DNA的多核苷酸。本領域一般技術人員會認識到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的組合。這些脫氧核糖核苷酸與核糖核苦酸包括天然分子和合成類似物這二者。本發明的多核苷酸還包括所有序列形式，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發夾、莖環結構等。本發明的Zm-D9多核苷酸分子可在用于目標植物Zm-D9中表達的表達盒中提供。該表達盒包括與本發明的Zm-D9多核苷酸分子有效連接的5'和3'調控序列。"有效連接的"是指兩個或多個元件的功能性連接。例如，目標多核苷酸分子與調控序列(即啟動子)之間的有效連接是一種功能性連接，其可使目標多核普酸分子表達。有效連接的元件可以是連續的或不連續的。當用于指兩個蛋白編碼區的連接時，所述有效連接是指編碼區處于相同讀框中。表達盒可另外包含至少一個要共轉化到生物中的其它基因。或者，其它基因可在多個表達盒上提供。這樣的表達盒可提供多個限制性位點和/或重組位點，用以插入Zm-D9多核香酸分子，使其處在調控區的轉錄調控之下。表達盒可另外含有選擇性的標記基因。表達盒按轉錄的5'-3'方向包括在植物中起作用的轉錄和翻譯起始區(即啟動子)、本發明的Zm-D9多核苷酸分子及轉錄和翻譯終止區(即終止區)。調控區(即啟動子、轉錄調控區和翻譯終止區)和/或本發明的Zm-D9多核苷酸分子對宿主細胞或彼此之間可以是天然的/類似的。或者，調控區和/或本發明的Zm-D9多核苷酸分子對宿主細胞或彼此之間可以是異源的。本文用于指示序列的"異源的"是指來源于外來物種的序列，或者，如果來自相同物種，則通過有意的人為干涉而在組成和/或基因組基因座方面由其天然形式發生顯著改變。例如，與異源多核苷酸分子有效連接的啟動子來自不同于多核苷酸分子來源物種的物種，或者，如果來自相同/類似物種，則其中一個或二者由其初始形式和/或基因組基因座發生顯著改變，或者啟動子不是有效連接的多核苷酸的天然啟動子。本文所用的嵌合基因包含與轉錄起始區有效連接的編碼序列，所述轉錄起始區對于編碼序列來說是異源的。盡管使用異源啟動子表達所述序列可能最佳，但還可使用天然啟動子序列。這些構建體可改變植物或植物細胞中的Zm-D9表達水平。因此，可改變植物或才直物細胞的表型。29終止區對轉錄起始區可以是天然的，對有效連接的目標Zm-D9多核苷酸分子可以是天然的，對植物宿主可以是天然的，或者可以相對于啟動子、目標Zm-D9多核苷酸分子、植物宿主或其任何組合得自另一個來源(即外源的或異源的)。便利的終止區可從根瘤土壤桿菌04.fwme/ac/ew力的Ti質粒獲得，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區。另參見Guerineau等，(1991)Afo/.G饑262:141-144;Proudfoot(1991)Ce〃64:671-674;Sanfacon等，(1991)Ge"^Dev.5:141-149;Mogen等，(1990)尸/a"fCW/2:1261畫1272;Munroe等，(1990)91:151-158;Ballas等，(1989)A^c/ezc爿aAi^s.17:7891-7903和Joshi等，(1987)M/d"c爿c/ds^仏15:9627-9639。在合適情況下，為了在轉化植物中增加表達，可優化多核苷酸。也就是說，可用植物優選的密碼子來合成多核苷酸，以提高表達。參見例如Campbell和Gowri(1990)尸/朋f尸/2;;w0/.92:1-11關于宿主優選的密碼子選擇的論述。這些方法可從合成植物優選基因的領域獲得。參見例如美國專利第5,380,831和5,436,391號，以及Murray等，(1989)M/c/dcZc/Ai^&17:477-498，所述文獻通過引用結合到本文中。已知在細胞宿主中增強基因表達的其它序列修飾。這些修飾包括除去編碼-假多聚腺苷化信號的序列、外顯子-內含子剪接位點信號、轉座子樣重復序列以及可能對基因表達不利的其它這類已充分表征的序列。通過參比在宿主細胞中表達的已知基因進行計算，可將序列的G-C含量調整至給定細胞宿主的平均水平。在有可能時，對序列進行修飾，以避免預測的發夾二級mRNA結構。表達盒可另外含有5'前導序列。這類前導序列可用于增強翻譯。翻譯前導序列是本領域已知的，包括小RNA病毒前導序列，例如EMCV前導序歹'K腦心肌炎S'非編碼區)(Ekoy-Stein等，(1989)尸rac.iV加/.^4c"dt/&486:6126-6130);馬鈴薯Y病毒前導序列，例如TEV前導序列(煙草蝕紋病毒)(Gallie等，(1995)G聰165(2):233-238),MDMV前導序列(玉米矮花葉病毒)(7^o/ogy154:9-20)，以及人免疫3泉蛋白重鏈結合蛋白(BiP)(Macejak等，(1991)7\^wre353:90-94);苜蓿花葉病毒殼蛋白mRNA的非翻譯前導序列(AMVRNA4)(Jobling等，(1987)M^we325:622-625);煙草花葉病毒前導序列(TMV)(Gallie等，(1989)載于Mo/ecw/"rA'o/o^Cech編輯，(Liss,NewYork),237-256頁)；以及玉米褪綠斑駁病毒前導序列(MCMV)(Lommel等，(1991)F/ra/ogy81:382-385)。另參見Della-Cioppa等，(1987)戶/a"f尸/戸'o/.84:965-968。在制備表達盒時，可操作多種DNA片段，從而提供方向正確并在適宜時讀框適合的DNA序列。為此，可使用適配體或連接物來連接DNA片段，或者可包括其它操作，以提供便利的限制性位點、除去冗余的DNA、除去限制性位點等。為此目的，可包括體外誘變、引物修復、限制、退火、再取代(例如轉換和顛換)。在本發明實踐中可使用多種啟動子，包括目標多核苷酸序列的天然啟動子。可基于所需結果選擇啟動子。可將本發明的核酸與組成型啟動子、組織優選啟動子或其它啟動子組合，用于在植物中表達。這樣的組成型啟動子包括例如在WO99/43838和美國專利第6,072,050號中7>開的Rsyn7啟動子的核心啟動子和其它組成型啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odell等，(1985)胸訓313:810-812);水稻肌動蛋白(McElroy等，(1990)P/a加Ce〃2:163-171);泛素(Christensen等，(1989)尸/朋fMo/.12:619-632和Christensen等，(1992)尸teMo/.所o/.18:675-689);pEMU(Last等，(1991)77eor.^;/.81:581-588);MAS(Velten等,(1984)3:2723-2730);ALS啟動子(美國專利第5,659,026號)等。其它組成型啟動子包括例如美國專利第5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268，463、5，608,142和6,177,611號。的基因表達。基于此目的，啟動子可以是化學誘導型啟動子，在此情況下使用化學物質誘導基因表達，或者是化學阻抑型啟動子，在此情31況下通過使用化學物質抑制基因表達。化學誘導型啟動子是本領域已知的，包括但不限于可^皮恭璜酰胺除草劑安全劑激活的玉米In2-2啟動子、可被用作前應急除草劑的疏水親電化合物激活的玉米GST啟動子，以及^^皮水楊酸激活的煙草PR-la啟動子。其它值得關注的化學調節啟動子包括類固醇響應型啟動子(參見例如Schena等，(1991)尸roc.爿cad"&488:10421-10425和MeNellis等，(1998)P/朋f/.14(2):247-257中的糖皮質激素誘導型啟動子)以及四環素誘導型和四環素抑制型啟動子(參見例如Gatz等，(l991)Mo/.227:229-237和美國專利第5,814,618和5,789,156號)，所述文獻通過引用結合到本文中。可使用組織優選啟動子將增強的Zm-D9表達定向于特定植物組織。組織優選啟動子包括Yamamoto等，(1997)尸/a"f12(2):255-265;Kawamata等，(1997)CW/戶/ywo/.38(7):792-803;Hansen等，(1997)Mo/.254(3):337畫343;Russell等，(1997)6(2):157-168;Rinehart等,(1996)P/a"fP/j>^o/.112(3):1331-1341;VanCamp等，(1996)P/朋f尸/2;^0/.112(2):525誦535;Canevascini等，(1996)P/aWP/j^y/o/.112(2):513-524;Yamamoto等，(1994)尸/朋fCe//尸/2;wo/.35(5):773-778;Lam(1994)Ke油/VoW,Ce〃20:181-196;Orozco等，(1993)尸/朋《Mo/所o/.23(6):1129-1138;Matsuoka等，(1993)A^/.爿o^.Sc/.U&490(20):9586-9590和Guevara-Garcia等，(1993)尸/a加,4(3):495-505。如有需要，可修飾這樣的啟動子，以減弱表達。本發明的某些實施方案利用以組織優選啟動子轉化的植物，尤其是莖優選啟動子，其與編碼Zm-D9蛋白的核苷酸序列有效連接。在本發明的一個實施方案中，MS-S2A啟動子(Abrahams等，(1995)P/amMo/說o/27:513-28)與編碼野生型或MUT1Zm-D9蛋白的多核苷酸序列有效連接。啟動子的選擇，以及固有的組織特異性，應有可能影響表達本發明的野生型或MUT1Zm-D9蛋白的轉基因植物的形態改變的程度或強度。就MS-S2A啟動子而言，莖優選的意^^木著已有文件記錄到與維管元件相關的表達(未顯示數據)。MS-S2A啟動子似乎對MUT1Zm-D9的表達最佳，而肌動蛋白一一種在葉組織中具有較高表達的組成型表達啟動子，在用于MUT1ZM-D9蛋白表達時，形態改變非常適度或輕微。葉優選啟動子是本領域已知的。參見例如Yamamoto等，(1997)尸/朋f,12(2):255-265;Kwon等，(1994)尸/a"f尸/ywo/.105:357-67;Yamamoto等，(1994)尸/朋fCe〃尸/^wo/.35(5):773-778;Gotor等，(1993)尸/朋"3:509-18;Orozco等，(1993)P/a"fAfo/.腸/.23(6):1129-1138;和Matsuoka等，(1993)Prac.Ato/.爿cadSc/."&490(20):9586-9590。(參見上文)。根優選啟動子是已知的，可選自眾多可由文獻獲得的啟動子，或從多種相適物種中從頭分離。參見例如Hire等，(1992)P/a"fMo/.5/o/.20(2):207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)尸/"mC"/3(10):1051-1061(法國菜豆GRP1.8基因的根特異性控制元件)；Sanger等，(1990)P/aWMo/.Ao/.14(3):433-443(根瘤土壤桿菌甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；以及Miao等，(1991)Ce〃3(l):ll-22(編碼胞質谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其可在大豆根和根瘤中表達)。另參見Bogusz等，(1990)戶/"WCe〃2(7):633-641，其中描述了從固氮非豆科榆科山黃麻(尸araspow/a朋oferaow'0和相關的非固氮非豆科山黃麻(7>ematom朋tosa)的血紅蛋白基因分離的兩個根特異性啟動子。這些基因的啟動子與p-葡萄糖醛酸苷酶報告基因連接，并導入到非豆科煙草(Wco"a"atoZ)Gfcw附)和豆科百脈根(丄o^sco/w'cw/aft^)這二者中，在這二種情況下根特異性啟動子活性都得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對發沖艮土i裏桿菌04gra6arfenwwr/2/zoge"e力中高表達的rolC和rolD根誘導基因的啟動子的分析(參見尸/"W(Limerick)79(1):69-76)。他們推斷增強子和組織優選的DNA決定子在這些啟動子中^Jf離的。Teeri等，(1989)用與lacZ融合的基因表明，編碼章魚33堿合酶的土壤桿菌(jgrak7"m"w)T-DNA基因在根尖表皮中尤其有活性，TR2'基因在完整植物中是根特異性的，并被葉組織中的傷口刺激，與殺蟲劑或殺幼蟲劑基因一起使用是尤其合乎需要的特征組合(參見5"MBOJ.8(2):343_350)。與"/^//(新霉素磷酸轉移酶11)融合的TR1'基因表現出類似的特征。其它的根優選啟動子包括VffiNOD-GRP3基因啟動子(Kuster等，(1995)尸/朋fMo/.說o/.29(4):759-772)和roffi啟動子(Capana等，(1994)Pte編.艦25(4):681腸691)。另參見美國專利第5,837,876、5,750,386、5，633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179號。在需要低水平表達的情況下，將使用弱啟動子。一般而言，所述"弱啟動子"意指以低水平驅動編碼序列表達的啟動子。所述低水平意指約1/1000轉錄物的水平至約1/100,000轉錄物的水平至約1/500,000轉錄物的水平。或者，要認識到，弱啟動子還包括僅在某些細胞而不在其它細胞中表達的啟動子，以產生總體低水平表達。在啟動子以不可4^受的高水平表達的情況下，可以缺失或修飾部分啟動子序列，以降低表達水平。這樣的弱組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子(WO99/43838和美國專利第6,072,050號)、核心CaMV35S啟動子等。其它組成型啟動子包括例如美國專利第5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268，463和5,608，142號。另參見美國專利第6,177,611號，該專利在此引入作為參考。表達盒還可以包括用于選擇轉化細胞的選擇性標記基因。選擇性標記基因用于轉化細胞或組織的選擇。標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新霉素磷酸轉移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉移酶(HPT)的那些，以及賦予對除草劑化合物(例如草銨磷、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D))抗性的基因。其它選擇性標記包括表型標記，例如P-半乳糖苷酶和熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)(Su等，(2004)說o&c/mo/85.610-9和Fetter等，(2004)尸/a"fCe〃/6.'215畫28)、青色熒光蛋白(CYP)(Bolte等，(2004)Ce〃117:943-54和Kato等，(2002)P/aW尸/2)w'o/129:913國42)和黃色焚光蛋白(來源于Evrogen的PhiYFP,參見Bolte等，(2004)/.Ce〃117:943-54)。關于其它選擇性標記，通常參見Yarmnton(1992)CWr.0//".5zo&cA.3:506-511;Christopherson等，(1992)尸rac.Sc/.