二芳基硫代乙內酰脲化合物的制作方法

專利名稱：二芳基硫代乙內酰脲化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包括二芳基硫代乙內酰脲的二芳基乙內酰脲化合物，及合成它們和在治療激素難治的(refractory)前列腺癌中使用它們的方法。該申請引入同一受讓人的PCT/US2006/011417作為參考。

背景技術：
前列腺癌是西方人中最常見的癌和癌死亡的第二主要原因。當癌被局部限制時，該疾病可通過外科或輻射而治愈。但是，30％的這種癌因為遠處轉移性疾病而復發，和其它的在診斷時具有晚期疾病(advanced disease)。晚期疾病通過去勢和/或抗雄激素的給藥，即所謂的去雄激素療法治療。去勢降低雄激素的循環水平和降低雄激素受體(AR)的活性。抗雄激素的給藥通過競爭掉(compete away)雄激素的結合而阻斷AR功能，因此降低AR活性。盡管一開始有效，但這些治療迅速失效且癌變為激素難治的。
最近，AR的過度表達已被確定和證實為激素難治的前列腺癌的原因。參見Chen，C.D.，Welsbie，D.S.，Tran，C.，Baek，S.H.，Chen，R.，Vessella，R.，Rosenfeld，M.G.，and Sawyers，C.L.，Molecular determinants of resistanceto antiandrogen therapy，Nat.Med.，1033-39，2004，其在此作為參考并入。AR的過度表達足以導致從激素敏感的前列腺癌敏感發展到激素難治的前列腺癌，暗示著比現有藥物更好AR抑制劑可減慢前列腺癌的發展。證明了AR和其配體結合對激素難治的前列腺癌的發展是必需的，說明AR仍是該疾病的靶。還證明了在激素難治的前列腺癌中AR的過度表達將抗雄激素從拮抗劑轉化成激動劑(agonist)(AR拮抗劑抑制AR活性和AR激動劑促進AR活性)。來自該工作的數據解釋了為什么去勢和抗雄激素未能防止前列腺癌發展和揭示了激素難治的前列腺癌的未被認識的性質。
比卡魯胺(biscalutamide)(商標名Casodex)是最常用的抗雄激素。盡管它對激素敏感的前列腺癌中的AR具有抑制作用，但當癌變為激素難治時它未能抑制AR。目前抗雄激素的兩個弱點歸咎于未能防止前列腺癌從激素敏感階段發展到激素難治的疾病和未能有效地治療激素難治的前列腺癌。一個是其弱拮抗活性，和另一個是當AR在激素難治的前列腺癌中過度表達時其強激動(agonistic)活性。因此，為延遲疾病發展和治療致命的激素難治的前列腺癌需要具有更有效的拮抗活性和最小激動活性的更好的AR抑制劑。
對于前列腺癌，非甾族抗雄激素如比卡魯胺相對甾族化合物是優選的，因為它們是更選擇性和具有更小的副作用。這類化合物已被描述于許多專利如美國專利No.4,097,578/美國專利No.5,411,981、美國專利No.5,705,654、PCT國際申請WO 97/00071和WO 00/17163、和美國公開專利申請號2004/0009969中，其全部在此作為參考并入本發明。
美國專利No.5,434,176包括包含非常大量的化合物的寬泛權利要求，但僅針對這些化合物的一小部分提供合成路徑和僅對它們中的兩種提供藥理學數據，和本領域技術人員不能容易地預想其它特定化合物。
因為激素難治的前列腺癌的機理是未知的，因此沒有生物系統測試描述于這些專利的這些化合物關于它們對激素難治的前列腺癌的作用。尤其，激素難治的前列腺癌中的AR過度表達將抑制劑從拮抗劑轉變到激動劑的能力未被認知。激素難治的前列腺癌的一些新性質報道在PCT申請US04/42221和US05/05529中，其在此作為參考并入。PCT國際申請US05/05529提出了一種用于確認化合物的雄激素受體拮抗劑和激動劑特性的方法。但對于所生成的各個化合物，測定化合物的拮抗劑和激動劑特性耗時過程必須是確定的。即，沒有單獨的從化合物的化學結構來準確預測與治療前列腺癌有關的特性的方法。
一些化合物已被報道為配體結合域(LBD)雄激素受體(AR)的抑制劑。幾種已用作治療前列腺癌的藥物，如比卡魯胺(Casodex)。AR LBD的幾種結合劑已被確定，如硫代乙內酰脲、RU59063和BTID。(Teutsch，G.；Goubet，F.；Battmann，T.；Bonfils，A.；Bouchoux，F.；Cerede，E.；Gofflo，D.；Gaillard-Kelly，M.；Philibert.D..J.Steroid Boichem.Molec.Biol.1994，48，111-119；Van Dort，M.E.；Robins，D.M.；Wayburn，B.J.Med.Chem.2000，43，3344-3347) 需要具有期望的藥理學性質的新的硫代乙內酰脲化合物，和用于制備它們的合成路徑。因為活性對小的結構變化敏感，一種化合物在治療前列腺癌中可為有效的，而第二種化合物可為無效的，即使它與第一中化合物僅稍微不同，例如單個取代基的替代。
具有高的拮抗雄激素活性的效力和具有最小激動劑活性的化合物的確認應該戰勝激素難治的前列腺癌(HRPC)和避免或減慢激素敏感的前列腺癌(HSPC)的發展。因此，本領域中需要確認雄激素受體的選擇性調節劑，如非甾族、非毒性和組織選擇性的調節劑。


發明內容
本發明提供對AR具有強的拮抗劑活性和最小激動劑活性的一系列化合物。這些化合物抑制激素難治的前列腺癌的發展。
本發明的具體化合物包括
本發明還提供包含治療有效量的根據任何前述化合物的化合物或其可藥用鹽和可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發明包括用于治療過度增生病癥的方法，包括將這種藥物組合物向需要這種治療的患者給藥，由此治療過度增生病癥。過度增生病癥可以是激素難治的前列腺癌。劑量可以是約0.001mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天、約0.01mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天、約0.1mg/kg體重/天至約10mg/kg體重/天、或約1mg/kg體重/天。
該化合物可通過靜脈注射給藥、通過注射入組織給藥、腹膜內給藥、口服給藥、或鼻內給藥。該組合物可具有選自溶液、分散體、懸浮液、粉末、膠囊、片劑、丸劑、延時釋放(time release)膠囊、延時釋放片劑和延時釋放丸劑的形式。
給藥的化合物可選自NC54、NC55、NC56、或NC57、或其可藥用鹽。給藥的化合物可以是NC53或其可藥用鹽。
本發明提供了合成NC54的方法，包括將N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺和4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈在DMF中混合和加熱以形成第一混合物，和如上進行處理。
本發明還提供了合成NC55的方法，包括將N-甲基-2-氟-4-(1-氰基環戊基)氨基苯甲酰胺、4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈和DMF混合和在回流下加熱以形成第一混合物，和如上進行處理。
本發明進一步提供了合成NC56的方法，包括將N，N-二甲基4-[4-(1-氰基環丁基氨基)苯基]丁酰胺、4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈和DMF混合和在回流下加熱以形成第一混合物；和如上進行處理。
本發明提供了合成NC57的方法，包括將DMSO、二氯甲烷和草酰氯混合以形成第一混合物，將4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酰胺加入第一混合物以形成第二混合物；將三乙胺加入第二混合物以形成第三混合物；加溫該第三混合物和用含水NH4Cl(aqueous NH4Cl)猝滅(quench)以形成第四混合物；從第四混合物中提取有機層；和從有機層中分離該化合物。
在一個實施方案中，化合物具有下式
R1和R2獨立地是甲基或，與它們所連接的碳一起形成4至5個碳原子的環烷基，R3選自氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基烷基、烷基氨基甲酰基烷基、氰基、和氰基烷基，和R4是氫或氟。
在一個實施方案中，藥物組合物包含治療有效量根據權利要求1的化合物或其可藥用鹽和可藥用載體或稀釋劑。
化合物可例如具有下式

或
藥物組合物可包含治療有效量的化合物NC54或其可藥用鹽和可藥用載體或稀釋劑。藥物組合物可包含治療有效量的根據權利要求的化合物NC55或其可藥用鹽和可藥用載體或稀釋劑。
在一個實施方案中，用于治療過度增生病癥的方法包括將權利要求2的藥物組合物向需要這種治療的患者給藥，由此治療過度增生病癥。
該組合物可例如具有選自溶液、分散體、懸浮液、粉末、膠囊、片劑、丸劑、延時釋放膠囊、延時釋放片劑和延時釋放丸劑的形式。該化合物可通過靜脈注射給藥、通過注射入組織給藥、腹膜內給藥、口服給藥、或鼻內給藥。該組合物可按照約0.001mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天的化合物劑量給藥。該組合物可按照約0.01mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天的化合物劑量給藥。該組合物可按照約0.1mg/kg體重/天至約10mg/kg體重/天的化合物劑量給藥。該組合物可按照約1mg/kg體重/天的化合物劑量給藥。
用于治療前列腺癌的方法包括將藥物組合物向需要這種治療的患者給藥，由此治療前列腺癌。該藥物組合物可干擾前列腺特異性抗原mRNA的轉錄。該藥物組合物可防止雄激素受體蛋白質的核易位。該藥物組合物可使雄激素受體蛋白質不穩定。該組合物可口服給藥。該組合物可具有選自膠囊、片劑和丸劑的形式。
在一個實施方案中，該化合物可以是NC54、NC55、NC56、NC57、這些任一種的可藥用鹽、或其組合。
合成下式二芳基化合物的方法
包括將化合物I
化合物I 與化合物II
化合物II 在第一極性溶劑中混合以形成混合物，加熱該混合物，將與第一極性溶劑相同或不同的第二極性溶劑和含水酸加入該混合物，回流該混合物，冷卻該混合物并與水混合，和從混合物中分離該二芳基化合物。R51可包括1至4個碳原子的烷基鏈。R52可以是氰基、羥基、甲基氨基甲酰基、甲基氨基甲酰基-取代的烷基、甲基砜氨基甲酰基-取代的烷基、甲基氨基甲基、二甲基氨基甲基、甲基磺酰氧基甲基、甲氧基羰基、3-氰基-4-三氟甲基苯基氨基甲酰基、氨基甲酰基-取代的烷基、羧甲基、甲氧基羰基甲基、甲磺酰基、4-氰基-3-三氟甲基苯基氨基甲酰基-取代的烷基、羧基-取代的烷基、4-甲磺酰基-1-哌嗪基、哌嗪基、羥乙基氨基甲酰基-取代的烷基、或羥基乙氧基羰基-取代的烷基。R53可選自F和H。
在一個實施方案中，R51包括1至2個碳原子的烷基鏈，R52選自氨基甲酰基和甲基氨基甲酰基，和R53是F。
合成下式化合物的方法
可包括將4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈和N-甲基-4-(1-氰基環丁基氨基)-2-氟苯甲酰胺在二甲基甲酰胺中混合以形成第一混合物，加熱第一混合物以形成第二混合物，將醇和酸加入第二混合物以形成第三混合物，回流第三混合物以形成第四混合物，冷卻第四混合物，將第四混合物與水混合和提取有機層，和從有機層中分離該化合物。
合成權利要求4的化合物[NC54]的方法可包括將N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺和4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈在DMF中混合和加熱以形成第一混合物，將醇和酸加入第一混合物以形成第二混合物，回流第二混合物，冷卻第二混合物，將第二混合物與水混合和提取有機層，和從有機層中分離該化合物。
合成權利要求6的化合物[NC55]的方法可包括將N-甲基-2-氟-4-(1-氰基環戊基)-氨基苯甲酰胺、4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈和DMF混合和在回流下加熱以形成第一混合物，將醇和酸加入第一混合物以形成第二混合物，回流第二混合物，冷卻第二混合物，將第二混合物與水混合和提取有機層，和從有機層中分離該化合物。
合成權利要求8的化合物[NC56]的方法可包括將N，N-二甲基4-[4-(1-氰基環丁基氨基)苯基]丁酰胺、4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈和DMF混合和在回流下加熱以形成第一混合物，將醇和酸加入第一混合物以形成第二混合物，回流第二混合物，冷卻第二混合物，將第二混合物與水混合和提取有機層，和從有機層中分離該化合物。
合成權利要求9的化合物[NC57]的方法可包括將DMSO、二氯甲烷和草酰氯混合以形成第一混合物，將4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酰胺加入第一混合物以形成第二混合物，將三乙胺加入第二混合物以形成第三混合物，加溫第三混合物和用含水NH4Cl猝滅以形成第四混合物，從第四混合物中提取有機層，從有機層中分離該化合物。
一種方法可包括提供至少一種二芳基硫代乙內酰脲化合物，測量該化合物的雄激素受體活性的抑制和確定該抑制是否在第一預定水平之上，測量該化合物在激素難治的癌細胞中的雄激素受體活性的刺激和確定該刺激是否在第二預定水平之下，如果該抑制在第一預定水平之上和該刺激在第二預定水平之下則選擇該化合物。該預定水平可以是比卡魯胺的那些。測量抑制可包括在AR響應報道分子(reporter)系統或前列腺特異性抗原分泌體系中測量抑制濃度(IC50)。測量刺激可包括通過增加AR響應報道分子系統或前列腺特異性抗原分泌體系中的濃度而測量誘導倍數。測量抑制和/或刺激可包括測量該化合物對動物的腫瘤生長的作用。測量雄激素受體活性的抑制和/或刺激的步驟可包括測量雄激素受體對該化合物的結合親合性。測量雄激素受體活性的抑制和/或刺激的步驟可包括測量對雄激素受體向前列腺特異性抗原增強子(enhancer)和前列腺特異性抗原啟動子(promoter)的至少一種的募集的防止。測量雄激素受體活性的抑制和/或刺激的步驟可包括測量對雄激素受體核易位的防止。測量雄激素受體活性的抑制和/或刺激的步驟可包括測量雄激素受體蛋白質的不穩定作用。
一種方法可包括將能夠表達前列腺特異性抗原的哺乳動物細胞與足夠量的二芳基硫代乙內酰脲化合物接觸以干擾前列腺特異性抗原mRNA的轉錄。二芳基硫代乙內酰脲化合物可選自NC53、NC54、NC55、NC56和NC57。該化合物可防止在前列腺特異性抗原基因上形成轉錄復合物。該化合物可防止雄激素受體蛋白質與前列腺特異性抗原基因復合。該化合物可防止RNA聚合酶TI與前列腺特異性抗原基因復合。
一種方法包括將哺乳動物細胞與足夠量的二芳基硫代乙內酰脲化合物接觸以防止雄激素受體蛋白質的核易位和/或使雄激素受體蛋白質不穩定。



以下附圖給出了一些化合物的藥理學檢查的結果。
圖1是描繪比卡魯胺對LNCaP-AR展現出激動作用的圖。比卡魯胺在AR-過度表達的激素難治的前列腺癌中顯示激動活性。具有過度表達AR的LNCaP細胞用增加濃度的作為載體的DMSO或比卡魯胺在不存在R11881下處理。測定AR響應報道分子的活性。
圖2是描繪比卡魯胺對LNCaP-AR的拮抗分析的圖。比卡魯胺在激素敏感的前列腺癌中的激動劑活性。LNCaP細胞用增加濃度的作為載體的DMSO或比卡魯胺在不存在R1881下處理。測定AR響應報道分子的活性。
圖3是描繪化合物對LNCaP-AR的作用的圖。
圖4是描繪對LNCaP-AR的抑制作用的圖。
圖5.對AR-過度表達LNCaP異種移植模型的PSA表達的抑制作用。小鼠用載體、0.1、1或10mg/kg實施例7-3b(NC7)治療44天，口服一日一次給藥。在44天治療之后從小鼠中取出腫瘤，提取腫瘤溶胞產物，和通過ELISA測定組織溶胞產物中的PSA水平。
圖6是腫瘤體積作為使用載體溶液、Casodex和NC53處理的時間的函數的圖。
圖7是腫瘤尺寸的圖。將AR過度表達LNCaP細胞皮下地注入去勢的SCID小鼠的脅腹中。當腫瘤達到約100立方毫米時，它們被隨機分成5組。每組有九只動物。在它們達到該腫瘤體積之后，對它們用載體、比卡魯胺或NC53在每天10或50mg/kg下口服給藥。使用測徑器三維(寬度、長度和深度)測量腫瘤。
圖8描繪腫瘤尺寸的實驗結果。在18天時，通過光學CCD照相機在最后治療劑量之后3小時時對動物進行成像。在腫瘤上畫出ROI用于螢光素酶活性測量，以光子/秒計。右面表示ROI測量。
圖9是描繪來自靜脈內給藥(上曲線)和口服給藥(下曲線)的NC53的藥代動力學曲線的圖。
圖10是熒光吸光率作為濃度對數的函數的圖，其反映幾種化合物對大鼠雄激素受體的結合親和性。
圖11給出反映當加入Casodex或NC53時雄激素受體和RNA聚合酶II對PSA增強子和與PSA啟動子的復合狀態的圖。
圖12給出反映雄激素受體在Casodex存在下，但不存在NC53下易位到核的圖。
圖13給出反映雄激素受體在Casodex存在下，但不存在NC53下易位到核的圖。
圖14給出反映雄激素受體蛋白質在NC53的存在下降解的圖。
圖15是描繪在用各種化合物治療之后的前列腺重量的圖表。如柱的標記所示，每天給藥10、25或50mg化合物/千克體重。將化合物向健康FVB小鼠給藥。在用化合物治療14天之后，通過取出半囊(semi-vesicle)、前列腺和膀胱并稱重而確定泌尿生殖道重量。三小鼠用給定化合物給藥以得到該圖中的柱所示的數據。一組小鼠不用化合物治療數據在柱中被標記為“未治療”。另一組小鼠僅用載體溶液治療數據在柱中標記為“載體”。
圖16是給出與圖6中所示的實驗程序一起進行的PSA分析的圖。
圖17是給出NC53的各種給藥方案對腫瘤體積的作用的圖。
圖18是給出在劑量0.1、1和10mg/千克體重/天下用NC53治療和沒有用NC53治療后第17天時與螢光素酶活性有關的光子發射速率相對與在第0天時的速率的圖。
圖19給出了實驗結果，其中SCID小鼠被注入LN-AR(HR)細胞系以誘導腫瘤生長。一組小鼠用化合物NC53在劑量10mg/千克體重/天下處理；另一組小鼠僅用載體溶液處理。(A)對于每組小鼠所示的作為時間函數的相對腫瘤體積。(B)每組小鼠在第31天時與螢光素酶活性有關的光子發射的圖像，表示為彩色輪廓。(C)每組小鼠在幾個時間上顯示的與螢光素酶活性有關的光子發射速率。
圖20是給出與使用各種濃度的NC53、NC54、NC55、和NC57及載體溶液處理的LN-AR細胞有關的PSA吸光率的圖。
圖21是給出與使用各種濃度的NC7、NC48、NC53、比卡魯胺和DMSO處理的LN-CaP細胞有關的PSA吸光率的圖。
圖22給出了使用野生型非轉基因小鼠(WT)、去勢的螢光素酶轉基因小鼠(Cast)和非去勢的螢光素酶轉基因小鼠(Intact)進行的實驗的結果。顯示了以90天釋放期用產生12.5mg/千克體重的植入睪酮丸治療的去勢的螢光素酶轉基因小鼠的數據(T/Cast)，和顯示了以90天釋放期用產生12.5mg/千克體重的植入睪酮丸治療的非去勢的螢光素酶轉基因小鼠的數據(Intact+T)。顯示了用植入睪酮丸和用比卡魯胺(BIC+T/Cast)或用NC53(NC53+T/Cast)在10mg/千克體重/天下治療的去勢的螢光素酶轉基因小鼠的數據。(A)在第14天時的泌尿生殖道重量。(B)在第14天時的光子發射速率。在所有的情況下，不引起激素難治的狀態。
圖23是描繪在用各種劑量的幾種化合物處理之后對LN-AR細胞所測量的PSA吸光率的圖。
圖24給出了提供化合物的幾個特性的表。圖15也給出了提供幾種化合物的作為時間函數的藥代動力學特性的圖，以化合物血清濃度計。
圖25是用在125nmol至1000nmol的濃度下給藥的各種化合物服藥的LIAR細胞系的螢光素酶活性的圖。

具體實施例方式 以下詳細討論本發明的實施方案。在描述實施方案時，為了清楚起見，采用特定術語。但是，不意圖將本發明限于如此選擇的特定術語。相關領域的技術人員將認識到，可以采用其它的等效部分和可開發其它方法，而不背離本發明的精神和范圍。本文所引用的所有參考文件作為參考并入，仿佛各自已獨立地并入。
二芳基乙內酰脲化合物的合成 實施例56[NC54] 以下，空氣或水分敏感反應在氬氣氛下使用烘干的玻璃器皿和標準注射器/隔片技術進行。反應使用SiO2TLC板在UV光(254nm)下監控，隨后用對茴香醛或茚三酮染色溶液顯影。柱色譜法在硅膠60上進行。1H NMR光譜在400MHz下在CDCl3中進行，除非另有所述，和數據如下以ppm(δ)由內標(TMS，0.0ppm)記錄化學位移(多重性，積分，單位為Hz的偶合常數)。

式37 將高碘酸(1.69g，7.41mmol)通過強烈攪拌溶解在乙腈(25mL)中，并隨后將三氧化鉻(0.16g，1.60mmol)溶解到該溶液中。將2-氟-4-硝基甲苯(0.33g，2.13mmol)在攪拌下加入以上溶液。隨著放熱反應立即形成白色沉淀物。在1小時攪拌之后，將反應混合物的上清液倒入燒瓶，和通過蒸發去除溶劑。殘余物用二氯甲烷(2 x 30mL)和水(2 x 30mL)提取。將有機層在MgSO4上干燥和濃縮以得到2-氟-4-硝基苯甲酸(式37)(0.32mg，81％)作為白色固體。1HNMR δ 8.06(ddd，1H，J＝9.9，2.2和0.3)，8.13(ddd，1H，J＝8.6，2.2和0.9)，8.25(ddd，1H，J＝8.6，7.0和0.3)。

式38 將亞硫酰氯(0.15g，1.30mmol)慢慢加入在-5℃下冷卻的2-氟-4-硝基苯甲酸(式37)(0.20g，1.10mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在-5℃下再攪拌1小時。將過量甲胺(從其40％水溶液中新蒸餾的)加入反應介質。將該第二混合物再攪拌1小時。將乙酸乙酯(50mL)加入該混合物，其用鹽水(2x50ml)洗滌。將有機層在MgSO4上干燥和濃縮以得到N-甲基-2-氟-4-硝基苯甲酰胺(式38)(0.18g，85％)作為帶黃色的固體。1H NMR(丙酮-d6)δ 3.05(d，3H，J＝4.3)，6.31(dd，1H，J＝13.5和2.1)，6.40(dd，1H，J＝8.6和2.1)，7.64(dd，1H，J＝8.6和8.6)。