(7&489:6314-6318;Yao等，(1992)Ce〃71:63-72;Reznikoff(1992)A/o/.M/cra6/o/.6:2419-2422;Barkley等，(1980)載于772eOpera",177-220頁；Hu等，(1987)Ce〃48:555-566;Brown等，(1987)Ce〃49:603-612;Figge等，(1988)Ce〃52:713-722;Deuschle等，(1989)Prac.Ato/.爿c/.(7&486:5400-5404;Fuerst等，(1989)Prac.A^/.爿cad"&486:2549-2553;Deuschle等，(1990)Sc/e"ce248:480-483;Gossen(1993)博士論文，海德堡大學；Reines等，(1993)P廠oc.Ato/.爿cadW&490:1917-1921;Labow等，(1990)Mo/.Ce〃.說o/.10:3343-3356;Zambretti等，(1992)尸rac,Ato/.LS489:3952-3956;Baim等，(1991)A^/.A^,5W.88:5072-5076;Wyborski等，(1991)M/c/e/c爿d必19:4647-4653;Hillenand-Wissman(1989)7bp/aMo/.Sfrwc.說o/.10:143-162;Degenkolb等，(1991)爿w"附/cn)6.爿ge^yOzewoAer.35:1591-1595;Kleinschnidt等，(1988)說ocAem,'對^27:1094-1104;Bonin(1993)博士論文，海德堡大學；Gossen等，(1992)Ato/.爿a^U&489:5547-5551;Oliva等，(1992)爿油'm/cra6.4gentoC/jemo^er.36:913-919;Hlavka等，(1985)7fo"必ooA:o/Ex/enimewto/尸/wrmaco/ogy,第78巻(Springer畫Verlag,Berlin);Gill等,(1988)A^we334:721-724。這些公開內容通過引用結合到本文中。以上列出的選擇標記基因沒有限制性。在本發明中可使用任何選擇性標記基因。在一個實施方案中，將目標多核普酸分子靶向用于表達的葉綠體。以此方式，在目標多核香酸沒有直接插入葉綠體的情況下，表達盒將另外包含編碼轉運肽的核酸，以將目標基因產物導入葉緣體中。35這樣的轉運肽是本領域已知的。參見例如VonHeijne等，(1991)尸/a"fMo/.5/o/.Aep.9:104-126;Clark等，(1989)J.說o/.CTzem.264:17544-17550;Della-Cioppa等，(1987)尸/a"fP/2"Zo/.84:965-968;Romer等，(1993)萬/oc/z柳..腦.Co麵w".196:1414-1421;和Shah等，(1986)233:478-481。葉綠體耙向序列是本領域已知的，包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的葉綠體小亞基(deCastroSilvaFilho等，(1996)Mo/,說o/.30:769-780;Schnell等，(1991)/.Ao/.C/ze肌266(5):3335-3342);5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等，(l990)J.5/o/we/w/>.22(6):789-810);色氨酸合酶(Zhao等，(1995)>7.5/o/.CTzem.270(11):6081-6087);質體藍素(Lawrence等，(1997)/.說o/.C&w.272(33):20357-20363);分支酸合酶(Schmidt等，(1993)說o/.C/zem.268(36):27447-27457);以及集光葉綠素^結合蛋白(LHBP)(Lamppa等，(1988)/.5,'o/.C/j柳.263:14996-14999)。另參見VonHeijne等，(1991)P/a加Afo/.S/o/.A印.9:104-126;Clark等，(1989)/.說o/.C/ew.264:17544-17550;Della-Cioppa等，(1987)尸/a"fP/^/o/.84:965-968;Romer等，(1993)5/0/7/2".Comww".196:1414-1421;和Shah等，(1986)Sc/e"ce233:478-481。用于轉化葉綠體的方法是本領域已知的。參見例如Svab等，(1990)/Voc.爿cac/.87:8526-8530;Svab和Maliga(1993)A^/.爿cadSc/.90:913-917;Svab和Maliga(1993)/.12:601-606。該方法依靠粒子槍傳遞含有選擇性標記的DNA,并將該DNA通過同源重組靶向質體基因組。另外，可通過核編碼和質體導向的RNA聚合酶的組織優選的表達反式激活質體攜帶的沉默轉基因的，由此實現質體轉化。這樣的系統已在McBride等，(1994)尸rac.Waf/.y4cadSc/.[/&491:7301-7305中凈良道。可以優化被靶向葉綠體的目標多核苦酸，用以在葉綠體中表達，以說明植物核和該細胞器之間的密碼子使用差異。以此方式，可使用36葉綠體優選的密碼子合成目標多核苷酸分子。參見例如美國專利號5,380,831,該專利通過引用結合到本文中。本發明的方法包括將多肽或多核苷酸分子導入到植物中。"導入"是指向植物提供多核苷酸分子或多肽，提供方式可使序列進入植物細胞內部。本發明的方法不依賴于向植物中導入序列的具體方法，只要多核苷酸分子或多肽進入植物的至少一個細胞內部。將多核苷酸分子或多肽導入4直物中的方法是本領域已知的，包括但不限于穩定轉化法、瞬時轉化法和病毒介導的方法。"穩定轉化"意指導入到植物中的目標核苷酸構建體整合到植物基因組中，并能由其子代遺傳下去。"瞬時轉化"意指多核苷酸分子被導入到植物中，并且不整合到植物基因組中，或者將多肽導入到植物中。轉化程序以及向植物中導入多肽或多核苷酸序列的程序可依據作為轉化靶標的植物或植物細胞的類型(即是單子葉還是雙子葉)而變化。向植物細胞導入多肽和多核苷酸的適合方法包括微注射(Crossway等，(1986)5/(^c/2W々i^4:320-334)、電穿孔(Riggs等，(1986)尸rac.A^/.A:^/.L/&483:5602-5606)、土壤桿菌介導的轉化(美國專利第5,563,055號和美國專利第5，981,840號)、定向基因轉移(Paszkowski等，(1984)￡MS(9/.3:2717-2722)及彈道顆粒加速法(參見例如美國專利第4,945，050號；美國專利第5,879,918號；美國專利第5,886,244和5,932,782號；Tomes等，(1995)栽于尸/a"fCe〃，r&we,朋d(9rg""Cw/旨e:FiW謹e她/Md/0(iy,Gamborg和Phillips編輯，(Springer隱Verlag,Berlin);McCabe等，(1988)5Zo^c/2"o/ogy6:923畫926);和Lecl轉化(WO00/28058)。另參見Weissinger等，(1988)」肌"ev.G認t22:421-477;Sanford等，(1987)尸arto/她Sc/e臟朋drec/2"o/ogy5:27-37(洋蔥)；Christou等，(1988)尸/朋f尸/2^,'o/.87:671-674(大豆)；McCabe等，(1988)說o/Tec/2"o/ogy6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)/"P7fraCe〃Dev.倫/.27P:175-182(大豆)；Singh等，(1998)T7eor，96:319-324(大豆);Datta等，(1990)說ofec/jwo/ogy8:736-740(水稻)；Klein等，(1988)尸rac.爿cadScZ.[/&485:4305-4309(玉米)；Klein等，(1988)B/o&c/wo/ogy6:559-563(玉米)；美國專利第5,240,855、5,322,783和5,324,646號；Klein等，(1988)尸/a"fP/2>w'o/.91:440-444(玉米)；Fromm等，(1990)5Zofec/wo/ogy8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren等，(1984)A^fw^(London)311:763-764;美國專利第5,736,369號(谷物)；Bytebier等，(1987)尸rac.Zo^.WX484:5345-5349(百合)；DeWet等，(1985)載于77e￡!x/7m'wewto/她w—/加'owo/Ovw/eT7纖es'Chapman等編輯,(Longman，NewYork),197-209頁(花粉)；Kaeppler等，(1990)尸/a"fCe〃9:415-418和Ka印pler等，(1992)T72eorjpp/.84:560-566(頸須介導的轉化)；D'Halluin等，(1992)尸/"WCW/4:1495-1505(電穿孔)；Li等，(1993)Ce〃12:250-255以及Christou和Ford(1995)j""a/s。/So^y75:407-413(水稻)；Osjoda等，(1996)Atow"說o&c/"o/ogy14:745-"0(玉米通過根瘤土i裏桿菌轉化)；所有這些文獻均通過引用結合到本文中。在具體的實施方案中，可使用多種瞬時轉化方法將本發明的Zm-D9序列提供給植物。這樣的瞬時轉化方法包括但不限于將Zm-D9蛋白或其變體和片段直接導入植物中，或者將Zm-D9轉錄物導入植物中。這樣的方法包括例如微注射或顆粒轟擊。參見例如Crossway等，(1986)Afo/202:179-185;Nomura等，(1986)尸/朋fSc/.44:53-58;Hepler等，(1994)尸rac.扁.爿c。dSc,.91:2176-2180和Hush等，(1994)77eJow77fl/0/CW/Sc&"ce107:775-784,所有文獻都通過引用結合到本文中。或者，Zm-D9多核苷酸分子可使用本領域已知的技術瞬時轉化到植物中。這些技術包括病毒載體系統和以排除后續DNA釋放的方式沉淀多核苷酸分子。因此，可由與顆粒結合的DNA進行轉錄，但其被釋放以整合到基因組中的頻率被極大降低。這些方法包括使用包被聚乙烯聚胺(polyethylimine)(PEI;Sigma沖3143)的顆粒。在其它實施方案中，可通過使植物與病毒或病毒核酸接觸而將本發明的多核苷酸分子導入植物中。通常，這樣的方法包括將本發明的核苷酸構建體摻入病毒DNA或RNA分子中。應當認識到，本發明的Zm-D9氨基酸序列最初可作為病毒多聚蛋白的一部分而合成，該部分稍后可在體內或體外通過蛋白水解加工，產生所需的重組蛋白。另外，要意識到的是，本發明的啟動子還包括通過病毒RNA聚合酶轉錄^吏用的啟動子。涉及病毒DNA或RNA分子的、用于將多核普酸導入才直物中并在其中表達編碼蛋白的方法是本領域已知的。參見例如美國專利第5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931號和Porta等，(1996)Mo/ecw/wS/Wec/mo/ogy5:209-221;所述文獻通過引用結合到本文中。在植物基因組中的特定位置靶向插入多核苷酸分子的方法是本領域已知的。在一個實施方案中，使用位點特異重組系統實現多核苷酸分子在所需基因組位置的插入。參見例如W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853,所有文獻都通過引用結合到本文中。簡而言之，本發明的多核苷酸分子可包含在轉移表達盒中，側接兩個不引起重組的重組位點。將轉移表達盒導入到耙位點已穩定摻入其基因組中的植物中，所述靶位點側接兩個對應于轉移表達盒的位點的不引起重組的重組位點。提供合適的重組酶，使轉移表達盒整合在靶位點。因此，目標多核苷酸分子被整合在植物基因組中的特定染色體位置。已轉化的細胞可按照傳統方法培育成植抹。參見例如McCormick等，(1986)P/aWCW/i^ports5:81-84。然后可培育這些植林，用相同轉化的植抹或不同植林授粉，并鑒定組成型表達所需表型特征的所獲子代。可培育兩代或多代，以確保所需表型特征的表達#1穩定地保持并遺傳，然后收獲種子，以確保實現所需表型特征的表達。以此方式，本發明提供已將本發明的多核苷酸分子(例如本發明的表達盒)穩定摻入其基因組中的轉化種子(也稱為"轉基因種子")。39鐠系育種從兩個基因型的雜交開始，例如目標原種系和另一個具有一種或多種與目標原種系互補的所需特征(即穩定摻入本發明的多核苷酸分子，調控的本發明多肽的活性和/或水平等)的近交系。如果兩個原始親本不提供所有需要特征，則在繁殖種群中可包括其它來源。在譜系方法中，使優良植4^自交，并在連續子代中選擇。在隨后的子代中，雜合狀態被由自花授粉和選擇產生的純系代替。典型地，在譜系育種方法中，進行5個或更多個連續子代的自交和選擇Fl~>F2;F2卄F3;F3■>F4;F4—F5等。在足量近交后，連續的子代將用于增加發育近交系的種子。在具體的實施方案中，近交系在其約95%以上的基因座包含純合等位基因。回交除了用于產生回交轉化之外，還可用于與語系育種組合，以改變目標原種系和使用改變的原種系產生的雜種。如前所述，回交可用于將來自一個系(供體親本)的一個或多個特定所需特征轉移到稱為輪回親本的近交系中，該近交系具備整體上良好的農學特征，但卻沒有所需的一種或多種特性。不過，該相同的程序可用于使子代傾向輪回親本的基因型，4旦同時通過在早期停止回交并繼續進行自交和選擇保持非輪回親本的許多組分。例如，產生諸如商品化雜種的Fl。該商品化雜種可與其親本系之一回交，產生BC1或BC2。子代進行自交并選擇，以使新發育的近交系具有輪回親本的多種特征，但具有非輪回親本的幾個所需特征。該方法平衡了新型雜種和育種中所用的輪回親本的價值和強度。因此，本發明的一個實施方案是使目標玉米近交系回交轉化的方法，該方法包括以下步驟使目標玉米近交系植物與賦予所需特征(即降低林高或林型)的突變基因或轉基因的供體植林雜交，選擇賦予所需特征的突變基因或轉基因的Fl子代植抹，并將選定的Fl子代植抹與目標玉米近交系植#朱回交。該方法還可以包括以下步驟獲得目標玉米近交系的分子標記譜，并用該分子標記譜選擇具有所需特征和目標近交系分子標記譜的子代才直株。按同樣的方式，該方法通過增加以下40的最后一個步驟可用于生產Fl雜種種子使目標玉米近交系的所需特征轉化與不同的玉米植林雜交，以產生賦予所需特征的突變基因或轉基因的F1雜種玉米種子。輪回選擇是在植物育種程序中用于改良植物群體的方法。該方法需要使個體植抹彼此雜交授粉，以形成子代。培育子代，并通過眾多選擇方法篩選優良子代，其包括個體植林、半同胞子代、全同胞子代、自交子代及頂交子代。選定的子代彼此雜交授粉，以形成另一群子代。種植該種群，并再次選擇優良植抹，彼此進行雜交授粉。輪回選擇是一個循環過程，因此可根據需要重復多次。輪回選擇的目的是改良種群的品質。然后可將改良的種群用作育種材料的來源，以獲得用于雜種或用作合成栽培變種的親本的近交系。合成栽培變種是通過幾個選定近交系的雜交所形成的后代。混合選擇在與分子標記增強選擇聯合使用時是一種有用的技術。在混合選擇中，根據表型和/或基因型選擇來自個體的種子。然后，將這些選定的種子混合在一起，用于培養下一代。混合選擇需要成批培育植物群，使植4朱自花授粉，成批收獲種子，然后使用成批收獲的種子的樣本種植下一代。直接授粉可代替自花授粉用作育種程序的一部分。突變育種是可用于將新性狀引入原種系的眾多方法中的一種。對于植物育種工作者，自發產生或人工誘導的突變可為變異性的有用來源。人工誘變的目標是提高所需性狀的突變速率。