式39 將N-甲基-2-氟-4-硝基苯甲酰胺(式38)(0.18g，0.91mmol)和鐵(0.31g，5.60mmol)在乙酸乙酯(5mL)和乙酸(5mL)中的混合物回流1小時。過濾掉固體顆粒。將濾液用水洗滌和用乙酸乙酯提取。將有機層在MgSO4上干燥、濃縮和將殘余物用SiO2柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，95:5)純化以得到N-甲基-2-氟-4-氨基苯甲酰胺(式39)(0.14g，92％)作為灰白色固體。1H NMR(丙酮-d6)δ 2.86(d，3H，J＝4.3)，5.50(br s，2H)，6.37(dd，1H，J＝14.7和2.1)，6.50(dd，1H，J＝8.6和2.1)，7.06(br s，1H)，7.68(dd，1H，J＝8.8和8.8)。

式40 將N-甲基-2-氟-4-氨基苯甲酰胺(式39)(96mg，0.57mmol)、丙酮氰醇(0.3mL，3.14mmol)和硫酸鎂(50mg)的混合物加熱至80℃和攪拌12小時。向介質中加入乙酸乙酯(25mL)并隨后用水(2 x 25mL)洗滌。將有機層在MgSO4上干燥和濃縮，和將殘余物用SiO2柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，95:5)純化以得到N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺(式40)(101mg，75％)作為白色固體。1H NMR δ 1.74(s，6H)，2.98(dd，3H，J＝4.8和1.1)，6.58(dd，1H，J＝14.6和2.3)，6.63(dd，1H，J＝8.7和2.3)，6.66(br s，1H)，7.94(dd，1H，J＝8.7和8.7)。

式41 將4-氨基-2-三氟甲基芐腈(2.23g，12mmol)在室溫下在15分鐘內分批(portionwise)加入硫光氣(1mL，13mmol)在水(22mL)中的攪拌良好的非均勻混合物。攪拌繼續再1小時。將反應介質用氯仿(3 x 15ml)提取。將混合的有機相在MgSO4上干燥和在減壓下蒸發至干燥以得到所需產物4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈(式41)作為帶褐色的固體和原樣用于下一步驟(2.72g，11.9mmol，99％)。1H NMR δ 7.49(dd，1H，J＝8.3和2.1)，7.59(d，1H，J＝2.1)，7.84(d，1H，J＝8.3)。

NC54(式42) 56-1)NC54 將N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺(式40)(30mg，0.13mmol)和4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈(式41)(58mg，0.26mmol)在DMF(1mL)中的混合物在微波照射下在100℃下加熱11小時。向該混合物中加入甲醇(20mL)和1N HCl水溶液(5mL)。將該第二混合物回流1.5小時。在冷卻至室溫之后，將反應混合物倒入冷水(50mL)中和用乙酸乙酯(50mL)提取。將有機層在MgSO4上干燥、濃縮和將殘余物用SiO2柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，95:5)純化以得到NC54(式42)(15mg，25％)作為無色晶體。1H NMR δ1.61(s，6H)，3.07(d，3H，J＝4.1)，6.71(m，1H)，7.15(dd，1H，J＝11.7和2.0)，7.24(dd，1H，J＝8.4和2.0)，7.83(dd，1H，J＝8.2和2.1)，7.95(d，1H，J＝2.1)，7.99(d，1H，J＝8.2)，8.28(dd，1H，J＝8.4和8.4)。
實施例57
式43 將N-甲基-2-氟-4-氨基苯甲酰胺(式39)(62mg，0.37mmol)、環戊酮(0.07mL，0.74mmol)和TMSCN(0.1mL，0.74mmol)的混合物加熱至80℃和攪拌13小時。向介質中加入乙酸乙酯(2 x 20mL)并隨后用水(2 x 20mL)洗滌。將有機層在MgSO4上干燥和濃縮，和將殘余物用硅膠柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，95:5)純化以得到N-甲基2-氟-4-(1-氰基環戊基)氨基苯甲酰胺(式43)(61mg，63％)作為白色固體。1H NMR δ 7.95(dd，1H，J＝8.8，8.8Hz)，6.65(br s，1H)，6.59(dd，1H，J＝8.8，2.3Hz)，6.50(dd，1H，J＝14.6，2.3Hz)，4.60(br s，1H)，2.99(dd，3H，J＝4.8，1.1Hz)，2.36-2.45(m，2H)，2.10-2.18(m，2H)，1.82-1.95(m，4H)。

NC55(式44) 57-1)NC55 將N-甲基2-氟-4-(1-氰基環戊基)氨基苯甲酰胺(式43)(57mg，0，22mmol)和4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈(0.15g，0.65mmol)在DMF(3mL)中的混合物在微波照射(開式容器)下在130℃下加熱12小時。向該混合物中加入甲醇(20mL)和1N HCl水溶液(5mL)。將該第二混合物回流1.5小時。在冷卻至室溫之后，將反應混合物倒入冷水(50mL)中和用乙酸乙酯(50mL)提取。將有機層在MgSO4上干燥、濃縮和將殘余物用硅膠柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，95:5)純化以得到4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-2-硫代-1，3-二氮雜螺[4.4]壬烷-1-基)-2-氟-N-甲基苯甲酰胺，NC55(式44)(8mg，7％)作為帶黃色的固體。1H NMR δ 8.28(dd，1H，J＝8.4，8.4Hz)，7.98(d，1H，J＝8.3Hz)，7.96(d，1H，J＝1.8Hz)，7.84(dd，1H，J＝8.3，1.8Hz)，7.27(dd，1H，J＝8.4，1.8Hz)，7.17(dd，1H，J＝11.7，1.8Hz)，6.67-6.77(m，1H)，3.07(d，3H，J＝4.3Hz)，2.32-2.41(m，2H)，2.13-2.21(m，2H)，1.85-1.96(m，2H)，1.49-1.59(m，2H)。
實施例58
式45 在0℃下將三氟乙酸酐(0.85mL，6.14mmol)加入4-(4-氨基苯基)丁酸(0.5g，2.79mmol)在氯仿(10mL)中的溶液。將混合物加溫至室溫和攪拌3小時。將混合物用氯仿(20mL)和水(20mL)分配。將有機層在MgSO4上干燥、濃縮和將殘余物用硅膠柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，9:1)純化以得到4-[4-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)苯基]丁酸(式45)(0.53g，69％)。1H NMR δ 7.81(br s，1H)，7.48(d，2H，J＝8.5Hz)，7.22(d，2H，J＝8.5Hz)，2.68(t，2H，J＝7.5Hz)，2.38(t，2H，J＝7.5Hz)，1.96(p，2H，J＝7.5Hz)。

式46 將亞硫酰氯(71mg，0.60mmol)慢慢加入在-5℃下冷卻的4-[4-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)苯基]丁酸(式45)(0.15g，0.55mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在-5℃下再攪拌1小時。將過量二甲胺(從其40％水溶液中新蒸餾)加入反應介質。將第二混合物再攪拌1小時。將乙酸乙酯(50mL)加入混合物，其用鹽水(2 x 50ml)洗滌。將有機層在MgSO4上干燥和濃縮以得到N，N-二甲基4-[4-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)苯基]丁酰胺(式46)(0.17g，定量)作為帶黃色的固體。1H NMR δ 9.70(br s，1H)，7.55(d，2H，J＝8.6Hz)，7.11(d，2H，J＝8.6Hz)，2.91(s，3H)，2.89(s，3H)，2.60(t，2H，J＝7.7Hz)，2.27(t，2H，J＝7.7Hz)，1.89(p，2H，J＝7.7Hz)。

式47 在室溫下將1N NaOH溶液(3mL)加入N，N-二甲基4-[4-(2，2，2-三氟乙酰基氨基)苯基]丁酰胺(式46)(0.17g，0.55mmol)在甲醇(2mL)中的溶液。將混合物攪拌14小時。將混合物用氯仿(25mL)和水(25mL)分配。將有機層在MgSO4上干燥和濃縮，和將殘余物用硅膠柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，9:1)純化以得到N，N-二甲基4-(4-氨基苯基)丁酰胺(式47)(74mg，66％)作為白色固體。1H NMR δ 6.97(d，2H，J＝8.3Hz)，6.61(d，2H，J＝8.3Hz)，3.56(br s，2H)，2.92(s，6H)，2.56(t，2H，J＝7.7Hz)，2.28(t，2H，J＝7.7Hz)，1.91(p，2H，J＝7.7Hz)。

式48 將N，N-二甲基4-(4-氨基苯基)丁酰胺(式47)(74mg，0.36mmol)、環丁酮(54mg，0.78mmol)和TMSCN(77mg，0.78mmol)的混合物加熱至80℃和攪拌15小時。向介質中加入乙酸乙酯(2 x 20mL)并隨后用水(2 x 20mL)洗滌。將有機層在MgSO4上干燥和濃縮，和將殘余物用硅膠柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，9:1)純化以得到N，N-二甲基4-[4-(1-氰基環丁基氨基)苯基]丁酰胺(式48)(58mg，57％)作為白色固體。1H NMR δ 7.07(d，2H，J＝8.5Hz)，6.59(d，2H，J＝8.5Hz)，3.94(br s，1H)，2.94(s，3H)，2.93(s，3H)，2.75-2.83(m，2H)，2.60(t，2H，J＝7.6Hz)，2.33-2.42(m，2H)，2.30(t，2H，J＝7.6Hz)，2.11-2.28(m，2H)，1.93(p，2H，J＝7.6Hz)。

NC56(式49) 將N，N-二甲基4-[4-(1-氰基環丁基氨基)苯基]丁酰胺(式48)(58mg，0.20mmol)和4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈(74mg，0.32mmol)在DMF(3mL)中的混合物在回流下加熱2小時。向該混合物中加入甲醇(20mL)和1N HCl水溶液(5mL)。將第二混合物回流1.5小時。在冷卻至室溫之后，將反應混合物倒入冷水(50mL)中和用乙酸乙酯(50mL)提取。將有機層在MgSO4上干燥、濃縮和將殘余物用硅膠柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，95:5)純化以得到4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)-N，N-二甲基丁酰胺，NC56(式49)(44mg，42％)作為淺帶黃色的固體。1H NMR δ 7.98(s，1H)，7.97(d，1H，J＝8.2Hz)，7.86(d，1H，J＝8.2Hz)，7.42(d，2H，J＝8.3Hz)，7.22(d，2H，J＝8.3Hz)，2.99(s，3H)，2.96(s，3H)，2.78(t，2H，J＝7.5Hz)，2.62-2.70(m，2H)，2.52-2.63(m，2H)，2.40(t，2H，J＝7.5Hz)，2.15-2.30(m，1H)，2.04(p，2H，J＝7.5Hz)，1.62-1.73(m，1H)。
實施例59
式50 將4-(4-氨基苯基)丁酸(0.20g，1.12mmol)、環丁酮(0.17mL，2.23mmol)和TMSCN(0.30mL，2.23mmol)的混合物加熱至80℃和攪拌13小時。向介質加入乙酸乙酯(2 x 30mL)并隨后用水(2 x 30mL)洗滌。將有機層在MgSO4上干燥和濃縮，和將殘余物用硅膠柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，9:1)純化以得到4-[4-(1-氰基環丁基氨基)苯基]丁酸(式50)(0.21g，74％)作為帶黃色的固體。1H NMR δ 7.06(d，2H，J＝8.6Hz)，6.59(d，2H，J＝8.6Hz)，2.75-2.83(m，2H)，2.59(t，2H，J＝7.5Hz)，2.37(t，2H，J＝7.5Hz)，2.33-2.42(m，2H)，2.11-2.28(m，2H)，1.92(p，2H，J＝7.5Hz)。