通過多種不同方法可提高突變速率，包括溫度、長期種子儲存、組織培養條件、輻射(例如X射線、Y射線(例如鈷60或銫137)、中子(原子反應堆中鈾235的核裂變產物)、p輻射(^U文射性同位素如磷32或碳14發射)或紫外線照射(優選地從2500nm至2900nm))，或化學誘變劑(例如-威基類似物(5-溴尿嘧啶)、相關化合物(8-乙氧基咖啡因)、抗生素(鏈黑霉素)、烷化劑(硫芥子氣、氮芥、環氧化物、乙烯胺、硫酸鹽、磺酸鹽、砜、內酯)、疊氮化物、羥胺、亞硝酸或吖啶。一旦通過誘變觀測到所需性狀，41則可以通過傳統育種技術如回交將該性狀摻入既有種質中。突變育種的細節可見于"PrincipalsofCultivarDevelopment,"Fehr,1993MacmillanPublishingCompany,其公開內容通過引用結合到本文中。另外，在其它系中產生的突變可用于產生含這些突變的原種系的回交轉化。本文使用的術語植物包括植物細胞、植物原生質體、可以再生植物的植物細胞組織培養物、植物愈傷組織、植物塊以及在植物或才直物部分(例如胚、花粉、胚珠、種子、葉子、花、枝、果實、核/仁、耳穗(ears)、穗軸、外殼、桿、根、根尖、花藥等)中完整的植物細胞。籽粒意指商業種植者為了生長或繁殖物種以外的目的而生產的成熟種子。再生的植物的后代、變體和突變體也包括在本發明范圍內，只要這些部分包含導入的多核苷酸。本發明可用于轉化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。目標植物物種的實例包括但不限于玉米(Zeamap);蕓苔類(Bra肌cflsp.)(例如甘蘭型油菜(及"apzw)、白菜型油菜(凡ra;a)、芥菜型油茱(5.尤其是那些可用作種子油來源的蕓苔類；苜蓿(Me血agos加'va)、水稻(O，a她va)、黑麥(Seca/ece，/e)、高粱(Sorg/MOT6/co/o/%Sorg/rawvw/gare)、黍(侈'J^口珍珠稷(尸ewm.s"wmg7awcw附)、稷(Paw/cwwm〃/aceww)、粟(Sefa〃'a"a//ca)、龍爪稷(五/eww'"ecorac朋(^'))、向曰葵(/^//""^^a朋wiw)、紅花(Cart/wwz^"w"on'w力、馬鈴薯(So/a"wwfwZerosMW)、花生(^4rac//s/y^ogaea)、才帛花(Gos"/7/wm6ar6a(iewse,Gas^_y/7Zww//nsz^wm)、甘募(/po附oea6afaft^)、木募(Ma"z720fescw/e幽)、咖啡(Co,a卿.)、椰子(Coc(w肌cz/era)、菠蘿(^4"朋ascomora力、4甘才禹屬;f對(C"n^可可(r/2eo6rowaacao)、茶(Cawe〃/aWe服'力、香蕉(她sa聘梨(尸e，aa附m'ca—、無花果(FZcwscas7'ca)、番石榴(尸sW應g呵'crra)、芒果(M^喂/era/"血a)、橄欖(0/eaewro/aea)、番木瓜(Co7/3a/a少a)、腰果(^4/7acaWw附occ/c;fewto/e)、澳洲堅果(她c"由附Za〖>7fegrz/o//Gf)、杏仁(尸rw"wsam;vg必/w力、糖甜菜(萬etovw/ga&)、甘蔗(Sfircc/wrn/m^/.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。蔬菜包括番癡(Z^copera'cowesctz/ew幽)、萵苣(例如Lac加casa"'vc()、扁豆(P/]aseo/usvw/gan's)、利馬豆(尸/w^eo/iW/Zwe"w'力、豌豆(Lo^yms^;.)和黃瓜(Cwcwwz'力屬成員，例如黃瓜(C.ra"V^)、哈密瓜(C.c朋to/w/e朋,》和甜瓜(C.we/o)。觀賞植物包括杜鵑花(i/206to血"(irawW/7.)、八仙花(Macra//2少〃"/2>^ra/g—、芙蓉(/i7^cwsramycr"e"^)、玫瑰(ioraspp.)、郁金香(7W^as;p.)、水仙花(A^r/^iw^/7.)、矮牽牛花(尸W廳'flf/^6n'cto)、荷蘭石竹(DZa涵wscfl^yop/y/〃w51)、一品紅(Ewp/207"6/(3/w/c/2em'附句和菊花。可用于實施本發明的針葉樹包括例如松樹，例如火炬松(尸Z"wstoeda)、沼'澤^^(尸/"twe肌o"7)、美國黃;^"(尸z力iAy/70Wfifercwa)、黑l^(尸/"iwcowtorta)牙口輻射+》(尸Z"iASra&'Gfto);花》真+A(尸化wcfo^7^awe"2/e57'/);力口州纟失杉(Z^wgaca""cfe"wX);美國西力口云杉(尸/ceag/fifwca);紅杉(Se《wo/a"wpervz'rais);冷杉，例如銀批(^46&sa附GZ)Zfo)和膠枇(^4&esZw/sa附^);和雪,例如美國西部側柏(r/^'ap"coto)和黃扁柏(C/wmaec^pahswoo^7tow&)。在具體的實施方案中，本發明的植物為栽培才直物(例如玉米、苜蓿、向曰葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、黍、煙草等)。在其它實施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，在進一步的其它實施方案中，玉米植物是最佳的。其它目標植物包括提供目標種子的谷類植物、油類種子植物和豆科植物。目標種子包括谷物種子，例如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥等。油類種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜爾豆、槐豆、胡,巴、大豆、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。提供在植物中調控本發明多肽的濃度和/或活性的方法。一般而言，濃度和/或活性相對于不含導入的本發明序列的天然對照植物、植物部分或細胞增加或降低至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。本發明中的調控可發生在植物生長至所需發育階段的過程中和/或之后。在具體的實施方案中，在單子葉植物中尤其是玉米調控本發明的多肽。Zm-D9多肽的表達水平可通過例如植物中的Zm-D9多肽水平直接檢測，或者例如通過植物中的Zm-D9多肽的Zm-D9活性(例如測定整體抹高或莖或桿的高度)間接檢測。測定Zm-D9活性的方法在本文它處描述。在具體的實施方案中，將本發明的多肽或多核苷酸分子導入到檔—物細胞中。隨后，使用本領域技術人員已知的方法，例如但不限于DNA印跡分析、DNA測序、PCR分析或表型分析，選擇導入了本發明序列的植物細胞。通過前述實施方案而被改變或修改的植物或植物部分在檔j朱形成條件下生長一段時間，該段時間足以調控本發明多肽在植物中的濃度和/或活性。植抹形成的條件在本領域中眾所周知，并在本文它處簡要論述。還要認識到的是，可使用不能在轉化植物中引導蛋白或RNA表達的多核苷酸分子調控多肽的水平和/或活性。例如，本發明的多核苷酸可用于設計多核苷酸構建體，該構建體可用于改變或突變生物中的基因組核香酸序列的方法中。這樣的多核苷酸構建體包括但不限于RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復載體、混合雙螺旋寡核苷酸、自身互補的RNA:DNA寡核苷酸和引起重組的寡核苷酸酶。這些核苷酸構建體和使用方法是本領域已知的。參見美國專利第5,565，350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984號；所有專利都通過引用結合到本文中。另參見WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等，(1999)P亂扁.加dSci.[/&496:8774-8778;所述文獻通過引用結合到本文中。因此，要認識到，本發明的方法不依賴于將整個多核苷酸摻入基因組中，只要植物或其細胞由于多核苷酸分子導入細胞中而發生改變即可。在本發明的一個實施方案中，基因組可在多核苷酸分子導入細胞中之后而被改變。例如，多核苷酸或其任何部分均可摻入植物基因組中。本發明的基因組改變包括但不限于基因組中的核苷酸的增加、缺失和取代。盡管本發明的方法不依賴于任何特定數目核苷酸的添力口、缺失和取代，但公認這類添加、缺失或取代包含至少1個核苷酸。在一個實施方案中，增加本發明的Zm-D9多肽的活性和/或水平。可通過向植物提供Zm-D9多肽實現本發明的Zm-D9多肽水平和/或活性的增加。如本文它處所論述，本領域已知向植物提供多肽的許多方法，包括但不限于將多肽直接導入植物中，和將編碼具有Zm-D9活性的多肽的多核苷酸構建體導入植物中(瞬時地或穩定地)。還要認識到，本發明的方法可使用不能在轉化植物中指導蛋白或RNA表達的多核苷酸分子。因此，Zm-D9多肽的水平和/或活性可通過改變編碼Zm-D9多肽的基因或其啟動子而增加。參見例如Kmiec，美國專利5,565,350;Zarling等，PCT/US93/03868。因此，提供了在Zm-D9基因中攜帶突變的誘變植物，其中突變增加Zm-D9基因的表達，或增加所編碼Zm-D9多肽的Zm-D9活性。在其它實施方案中，通過將抑制本發明的Zm-D9多肽的水平或活性的多核苷酸導入植物中降低或去除本發明的Zm-D9多肽的活性和/或水平。所述多核苷酸可通過阻止Zm-D9信使RNA的翻譯而直接抑制Zm-D9表達，或通過抑制編碼Zm-D9蛋白的Zm-D9基因的轉錄或翻譯的編碼多肽間接抑制Zm-D9表達。在植物中抑制或去除基因表達的方法在本領域眾所周知，任何這樣的方法均可在本發明中用于抑制Zm-D9在植物中的表達。在本發明的其它實施方案中，用抑制Zm-D9多肽活性的多肽的編碼序列轉化植物細胞來降低或去除Zm-D9多肽的活性。在其它實施方案中，可通過^C壞編碼Zm-D9多肽的基因降低或去除Zm-D9多肽的活性。本發明包括在Zm-D9基因中攜帶突變的誘變植物，其中突變降低Zm-D9基因的表達，或抑制編碼的Zm-D9多肽的Zm-D9活性。植物遺傳工程的若干方面需要降低特定基因的活性(也稱為基因沉默或基因抑制)。許多基因沉默技術在本領域眾所周知，包括但不限于反義技術(參見例如Sheehy等，(1988)尸roc.爿o^.Sc/.V&485:8805-8809;和美國專利號5,107,065;5,453,566;和5,759,829);共抑制(例如Taylor(1997)尸/"WCe〃9:1245;Jorgensen(1990)7Ve"A傷ofec/2.8(12):340國344;Flavell(1994)尸rac.A^/.爿cadScZ.7&491:3490-3496;Finnegan等，(1994)說o/Tec/wo/ogy12:883-888;和Neuhuber等，(1994)Afo/.G饑Ge"ef.244:230-241);RNA干擾(Napoli等，(1990)尸/a"fCW/2:279-289;美國專利號5,034,323;Sharp(1999)Ge"^Dev.13:139-141;Zamore等，(2000)Ce〃101:25-33;和Montgomery等，(1998)Prac.A^/.爿cadOS495:15502-15507);病毒誘導的基因沉默(Burton等，(2000)尸/a"fCe//12:691-705;和Baulcombe(1999)O/tt.Op.尸/"m5/0.2:109-113);耙-RNA-特異性核酶(Haseloff等，(1988)胸腳334:585-591);發夾結構(Sm池等，(2000)Atow^407:319-320;WO99/53050;WO02/00904;WO98/53083;Chuang和Meyerowitz(2000)尸rac.iVa".爿cadSc/.[/&497:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)P/朋fiVzyo/.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)Ato.4:29-38;Pandolfini等，SMC說ofec/^o/ogy3:7，美國專利公布號20030175965;Panstruga等，(2003)Mo/.說o/.30:135-140;Wesley等，(2001)尸/a"f汄27:581-590;Wang和Waterhouse(2001)Cwr.Qp/".尸/aW說o/.5:146-150;美國專利7>布號20030180945;以及WO02/00904,所有這些文獻都通過引用結合到本文中)；核酶(Steinecke等，(1992)J.11:1525;和Perriman等，(1993)JwtoeraeAay.Dev.3:253);寡核苦酸介導的靶向修改(例如WO03/076574和WO99/25853);鋅指靶向分子(例如WO01/52620;WO03/048345;和WO00/42219);轉座子標記(Maes等，(1999)TVe"Af/aWSc/.4:90誦96;Dharmapuri和Sonti(1999)A^cra^'o/.179:53-59;Meissner等，(2000)P/"""22:265-274;Phogat等，(2000)A(wcz'.25:57-63;Walbot(2000)Cww.Opz>2.P/aW^o/.2:103-107;Gai等，(2000)A^c/e/c爿czAi仏28:94-96;Fitzmaurice等，(1999)Ge"e"cs153:1919-1928;Bensen等，(1995)P/"WCe〃7:75-84;Mena等，(1996)Sc/e"ce274:1537-1540;和美國專利第5,962,764號)；所述文獻的每一個均通過引用結合到本文中；以及其它方法和本領域技術人員已知的以上方法的組合。要認識到的是，用本發明的多核苷酸可以構建與Zm-D9序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互補的反義構建體。構建的反義核普酸與對應的mRNA雜交。可對反義序列進行修飾，只要該序列與對應的mRNA雜交并干擾其表達。以此方式，可以使用與對應的反義序列具有70%、優選80%、更優選85%的序列同一性的反義構建體。此外，反義核普酸的部分可用于破壞耙基因的表達。一般而言，可使用至少50個核苷酸、IOO個核苷酸、200個核苷酸、300個、400個、450個、500個、550個以上的核苷酸的序列。本發明的多核苷酸還可以用于在植物中以有義方向抑制內源基因表達。使用有義方向的多核苷酸在植物中抑制基因表達的方法是本領域已知的。一般來說，該類方法涉及用^sf在植物中驅動表達的啟動子的DNA構建體轉化;植物，所述啟動子與對應于內源基因轉錄物的至少部分多核苷酸有效連接。典型地，該核苷酸序列與內源基因轉錄物的序列具有顯著的序列同一性，優選約65%以上的序列同一性，更優選約85%以上的序列同一性，最優選約95%以上的序列同一性。參見美國專利第5,283,184和5,034,323號，所述專利通過引用結合到本文中。因此，許多方法可用于降低或去除Zm-D9多肽的活性。可使用一種以上的方法降低單一Zm-D9多肽的活性。另外，還可以使用組合方法來降低或去除Zm-D9多肽的活性。在某些實施方案中，用表達抑制Zm-D9表達的多核苷酸的表達盒轉化Zm-D9植物細胞來降低或去除Zm-D9的活性。該多核苷酸可47通過阻止Zm-D9信使RNA的翻譯而直接抑制一個或多個Zm-D9蛋白表達，或通過編碼抑制編碼Zm-D9蛋白的玉米基因的轉錄或翻譯的多肽間接抑制一個或多個Zm-D9蛋白表達。在^f直物中抑制或去除基因表達的方法在本領域眾所周知，任何這樣的方法均可在本發明中用于抑制一個或多個Zm-D9蛋白的表達。