式51 將4-[4-(1-氰基環丁基氨基)苯基]丁酸(式50)(0.21g，0.83mmol)和4-異硫代氰酸基-2-三氟芐腈(0.25g，1.08mmol)在甲苯(10mL)中的混合物在回流下加熱1小時。向該混合物中加入1N HCl水溶液(5mL)。將第二混合物回流1.5小時。在冷卻至室溫之后，將反應混合物倒入冷水(50mL)中和用乙酸乙酯(50mL)提取。將有機層在MgSO4上干燥、濃縮和將殘余物用硅膠柱色譜法(二氯甲烷:丙酮，95:5)純化以得到4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酸，NC122(式51)(60mg，15％)。1H NMR δ 7.98(d，1H，J＝1.8Hz)，7.97(d，1H，J＝8.3Hz)，7.86(dd，1H，J＝8.3，1.8Hz)，7.42(d，2H，J＝8.5Hz)，7.24(d，2H，J＝8.5Hz)，2.79(t，2H，J＝7.5Hz)，2.62-2.68(m，2H)，2.51-2.59(m，2H)，2.47(t，2H，J＝7.5Hz)，2.14-2.26(m，1H)，2.06(p，2H，J＝7.5Hz)，1.60-1.70(m，1H)。
實施例61
NC57式53 在-78℃下將DMSO(0.01mL，0.12mmol)在無水二氯甲烷(1mL)中的溶液加入草酰氯(0.01mL，0.09mmol)在無水二氯甲烷(2mL)中的攪拌溶液。在15分鐘之后，將4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酰胺，NC47(式52)(35mg，0.07mmol)的二氯甲烷溶液加入反應混合物。在-78℃下繼續攪拌20分鐘，并隨后加入三乙胺(0.03mL，0.22mmol)。在-78℃下30分鐘之后，將反應混合物加溫至室溫并隨后用飽和NH4Cl水溶液猝滅(quench)。將反應混合物用二氯甲烷稀釋，和用二氯甲烷提取。將有機層在MgSO4上干燥、濃縮和色譜分離(二氯甲烷:丙酮，95:5)以得到4-(5-(4-(3-氰基丙基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜螺[3.4]辛烷-7-基)-2-(三氟甲基)芐腈，NC57(式53)(29mg，87％)作為粘性油。1HNMR δ 7.98(d，1H，J＝1.8Hz)，7.98(d，1H，J＝8.3Hz)，7.86(dd，1H，J＝8.3，1.8Hz)，7.43(d，2H，J＝8.4Hz)，7.27(d，2H，J＝8.4Hz)，2.90(t，2H，J＝7.3Hz)，2.63-2.73(m，2H)，2.52-2.62(m，2H)，2.42(t，2H，J＝7.3Hz)，2.18-2.30(m，1H)，2.07(p，2H，J＝7.3Hz)，1.63-1.73(m，1H)。
本領域技術人員可改變和/或混合本文所述的合成以制備其它二芳基乙內酰脲化合物。
化合物的藥理學檢查 上述合成路徑所針對的化合物采用類似于PCT申請US04/42221和US05/05529的篩選程序通過在激素難治的前列腺癌細胞上對AR的拮抗和激動活性進行篩選而確定，所述PCT申請在此作為參考并入。許多化合物對激素難治的前列腺癌中的過度表達AR展現出有效的拮抗活性以及最小激動活性。
體外生物分析 通過報道分子分析的化合物對AR的作用 使化合物經歷使用人造AR響應報道分子系統在激素難治的前列腺癌細胞系中的試驗。在該系統中，前列腺癌LNCaP細胞改造成穩定地表達內源水平的約5-倍高水平的AR。外源AR具有與內源AR類似的性能，因為；兩者都通過合成雄激素R1881穩定化。AR-過度表達的細胞還改造成穩定地引入AR響應報道分子，和這些細胞的報道分子活性表現出激素難治的前列腺癌的特征。它響應于低濃度的合成雄激素R1881，僅受高濃度的比卡魯胺抑制(參見表1)，和顯示用比卡魯胺的激動活性(圖1和表2)。與公開的數據一致，比卡魯胺抑制AR響應報道分子和在激素敏感的前列腺癌細胞中不具有激動活性(圖2)。
表1 我們檢查了上述合成所針對的化合物在100pM R1881存在下的拮抗活性。所改造的LNCaP細胞(LNCaP-AR，也簡稱為LN-AR)保持在包含10％胎牛血清(FBS)的Iscove′s培養基中。在藥物治療前的兩天，細胞在包含10％木炭處理的(charcoal-stripped)FBS(CS-FBS)的Iscove′s培養基中生長以去雄激素。細胞在包含10％CS-FBS以及100pM R1881和增加濃度的試驗化合物的Iscove′s培養基中分裂和生長。在兩天培養之后，分析報道分子活性。
表1列出了這些化合物在激素難治的前列腺癌中抑制AR的IC50。對照物質比卡魯胺具有889nM的IC50。所確定的化合物(二芳基硫代乙內酰脲)的大部分在抑制激素難治的前列腺癌中的AR中具有100至200nM的IC50。相反，在美國專利No.5,705,654中作為例子列出的抗雄激素化合物如實施例30-2、30-3、31-2、31-3和24-3(NC24-NC28)在該體系中不具有對AR的抑制活性。通過AR響應報道分子和通過內源PSA表達測量對激素難治的前列腺癌中的AR的拮抗活性。
(*)無該化合物不抑制AR響應報道分子；(**)n/a該化合物在該分析中未被檢查。
表2 激素難治的前列腺癌中的AR過度表達的一個以前未被認識的性質是其將拮抗劑轉變成激動劑的能力。因此，僅具有最小或沒有激動活性的那些化合物適于成為用于該疾病的抗雄激素。為了確定不同化合物的激動活性，我們使用AR響應報道分子作為LN-AR體系中的度量在不存在R1881的情況下檢查它們對AR的刺激活性。表2列出了不同的化合物的激動活性。與以前結果一致，比卡魯胺活化激素難治的前列腺癌中的AR。二芳基硫代乙內酰脲衍生物如實施例7-3b(NC7)、33(NC34)、34(NC35)和35(NC36)不具有激動活性。相反，RU59063和在美國專利No.5,705,654中作為例子列出的其它抗雄激素化合物如實施例30-2、30-3、31-2、31-3和24-3(NC24-NC28)強烈地活化激素難治的前列腺癌中的AR。
選擇的試驗物質對激素難治的前列腺癌中的AR響應報道分子的激動活性 通過增加化合物的濃度而產生的誘導倍數 *(*)誘導倍數由特定試驗物質對在DMSO載體中的活性所誘導的活性； (**)n/a該化合物在該分析中未被檢查。
為了檢查AR抑制劑的特異性，選擇的化合物在具有糖皮質激素受體(GR)(核受體族中AR的最接近的成員)的過度表達的LNCaP細胞中測試。這些細胞還攜帶GR響應報道分子，和報道分子活性通過地塞米松(GR激動劑)誘導，和誘導通過RU486(GR抑制劑)阻斷。實施例7-3b(NC7)(4-(8-氧代-6-硫代-5-(4-甲基苯基)-5，7-二氮雜螺[3.4]辛-7-基)-2-三氟甲基芐腈)在該體系中有對GR沒有作用。
通過測量前列腺特異性抗原(PSA)的分泌水平得到的化合物對AR的作用 已經充分確定的是，PSA水平是前列腺癌中的AR活性的指示物。為了檢查化合物在生理環境中是否影響AR功能，我們測定由R1881在AR-過度表達LNCaP細胞(LNCaP-AR，也簡稱為LN-AR)中引起的內源PSA的分泌水平。LNCaP-AR細胞是以制造表達雄激素受體的質粒轉導(transduce)的前列腺細胞的淋巴腺癌系。LNCaP-AR細胞保持在包含10％FBS的Iscove′s培養基中。在藥物治療前的兩天，細胞在包含10％CS-FBS的Iscove′s培養基中生長以去雄激素。細胞在包含10％CS-FBS以及合適濃度的R1881和試驗化合物的Iscove′s培養基中分裂和生長。在四天培養之后，使用PSA ELISA試劑盒(American Qualex，San Clemente，CA)分析分泌PSA水平。
LNCaP-AR細胞的分泌PSA水平受25pM的R1881強烈誘導。相反，PSA在母體LNCaP細胞中不被誘導直至R1881的濃度達到100pM。這與我們以前報告一致，即激素難治的前列腺癌中的AR對雄激素是過度敏感的。進行對AR活性的劑量依賴性抑制以確定不同的化合物在抑制PSA表達中的IC50，和結果列于表1。選擇的化合物對PSA表達的IC50接近地類似通過報道分子分析測定的那些，證實二芳基乙內酰脲衍生物是激素難治的前列腺癌中的AR的強抑制劑。
我們還使用分泌PSA作為替代品標記檢查了選擇的化合物對激素難治的前列腺癌中的AR的激動活性。為此，雄激素缺少的AR過度表達的LNCaP細胞使用增加濃度的上述合成所針對的化合物在不存在R1881下培養，和培養基中的分泌PSA在4天之后測量。
表3列出了選擇的化合物的激動活性。與由報道分子分析得到的結果一致，二芳基硫代乙內酰脲衍生物如實施例7-3b(NC7)、33(NC34)、34(NC35)和35(NC36)不具有激動活性。相反，RU59063和在美國專利No.5,705,654中作為例子列出的其它抗雄激素化合物如實施例30-2(NC24)、30-3(NC25)和31-2(NC26)刺激激素難治的前列腺癌中的PSA表達。
表3 選擇的試驗物質在激素難治的前列腺癌中對內源PSA的激動活性 通過增加化合物的濃度產生的誘導倍數 (*)誘導倍數由特定試驗物質相對在DMSO載體中的活性所誘導的活性； (**)n/a該化合物在該分析中未被檢查。
通過MTS分析的化合物對AR線粒體活性的作用 LNCaP-AR細胞保持在包含10％FBS的Iscove′s培養基中。檢查化合物對激素難治的前列腺癌細胞生長的影響。使用過度表達LNCaP細胞，因為這些細胞在體外和體內表現為激素難治的前列腺癌細胞(1)。我們通過MTS分析(生長的替代者)測定線粒體活性。具有過度表達AR的LNCaP細胞(LN-AR)保持在包含10％FBS的Iscove′s培養基中。在藥物治療前的兩天，細胞在包含10％CS-FBS的Iscove′s培養基中生長以去雄激素。細胞隨后在包含10％CS-FBS以及合適濃度的R1881和增加濃度的試驗化合物的Iscove′s培養基中分裂和生長。在四天培養之后，細胞生長通過MTS(Promega，Madison，WI)監控。
與報道分子分析和PSA分析一致，AR-過度表達LNCaP的生長被25μM的R1881刺激，但母體細胞不被刺激直至R1881濃度達到100μM。圖2顯示了所選化合物在100pM R1881存在下對激素難治的前列腺癌生長的抑制作用。目前的臨床藥物比卡魯胺不抑制激素難治的前列腺癌。相反，實施例5-3b(NC2)(4-[3-(4-甲基苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基]-2-三氟甲基-芐腈)和實施例7-3b(NC7)(4-(8-氧代-6-硫代-5-(4-甲基苯基)-5，7-二氮雜螺[3.4]辛-7-基)-2-三氟甲基芐腈)高效地抑制激素難治的前列腺癌。
我們檢查MTS分析中的生長抑制是否通過標靶AR而發生，實施例5-3b(NC2)(4-[3-(4-甲基苯基)-4，4-二甲基-5-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基]-2-三氟甲基-芐腈)和實施例7-3b(NC7)(4-(8-氧代-6-硫代-5-(4-甲基苯基)-5，7-二氮雜螺[3.4]辛-7-基)-2-三氟甲基芐腈)在DU-145細胞(缺少AR表達的前列腺癌細胞系)中測試。這些化合物不具有對DU-145細胞的生長抑制作用。這些化合物不抑制除AR-表達前列腺癌細胞之外的細胞，因為它們對MCF7和SkBr3(兩種常用的乳腺癌細胞)或3T3(一種正常的小鼠成纖細胞系)不具有生長作用。
二芳基硫代乙內酰脲衍生物的體外生物活性的例子在圖3和4中給出。例如，基于相對螢光素酶活性，圖3顯示在濃度500nM下，化合物按照最大活性至最小活性的順序分級如下NC67>NC68>NC66>NC69>NC77＝NC53>比卡魯胺。例如，基于相對PSA水平，發現在濃度500nM下，化合物按照最大活性至最小活性的順序分級如下NC50>NC48>NC7>NC43>NC44>NC49>NC50>NC45>比卡魯胺。例如，基于相對MTS單元，圖4顯示在濃度500nM下，化合物按照最大活性至最小活性的順序分級如下NC70>NC7>NC122>NC53>比卡魯胺。
對激素難治的和激素敏感的前列腺癌異種移植腫瘤的抑制作用 使用本發明化合物檢查二芳基乙內酰脲衍生物是否對激素難治的前列腺癌具有體內作用。首先，我們檢查在由AR-過度表達LNCaP細胞確立的異種移植腫瘤上的該化合物。Matrigel(Collaborative Biomedical)中所改造的細胞被皮下注入去勢雄性SCID小鼠的脅腹。腫瘤尺寸每周使用測徑儀三維測定。在確立異種移植腫瘤(腫瘤尺寸至少40mm3)之后，將具有腫瘤的小鼠隨機分配并用不同劑量的化合物一日一次口服治療。對AR-過度表達LNCaP異種移植模型的生長的抑制作用研究如下。具有所確立的LN-AR異種移植腫瘤的小鼠被隨機分配并用所指定的化合物一日一次口服治療。腫瘤尺寸通過測徑儀而測量。
與臨床觀察一致，目前的臨床藥物比卡魯胺不抑制激素難治的前列腺癌的生長(與載體相同)。相反，根據本發明的化合物抑制這些腫瘤的生長，和抑制是劑量依賴性的。另外，這些化合物抑制PSA表達(激素難治的前列腺癌的臨床標志物)。
本發明化合物還在激素難治的前列腺癌的另一異種移植模型，激素難治的LAPC4中測試。該模型由去勢小鼠中激素敏感的前列腺癌的傳代(passaging)確立，其模擬前列腺癌的臨床傳變(2)。類似于使用AR-過度表達LNCaP異種移植模型的發現，目前的臨床藥物比卡魯胺在激素難治的LAPC4異種移植模型中不抑制生長和PSA表達(與載體相同)。相反，本發明化合物抑制這些腫瘤的生長和PSA表達。
圖6給出了實驗結果，其中來自LNCaP激素敏感的模型的細胞異種移植到小鼠中(106個LNCaP細胞被注入小鼠中)。第一組小鼠用NC53治療，第二組小鼠用Casodex治療，和第三組小鼠用載體溶液治療。每組包括6只小鼠。小鼠用10mg/kg/天治療。圖6以作為時間函數的腫瘤體積的圖給出了結果。作為對照的用載體溶液治療的小鼠展現出最快速的腫瘤體積的增加。用Casodex治療的小鼠和用NC53治療的小鼠具有類似腫瘤生長速率，慢于用載體溶液治療的小鼠。
對荷爾蒙敏感性前列腺癌細胞的生長的抑制性作用 為了確定二芳基硫代乙內酰脲衍生物是否還抑制激素敏感的前列腺癌細胞，我們通過測量線粒體活性的MTS而對LNCaP細胞的生長測試了一些選擇的化合物。雄激素缺乏的LNCaP細胞用增加濃度的DMSO作為載體或試驗物質在1pM R1881存在下進行處理。在4天培養之后，細胞生長通過MTS分析測量。本發明化合物以高于比卡魯胺的效力抑制激素敏感的前列腺癌。
體內生物分析 所有動物實驗按照洛杉磯加利福尼亞大學的動物研究委員會(theAnimal Research Committee of the University of California at Los Angeles)的指導方針進行。動物買自Taconic和在規定的菌群菌落的層流塔中供養。LNCaP-AR和LNCaP-載體細胞保持在補充有10％FBS的RPMI培養基中。100μl的1:1Matrigel:RPMI培養基中的106個細胞被皮下注入未受損傷或去勢的雄性SCID小鼠的脅腹。腫瘤尺寸每周使用測徑儀三維(長度x寬度x深度)測量。當腫瘤尺寸達到約100mm3時，小鼠被隨機分配至治療組。藥物每天以10mg/kg和50mg/kg口服供給。為了得到藥效(pharmacodynamic)讀出，動物在最后的劑量的治療之后3小時時通過光學CCD照相機成像。在腫瘤上畫出ROI用于螢光素酶活性測量，以光子/秒計。右面表示ROI測量。數據在圖7和8中給出。在18天中NC53有效地防止腫瘤生長和甚至造成腫瘤收縮，和明顯比比卡魯胺更有效。
比卡魯胺、4-[7-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜-螺[3.4]辛-5-基]-甲苯[NC7]、N-甲基-4-{4-[7-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜-螺[3.4]辛-5-基]苯基}丁酰胺[NC48]和N-甲基-4-[7-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜-螺[3.4]辛-5-基]-2-氟苯甲酰胺(52d)[NC53]的藥代動力學使用購自Charles River Laboratories的8周齡FVB小鼠進行體內評估。小鼠分成三組用于每一時間點。兩只小鼠未用藥物治療，和另兩只小鼠用載體溶液處理。每組用10mg/千克體重治療。
藥物溶解在DMSO:PEG400:H2O的1:5:14混合物(載體溶液)中和通過尾部靜脈向小鼠給藥。在治療之前，將動物在熱燈下加溫約20分鐘使其尾部靜脈擴大。每只小鼠放在小鼠限制器(Fisher Sci.Cat#01-288-32A)中和向擴張的尾部靜脈中注入200μl在載體溶液中的藥物。在藥物給藥之后，對動物在以下不同的時間點通過CO2吸入進行無痛致死5分鐘、30分鐘、2小時、6小時、16小時。動物在暴露于CO2之后通過心臟穿刺(1ml BD注射器+27G5/8針)而立即放血。對于口服劑量，在通過加料注射器口服給藥之前，將藥物溶解在DMSO:羧甲基纖維素Tween 80:H2O的50:10:1:989的混合物中。
將血清樣品通過配有Alltima C18柱(3μ，150mm x 4.6mm)的HPLC(Waters 600泵、Waters 600控制器和Waters 2487檢測器)分析以測定藥物濃度。NC7、NC48和NC53化合物在254nm波長處檢測和比卡魯胺在270nm波長處檢測。
用于HPLC分析的樣品根據以下程序制備 -血液細胞通過離心從血清中分離。
-向400μl血清中加入80μl內標的10μM溶液和520μl乙腈。發生沉淀。
-將混合物渦旋3分鐘并隨后在超聲下放置30分鐘。
-將固體顆粒濾出或通過離心分離。
-將濾液在氬流動下干燥至干燥狀態。在通過HPLC分析以測定藥物濃度之前，將樣品用乙腈重構成80μl。
-使用藥物的標準曲線以改善精確度。
由靜脈內和口服給藥得到的作為時間函數的NC53在血漿中的濃度在圖9中給出。比卡魯胺、NC48和NC53的穩定態濃度(Css)示于表4。NC53的穩定態濃度基本上與比卡魯胺一樣好，和基本上優于NC48。
表4比卡魯胺、NC48和NC53在小鼠血漿中的穩態濃度。
雄激素受體活性可包括雄激素受體行為的刺激和抑制的幾個方面，包括，但不限于，以下在AR響應報道分子系統或前列腺特異性抗原分泌體系中的抑制濃度(IC50)；與AR響應報道分子系統或前列腺特異性抗原分泌體系中的增加濃度有關的誘導倍數；在動物中的相關腫瘤生長；雄激素受體與化合物的結合親合性；雄激素受體向前列腺特異性抗原增強子或前列腺特異性抗原啟動子的募集；雄激素受體核易位；和雄激素受體蛋白質的不穩定作用。
體外分析 圖10給出了化合物對小鼠雄激素受體(小鼠AR)的配體結合域的相對結合親和性，如使用競爭者分析試劑盒(Invitrogen)確定的。熒光偏振用作讀出。每一激素劑量一式三份地進行和相對誤差通過由平均值計算三個值的標準誤差而確定。該研究控制用于最小競爭(單獨的載體)、無受體、無熒光配體和最大競爭(10-5M R1881、黃體酮、E2或地塞米松)。使用單結合位點競爭模型擬合曲線(使用Prism統計分析軟件包。R1881具有最低的平衡離解常數，Ki＝4nM(和因此小鼠雄激素受體對于所測試的四種化合物中的R1881具有最高的親合性)。RU59063具有平衡離解常數Ki＝20nM，和NC53具有平衡離解常數Ki＝0.8μM。Casodex具有平衡離解常數Ki＝0.4μM(和因此小鼠雄激素受體對于所測試的四種化合物中的Casodex具有最低的親合性)。NC53和Casodex具有類似平衡離解常數，和因此，小鼠雄激素受體對于這些化合物具有類似的親合性。
NC53防止雄激素受體(AR)和RNA聚合酶II(Pol II)向PSA增強子和PSA啟動子的募集。圖11給出了研究結果。所用材料是具有AR(Upstate，cat#06-680)和Pol II(Covance，cat#MMS-126R)的Chromatin IP。LNCaP(ATCC)細胞在全血清中制板(plate)。在實驗那天，將板用1x PBS洗滌一次，和加入5％CSS3天。對于第一組實驗，加入10μM NC53(R)，對于第二組實驗，加入10μM比卡魯胺(C)，和對于第三組實驗，加入1nM R1881(+)。這些化合物各自加入6小時。在第四組實驗中，加入對照物，無額外的化合物(-)。6小時時間點在28個循環處運行。使用來自Upstate的ChIP試劑盒(cat#17-295)。增強子和啟動子引物分別得自Louie(PNAS 2003 Vol.100，pp.2226-2230)和Shang(Molecular Cell 2002 vol.9，pp.601-610)。對于其中加入NC53(R)的實驗的較暗圖像表明NC53防止雄激素受體和防止RNA聚合酶II在前列腺特異性抗原(PSA)基因上形成轉錄復合物。相反，對于其中加入比卡魯胺(Casodex，C)的實驗的較亮圖像表明在比卡魯胺存在下，雄激素受體和RNA聚合酶II仍募集到PSA成分以轉錄PSA mRNA。
NC53抑制LNCaP細胞中的雄激素受體核易位。圖12和13給出了研究的結果。LNCaP細胞在5％CSS中制板。第一組細胞用10μM NC53(R)處理，第二組細胞用10μM比卡魯胺(C)處理，和第三組細胞用1nM R1881(+)處理。第四組細胞用作對照物(-)。TOPO I(Santa Cruz，cat#sc-32736)用于控制核部分，和GAPDH(Santa Cruz，cat#sc-20357)用于控制細胞質部分。LNCaP細胞被采集用于亞細胞分級或用對雄激素受體(AR)的FITC(Santa Cruz)標記的抗體(Santa Cruz，cat#sc-815)染色(stain)。由亞細胞分級得到圖像，如圖12所示。對于比卡魯胺(Casodex，C)處理樣品的核部分中的較暗圖像表明，比卡魯胺誘導雄激素受體核易位。對于NC53處理樣品的亮圖像表明，NC53取消了核易位。對于AR-FITC分析，使用含DAPI的培養基將蓋片安裝在載玻片上，和使用熒光Nikon顯微鏡在x60下以對于DAPI和FITC的濾光器在24小時之后對細胞進行成像。在AR-FITC分析中，R1881和比卡魯胺處理的細胞的核明顯是綠色的，如圖13所示，表明雄激素受體發生核易位。相反，DMSO和NC53處理的細胞的核綠色較淡的。
NC53使LNCaP細胞中的雄激素受體蛋白質不穩定。圖14給出了研究的結果。該研究通過將105LNCaP(fgc)細胞在5％CSS中制板3天而進行。將100pM R1881加入第一組細胞(+)，將10μM比卡魯胺加入第二組細胞(B)，將10μM NC53加入第三組細胞(RD)，將100pM R1881和10μM比卡魯胺加入第四組細胞(B+)，和將100pM R1881和10μM NC53加入第五組細胞(RD+)。R1881、比卡魯胺或NC53都不加入第六組細胞(-)。細胞與加入比卡魯胺、NC53和/或R1881一起存在24小時(或在(-)組的情況下，在沒有任何這些的情況下24小時)。在圖14中，對于加入比卡魯胺(B)的組和對于加入比卡魯胺和R1881(B+)的組的暗圖像表明，當加入這些化合物的組合時，雄激素受體蛋白質是同一水平的。相反，對于加入NC53(RD)的組和對于加入NC53和R1881(RD+)的組的亮圖像表面，NC53的加入導致雄激素受體蛋白質的退化，無論R1881是否存在。
各等級化合物的分等 表5-10給出了分成等級1-6的二芳基乙內酰脲化合物。表11給出了未放入等級中的二芳基乙內酰脲化合物。將化合物分為各等級是基于可得數據以及分析判斷。所考慮的數據包括體外分析(在LNCaP細胞系中的AR響應報道分子系統、PSA水平測量、MTS線粒體分析)和體內試驗(直接測量的腫瘤尺寸或通過螢光素酶報道基因所誘導的發射、基于血液血漿水平的藥代動力學分析)。不是每一化合物都進行每一分析。不是所產生的所有數據都給出。在根據它們在治療前列腺癌中的效用對化合物相對于彼此進行分等時，尤其是當對未進行相同試驗的兩種化合物分等時，進行判斷。在確立分等時所考慮的特征包括AR拮抗作用活性、在激素難治的細胞中AR激動作用的缺乏、防止腫瘤生長、腫瘤收縮和藥代動力學行為，且在血液中較長的停留時間是有利的。
等級1 通常，等級1化合物是在右乙內酰脲碳上被二取代的具有二取代的左手芳基環的二芳基硫代乙內酰脲，和在左乙內酰脲碳上具有氧或N取代基。預計酰氨基取代基在例如生物體系所遇到的水溶液中體外和體內水解成氧。NC63因在左手芳基環上具有碘代替CF3取代基而具有良好活性。
判斷等級1化合物(見表5)對于治療前列腺癌比比卡魯胺好得多。但發現NC7和NC48代謝快，即在血液中具有短停留時間。NC53具有期望的藥代動力學。
圖16顯示，在用比卡魯胺處理時，對于LNCaP細胞的PSA水平相對用載體溶液處理時保持相同或增加，而在用NC53處理時，PSA水平下降。圖17說明，在用載體溶液處理時，腫瘤尺寸繼續增加。相反，在用NC53在劑量1mg/kg體重/天下處理時，腫瘤增加的速率下降，和腫瘤尺寸在約17天之后似乎穩定。在用NC53在劑量10mg/kg體重/天下處理時，腫瘤尺寸隨著時間而減小。圖18說明，在用NC53在劑量10mg/kg體重/天下處理時，與螢光素酶活性有關的光子發射下降。圖19顯示，在該劑量下的NC53處理導致腫瘤尺寸的減小或穩定和與螢光素酶活性有關的光子發射的下降。
圖20顯示，在用NC53、NC54、NC55、NC56和NC57在劑量100、200、500和1000nM下處理時，LN-AR細胞的PSA水平下降。另外，劑量越高，PSA水平越低。圖22給出了對未受損傷和去勢小鼠在初始時和用比卡魯胺或用NC53治療14天之后的泌尿生殖道重量和與螢光素酶活性有關的光子發射速率。重量和光子發射速率對于未受損傷和去勢小鼠都增加。相對未治療的去勢小鼠，用NC53治療去勢小鼠導致重量和光子發射的下降，如同用比卡魯胺治療的那樣。
因此，等級1化合物對于用作AR拮抗劑和用作用于激素難治的前列腺癌的治療劑是特別有利的。它們可用于治療其它AR相關疾病或病況如良性前列腺增生、頭發損失和粉刺。這些和相關化合物也可用作其它核受體如糖皮質激素受體、雌激素受體和過氧化物酶體增殖劑-活化的受體的調節劑，和用作其中核受體發揮作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心臟疾病和新陳代謝相關疾病的治療劑。它們可用于分析如作為標準，或作為中間體或前藥。
表5