根據本發明，如果Zm-D9的蛋白水平在統計上低于在未進行遺傳改變或誘變以抑制該Zm-D9蛋白表達的植物中的相同Zm-D9的蛋白水平，則Zm-D9的表達^支抑制。在本發明的具體實施方案中，在本發明的改變植物中的Zm-D9蛋白的蛋白水平低于在不是突變體或還未4皮遺傳改變以抑制該Zm-D9蛋白表達的植物中相同Zm-D9蛋白的蛋白水平的95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。Zm-D9蛋白的表達水平例如可通過測定玉米片直物細胞或植物中表達的Zm-D9蛋白水平直接測定，或者例如通過檢測玉米植物細胞或植物中Zm-D9蛋白的Zm-D9活性間接測定。測定Zm-D9蛋白的Zm-D9活性的方法在本文它處描述。在本發明的其它實施方案中，用表達盒轉化玉米植物細胞來降低或去除一個或多個Zm-D9蛋白的活性，所述表達盒含編碼抑制一個或多個Zm-D9蛋白活性的多肽的多核苷酸。根據本發明，如果Zm-D9蛋白的Zm-D9活性在統計上^^于在未進行遺傳改變以抑制該Zm-D9蛋白的Zm-D9活性的植物中相同Zm-D9蛋白的Zm-D9活性，則Zm-D9蛋白的Zm-D9活性被抑制。在本發明的具體實施方案中，在本發明的改變植物中的Zm-D9蛋白的Zm-D9活性低于在還未進行遺傳改變以抑制該Zm-D9蛋白表達的植物中相同Zm-D9蛋白的Zm-D9活性的95%、90%、80°/。、70。/。、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。根據本發明，當通過本文它處描述的檢測方法不能檢出Zm-D9蛋白的Zm-D9活性時，則該活性被"去除/消除"。測定Zm-D9蛋白的Zm-D9活性的方法在本文它處描述。在其它實施方案中，可通過破壞編碼Zm-D9蛋白的基因降低或48去除Zm-D9蛋白的活性。本發明包括在Zm-D9基因中攜帶突變的誘變玉米植物，其中所述突變降低Zm-D9基因的表達，或抑制編碼的Zm-D9蛋白的Zm-D9活性。因此，可使用多種方法降低或去除Zm-D9蛋白的活性。可使用一種以上的方法降低單個Zm-D9蛋白的活性。另夕卜，還可使用組合方法降低或去除兩個或多個不同Zm-D9蛋白的活性。降低或去除Zm-D9蛋白表達的方法的非限制性實例在下文給出。A.基于多核苷酸的方法在本發明的某些實施方案中，用能夠表達抑制Zm-D9蛋白表達的多核苷酸的表達盒轉化玉米植物細胞。本文所用術語"表達，，是指基因產物的生物合成，包括所述基因產物的轉錄和/或翻譯。例如，對本發明目標而言，能夠在玉米植物中表達抑制至少1個Zm-D9蛋白表達的多核苷酸的表達盒是能夠在玉米植物中產生抑制至少1個Zm-D9蛋白的轉錄和/或翻譯的RNA分子的表達盒。從DNA分子"表達"或"產生"蛋白或多肽是指編碼序列的轉錄和翻譯產生蛋白或多肽，而從RNA分子"表達"或"產生"蛋白或多肽是指RNA編碼序列的翻譯產生蛋白或多肽。在玉米植物中抑制Zm-D9蛋白表達的多核苷酸的實例在下文給出。1.有義抑制/共抑制在本發明的某些實施方案中，可通過有義抑制或共抑制獲得對Zm-D9蛋白表達的抑制。對于共抑制，表達盒設計用于以"有義，，方向表達對應于編碼Zm-D9蛋白的信使RNA的全部或部分的RNA分子。RNA分子的過表達可導致天然基因表達降低。因此，篩選用共抑制表達盒轉化的多個植物系，以鑒定那些表現出最大的Zm-D9蛋白表達抑制的植物系。用于共抑制的多核苷酸可對應于編碼Zm-D9蛋白的序列的全部或部分，Zm-D9蛋白轉錄物的5'和/或3'非翻譯區的全部或部分，或者編碼Zm-D9蛋白的轉錄物的編碼序列和非翻譯區這二者的全部或部分。在某些實施方案中，在多核苷酸包含Zm-D9蛋白編碼區的全部或部分時，表達盒^皮設計成除去多核苷酸的起始密碼子，使得蛋白產物將不被轉錄。共抑制可用于抑制植物基因表達，以產生由這些基因編碼的蛋白的蛋白水平不可檢測的植物。參見例如Broin等，(2002)尸/朋fCe〃14:1417-1432。共抑制還可以用于抑制同一植林中多個蛋白的表達。參見例如美國專利第5,942,657號。用共抑制抑制植物中的內源基因表達的方法描述于下列文獻中Flavell等，(1994)尸rocMW/.爿cadt/&491:3490-3496;Jorgensen等，(1996)P/aWMo/.說o/.31:957-973;Johansen和Carrington(2001)P/aW尸wo/.126:930-938;Broin等，(2002)尸/o"fO〃14:1417-1432;Stoutjesdijk等，(2002)尸/a加尸/^/。/.129:1723-1731;Yu等，(2003)尸/y/toc/^m加^63:753-763;和美國專利第5,034,323、5,283,184和5,942,657號；所述文獻的每一個均通過引用結合到本文中。可通過在表達盒的有義序列的3'位和聚腺苷化信號的5'位包含poly-dT區來提高共抑制的效率。參見美國專利公開號20020048814,該專利通過引用結合到本文中。典型地，該核苦酸序列與內源基因轉錄物的序列具有顯著的序列同一性，優選約65%以上的序列同一性，更優選約85%以上的序列同一性，最優約95%以上的序列同一性。參見美國專利第5,283,184和5,034,323號，所迷專利通過引用結合到本文中。2.反義抑制在本發明的某些實施方案中，可通過反義抑制獲得對Zm-D9蛋白表達的抑制。對于反義抑制，表達盒被設計成表達與編碼Zm-D9蛋白的信使RNA的全部或部分互補的RNA分子。反義RNA分子的50過表達可導致天然基因的表達降低。因此，篩選用反義抑制表達盒轉化的多個植物系，以鑒定表現出最大的Zm-D9蛋白表達抑制的那些植物系。用于反義抑制的多核苷酸可對應于編碼Zm-D9蛋白的序列的互補物的全部或部分，Zm-D9蛋白轉錄物5'和/或3'非翻譯區的互補物的全部或部分，或者編碼Zm-D9蛋白的轉錄物的編碼序列和非翻譯區這二者的互補物的全部或部分。另外，反義多核苷酸可以與靶序列完全互補(即與耙序列的互補物100%同一性)或部分互補(即與靶序列的互補物的同一性小于100%)。反義抑制可用于抑制同一植抹中多種蛋白的表達。參見例如美國專利第5,942,657號。此外，反義核苷酸的部分可用于破壞耙基因的表達。一般而言，可使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苦酸、300個、400個、450個、500個、550個以上的核香酸的序列。用反義抑制來抑制植物中的內源基因表達的方法描述在例如Liu等，(2002)尸/aW尸/jywo/.129:1732-1743和美國專利笫5,759,829和5,942,657號中，所述文獻每個均通過引用結合到本文中。可通過在表達盒中的反義序列的3'位和聚腺苷化信號的5'位包含poly-dT區來提高反義抑制的效率。參見美國專利公開號20020048814,該專利通過引用結合到本文中。3.雙鏈RNA干擾在本發明的某些實施方案中，可通過雙鏈RNA(dsRNA)干擾獲得對Zm-D9蛋白表達的抑制。對于dsRNA干擾，在同一細胞中表達與以上對共抑制所述類似的有義RNA分子和與有義RNA分子完全或部分互補的反義RNA分子，產生對相應內源信使RNA表達的抑制。設計含有義序列和反義序列的表達盒可實現有義和反義分子的表達。或者，可對正義和反義序列使用獨立的表達盒。然后篩選用一個或多個dsRNA干擾表達盒轉化的多種植物系，以鑒定表現出最大Zm-D9蛋白表達抑制的植物系。用dsRNA干擾抑制內源植物基因表51達的方法描述在Waterhouse等，(1998)尸rac.A^/.爿codSc/.(7&495:13959-13964;Liu等，(2002)尸/a"f尸/;^0/.129:1732-1743和WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631和WO00/49035中；所述文獻每個均通過引用結合到本文中。4.發夾RNA干擾和含有內含子的發夾RNA干擾在本發明的某些實施方案中，可通過發夾RNA(hpRNA)干擾或含有內含子的發夾RNA(ihpRNA)干擾獲得對Zm-D9蛋白表達的抑制。這些方法高效抑制內源基因的表達。參見Waterhouse和Helliwell(2003)W加.Pev.4:29-38和其中提及的參考文獻。對于hpRNA千擾，表達盒纟皮設計成表達與自身雜交而形成發夾結構的RNA分子，所述發夾結構含有單鏈環區和威基配對莖。堿基配對莖區含有對應于內源信使RNA的全部或部分的有義序列以及與該有義序列完全或部分互補的反義序列，所述內源信使RNA編碼基因的表達被抑制。因此，分子的堿基配對莖區通常決定RNA干擾的特異性。hpRNA分子高效抑制內源基因表達，其誘導的RNA干擾可由植物后代繼承。參見例如Chuang和Meyerowitz(2000)爿cadScZ.[/&497:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)尸/aW尸/^wo/.129:1723-1731;和Waterhouse和Helliwell(2003)Ato.iev.4:29-38。使用hpRNA干擾抑制或沉默基因表達的方法描述在例如Chuang和Meyerowitz(2000)尸rac.Ato/.爿cadSc/.OX497:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)P/aW尸/^wo/.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)A^f.4:29-38;Pandolfmi等，5MC說o&c/2"o/ogv3:7和美國專利公開號20030175965中；所述文獻每個均通過引用結合到本文中。在Panstruga等，(2003)Mo/.S/o/.化/7.30:135-140中描述了hpRNA構建體在體內沉默基因表達的效率的瞬時測定，該文獻通過引用結合到本文中。對于ihpRNA，千擾分子具有與hpRNA相同的通用結構，但RNA分子另外含有能夠在表達ihpRNA的細胞中被剪接的內含子。使用內含子使發夾RNA分子中剪接后環的大小最小化，這增加了干擾效率。參見例如Smith等，(2000)Mm/M407:319-320。事實上，Smith等使用ihpRNA介導的干擾表現出100%的內源基因表達抑制。用ihpRNA干擾抑制內源植物基因表達的方法描述在例如Smith等，(2000)407:319-320;Wesley等，(2001)P/aW/27:581-590;Wang和Waterhouse(2001)C鮮.爭力.尸/a"腸/.5:146-150;Waterhouse和Helliwell(2003)iVatWe乂4:29-38;Helliwell和Waterhouse(2003)MeAoA30:289-295和美國專利公開號20030180945中，所述文獻的每一個均通過引用結合到本文中。用于hpRNA千擾的表達盒還可以設計成有義序列和反義序列不對應于內源RNA。在該實施方案中，有義序列和反義序列位于環序列側翼，所述環序列含有的核苷酸序列對應于靶基因的內源信使RNA的全部或部分。因此，是環區決定RNA千擾的特異性。參見例如WO02/00904，該文獻通過引用結合到本文中。可通過使用hpRNA構建體實現轉錄基因沉默(TGS)，其中發夾的反向重復序列與要沉默的基因啟動子區共有序列同一性。將hpRNA加工為可與同源啟動子區相互作用的短RNA可觸發降解或甲基化，從而導致沉默(Aufsatz等，(2002)/WAS99(4):16499-16506;Mette等，(2000)五MS(9J19(19):5194-5201)。v.擴增子介導的干擾擴增子表達盒含有植物病毒來源的序列，該序列含有全部或部分的耙基因，但通常不含天然病毒的所有基因。表達盒的轉錄產物中存在的病毒序列可使轉錄產物指導其自身復制。由擴增子產生的轉錄物相對于靶序列(即Zm-D9蛋白的信使RNA)可為有義的或反義的。用擴增子抑制內源植物基因表達的方法描述在例如Angell和Baulcombe(1997)五MSOJ.16:3675-3684;Angell和Baulcombe(1999)尸/a"f,5320:357-362和美國專利第6,646,805號中，所述文獻的每一個均通過引用結合到本文中。6.核酶在某些實施方案中，由本發明的表達盒表達的多核苷酸是催化性RNA，或者對Zm-D9蛋白的信使RNA具有特異性的核酶活性。因此，多核苷酸可使內源信使RNA降解，導致Zm-D9蛋白的表達降低。該方法描述于例如美國專利第4,987，071號，該專利通過引用結合到本文中。7.小干擾RNA或微RNA在本發明的某些實施方案中，可通過表達編碼微RNA(miRNA)的基因的RNA干擾獲得對Zm-D9蛋白表達的抑制。miRNA是由約22個核糖核普酸組成的調控因子。miRNA高效抑制內源基因表達。參見例如Javier等，(2003)A^we425:257-263，該文獻通過引用結合到本文中。t對于miRNA干擾，表達盒被設計成表ii^莫擬內源miRNA基因的RNA分子。miRNA基因編碼的RNA形成含22個核苷酸的序列的發夾結構，該結構與另一內源基因(靶序歹'1)互補。為抑制Zm-D9蛋白表達，22個核苷酸的序列選自Zm-D9蛋白轉錄物序列，并在有義方向含有所述Zm-D9蛋白序列的22個核苷酸，以及與有義序列互補的對應反義序列的21個核普酸。miRNA分子高效抑制內源基因表達，它們誘導的RNA干擾被植物后代繼承。B.基于多肽的基因表達抑制在一個實施方案中，多核苷酸編碼的鋅指蛋白與在玉米植物或細胞中編碼Zm-D9蛋白的基因結合，導致基因表達降低。在具體的實施方案中，鋅指蛋白與Zm-D9蛋白基因的調控區結合。在其它實施方案中，鋅指蛋白與編碼Zm-D9蛋白的信使RNA結合，并阻止其翻譯。選擇鋅指蛋白靶向位點的方法描述于例如美國專利第6,453,242號，使用鋅指蛋白抑制植物中的基因表達的方法描述于例如美國專利公開號20030037355;所述文獻的每一個均通過引用結合到本文中。C.基于多肽的蛋白活性抑制:在本發明的某些實施方案中，多核苷酸編碼與至少一種Zm-D9蛋白結合的抗體，并降低Zm-D9蛋白的Zm-D9活性。在另一個實施方案中，抗體的結合通過細胞質控機制導致抗體-Zm-D9蛋白復合物的轉換增加。抗體在植物細胞中的表達以及通過在植物細胞中表達抗體并使抗體與蛋白結合而抑制分子途徑在本領域眾所周知。參見例如Conrad和Sonnewald(2003)A^wre說o^c/j.21:35-36，該文獻通過引用結合到本文中。D.基因破壞:在本發明的某些實施方案中，通過破壞編碼Zm-D9蛋白的基因降低或去除Zm-D9蛋白的活性。可通過任何本領域已知方法破壞編碼Zm-D9蛋白的基因。例如，在一個實施方案中，通過轉座子標記破壞基因。在另一個實施方案中，如下破壞基因使用隨機或定向誘變誘變玉米植物，并選擇Zm-D9蛋白活性降低或改變的植物。1.轉座子標記在本發明的一個實施方案中，使用轉座子標記降低或去除Zm-D9蛋白的Zm-D9活性。轉座子標記包括將轉座子插入到內源Zm-D9基因中，以降低或去除Zm-D9蛋白表達。"Zm-D9基因"是指編碼本發明的Zm-D9蛋白的基因。在該實施方案中，將轉座子插入編碼Zm-D9蛋白的基因的調控區或編碼區中降低或去除Zm-D9蛋白的表達。可使用位于Zm-D9基因的外顯子、內含子、5'或3'非翻譯序列、啟動子或任何其它調控序列中的轉座子降低或去除編碼Zm-D9蛋白的表達和/或活性。55用于植物中特定基因的轉座子標記的方法在本領域眾所周知。參見例如Maes等，(1999)7>e"A尸/"W4:90-96;Dharmapuri和Sonti(1999)F￡MSMZcra6/o/.LW.179:53-59;Meissner等，(2000)P/a"f,22:265-274;Phogat等，(2000),Ao"Z.25:57-63;Walbot(2000)O/rr0戸'".P/aWS/o/.2:103國107;Gai等，(2000)M/c/e/c』cZ&"化28:94-96;Fitzmaurice等，(1999)153:1919-1928)。