等級2 等級2化合物(參見表6)對于治療前列腺癌明顯好于比卡魯胺，盡管有跡象NC12可作為激動劑。圖3說明，在濃度125nM至1000nM下給藥的等級1中的化合物NC66、NC67、NC68、NC53和NC69和等級2中的NC57起到降低LNCaP-AR細胞的螢光素酶活性的作用，而DMSO和比卡魯胺的對照溶液具有很小的作用或不具有作用。發現在濃度1000nM下，等級1中的化合物NC7和NC48與等級2中的NC43、NC44和NC50相比造成LNCaP-AR細胞的PSA水平的更大下降。圖7給出了隨著時間的腫瘤體積，和說明在用比卡魯胺或載體溶液處理時，腫瘤繼續生長，而在用等級1中的NC53處理時，腫瘤尺寸下降。圖8說明相對于用載體溶液處理，在用比卡魯胺處理時與螢光素酶活性有關的光子發射保持大約相同或增加，而在用NC53處理時光子發射下降。圖23說明在用比卡魯胺處理時，PSA水平下降很小或不下降，而在用NC48和NC53處理時，PSA水平下降。圖24說明，等級1中的NC7、NC48和NC53的IC50比比卡魯胺的IC50低得多。
通常，等級2化合物在結構上類似于等級1化合物，但在右手芳基環上具有不同的取代基。等級2化合物對于用作AR拮抗劑和用作用于激素難治的前列腺癌的治療劑是有利的。它們可用于治療其它AR相關疾病或病況如良性前列腺增生、頭發損失和粉刺。這些和相關化合物也可用作其它核受體如雌激素受體和過氧物酶體增殖劑-活化的受體的調節劑，和用作其中核受體發揮作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心臟疾病和新陳代謝相關疾病的治療劑。它們可用于分析如作為標準，或作為中間體或前藥。
表6

等級3 判斷等級3化合物(參見表7)對于治療前列腺癌稍好于比卡魯胺。NC43、NC44和NC50(等級2中)與等級3中的NC45和NC49相比造成LNCaP-AR細胞的PSA水平更大下降。所有這些化合物造成大于比卡魯胺的PSA水平下降。
其它等級3化合物(未示出)不是二芳基硫代乙內酰脲，和在活性上相當于現有技術單芳基乙內酰脲化合物NC83、NC79和NC80。
因此，等級3化合物可用作AR拮抗劑，和用作用于激素難治的前列腺癌的治療劑。它們可用于治療其它AR相關疾病或病況如良性前列腺增生、頭發損失和粉刺。這些和相關化合物也可用作其它核受體如雌激素受體、和過氧物酶體增殖劑-活化的受體的調節劑，和用作其中核受體發揮作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心臟疾病和新陳代謝相關疾病的治療劑。它們可用于分析如作為標準，或作為中間體或前藥。
表7
等級4 判斷等級4化合物(參見表8)對于治療前列腺癌不優于比卡魯胺。等級4的NC93和NC94和等級1的NC7，例如，僅在乙內酰脲環的下右碳上的取代基上不同。右手芳基環上的取代基也可影響活性。
一些等級4化合物(包括所示的那些和其他未示出的)不是二芳基化合物(缺少右手芳基環)，不是硫代乙內酰脲，在乙內酰脲環的下右手的碳上未被二取代，和/或在乙內酰脲環的下左手碳上具有不同于氧或酰氨基的取代基。這提供了在乙內酰脲環的下右手碳上被二取代和在乙內酰脲環的下左手碳上具有氧或酰氨基的二芳基硫代乙內酰脲的預料不到的優點的證據。
因此，等級4化合物可用作AR拮抗劑，和用作用于激素難治的前列腺癌的治療劑，至少達到它們相當于比卡魯胺的程度。它們可用于治療其它AR相關疾病或病況如良性前列腺增生、頭發損失和粉刺。這些和相關化合物也可用作其它核受體如雌激素受體和過氧物酶體增殖劑-活化的受體的調節劑，和用作其中核受體發揮作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心臟疾病和新陳代謝相關疾病的治療劑。它們可用于分析如作為標準，或作為中間體或前藥。
表8

等級5 等級5化合物(參見表9)是非活性的或幾乎非活性的，和因此對于治療前列腺癌比比卡魯胺差。右手芳基環上的取代基對于確定活性是重要的。
一些等級5化合物(所示的一些和未示出的一些)不是二芳基化合物(缺少右手芳基環)，不是硫代乙內酰脲，在乙內酰脲環的下右手的碳上未被二取代，和/或在乙內酰脲環的下左手碳上具有不同于氧或酰氨基的取代基。這提供了在乙內酰脲環的下右手碳上被二取代和在乙內酰脲環的下左手碳上具有氧或酰氨基的二芳基硫代乙內酰脲的預料不到的優點的證據。尤其是，在NC103、NC104和NC106中的端取代基(CH2NRxRy，其中Rx，y＝H或甲基)不被認為有助于這些化合物的活性。
等級5化合物對于治療前列腺癌或作為AR拮抗劑不是理想的，盡管這些和相關化合物可用作其它核受體如雌激素受體和過氧物酶體增殖劑-活化的受體的調節劑，和用作其中核受體發揮作用的疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心臟疾病和新陳代謝相關疾病的治療劑。它們可用于分析如作為標準，或作為中間體或前藥。
表9
等級6 等級6化合物(參見表10)是非活性或幾乎非活性的，而且是強激動劑，和因此對于治療前列腺癌比比卡魯胺差得多。相對于本發明化合物，對比化合物分等為非常差。特別地，NC107因在左手芳基環上具有氯取代基而具有非常差的活性，而具有三氟甲烷的NC2和具有碘的NC63分等在等級1中。等級6化合物的結果提供了在乙內酰脲環的下右手碳上被二取代和在乙內酰脲環的下左手碳的具有氧或酰氨基，和在左手芳基環上具有某些取代基的二芳基硫代乙內酰脲的預料不到的優點的證據。
等級6化合物對于治療前列腺癌或作為AR拮抗劑是不理想的。
表10
未分等級的化合物 對于幾種化合物，實驗數據不足以對它們分等。這些未分等級的化合物在表11中給出。
基于本發明的數據和方法，和基于許多化合物(包括本文未示出的一些)的觀察進行判斷，可以對未分等級的化合物進行一些評論。預計對比例NC108與對比例NC78-NC80一起在等級3中。預計NC113水解成NC7(等級1)，和應該因此具有相當的活性。預計NC114水解成NC16(等級1)，和應該因此具有相當的活性。預計NC115水解成NC3(等級1)，和預計NC120和NC121水解成NC50(等級2)，和它們應該因此具有相當的活性。
表11