另外，在Bensen等，(1995)尸/a"fCW/7:75-84;Mena等,(1996)Sc/e訓274:1537-1540;和美國專利第5,962,764號中描述了在選定基因中選擇Mu插入的TUSC方法，所述文獻的每一個均通過引用結合到本文中。2.活性降低的突變植物降低或去除植物中內源基因表達的其它方法在本領域也是已知的，并可類似地應用于本發明。這些方法包括其它形式的"i秀變，例如在反向遺傳學方面(采用PCR)使用曱磺酸乙酯誘導的誘變、缺失誘變和快中子缺失誘變，以鑒定內源基因已缺失的植物系。這些方法的實例參見Ohshima等，(1998)Wra/ogy243:472-481;Okubara等，(1994)137:867-874;和Quesada等，(2000)154:421-436;所述文獻的每一個均通過引用結合到本文中。另外，使用變性HPLC或選定PCR產物的選擇性內切核酸酶消化篩選化學誘導突變的快速自動化方法TILLING(定向誘導基因組局部突變)也可應用于本發明。參見McCallum等，(2000)Ato.5/o&c/z"o/.18:455-457，該文獻通過引用結合到本文中。影響基因表達或干擾編碼蛋白功能(Zm-D9活性)的突變在本領域眾所周知。在基因外顯子中的插入突變通常產生無效突變體。保守殘基突變對抑制編碼蛋白的Zm-D9活性特別有效。已描述了植物DELLA蛋白中適于以去除或抑制赤霉素信號轉導活性為目標的誘變的保守殘基。參見例如Itoh,H.,M.Ueguchi-Tanaka等，(2002)尸/a"fCW/14:57-70。這類突變體可根據眾所周知的方法分離，不同Zm-D9基因56座中的突變可通過遺傳雜交堆積。參見例如Gruis等，(2002)尸/a"fCe〃14:2863-2882。在本發明的另一個實施方案中，由于基因反向和重復基因座的重組，顯性突變體可用于觸發RNA沉默。參見例如Kusaba等，(2003)尸/a"fCe〃15:1455-1467。本發明包括降低或去除Zm-D9蛋白活性的其它方法。改變或突變植物中的基因組核苷酸序列的其它方法的實例是本領域已知的，包括但不限于使用RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復載體、混合雙鏈寡核苷酸、自身互補的RNA:DNA寡核苷酸和引起重組的寡核苷酸酶。這些載體和使用方法是本領域已知的。參見例如美國專利第5,565,350、5,731,181、5/756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984號，所述各專利均通過引用結合到本文中。另參見WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等，(1999)尸wc.Ato/.^cad[/&496:8774-8778;所述各文獻均通過引用結合到本文中。.在某些實施方案中，可以將本發明的多核苷酸分子與目標多核苷酸序列的任意組合相堆疊，以生成具有所需性狀的植物。本文使用的性狀是指來源于特定序列或序列組的表型。例如，本發明的多核苷酸分子可以與編碼具有殺蟲劑和/或農藥活性的多肽的任意其它多核苷酸分子相堆疊例如其它蘇云金芽孢桿菌(Sac"/wsf/wn"peR^)毒蛋白(描述于美國專利號5,366,892;5,747,450;5,737,514;5,723,756;5，593，881;和Geiser等，(1986)Ge"e48:109)、凝集素(VanDamme等,(1994)尸/aWA/o/.萬Zo/.24:825)、pentin(描述于美國專利號5,981,722)等。產生的組合還可以包括任一個目標多核苷酸分子的多個拷貝。本發明的多核苷酸分子還可以與任何其它基因或基因組合堆疊，以產生具有多種所需性狀組合的植物，包括但不限于針對動物鉤料所需的性狀例如高油基因(例如美國專利號6,232,529);平衡的氨基酸(例如hordothionins(美國專利號5,990,389;5,885,801;5,885，802;和5,703,409);大麥高賴氨酸(Williamson等，(1987)&oc/2em.165:99-106;和WO98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等，(1986)丄說o/.C/em.261:6279;Kirihara等，(1988)71:359;和Musumura等，(1989)尸/a^Mo/.歷o/.12:123));增加的消化性(例如改性的貝i藏蛋白(2001年11月7日提交的美國申請系列號10/053,410);和硫氧還蛋白(2001年12月3日提交的美國申請系列號10/005,429));所述文獻的公開內容通過引用結合到本文中。本發明的多核苷酸分子還可以與針對以下的所需性狀相堆疊疾病或除草劑抗性(例如fiimonisin脫毒基因(美國專利號5,792,931);無毒力和疾病抗性基因(Jones等，(1994)Sc/e"ce266:789;Martin等，(1993)Scz'e打ce262:1432;Mindrinos等，(1994)Ce〃78:1089);產生除草劑抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突變體，例如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶抑制劑，例如草銨磷(phosphinothricin)或草銨磷(basta)(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；以及加工或加工產品所需的性狀，例如高油(例如美國專利號6,232,529);改性油(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國專利號5,952,544;WO94/11S16));改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE));和促進聚羥基鏈烷酸酯(PHA)表達的聚合物或生物塑料(例如美國專利號5.602，321;|3-酮硫解酶、聚羥基丁酸合酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶(Schubert等，(1988)/Sa"en'o/.170:5837-5847));其公開內容通過《1用結合到本文中。人們還可以組合本發明的多核苦酸分子和提供農業性狀的多核苷酸分子，所述農業性狀例如雄性不育(例如參見美國專利號5,583,210)、桿強度(參見美國專利號6,803,498)、開花時間(參見美國專利號6,573,430)或轉化技術性狀，例如細^>周期調節或基因打靶(例如WO99/61619、WO00/17364和WO99/25821);所述文獻的公開內容通過引用結合到本文中。這些堆疊組合可以通過任意方法來生成，所述方法包括且不限于，通過任意常規的或TopCross方法或遺傳轉化雜交育種植物。如果通過遺傳轉化;拔物堆疊序列，則可以在任意時間且以任意次序組合目58標多核普酸序列。例如，可以將包含一個或多個所需性狀的轉基因植物用作通過隨后的轉化導入其它性狀的靶。在共轉化方案中，可以與轉化盒的任意組合提供的目標多核苷酸分子同時導入性狀。例如，如果將導入2個序列，則2個序列可以包含在分開的轉化盒中(反式)或包含在相同轉化盒中(順式)。序列的表達可以由相同啟動子或不同啟動子驅動。在某些情況下，可能需要導入將抑制目標多核苷酸表達的轉化盒。這可以與其它抑制盒或超表達盒的任意組合相組合，以在檔_物中生成所需的性狀組合。還要認識到，多核苷酸序列可以使用位點-特異性的重組系統在需要的基因組位置堆疊。參見例如099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853,它們全部通過引用結合到本文中。表型的多種改變中令人感興趣的包括改變植物的脂肪酸組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御機制等。這些結果可通過提供異源產物的表達或增加植物中內源產物的表達來實現。或者，所迷結果可通過提供一種或多種內源產物表達的降低來實現，尤其是植物中的酶或輔因子。這些改變導致轉化植物的表型改變。目標基因反映了商品市場，并且是涉及該作物開發的那些人的目標。作物和目標市場改變，并且隨著發展中國家打開國際市場，新的作物和技術還將涌現。另外，隨著我們對農業性狀和特征(例如產量和雜種優勢)的理解的增加，用于轉化的基因的選擇也將相應改變。目標基因的一般分類包括例如涉及信息的那些基因，例如鋅指，涉及通訊的那些基因，例如激酶，以及涉及看家的那些基因，例如熱激蛋白。更具體的轉基因分類例如包括編碼重要農業性狀、昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑抗性、不育、籽粒特征和商品化產物的基因。目標基因一般包括涉及油、淀粉、碳水化合物或營養代謝的那些基因，以及影響谷粒大小、蔗糖載量等的那些基因。在農業上重要的性狀，例如油、淀粉和蛋白含量，除使用傳統育種方法外還可以經遺傳工程改變。修改包括增加油酸、飽和和不飽和油的含量、增加賴氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸以及淀粉改性。Hordothionin蛋白改性描述于美國專利號5,703,049、5,885,801、5,885,802和5，990,389,這些專利通過引用結合到本文中。另一個實例是由大豆2S白蛋白編碼的富含賴氨酸和/或硫的種子蛋白，其描述于美國專利號5,850,016，和得自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制劑，其描述于Williamson等，(1987)/.S/oc/em.165:99-106，這些文獻的公開內容通過引用結合到本文中。可通過定點誘變制備編碼序列的衍生物，以增加編碼多肽中預先選定的氨基酸的水平。例如，編碼大麥高賴氨酸多肽(BHL)的基因來源于大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑，1996年11月1日提交的美國申請序列號08/740,682和WO98/20133，所述文獻的公開內容通過引用結合到本文中。其它蛋白包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，例如來自向日葵種子(Lilley等,(1989)o/『or/dCo"gmwo"F"eg咖A/eP/x^e/wL^'/z'z""ow//w附awFoo<is爿w'淤a/i^editWj^,Applewhite編凈耳,(AmericanOilChemistsSociety,Champaign,Illinois),497-502頁；所述文獻通過引用結合到本文中)；玉米(Pedersen等，(1986)5/o/.Ctem.261:6279;Kirihara等，(1988)71:359;這兩個文獻均通過引用結合到本文中)；和水稻(Musumura等，(1989)尸/朋fA/o/.5Zo/.12:123,該文獻通過引用結合到本文中)。其它在農業上重要的基因編碼latex、Floury2、生長因子、種子貯存因子和轉錄因子。昆蟲抗性基因可以編碼對引起大量減產的昆蟲的抗性，如根蟲、毛蟲、玉米鉆心蟲等。這些基因包括蘇云金芽胞桿菌毒蛋白基因(美國專利號5,366,892;5,747，450;5,736,514;5,723,756;5,593,881;和Geiser等，(1986)G朋e48:109)。編碼疾病抗性性狀的基因包括脫毒基因，例如抗伏馬毒素的基因(美國專利號5/792，931);無毒力(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等,(1994)Scze"ce266:789;Martin等，(1993)Scz'e"ce262:1432;和Mindrinos等，(1994)Ce〃78:1089);等等。除草劑抗性性狀可包括編碼除草劑抗性的基因，所述除草劑用于抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用，尤其是磺酰脲類除草劑(例如含有突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，產生這樣的抗性，特別是S4和/或Hra突變)；所述除草劑用于抑制谷氨酰胺合酶活性的作用，例如草胺磷(phosphinothricin)或草胺磷(basta)(例如bar基因)；或草甘膦(例如EPSPS基因和GAT基因；參見例如美國公開號20040082770和WO03/092360);或者本領域所知的其它這樣的基因。6w基因編碼對除草劑草胺蜂(basta)的抗性，基因編碼對抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性，ALS基因突變體編碼對除草劑氯磺隆的抗性。不育基因也可在表達盒中編碼，為物理去雄提供了一個備選。以此方式使用的基因的實例包括雄性組織優選的基因和具有雄性不育表型的基因，如QM,其描述于美國專利號5,583,2100。其它基因包括激酶基因和編碼對雄性和雌性配子發育均有毒性的化合物的那些基因。籽粒的質量反映出性狀，例如油的水平和類型、飽和和不飽和、必需氨基酸的質和量以及纖維素水平。在玉米中，改性的hordothionin蛋白描述于美國專利號5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389。商品化特性也可由一個或多個可增加例如用于乙醇生產的淀粉或提供蛋白表達的基因編碼。轉化植物的另一個重要的商業用途為生成聚合體和原生質體，例如描述于美國專利號5,602,321。諸如P-酮硫解酶、PHB酶(聚羥基丁酸合酶)和乙酰乙酰輔酶A還原酶的基因(參見Schubert等，(1988)Sa"e〃'o/.170:5837-5847)促進聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達。外源基因產物包括植物酶和產物以及來自其它來源(包括原核生物和其它真核生物)的那些產物。這些產物包括酶、輔因子、激素等。可以增加蛋白水平，尤其是具有改善的氨基酸分布的改性蛋白的水平，以改善植物的應用價值。這通過表達所述具有增強的氨基酸含量的蛋白來實現。61"受試的植物或植物細胞"是指其中相對于目標基因已實現基因改變如轉化的植物或植物細胞，或者為由如此改變的植物或細胞遺傳并含有該改變的植物或植物細胞。"對照"或"對照植物"或"對照植物細胞"提供測定受試植物或植物細胞的表型變化的參考點。對照植物或植物細胞可包含例如(a)野生型植物或細胞，即其與起始材料具有相同基因型，用于基因改變，產生受試植物或細胞；(b)與起始材料具有相同基因型但已用無效構建體(即對目標性狀沒有已知影響的構建體，例如含標記基因的構建體)轉化的植物或植物細胞；(c)在受試植物或植物細胞的后代中為非轉化的分離子的植物或植物細胞；(d)與受試植物或植物細胞遺傳相同但未接觸會誘導目標基因表達的條件或刺激的植物或植物細胞，或(e)在不表達目標基因的條件下的受試植物或植物細胞本身。提供以下的實施例是為了闡述，而不是為了限制。實施例1玉米D9基因的分離玉米編碼兩種DELLA蛋白(矮化植物8，D8，以及矮化植物9,D9),其幾個顯性突變體已被分離(Winkler和Freeling(1994)P/朋to193:341-348)。盡管已在遺傳學上描述了Zm-D9(Winkler和Freeling(1994)尸/朋to193:341-348),但以前還沒有在分子水平上表征該基因。在本工作的過程中已分離并分析了兩個Zm-D9等位基因。野生型Zm-D9等位基因通過RTPCR由玉米系B73的RNA分離。Zm-D9MUT1等位基因通過PCR由分離自稱為D9xB73的GA無反應系的幼苗的基因組DNA分離(圖1)。預測Zm-D9MUT1沒有內含子，其它報告的DELLA基因也沒有。為確保獲得Zm-D9MUTl的正確編碼序列，通過RT-PCR檢驗cDNA。Zm-D8位于BIN1.09中，而Zm-D9位于染色體5,BIN5.00的同線性(syntenous)區中(Helentjaris等，(1988)g認"cs118:353-363;Winkler和Freeling(1994)尸/a"to193:341-348;Lawrence等，(2005)P/朋f尸/z"Zo/.138:55-58)。為檢驗分離的等位基因為Zm-D9形式，啟動多個項目，包括BAC文庫篩選和通過轉基因進行表型重演。Zm-D9被作圖至不能與遺傳和物理圖譜聯系在一起的B73BACbacb.pk425.i4，盡管其確實與染色體1和5這二者上的標志連鎖。為表明推定的Zm-D9與Zm-D8不同，并確定其染色體定位，進行燕麥附加系的PCR分析(圖2;Ananiev等，(1997)尸rac.Ato/,Sc/.94:3524-3529),并通過測序反應產物證實。該分析證實，推定的Zm-D9位置與染色體5相同，與染色體l上的Zm-D8基因座不同。通ii熒光蛋白融合體確定兩個玉米DELLA蛋白的亞細月包定位(圖3)。推定的Zm-D9定位與Zm-D8的定位類似，并與在核中的定位相一致。已在文件中記錄了眾多DELLA蛋白在其它植物系統中的核定位(Silverstone等，(2001)尸/朋fCe〃10:155-169;Ogawa等，(2000)基因245:21-29;Fleck和Harberd(2002)尸/朋f32:935-947;Gubler等，(2002)尸/a加尸/yw'o/.129:191-200;Wen和Chang(2002)尸/a"fCe〃14:87-100)。使用以下MultisiteGateway(Invitrogen,USA)改良的曰本煙草中間構建體(Hiei等，1994;Ishida等，1996)包被的鴒顆粒PHP23800、attB4:UBIPRO:attBl:ZM-D8:attB2:AC陽GFPl:NOSTE固:attB3或PHP25355、attB4:UBIPRO:attBl:ZM-D9:attB2:AcGFPl:NOSTERM:attB3。在室溫于黑暗中發芽后3天(DAG)，使用BiolisticPDS-1000/He粒子傳遞系統(BioRad,USA)和650psi裂片用以上構建體粒子轟擊HG11黃化苗。在DAG為6天時，用CARV旋轉盤共焦顯微鏡(FryerCompany,USA)目檢被轟擊的黃化苗。已生產了攜帶由苜蓿維管系統厚壁組織細胞優選的MS-S2a啟動子驅動的玉米DELLAcDNA的擬南芥T2植林。矮化作用(由最嚴重的至最不嚴重的)表現為以下的Zm-D8MUT>Zm-D8MPL>Zm-D9MUTl〉Zm-D8-Zm-D9(參見圖4)。另外，轉基因植林看起來具有如63在圖5中可見的改變的花形態。在Zm-D8MUT、Zm-D8MPL、Zm-D9和Zm-D9MUT1中，花絲似乎優先被縮短，使得花粉嚢比柱頭短。Zm-D8MUT轉基因植林看起來受到最大影響，而Zm-D9和Zm-D8MPL轉基因植抹幾乎不受影響。GUS和Zm-D8轉基因植抹的花絲似乎不受影響。所示的特定Zm-D8MUT轉基因系也是雄性不育的，因為其不脫落花粉。在圖2-5中公開的結果確證，分離的推定Zm-D9等位基因為Zm-D9的真實等位基因。分離的野生型Zm-D9在玉米染色體5上被編碼，與先前對Zm-D9測定的一樣(Winkler和Freeling，1994)。當將由Zm-D9編碼的蛋白與熒光標記蛋白翻譯融合時，其存在于與核一致的亞細胞位置，其它DELLA蛋白也是如此。最有意義的是，攜帶Zm-D9MUT1等位基因的擬南芥轉基因植抹是矮化的，而攜帶野生型的那些為正常;f朱型。這些結果證實，由矮化的D9突變玉米苗分離的突變DELLA蛋白等位基因實際上負責玉米矮化機制，證實該基因的身份為Zm-D9。還在T2擬南芥植才朱中研究了對表達玉米DELLA蛋白的根結構的作用。所有植物都在18小時白天長度下在ArabiSun車載照明系統中于垂直的方形培一上生長。在發芽后10天時測定每4朱才直4朱的平均根長度和平均根尖數量，結果概述于表l。比對照植物(GUS)相比，攜帶Zm-D8MPL、Zm-D8MUT和MUT1Zm-D9構建體的植抹的平均根長度明顯更短，每林植林的根尖明顯更少。因此，與Zm-D8基因一樣，Zm-D9基因參與根結構的控制，尤其是根長度和根分枝(以每抹植抹的平均根尖數為證)。表1.表達玉米DELLA蛋白對轉基因(T2)擬南芥植林主要生長期1.03的根結構的作用(Boyes等，(2001)尸/a"fCe〃13:1499-1510)。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>上標字母指示依椐LSD分析于95%置信水平彼此不是顯著不同的組別。由4個獨立轉化事件的4-15個平行測定收集數據。實施例2Zm-D9轉化玉米植物和轉基因植物的再生用含有與MS-S2A啟動子(MS-S2aPRO)有效連接的Zm-D9和選擇性標記基因PAT(Wohlleben等，(1988)70:25-37)的質粒轟擊得自溫室供應植物的未成熟玉米胚，所述選擇性標記基因PAT賦予對除草劑雙丙氨膦的抗性。或者，選擇性標記基因在獨立的質粒上提供。如下進行轉化。培養基配方如下。草巴組織的制備除掉穗的外殼，并在加0.5%Micro變性劑的30%Clorox漂白液中表面消毒20分鐘，用無菌水沖洗2次。切下未成熟胚，并將胚軸側向下(子葉盤側向上)放置在560Y培養基上達4小時，每個平^li丈25個胚，然后在2.5cm靶區內對齊，準備轟擊。制備含有與在植物中可表達的啟動子有效連接的Zm-D9的質粒載體。如下使用CaCl2沉淀法將該質粒DNA與含PAT選擇性標記的質粒DNA沉淀在l.lpm(平均直徑)鎢顆粒上100pl制備的鵠顆粒的水溶液；10pl(1pg)DNA的TrisEDTA緩沖液(l貼總DNA);100pl2.5MCaCl2;和10pl0,1M亞精胺。在多管渦旋器上保持的同時將每種試劑依次加入鎢顆粒懸浮液中。對最終混合物短暫超聲處理，并使其在恒定渦旋下溫育10分鐘。在沉淀期后，將各管短暫離心，除去液體，用500ml100%乙醇洗滌，并離心30秒。再次除去液體，向最終鴒顆粒沉淀加入105^1100%乙醇。對于粒子槍轟擊，對鴒/DNA顆粒短暫超聲處理，將10pl點樣在每個巨載體中心，并在轟擊前將其干燥約2分鐘。樣品平板在粒子槍中以水平#4轟擊。所有樣品都接受650PSI的單次轟擊，由每管制備的粒子/DNA取出總共IO個等份試樣。在轟擊后，將胚保持在560Y培養基上達2天，然后轉移至含有3mg/升雙丙氨膦的560R選擇培養基，并每2周進行1次傳代培養。約10周選擇后，將選出的抗性愈傷組織克隆轉移至288J培養基，以啟動植抹再生。在體細胞胚成熟(2-4周)后，將良好發育的體細胞胚轉移至萌發培養基，并轉移至光照培養室。約7-10天后，將發育的小植林轉移至在管中的272V無激素培養基培養7-10天，直至小植4朱長勢良好。然后，將植物轉移至鋪有盆栽土的平板(相當于2.5"盆)襯墊中，放在培養室中生長l周，隨后放在溫室中再生長l-2周，接著轉移至經典的600盆(1.6加侖)中，并生長至成熟。監測植林，并記錄林高。MUT1Zm-D9林高在該階段降低約60%。轟擊培養基(560Y)含有4.0g/1N6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson氏維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺素、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12,4-D和2.88g/1L-脯氨酸(用KOH調整至pH5.8后用D-IH20定容)；2.0g/1脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)(用D-IH20定容后加入)；和8.5mg/l硝酸銀(在培養基滅菌并冷卻至室溫后加入)。選擇培養基(560R)含有4.0g/1N6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson氏維生素混合物(IOOOXSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺素、30.0g/1蔗糖和2.0mg/12,4-D(用KOH調整至pH5.8后用D-IH20定容)；3.0g/1脫乙酰吉蘭糖膠(用D-IH20定容后加入)；以及0.85mg/1硝酸銀和3.0mg/1雙丙氨膦(二者均在培養基滅菌并冷卻至室溫后加66入)。植林再生培養基(288J)含有4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/IMS維生素母液(0.100g煙酸、0.02g/1鹽酸硫胺素、0.10g/1鹽酸吡噴醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)(Murashige和Skoog(1962)尸/2少w'o/.15:473)、100mg/1肌醇、0.5mg/1玉米素、60g/1蔗糖和1.0ml/10.1mM脫落酸(調整至pH5.6后用精制的D-IH20定容)；3.0g/l脫乙酰吉蘭糖膠(用D-IH20定容后加入)；和1.0mg/1吲哚乙酸和3.0mg/1雙丙氨膦(在培養基滅菌并冷卻至60°C后加入)。無激素培養基(272V)含有4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/1MS維生素母液(O.IOOg/1煙酸、0.02g/1鹽酸硫胺素、0.10g/1鹽酸吡哆醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)、0.1g/1肌醇和40.0g/1蔗糖(在調整至pH5.6后用精制的D-IH20定容)；和6g/1細菌瓊脂(在用精制的D-IH20定容后加入)，滅菌并冷卻至60°C。轟擊和培養基轟擊培養基(560Y)含有4.0g/1N6基礎鹽(SIGMA01416)、1.0ml/1Eriksson氏維生素混合物(l000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺素、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12，4-D和2.88g/1L-脯氨酸(用KOH調整至pH5.8后用D-IH20定容)；2.0g/1脫乙酰吉蘭糖膠(用D-IH20定容后加入)；和8.5mg/1硝酸銀(在培養基滅菌并冷卻至室溫后加入)。選擇培養基(560R)含有4.0g/1N6基礎鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson氏維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺素、30.0g/1蔗糖和2.0mg/12,4-D(用KOH調整至pH5.8后用D-IH20定容)；3.0g/l脫乙酰吉蘭糖膠(用D-IH20定容后加入)；和0.85mg/l硝酸銀和3.0mg/1雙丙氨膦(二者均在滅菌培養基并冷卻至室溫后加入)。植林再生培養基(288J)含有4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/IMS維生素母液(0.100g煙酸、0.02g/1鹽酸硫胺素、0.10g/1鹽酸吡p多醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)(Murashige和Skoog(1962)尸/戸o/.15:473)、100mg/1肌醇、0.5mg/1玉米素、60g/1蔗糖和1.0ml/1的0.1mM脫落酸(在調整至pH5.6后用D-I仏0定容)；3.0g/1脫乙酰吉蘭糖膠(用D-IH20定容后加入)；和1.0mg/1吲哚乙酸和3.0mg/1雙丙氨膦(在培養基滅菌并冷卻至60。C后加入)。無激素培養基(272V)含有4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/1MS維生素母液(O.IOOg/1煙酸、0.02g/1鹽酸硫胺素、0.10g/1鹽酸吡哆醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)、0.1g/1肌醇和40.0g/1蔗糖(在調節pH至5.6后用精制的D-IH20定容)；和6g/1細菌-瓊脂(在用精制的D-IH20定容后加入)，滅菌并冷卻至60。C。實施例3土壤桿菌介導的含Zm-D9的玉米轉化和轉化植物的再生對于用一種或多種本發明的Zm-D9核苷酸多核苷酸分子進行的土壤桿菌(^gratoc^7MW)介導的玉米轉化，使用Zhao的方法(美國專利號5,981,840和PCT專利公布號W098/32326;其內容在此引入作為參考)。簡而言之，由玉米分離未成熟胚，使所述胚與土壤桿菌懸浮液接觸，其中該細菌能夠將目標Zm-D9多核苷酸轉移至至少1個未成熟胚的至少l個細胞(步驟l:感染步驟)。在該步驟中，將未成熟胚浸入土i裏桿菌懸浮液中開始接種。將胚與土壤桿菌共培養一段時間(步驟2:共培養步驟)。在感染步驟后將未成熟胚在固體培養基上培養。在此共培養階段之后，設想了任選的"休眠"步驟。在該休眠步驟中，在至少1種已知抑制土i裏桿菌生長的抗生素存在下溫育胚，而且不加入4直物轉化體的選擇劑(步驟3:休眠步驟)。將未成熟胚在具有抗生素但沒有選擇劑的固體培養基上培養，用于土壤桿菌的消除和感染細胞的休眠期。接著，將接種的胚在含有選擇劑的培養基上培養，并回收生長的轉化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。將未成熟胚在具有選擇劑的固體培養基上培養，使轉化細胞產生選擇性生長。然后愈傷組織再生為植抹(步驟5:再生步驟)，并將在選擇性培養基上生長的愈傷組織在固體培養基68上培養，以再生植林。實施例4用Zm-D9轉化大豆胚和轉化植物的再生培養條件將大豆胚發生懸浮培養物(栽培變種Jack)保持在150ipm、26°C旋轉搖床上的35ml液體培養基SB196(參見下文配方)中，按照16:8小時晝/夜光周期冷白熒光燈照明，光強度為60-85^E/m2/s。將約35mg組織接種入35ml新鮮液體SB196中，每7天至2周將培養物傳代培養1次(優選的傳代培養間隔為每7天1次)。用在以下實施例中描述的質粒和DNA片段通過粒子^r轟擊方法轉化大豆胚發生懸浮培養物(Klein等，(1987)327:70)。啟動大豆胚發生懸浮培養每月2次啟動大豆培養，每次啟動之間為5-7天。在種植后45-55天由可用的大豆植;昧揀選具有未成熟種子的豆莢，除去它們的外殼后置于品紅色無菌箱中。在含有1滴象牙皂的5%Clorox溶液(95ml高壓蒸汽滅菌的蒸餾水加5mlClorox和1滴皂)中振搖15分鐘消毒大豆種子。充分混合。使用2瓶1升的無菌蒸餾水沖洗種子，將小于4mm的那些種子置于單獨的顯微鏡載玻片上。切下種子的小末端，將子葉壓出種皮。將子葉轉移至含有SB1培養基的平板(每個平板放25-30個子葉)。用纖維帶包裏平板，并儲存8周。然后，切下次生胚，并置于SB196液體培養基中達7天。準備轟擊用DNA使用含有目標基因和選擇性標記基因的完整質粒或DNA質粒片段進行轟擊。