簡而言之，表明在治療前列腺癌方面遠優于比卡魯胺的新型化合物被確認和制造。
化合物的抗癌活性對結構差異的敏感度 發明人已經確定，看起來似乎是乙內酰脲化合物結構上小的變化可導致化合物在治療前列腺癌的性能上大的改變。例如，NC77和NC53的不同僅在于芳基環上的單氟取代基，和NC53在等級1中，而NC77在等級2中，兩者對于治療前列腺癌都優于比卡魯胺，但NC53是優異的。但是，與NC77不同僅在于在甲基氨基甲酰基和芳基環之間具有額外的碳原子的NC98對于治療前列腺癌不優于比卡魯胺和分等在等級4中。NC77、NC53和NC98對螢光素酶活性的作用可在圖25中看出。在給定的化合物濃度下，暴露于NC77和NC53的螢光素酶活性低于暴露于NC98時的螢光素酶活性。
NC4與NC3的不同僅在于氨基被羥基代替。但NC3在等級1中，對于治療前列腺癌比比卡魯胺好得多，而NC4在等級4中，不優于比卡魯胺。NC3和NC4對在1AR細胞系的螢光素酶活性的作用通過將各種化合物在濃度1.25至10μmol下給藥和觀察PSA水平而研究。對于給定的劑量，暴露于NC3的螢光素酶活性小于暴露于NC4的螢光素酶活性。NC3和NC4對在4AR細胞系的螢光素酶活性的作用通過將各種化合物在濃度1.25至10μmol下給藥和觀察PSA水平而研究。對于給定的劑量，暴露于NC3的螢光素酶活性小于暴露于NC4的螢光素酶活性。NC3和NC4對在LN/AR細胞系的螢光素酶活性的作用通過將各種化合物在濃度1.25至10μmol下給藥和觀察PSA水平而研究。對于給定的劑量，暴露于NC3的PSA水平小于暴露于NC4的PSA水平。
NC47和NC48彼此不同于僅在于氨基甲酰基末端上的甲基取代基和這兩種化合物分等在等級1中，盡管發現NC48是特別有利的。NC46與NC47相同，除了甲氧基被氨基代替。但是，NC46分等在等級3中。NC42類似于NC46，但在將酯基連接至芳基環的鏈中少一個碳；NC42分等在等級3中。NC47、NC48、NC42和NC46對在LN/AR細胞系的PSA水平的作用通過將各種化合物在濃度125nmol至1000nmol下給藥和觀察PSA水平而研究。對于給定濃度，暴露于NC47和NC48的PSA水平低于暴露于NC42和NC46的PSA水平。
NC68和NC103的相互區別在于，前者具有連接到芳基環上的甲基氨基甲酰基基團和連接到硫代乙內酰脲基團上的二甲基取代基，而后者具有連接到右手芳基環上的甲基氨基基團和連接到硫代乙內酰脲基團上的環丁基取代基。但NC68在等級1，明顯優于比卡魯胺用于治療前列腺癌，NC103在等級5，在治療前列腺癌時無活性或幾乎無活性。NC68和NC103在LN/AR細胞系中對螢光素酶活性的作用通過將各種化合物在濃度125nmol至1000nmol下給藥和觀察螢光素酶活性而研究。對于給定的濃度，暴露于NC68的螢光素酶活性不如暴露于NC103的螢光素酶活性。
NC16和NC18相互區別在于，將硫代替換為氧代基團和二甲基取代基替換為環丁基取代基。但NC16在等級1，NC18在等級4。
藥物組合物和給藥 本發明化合物可用作使用治療有效量本文所限定的本發明化合物和可藥用載體或稀釋劑制備的藥物組合物。
本發明二芳基乙內酰脲化合物可被配制成藥物組合物和以適用于所選給藥途經的各種形式向需要治療的患者例如哺乳動物如人患者給藥，例如口服給藥、鼻內給藥、腹膜內給藥、或非消化道給藥、通過靜脈內、肌內、局部或皮下路徑給藥、或通過注入組織給藥。
因此，本發明二芳基乙內酰脲化合物可與可藥用載體如惰性稀釋劑或可同化的食用載體一起例如口服而系統給藥，或通過吸入或吹入法而系統給藥。它們可被包封在硬或軟殼明膠膠囊中，可被壓成片劑，或可直接與病人飲食的食品混合。對于口服治療給藥，化合物可與一種或多種賦形劑組合和以可攝取的片劑、口含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、干膠片(wafer)等的形式使用。二芳基乙內酰脲化合物可與細的惰性粉狀載體組合和由患者吸入或吹入。這種組合物和制劑應該包含至少0.1％的二芳基乙內酰脲化合物。組合物和制劑的百分數當然可以變化和可適宜地在給定單元劑型的約2％至約60％重量之間。二芳基乙內酰脲化合物在這種治療有用的組合物中的量使得獲得有效的劑量水平。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等也可包含以下粘合劑如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；和甜味劑如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或可加入芳香劑如薄荷、冬青油或櫻桃調味劑。當單元劑型是膠囊時，除了以上類型的材料，它還可包含液體載體如植物油或聚乙二醇。各種其它材料可存在作為涂層或以其它方式改變固體單元劑型的外形(physicalform)。例如，片劑、丸劑或膠囊可涂有明膠、蠟、蟲膠或糖等。糖漿或酏劑可包含活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或果糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料、和調味劑如櫻桃或橙子調味劑。當然，用于制備任何單元劑型的任何材料在用量上應該是可藥用的和實質上無毒的。另外，二芳基乙內酰脲化合物可引入持續釋放制劑和設備。例如，二芳基乙內酰脲化合物可引入延時釋放膠囊、延時釋放片劑和延時釋放丸劑。
二芳基乙內酰脲化合物也可通過輸注或注射而靜脈內或腹膜內給藥。二芳基乙內酰脲化合物的溶液可在水中制備，任選地與非毒性表面活性劑混合。分散體也可在甘油、液體聚乙二醇、三醋汀、和其混合物中和在油中制備。在普通的儲存和使用條件下，這些制劑可包含防腐劑以防止微生物生長。
適用于注射或輸注的藥物劑型可包括無菌水溶液或分散體或無菌粉末，其包含任選地包封在脂質體中的適用于即時制備無菌的可注射或可輸注的溶液或分散體的本發明化合物。在所有情況下，最終劑型在制造和儲存條件下應該是無菌的、流動的和穩定的。液體載體可以是溶劑或液體介質，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、植物油、非毒性甘油酯、和其合適的混合物。合適的流動性可例如通過形成脂質體、在分散體情況下通過保持所需顆粒尺寸或通過使用表面活性劑而保持。可通過各種抗細菌和抗真菌劑例如對羥苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等產生預防微生物的作用。在許多情況下，優選包括等滲劑例如糖、緩沖劑或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中使用延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和明膠而產生。
無菌可注射溶液通過將所需量的二芳基乙內酰脲化合物與以上列舉的各種其它成分(根據需要)一起引入合適溶劑中，隨后過濾殺菌而制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，其產生活性成分加上存在于之前無菌過濾溶液中的任何其它的所需成分的粉末。
對于局部給藥，二芳基乙內酰脲化合物可以純的形式施用。但是，通常期望將它們作為組合物或制劑與可以是固體或液體的皮膚學上可接受載體一起向皮膚給藥。
有用的固體載體包括細分散的固體如滑石、粘土、微晶纖維素、硅石、礬土等。其它固體載體包括非毒性聚合物納米顆粒或微顆粒。有用的液體載體包括水、醇或二醇或水/醇/二醇共混物，其中二芳基乙內酰脲化合物可在有效的水平下任選地借助于非毒性表面活性劑而溶解或分散。可加入助劑如香料和另外的抗微生物劑以針對給定用途而優化性能。所得液體組合物可由吸收劑墊施用、用于浸漬繃帶和其它敷料、或使用泵-型或氣溶膠噴霧器噴霧到受影響的區域上。
增稠劑如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性的纖維素或改性的礦物材料也可與液體載體一起使用以形成可鋪展的糊、凝膠、軟膏、皂等，用于直接施用到使用者的皮膚上。
可用于將二芳基乙內酰脲化合物傳輸至皮膚上的有用的皮膚組合物的例子是本領域已知的；例如，參見Jacquet等人(美國專利No.4,608,392)、Geria(美國專利No.4,992,478)、Smith等人(美國專利No.4,559,157)和Wortzman(美國專利No.4,820,508)，其全部在此作為參考并入本發明。
式I的化合物的有用劑量可通過比較其體外活性和通過在動物模型中比較其體內活性而確定。用于將在小鼠和其它動物中的有效劑量外推至人體的方法是本領域已知的；例如，參見美國專利No.4,938,949，其在此作為參考并入本發明。
例如，二芳基乙內酰脲化合物在液體組合物如洗劑中的濃度可以是約0.1至25％重量，或約0.5至10％重量。在半固體或固體組合物如凝膠或粉末中的濃度可以是約0.1至5％重量，或約0.5至2.5％重量。
二芳基乙內酰脲化合物用于治療所需的量不僅隨著所選的特定鹽變化，而且隨著給藥路徑、正在治療的病況的性質以及病人的年齡和病況而變化，且最終由主治醫師(attendant physician)或臨床醫師決定。
本發明試劑給藥的有效劑量和路徑是常規的。試劑的精確量(有效劑量)因患者不同而變化，取決于例如患者的種類、年齡、重量和一般或臨床狀態、正在治療的任何病癥的嚴重性或機理、所用的特定試劑或載體、給藥的方法和進度等。治療有效劑量可通過本領域技術人員已知的常規程序經驗地確定。參見如The Pharmacological Basis of Therapeutics，Goodman andGilman，eds.，Macmillan Publishing Co.，New York。例如，有效劑量可起始在細胞培養物分析中或在合適的動物模型中估計。動物模型也可用于確定給藥的合適濃度范圍和路徑。這種信息可隨后用于確定用于人體給藥的有用劑量和路徑。治療劑量也可對類似的治療劑的劑量用類推的方法選擇。
特殊給藥模式和給藥方案由主治臨床醫師考慮到情況的詳情(如患者、疾病、所涉及的疾病狀態和該治療是否是預防性的)而選擇。治療可涉及在幾天至數月或甚至數年內化合物的日劑量或多-日劑量(multi-daily dose)。
但一般來說，合適的劑量可以是約0.001至約100mg/kg/天，如約0.01至約100mg/kg體重/天，如大于約1mg/千克/天，或約1至約10mg/kg受者體重/天。例如，合適的劑量可以是約1mg/kg、10mg/kg或50mg/kg體重/天。
本發明化合物便利地以單元劑型給藥；例如，每單元劑型包含0.05至10000mg、0.5至10000mg、5至1000mg、或約100mg活性成分。
二芳基乙內酰脲化合物可給藥以實現例如約0.5至約75μM、約1至50μM、約2至約30μM、或約5至約25μM的血漿濃度峰值。示例性的期望血漿濃度包括至少或不超過(at least or no more than，大約)0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100或200μM。例如，血漿水平可為約1-100微摩爾或約10至約25微摩爾。這可例如通過以下實現靜脈注射二芳基乙內酰脲化合物的0.05-5％溶液(任選地在鹽水中)，或以包含約1-100mg二芳基乙內酰脲化合物的大丸劑口服給藥。期望的血液水平可通過連續輸注以提供約0.00005至5mg/kg體重/小時，例如至少或不超過0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5或5mg/kg/小時而保持。或者，這種水平可通過包含約0.0002至20mg/kg體重，例如至少或不超過0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20或50mg二芳基乙內酰脲化合物/kg體重的間歇輸注而得到。
二芳基乙內酰脲化合物可便利地以單劑量供給或作為在合適的間隔給藥的分劑量例如作為2、3、4或更多子劑量(sub-dose)/天供給。子劑量自身可進一步例如分成許多離散的松散分開的給藥；如從吹入器多次吸入。
許多以上確定的化合物對于激素難治的前列腺癌細胞展現出很小的或沒有激動活性。因為這些化合物是強AR抑制劑，它們可不僅用于治療前列腺癌，而且用于治療其它AR相關疾病或病況如良性前列腺增生、頭發損失和粉刺。因為AR屬于核受體類，這些化合物可作為用于標靶其它核受體如雌激素受體和過氧物酶體增殖劑-活化的受體的藥物合成的骨架。因此，它們可被進一步開發用于其中核受體發揮作用的其它疾病如乳腺癌、卵巢癌、糖尿病、心臟疾病和新陳代謝相關疾病。
以下給出根據本發明的幾種化合物的化學合成順序。氰醇10abc通過與三種不同的苯胺11abc反應轉化成四種不同的氰胺12abcd(10a和11a得到12a，10b和11a得到12b，10c和11b得到12c，和10c和11c得到12d)。在分離工藝中，苯胺13在一個步驟中被轉化成異硫氰酸鹽14，將12abcd加入14，隨后用溫和酸處理，以良好產率得到所需硫代乙內酰脲4(NC54)、5(NC55)、6(NC56)和7。