常規制備用于轟擊的質粒DNA，并使用在PromegaProtocolsandApplicationsGuide,第二版(第106頁)中描述的方法純化。通過凝膠分離雙重消化的質粒獲得攜帶Zm-D9多核苷酸的質粒片69段。在每種情況下，在適于目標質粒的0.5ml特定酶混合物中消化100嗎質粒DNA。獲得的DNA片段在1%SeaPlaqueGTG瓊脂糖(BioWhitakerMolecularApplications)上進行凝膠電泳分離，由瓊脂糖凝膠上切下含有Zm-D9多核苷酸的DNA片段。使用GELase消化酶按照生產商的方案由瓊脂糖純化DNA。將含有3mg金顆粒(3mg金)的50pl等份的無菌蒸餾水加入5pl的1pg/nlDNA溶液(如上所述制備的完整質粒或DNA片段)、50pl2.5MCaCl2和20pl0.1M亞精胺中。將混合物以渦旋振蕩器的水平3振搖3分鐘，并在臺式離心機中離心10秒。在用400pl100%乙醇洗滌后，超聲處理將顆粒物懸浮于40pl100%乙醇中。將5plDNA懸浮液分配到BiolisticPDS1000/HE設備盤的每個飛行盤。每5pl等份試樣^^有每次轟擊(即每盤)約0.375mg金。組織制備和用DNA轟擊將約150-200mg的7天齡胚懸浮培養物置于空的無菌60x15mm培養皿中，培養亞用塑料網覆蓋。以每個平板1或2次射擊來轟擊組織，膜破裂壓力設置為1100PSI,彈腔祐:抽空至27-28英寸汞柱真空度。將組織置于距保留/阻擋片約3.5英寸處。轉化胚的選擇使用潮霉素(當使用潮霉素磷酸轉移酶HPT基因作為選擇性標記時)或氯磺隆(當使用乙酰乳酸合酶ALS基因作為選擇性標記時)選擇轉化胚。潮霉素(HPT、選擇在轟擊后，將組織置于新鮮SB196培養基中，并如上所述培養。在轟擊后6天，用含有30mg/L潮霉素選擇劑的新鮮SB196更換SB196。每周更新選擇培養基。在選擇后4-6周，可觀察到由未轉化的壞死胚發生叢生長出綠色轉化組織。取出分離的綠色組織，并接種70入多孔平板中，以產生新的、克隆繁殖的轉化胚發生懸浮培養物。氯磺隆(ALS、選擇在轟擊后，將組織分配在含有新鮮SB196培養基的2個長頸瓶中，并如上所述培養。在轟擊后6-7天，用含有100ng/ml氯磺隆選擇劑的新鮮SB196更換SB196。每周更新選擇培養基。在選擇后4-6周，可觀察到由未轉化的壞死胚發生叢生長出綠色轉化組織。取出分離的綠色組織，并接種入含有SB196的多孔平板中，以產生新的、克隆繁殖的轉化胚發生懸浮培養物。大豆體細胞胚再生為植抹為了由胚發生懸浮培養物獲得全抹，必須再生組織。胚成熟在冷白熒光(Phillips冷白EconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro)燈泡(40瓦)下，以16:8小時光周期和90-120uE/m2s光強度，將胚在SB196中于26。C培養4-6周。此后，將胚叢移至固體瓊脂培養基SB166達1-2周。然后將各叢在培養基SB103中傳代培養達3周。胚脫水和發芽將成熟的單個胚置于空的小培養皿(35xl0mm)中約4-7天使其脫水。用纖維帶密封平板(產生小濕潤腔)。將脫水的胚種植在SB71-4培養基中，在該培養基中，使它們在上述相同的培養條件下發芽。由發芽培養基取出發芽的小植4朱，并用水徹底沖洗，然后種植在24-孔淺盤(24-ce11packtray)的Redi-Earth中，用透明的塑料罩覆蓋。在2周后，移開罩，植林經過耐寒鍛煉l周。如果小植林看起來強壯了，則將它們移植到IO，，盆的Redi-Earth，每個盆至多3棵小植4朱。在10-16周后，收獲成熟種子，^爭裂并分析蛋白。培養基配方SB196-FN低鹽液體增殖培養基(每升)-MSFeEDTA-100x原液110mlMS硫酸鹽-100x原液210mlFN低鹽囟化物-100x原液310mlFN低鹽P、B、Mo-100x原液410mlB5維生素(lml/L)1.0ml2,4-D(10mg/L終濃度)1.0mlKN032.83gm(NH4)2S040.463gm天冬酰胺1.0gm蔗糖(1%)10gmpH5.8FN低鹽原液母液#1MSFeEDTA100x原液Na2EDTA*FeS04-7H201000ml500ml3.724g1.862g2.784g1.392g*首先加入，在攪拌的同時溶于黑色瓶中2MS硫酸鹽100x原液MgS04-7H2037.0g18.5gMnS04-H201.69g0.845gZnS04-7H200.86g0.43gCuS04-5H200.0025g0.00125g3FN低鹽面化物lOOx原液CaCl2-2H2030.0g15.0gKI0.083g0.0715gCoCl2-6H200.0025g0.00125g4FN低鹽P、B、Mol00x原液KH2P0418.5gH3B030.62gNa2Mo04-2H200.025g9.25g0.31g0.0125gSB1固體培養基(每升)含有1包MS鹽(Gibco/BRL-目錄號11117-066);1mlB5維生素1000X母液；31.5g蔑糖；2ml2,4-D(20mg/L終濃度)；pH5.7;和8gTC瓊脂。SB166固體培養基(每升)含有1包MS鹽(GibcoZBRL-目錄號11117-066);1mlB5維生素1000X母液；60g麥芽糖；750mgMgCl2六水合物；5g活性炭；pH5.7;和2g脫乙酰吉蘭糖膠。SB103固體培養基(每升)含有1包MS鹽(Gibco/BRL-目錄號11117-066);1mlB5維生素1000X母液；60g麥芽糖；750mgMgCl2六水合物；pH5.7;和2g脫乙酰吉蘭糖膠。SB71-4固體培養基(每升)含有1瓶Gamborg氏B5鹽w/庶糖(Gibco/BRL-目錄號21153-036);pH5.7;和5gTC瓊脂。2,4-D原液由濃度為1mg/ml的Phytotech目錄號D295預制備獲3曰付。以等份試樣儲存于-20。C的B5維生素原液(每100ml)^^有10g肌醇；100mg煙酸；100mg鹽酸吡p多醇；和lg碌u胺素。如果該溶液溶解得不夠快，則經加熱攪拌器施加低水平熱量。氯磺隆母液含有1mg/ml的0.01N氫氧化銨溶液。用Zm-D9進行向日葵分生組織轉化和轉化植物的再生用含有與MS-S2A啟動子有效連接的本發明的Zm-D9多核苷酸分子的表達盒如下轉化向日葵分生組織(另參見歐洲專利號EP0486233,該專利在此引入作為參考，和Malone-Schoneberg等，(l"4)尸/a^Scze"ce103:199-207)。使用1臺麥穗脫粒機使成熟的向日葵種子(Hetom/wsa朋,sL.)脫殼。用每50ml溶液加入2滴吐溫20的20%實施例573Clorox漂白溶液將種子表面消毒30分鐘。用無菌蒸餾水沖洗種子兩次。通過修改的Schrammeijer等，(Schrammeijer等，(1990)尸/朋fCe//丑W.9:55-60)所述程序制備裂開的胚軸外植體。在表面消毒程序后將種子浸入蒸餾水中達60分鐘。然后折斷每粒種子的子葉，在胚軸平面得到干凈斷面。切下根尖后，將外植體在原葉之間縱向對分。將兩個半切面的切割面向上放置在GBA培養基上，GBA培養基由Murashige禾口Skoog礦物元素(Murashige等，(1962)尸/z;wo/.尸/a"[15:473-497)、Shepard氏維生素添加劑(Shepard(1980)載于五w^geWrec/2wz々wes/orAeG^we"c/附p廠ove附ewo/Oo/w(UniversityofMinnesotaPress,St.Paul,Minnesota)、40mg/1硫酸^l^票呤、30g/1蔗糖、0.5mg/16-千基-氨基。票呤(BAP)、0.25mg/1吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/1赤霉酸(GA3),pH5.6和8g/l植物瓊脂組成。在土壤桿菌處理前，對外植體進行微彈轟擊(Bidney等，(1992)f/aWMo/.說o/.18:301-313)。將30-40個外植體以環狀放置在60x20mm平板中心進行該處理。將約4.7mg的1.8mm鵠微彈重懸浮在25ml無菌TE緩沖液(lOmMTrisHCl,1mMEDTA,pH8.0)中，每次轟擊使用1.5ml等份試樣。每塊平板在PDS1000⑧顆粒加速器中經置于樣品之上2cm的150mmnytex屏轟擊2次。在所有轉化實驗中都使用卸曱根瘤土壤桿菌菌林EHA105。按照Holsters等，(1978)Mo/.G饑Gew",163:181-187所述的凍融法將含有表達盒的二元質粒載體導入土壤桿菌菌林EHA105中，所迷表達盒包含與所述啟動子有效連接的Zm-D9多核苦酸分子。該質粒還包含卡那霉素選擇性標記基因(即"^/T)。用于植物轉化實驗的細菌在液體YEP培養基(10g/l酵母提取物、10g/l細菌蛋白胨和5g/lNaCl，pH7.0)中過夜培養(28。C和100RPM連續攪拌)，所述液體YEP培養基含有維持細菌菌林和二元質粒所需的合適抗生素。懸浮液在OD6oo達到約0.4-0.8時使用。沉淀土壤桿菌細胞，并用含有12.5mMMESpH5.7、1g/lNH4Cl和O.3g/lMgS04的接種培養基重懸浮至最終OD6oo為0.5。將轟擊過的新鮮外植體置于土壤桿菌懸浮液中，混合，并靜置30分鐘。然后將外植體轉移到GBA培養基，并切面向下于26。C以18小時白晝共栽培。共栽培3天后，將外植體轉移到補加250mg/l頭孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B(沒有生長調控劑且蔗糖水平降低為P/。的GBA培養基)中。將外植體選擇培養2-5周，然后轉移到不含卡那霉素的新鮮374B培養基中繼續發育l到2周。將具有分化的、耐抗生素的、尚未產生適于切除的枝條的生長區的外植體轉移到含250mg/1頭孢噻肟的GBA培養基中，用以進行第二次3天的植物激素處理。通過ELISA測定來自綠色的、抗卡那霉素的枝條的葉樣品的NPTII存在情況，并通過測定Zm-D9活性測定轉基因表達的存在情況。將NPTII陽性枝條嫁接到Pionee^雜種6440體外生長向日葵實生砧。使表面消毒的種子在48-0培養基(半濃Murashige和Skoog鹽、0.5%蔗糖、0.3%脫乙酰吉蘭糖膠，pH5.6)中萌發，并在針對外才直體培養所描述的條件下生長。去掉幼苗上部，在下胚軸上制作1cm垂直切片，然后將轉化的枝條插入切口。整個區域用石蠟膜(parafilm)包裹，以保護枝條。可在1周體外培養后將嫁接的植林轉移到土壤中。將在土壤中的移植體保持在高濕度條件下，然后對溫室環境緩慢適應。在溫室中成熟的To植林(親本代)的轉化部分通過葉提取物的NPTIIELISA來鑒定。實施例6Zm-D9的表達和表征表達譜表明，由發育觀點看，必顯示出對成熟的分化細胞的偏好性，尤其是那些與桿結合的分化細胞，而必與分裂細胞或分生組織細胞更相關(圖10)。例如，必在分生組織、桿的分裂區(節間)和過渡區中的表達明顯更高，而必和必在節間的成熟區中大致平等地表達。必和必的最高表達水平分別在穗和維管束中。一般而言，維管器官/75組織具有的兩種基因的表達均高于非維管器官/組織的表達。這與在雙子葉植物維管系統之中和周圍的DELLAmRNA和蛋白的存在情況相一致(Haywood等，(2005)P/朋fJowma/42:49-68;Isradsson等，(2005)P/aWJowma/44:494-504),提示在雙子葉植物和單子葉植物之間定位是保守的。為進一步剖析D9等位基因的性質，建立結構域交換構建體，并將其轉化入擬南芥中。在必和入門克隆之間交換5個遺傳區(圖11),使用獲得的嵌合入門克隆建立S2APRO::DELLA中間體和共整合載體，如對天然玉米等位基因所述用于轉化。在Tl代進行結構域交換轉基因植林的形態測量分析(圖14)。得自DP的E600K突變對于矮化和更早開花的表型變化是必須的并足夠的。必E600K和DPK597E產生的形態影響與它們的主鏈等位基因不同(圖14)。最值得注意的差異是片朱高、長角果長度、至開花的天數以及開花時的蓮座葉的數量。對于全部4種情況，必(E600K)4i^朱均顯示出類似于Z^的特征。平均看來，(E600K)嵌合體產生的才直林的莖和長角果最短，在IO個構建體中的任一個開花時的蓮座葉都最少。相反，D9K597E的長角果長度、至開花的天數和開花時的蓮座葉數量排在第二高或笫三高。沒有其它的多態性展現出清晰的高度或開花時間改變模式。該突變和其它突變因此在玉米林型向籽粒型高產能構型改變方面具有特定用途。玉米DELLA矮化等位基因被發現加速擬南芥開花。DSA/尸丄和DSA^7r將開花移前約6天(圖12)。引人注目的是，D9加速開花達11天(26.5%)。該作用似乎與赤霉素-不敏感性有關聯，因為必和必轉基因植林的開花時間與GUS對照沒有顯著不同。基因使TOGS3xGaspeFlint開花延后(圖13),而必導致開花提前(使用地面上的所有節點作為成熟轉變的基礎；圖12)。在必或DSAf尸丄轉基因玉米中還沒有觀察到開花時間改變。選擇MS-S2A啟動子，以驅動5個玉米DELLA等位基因在轉基因擬南芥中的表達。水稻肌動蛋白1啟動子用于驅動這些等位基因在提早的轉基因擬南芥組別中表達。這些轉化體的Tl植物沒有表現出任何可見的表型，提示水稻肌動蛋白1啟動子在適宜組織中不表達DELLA蛋白。已知該結果、必和必的玉米表達諉(圖10)以及Haywood等人的著作((2005)P/aW/owmo/42:49-68)表明DELLA蛋白和mRNA在3個物種中的維管系統關聯，選擇MS-S2A啟動子，用于在擬南芥和玉米中進行玉米DELLA表達。選擇轉基因方法，以便可以直接進行玉米等位基因比較，這應當不會被啟動子依賴性作用曲解。這些數據確證了組織特異性啟動子作為改變植物構型的策略的用途。實施例7Zm-D9變體A.不改變編碼的氨基酸序列的Zm-D9的變體核苷酸序列(SEQIDNO:1、3、4或6)在SEQIDNO:l、3、4或6中所示的Zm-D9核苷酸序列用于產生變體核普酸序列，在與SEQIDNO:1、3、4或6的起始未改變的ORF核苷酸序列相比較時，所述變體核苷酸序列具有的可讀框的核苷酸序列具有約70%、76%、81%、86%、92%和97%的核苦酸序列同一性。這些功能性變體使用標準密碼子表產生。盡管變體的核苦酸序列^L改變，但由可讀框編碼的氨基酸序列沒有改變。B.Zm-D9的變體氨基酸序列產生Zw-D9的變體氨基酸序列。在該實施例中，改變一個氨基酸。具體地說，考察在SEQIDNO:2或5中陳述的氨基酸序列，以確定合適的氨基酸改變。通過參考(與多個物種的另一個直系同源物和其它基因家族成員的)蛋白比對對要改變的氨基酸進行選擇。參見圖7。選定的氨基酸被認為并未處于高選擇壓力下(非高度保守的)，而是容易>&具有相似化學特征(即類似的功能性側鏈)的氨基酸取代。使用在77圖7中所示的蛋白比對可以改變適宜的M酸。一旦鑒定出目標_酸，就實施在實施例6A中積克述的方法。使用該方法產生與SEQIDNO:1、3、4或6具有約70%、75%、81%、86%、92%和97%的核酸序列同一性的變體。C.Zm-D9的其它變體氨基酸序列在本實施例中，產生相對于參比蛋白序列具有82%、87%、92%和97%的同一性的人工蛋白序列。此后一項工作需要由圖7中所示的比對鑒定保守區和可變區，然后明智地使用氨基酸取代表。這部分將在下文更詳細地論述。很大程度上基于Zm-D9蛋白或其它DELLA蛋白中的保守區決定要改變的氨基酸序列。參見圖7。基于序列比對，可能要改變的Zm-D9蛋白的多個區以小寫字母表示，而保守區以大寫字母表示。一般認為可在以下的保守區進行保守取代，而不改變功能。另外，技術人員應理解，本發明的Zm-D9氨基酸序列的功能變體可在保守區中具有少數非保守的氛基酸改變。保守區存在于SEQIDNO:2的約氨基酸37-109、224-504、528-625之間。非保守區為SEQIDNO:2的約氨基酸l-36、110-223、505-527。然后建立以80-85%、85-90%、90-95%和95-100%同一性的區間不同于原始序列的人工蛋白序列。以這些區間的中點為目標，自由度加上或減去例如1%。氨基酸取代可通過定制Perl腳本實現。取代表在下表2中提供。表2.取代表<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>首先鑒定蛋白中不應被改變的任何保守氨基酸，并被"標明為"與取代隔離。起始甲硫氨酸毫無疑問將被自動加入該列表。然后進行改變。H、C和P在任何情況下都不被改變。首先對異亮氨酸進行改變，從N末端掃描到C末端。然后是亮氨酸，并沿著列表向下類推，直到達到合適的耙點。可實施中間數取代，以便不引起反向改變。列表被標序為1-17,所以根據需要以許多異亮氨酸改變開始，然后是亮氨酸，并以此類推，直到曱硫氨酸。顯然，以此方式許多氨基酸不需要被改變。L、I和V涉及兩個可選擇的最佳取代的50:50取代。變體氨基酸序列被記錄為輸出。用Perl腳本計算同一性百分率。使用該方法，產生與SEQIDNO:1、3、4或6的起始未改變的ORF核苷酸序列具有約82%、87%、92%和97%的氨基酸同一性的Zm-D9蛋白變體。冠詞"一個，，和"一種"在本文用于指1個或1個以上(即至少1個)該冠詞的語法賓語。作為實例，"一種因素"意指1個或1個以上的因素。在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都表現出本發明所屬領域的技術人員的水平。所有出版物和專利申請都通過引用結合到本文中，其程度如同每個單獨的出版物或專利申請^皮具體地和單獨地指出通過引用結合到本文中一樣。盡管為了清楚理解的目的而通過闡述和實施例相當詳細地描述了前述發明，但是很顯然，可在隨附權利要求的范圍內實施某些變更和修改。實施例8Zm-D9在玉米中的表達和表征在玉米(T0代)中測試結構域交換構建體(參見實施例6)d9E600k和D9K597E,以便確定它們對抹高、葉數量、至出穗的天數、至首次花粉脫落的天數和至授粉的天數的影響。將d9E600k和D9K597E的表型數據與使用MUT1Zm-D9等位基因和Zm-D8MPL等位基因的數據對比。在所有情況下，S2a啟動子均用于驅動各自的結構基因表達。載體構建詳述于實施例6。相比于在溫室中同時生長的相同基因型的未轉化玉米植林，D9K597E的林高未被改變。同樣，D9K597E的葉數量、至出穗的天數、至首次花粉脫落的天數和至授粉的天數與未轉化植物類似。MUT1D9和d9E600K轉基因植林相比于D9K597E平均具有1個額外的葉。d9E600K和MUT1D9轉基因植林相比于D9K597E高度顯著降低(分別降低50。/o和30。/())。另一方面，d9E600k和MUT1D9在出穗、花粉脫落和授粉日期方面相比于D9K597E延遲。花粉脫落延遲多達14天(對于MUT1D9)和10天(對于d9E600k)。授粉延遲與這些轉基因植類似。另外，這些轉基因植林相比于D980K597E表現出約1個額外的節。這些數據在高度方面顯示出與擬南芥類似的模式(較短的莖)，但顯示出相反的成熟變化表型，其中MUT1D9和d9E600k的成熟延遲。這些數據證實了在擬南芥和玉米這二者中這種4^型和開花時間變化的多態性的意義。MUT1D9和d9E600k突變在玉米的籽粒型高產能構型中對改變備選植株構型的抹型、節數或成熟度可具有特定用途。權利要求1.一種分離的多肽，其包含選自以下的氨基酸序列(a)包含SEQIDNO2或5的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO2具有至少93％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有Zm-D9活性；(c)與SEQIDNO5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有MUT1Zm-D9活性；(d)由在嚴格條件下與SEQIDNO1或3的互補物雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，其中所述嚴格條件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中于37℃雜交，并在0.1XSSC中于60℃至65℃洗滌；(e)由在嚴格條件下與SEQIDNO4或6的互補物雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，其中所述嚴格條件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中于37℃雜交，并在0.1XSSC中于60℃至65℃洗滌；(f)含有SEQIDNO2的至少124個連續氨基酸的氨基酸序列，其中所述多肽保持Zm-D9活性；和(g)包含SEQIDNO5的至少124個連續氨基酸的氨基酸序列，其中所述多肽保持MUT1Zm-D9活性。2.—種分離的多核苷酸分子，其包含選自以下的核苷酸序列(a)包含SEQIDNO:l、3、4或6的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核苷酸序列；歹'],其中所述嚴格條件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37°C雜交，并在0.1XSSC中于60°C至65°C洗滌；(d)與SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；(e)含有SEQIDNO:1或3的至少698個連續核苷酸或其互補物的核苷酸序列；(f)編碼的氬基酸序列與SEQIDNO:2具有至少93。/。序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；和(g)與SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核苷酸序歹"其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)含有SEQIDNO:4或6的至少395個連續核苷酸或其互補物的核苷酸序列；和(i)編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核苦酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽。3.—種包含權利要求2的多核苷酸分子的表達盒。4.權利要求3的表達盒，其中所述多核苷酸分子與在植物中驅動表達的啟動子有效連接。5.—種含有權利要求3或4的表達盒的非人宿主細胞。6.權利要求5的宿主細力包，其中所述宿主細胞為植物細胞、細菌細胞或真菌細胞。7.—種植物，其含有與在植物中驅動表達的啟動子有效連接的多核苦酸分子，其中所述多核苦酸分子含有選自以下的核苷酸序列(a)含有SEQIDNO:1、3、4或6的核苷酸序列；(b)編碼含有SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核苷酸序列；列，其中所述嚴格條件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37°C雜交，并在0.1XSSC中于60。C至65。C洗滌；(d)與SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；(e)含有SEQIDNO:1或3的至少698個連續核苷酸或其互補物的核苷酸序列；(f)編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:2具有至少93%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核普酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；和(g)與SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核苷酸序歹'J，其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)^^有SEQIDNO:4或6的至少395個連續核苷酸或其互補物的核苷酸序列；和(i)編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽。8.權利要求7的植物，其中所述植物為細胞。9.權利要求7的植物，其中所述植物為單子葉植物。10.權利要求9的植物，其中所述單子葉植物選自玉米、小麥、水稻、高粱、黑麥、黍和大麥。11.權利要求7的植物，其中所述植物為雙子葉植物。12.權利要求11的植物，其中所述雙子葉植物選自擬南芥、大豆、向曰葵、紅花、苜蓿、蕓苔、棉花和花生。13.權利要求7-12中任一項的植物，其中所述多核苷酸分子^C穩定地摻入植物的基因組中。14.權利要求13的植物，其中所述植物為種子。15.—種增加^i物中的多肽水平的方法，該方法包括將含有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸分子導入所述植物中(a)包含SEQIDNO:l、3、4或6的核普酸序列；(b)編碼包含SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)在嚴格條件下與(a)的核苷酸序列的互補物雜交的核苷酸序歹'J,其中所述嚴格條件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37。C雜交，并在0.1XSSC中于60。C至65。C洗滌；(d)與SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；(e)^^有SEQIDNO:1或3的至少698個連續核苷酸或其互補物的核苷酸序列；(f)編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:2具有至少93%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；和(g)與SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核苷酸序歹'J，其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)含有SEQIDNO:4或6的至少395個連續核苷酸或其互補物的核普酸序列；和(i)編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽。16.—種用于調節植物中的多肽水平的方法，該方法包括將含有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸分子導入所迷植物中(a)包含SEQIDNO:l、3、4或6的核苦酸序列；(b)編碼包含SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核普酸序列；歹寸，其中所述嚴格條件包括在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37。C雜交，并在0.1XSSC中于60。C至65。C洗滌；(d)與SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；(e)^^有SEQIDNO:1或3的至少698個連續核苷酸或其互補物的核苷酸序列；(f)編碼的M酸序列與SEQIDNO:2具有至少93%序列同一性的核苷酸序列，其中所迷多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；和(g)與SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)含有SEQIDNO:4或6的至少395個連續核苷酸或其互補物的核苷酸序列；和(i)編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽。17.權利要求15或16的方法，其中所述多核苷酸分子穩定地摻入植物的基因組中。18.權利要求15-17中任一項的方法，其中所述植物為植物細胞。19.權利要求15-17中任一項的方法，其中所迷植物為雙子葉植物。20.權利要求19的方法，其中所述雙子葉植物選自擬南芥、大豆、向曰葵、紅花、苜蓿、蕓苔、棉花和花生。21.權利要求15-17中任一項的方法，其中所述植物為單子葉植物。22.權利要求21的方法，其中所述單子葉植物選自玉米、小麥、水稻、高粱、黑麥、黍和大麥。23.權利要求15的任一項的方法，其中所述植物為種子。24.—種用于改變植物生長的方法，所述方法包括用多核苷酸構建體轉化生物，所述多核苷酸構建體含有與能夠在所述生物中驅動所述核香酸序列表達的啟動子有效連接的核苷酸序列，其中所述核苦酸序列選自(a)包含SEQIDNO:l、3、4或6的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核苷酸序列；列，其中所述嚴格條件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37°C雜交，并在0.1XSSC中于60。C至65。C洗滌；(d)與SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核普酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；(e)含有SEQIDNO:1或3的至少698個連續核苷酸或其互補物的核苷酸序列；(f)編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:2具有至少93%序列同一性的核苦酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有Zm-D9活性的多肽；和(g)與SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核普酸序列，其中所述多核普酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)含有SEQIDNO:4或6的至少395個連續核苷酸或其互補物的核苦酸序列；和(i)編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核普酸序列，其中所述多核苷酸分子編碼具有MUT1Zm-D9活性的多肽。25.權利要求24的方法，其中所述核苷酸序列與所述啟動子有效連接以產生反義轉錄物。26.權利要求24的方法，其中相對于未轉化的植物，所述植物的高度降低。27.權利要求24的方法，其中相對于未轉化的植物，所述植物的高度增加。28.權利要求27的方法，其中相對于未轉化的植物，所述植物的根結構改變。29.權利要求24的方法，其中所述植物為單子葉植物。30.權利要求29的方法，其中所述單子葉植物選自玉米、小麥、水稻、高粱、黑麥、黍和大麥。31.權利要求24的方法，其中所述植物為雙子葉植物。32.權利要求31的方法，其中所述雙子葉植物選自擬南芥、大豆、向曰葵、紅花、苜蓿、蕓苔、棉花和花生。全文摘要本發明提供編碼玉米D9基因的突變等位基因和野生型等位基因的分離的多核苷酸分子。本發明進一步提供改變植物生長的方法，包括這些分離的多核苷酸分子、分離的多肽和轉化的植物、種子和細胞的用途。文檔編號C07K14/415GK101479294SQ200780022452公開日2009年7月8日申請日期2007年4月18日優先權日2006年4月19日發明者A·G·勞,D·T·托姆斯,S·拉維特,S·昆杜申請人:先鋒高級育種國際公司