在該說明書中說明和討論的實施方案僅意味著向本領域熟練技術人員教導發明人所知曉的制備和使用本發明的最佳方法。該說明書決不應被看作對本發明范圍的限定。所給出的所有實施例是代表性和非限定性的。本發明的上述實施方案可在不背離本發明的情況下被改進或變化，這是本領域熟練技術人員根據以上教導所理解的。因此可以理解，在權利要求和其等同物的范圍內，本發明可以具體描述之外的方式實現。
權利要求
1.具有下式的化合物
其中R1和R2獨立地是甲基或，與它們所連接的碳一起形成4至5個碳原子的環烷基，
其中R3選自氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基烷基、烷基氨基甲酰基烷基、氰基和氰基烷基，和
其中R4是氫或氟。
2.藥物組合物，包含治療有效量根據權利要求1的化合物或其可藥用鹽，和可藥用載體或稀釋劑。
3.權利要求1的化合物，具有下式
4.權利要求1的化合物，具有下式
5.藥物組合物，包含治療有效量根據權利要求4的化合物或其可藥用鹽，和可藥用載體或稀釋劑。
6.權利要求1的化合物，具有下式
7.藥物組合物，包含治療有效量的權利要求6的化合物或其可藥用鹽，和可藥用載體或稀釋劑。
8.權利要求1的化合物，具有下式
9.權利要求1的化合物，具有下式
10.一種用于治療過度增生病癥的方法，包括將權利要求2的藥物組合物向需要這種治療的患者給藥，由此治療過度增生病癥。
11.權利要求10的方法，其中組合物具有選自溶液、分散體、懸浮液、粉末、膠囊、片劑、丸劑、延時釋放膠囊、延時釋放片劑和延時釋放丸劑的形式。
12.權利要求10的方法，其中化合物通過靜脈內注射、通過注入組織、腹膜內、口服、或鼻內給藥。
13.權利要求10的方法，其中組合物以約0.001mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天的化合物劑量給藥。
14.權利要求10的方法，其中組合物以約0.01mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天的化合物劑量給藥。
15.權利要求10的方法，其中組合物以約0.1mg/kg體重/天至約10mg/kg體重/天的化合物劑量給藥。
16.權利要求10的方法，其中組合物以約1mg/kg體重/天的化合物劑量給藥。
17.一種用于治療前列腺癌的方法，包括將根據權利要求2的組合物向需要這種治療的患者給藥，由此治療前列腺癌。
18.權利要求10的方法，其中藥物組合物干擾前列腺特異性抗原mRNA的轉錄。
19.權利要求10的方法，其中藥物組合物防止雄激素受體蛋白質的核易位。
20.權利要求10的方法，其中藥物組合物使雄激素受體蛋白質不穩定。
21.權利要求10的方法，其中組合物以口服給藥。
22.權利要求10的方法，其中組合物具有選自膠囊、片劑和丸劑的形式。
23.權利要求10的方法，其中化合物選自NC54、NC55、NC56、NC57、這些中任一種的可藥用鹽、和其組合。
24.權利要求10的方法，其中化合物是NC53或可藥用鹽。
25.合成下式二芳基化合物的方法
包括將化合物I
化合物I
與化合物II
化合物II
在第一極性溶劑中混合以形成混合物，
加熱該混合物，
將與第一極性溶劑相同或不同的第二極性溶劑和含水酸加入該混合物，
回流該混合物，
冷卻該混合物并與水混合，和
從該混合物中分離該二芳基化合物，
其中R51包括具有1至4個碳原子的烷基鏈，R52選自氰基、羥基、甲基氨基甲酰基、甲基氨基甲酰基-取代的烷基、甲基砜氨基甲酰基-取代的烷基、甲基氨基甲基、二甲基氨基甲基、甲基磺酰氧基甲基、甲氧基羰基、3-氰基-4-三氟甲基苯基氨基甲酰基、氨基甲酰基-取代的烷基、羧甲基、甲氧基羰基甲基、甲磺酰基、4-氰基-3-三氟甲基苯基氨基甲酰基-取代的烷基、羧基-取代的烷基、4-甲磺酰基-1-哌嗪基、哌嗪基、羥乙基氨基甲酰基-取代的烷基、和羥基乙氧基羰基-取代的烷基，和R53選自F和H。
26.權利要求25的方法，其中R51包括1至2個碳原子的烷基鏈，R52選自氨基甲酰基和甲基氨基甲酰基，和R53是F。
27.合成下式化合物的方法
包括將4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈和N-甲基-4-(1-氰基環丁基氨基)-2-氟苯甲酰胺在二甲基甲酰胺中混合以形成第一混合物，
加熱該第一混合物以形成第二混合物，
將醇和酸加入該第二混合物以形成第三混合物，
回流該第三混合物以形成第四混合物，
冷卻該第四混合物，
將該第四混合物與水混合和提取有機層；
從該有機層中分離該化合物。
28.合成權利要求4的化合物[NC54]的方法，包括
將N-甲基-2-氟-4-(1，1-二甲基-氰基甲基)-氨基苯甲酰胺和4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈在DMF中混合和加熱以形成第一混合物；
將醇和酸加入該第一混合物以形成第二混合物；
回流該第二混合物；
冷卻該第二混合物，
將該第二混合物與水混合和提取有機層；
從該有機層中分離該化合物。
29.合成權利要求6的化合物[NC55]的方法，包括
將N-甲基-2-氟-4-(1，1-氰基環戊基)氨基苯甲酰胺、4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈和DMF混合和在回流下加熱以形成第一混合物；
將醇和酸加入該第一混合物以形成第二混合物；
回流該第二混合物；
冷卻第二混合物；
將該第二混合物與水混合和提取有機層；
從該有機層中分離該化合物。
30.合成權利要求8的化合物[NC56]的方法，包括
將N，N-二甲基4-[4-(1-氰基環丁基氨基)苯基]丁酰胺、4-異硫代氰酸基-2-三氟甲基芐腈和DMF混合和在回流下加熱以形成第一混合物；
將醇和酸加入該第一混合物以形成第二混合物；
回流該第二混合物；
冷卻該第二混合物；
將該第二混合物與水混合和提取有機層；
從該有機層中分離該化合物。
31.合成權利要求9的化合物[NC57]的方法，包括
將DMSO、二氯甲烷和草酰氯混合以形成第一混合物，
將4-(4-(7-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5，7-二氮雜螺[3.4]辛烷-5-基)苯基)丁酰胺加入該第一混合物以形成第二混合物；
將三乙胺加入該第二混合物以形成第三混合物；
加溫該第三混合物和用含水NH4Cl猝滅以形成第四混合物；
從該第四混合物中提取有機層；
從該有機層中分離該化合物。
32.一種方法，包括
提供至少一種二芳基硫代乙內酰脲化合物；
測量該化合物對雄激素受體活性的抑制和確定該抑制是否在第一預定水平之上，
測量該化合物對在激素難治的癌細胞中的雄激素受體活性的刺激和確定該刺激是否在第二預定水平之下，
如果該抑制在第一預定水平之上和該刺激在第二預定水平之下，則選擇該化合物。
33.權利要求32的方法，其中所述預定水平是比卡魯胺的那些水平。
34.權利要求32的方法，其中測量抑制的步驟包括在AR響應報道分子系統或前列腺特異性抗原分泌體系中測量抑制濃度(IC50)。
35.權利要求32的方法，其中測量刺激的步驟包括通過在AR響應報道分子系統或前列腺特異性抗原分泌體系中增加濃度測量誘導倍數。
36.權利要求32的方法，其中測量抑制和/或刺激的步驟包括測量該化合物對動物中的腫瘤生長的作用。
37.權利要求32的方法，其中測量雄激素受體活性的抑制和/或刺激的步驟包括測量雄激素受體與該化合物的結合親合性。
38.權利要求32的方法，其中測量雄激素受體活性的抑制和/或刺激的步驟包括測量對雄激素受體向前列腺特異性抗原增強子和前列腺特異性抗原啟動子中的至少一種的募集的防止。
39.權利要求32的方法，其中測量雄激素受體活性的抑制和/或刺激的步驟包括測量對雄激素受體核易位的防止。
40.權利要求32的方法，其中測量雄激素受體活性的抑制和/或刺激的步驟包括測量雄激素受體蛋白質的不穩定作用。
41.權利要求32的方法，其中二芳基硫代乙內酰脲化合物具有下式
其中R1和R2獨立地是甲基或，與它們所連接的碳一起形成4至5個碳原子的環烷基，
其中R3選自氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基烷基、烷基氨基甲酰基烷基、氰基和氰基烷基，和
其中R4是氫或氟。
42.一種方法，包括將能夠表達前列腺特異性抗原的哺乳動物細胞與足量的二芳基硫代乙內酰脲化合物接觸以干擾前列腺特異性抗原mRNA的轉錄。
43.權利要求42的方法，其中二芳基硫代乙內酰脲化合物具有下式
其中R1和R2獨立地是甲基或，與它們所連接的碳一起形成4至5個碳原子的環烷基，
其中R3選自氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基烷基、烷基氨基甲酰基烷基、氰基和氰基烷基，和
其中R4是氫或氟。
44.權利要求42的方法，其中二芳基硫代乙內酰脲化合物選自NC53、NC54、NC55、NC56和NC57。
45.權利要求42的方法，其中化合物防止轉錄復合物在前列腺特異性抗原基因上形成。
46.權利要求42的方法，其中化合物防止雄激素受體蛋白質與前列腺特異性抗原基因復合。
47.權利要求42的方法，其中化合物防止RNA聚合酶II與前列腺特異性抗原基因復合。
48.一種方法，包括將哺乳動物細胞與足量的二芳基硫代乙內酰脲化合物接觸以防雄激素受體蛋白質的核易位和/或使雄激素受體蛋白質不穩定。
全文摘要
本發明涉及二芳基硫代乙內酰脲化合物及合成它們和在治療激素難治的前列腺癌中使用它們的方法。
文檔編號C07D233/86GK101460467SQ200780020099
公開日2009年6月17日 申請日期2007年3月29日 優先權日2006年3月29日
發明者邁克爾·E·瓊格, 劉東沅, 查爾斯·L·索耶斯, 克里斯·特蘭 申請人:加利福尼亞大學董事會